CN103687873A

CN103687873A - 鉴定亲和力成熟的人类抗体

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Publication number: CN103687873A
Application number: CN201280034673.8A
Authority: CN
Inventors: J·西马德
Original assignee: Xbiotech Inc
Current assignee: Xbiotech Inc
Priority date: 2011-07-12
Filing date: 2012-07-12
Publication date: 2014-03-26
Anticipated expiration: 2032-07-12
Also published as: CA2841475A1; AU2012281078B2; RU2014102617A; CN107090459A; EP3034513B1; RU2636045C2; AU2017210585B2; US20160362679A1; AU2012281078A1; IL230358B; MX2018015450A; AU2017210585A1; US9453217B2; US20160060619A1; US9234030B2; CN103687873B; MX361600B; RU2762685C2; US9394536B2; KR102139388B1

Abstract

从一个核酸文库中鉴定抗原特异性免疫球蛋白V区，该核酸文库是通过使用了前导序列特异性正向引物的聚合酶链式反应而扩增的。使用前导序列引物允许扩增所有的V区序列（包括具有大量5’末端突变的那些），而没有丢失原始的5’V区基因区段序列。可以使用被工程化为表达所扩增的V区编码核酸的真核细胞或使用细菌噬菌体展示技术，针对抗原特异性V区对这些文库进行筛选。在后者情况下，使用比常规组的5’V区引物更大的引物制备一个第二V区文库。经由这种方法通过以下方式修正被引入这些扩增产物中的序列错误：使用在通过这些V区引物所扩增的产物中获得的序列信息，以筛选使用这些前导序列引物创建的文库。来自供体免疫球蛋白的片段的氨基酸序列信息可以用于辅助对编码了供体抗体的重链和轻链的核酸的鉴定，以及用于设计用来扩增此类核酸的引物。

Description

鉴定亲和力成熟的人类抗体

相关申请的交叉引用

本申请要求于2011年7月12日提交的美国临时专利申请号61/506,749的优先权。

序列表

本申请包含已经经由EFS-Web以ASCII格式提交的序列表，并且特此将其通过引用以其全文结合。创建于2012年7月12日的所述ASCII副本名称为54070121.txt并且大小是40,628字节。

发明领域

本发明总体上涉及免疫学和分子生物学领域。更具体地说，本发明涉及用于鉴定包含体细胞高变的“亲和力成熟的”人类抗体（Ab）的方法、组合物、以及试剂盒。

背景

纵观19世纪和20世纪，科学家和医师梦想能够定制设计对单个的生物靶标具有高度特异性的治疗剂。通过选择性地攻击疾病同时不伤害健康组织，这些“魔弹”被认为是理想的治疗剂。然而，直到20世纪70年代早期，当Kohler（科勒）和Milstein（米尔斯坦）（Nature（《自然》）256:495,1975）研发了用于制备抗原（Ag）特异性单克隆抗体（mAb）的开创性方法时，才开始实现这个梦想。这也许是现代免疫学历史中最重大的事件之一。使用这种新途径，研发了众多具有数千亿美元的组合市场的研究、诊断产品、以及治疗产品。

在Kohler（科勒）和Milstein（米尔斯坦）的方法中，各自表达一种独特的免疫球蛋白（Ig）（即，mAb）的啮齿动物B细胞通过与骨髓瘤细胞融合而得以永生化。这些分泌mAb的“杂交瘤”的无限复制的能力允许那些产生具有对给定Ag的高亲和力的mAb的杂交瘤被选为用于产生大量相同的mAb的引擎。由该方法制备的mAb最终被用作人类治疗剂。尽管有效，但是很快发现使用治疗性啮齿动物mAb不太理想，因为在多次给予之后，它们诱导抗啮齿动物Ig免疫反应，这中和了mAb的活性并且经常在受治疗的患者中引起严重的不良反应。

因此，通过将人类B细胞与骨髓瘤细胞融合，尝试了改编Kohler（科勒）和Milstein（米尔斯坦）的啮齿动物方法来制备人类mAb。由于许多不同的原因，这种“人类杂交瘤”技术证明比预期的更加具有挑战性。首先，由于道德或医学原因，通常难于通过反复地用Ag免疫人类受试者来增加Ag特异性B细胞的频率。第二，还是由于道德或医学原因，如在啮齿动物中所进行的那样来分离人类脾脏组织以获得B细胞是不切实际的。第三，永生化的产生mAb的人类细胞系不易于建立并且倾向于产生非常少的mAb。以及第四，因为人类免疫球蛋白多样性、或单独的Ab特异性的谱比啮齿动物的谱高得多（～10¹²对比～10⁷单独的特异性），并且因为在给定的取样中，采用的筛选方法被局限于不大于约10⁴特异性，所以分离具有所希望的特异性的人类的分泌mAb的细胞在技术上难得多。通过这一技术鉴定具有低频率特异性的mAb因此仍是一个令人生畏的、“大海捞针式”的努力。

与“人类杂交瘤”方法的研发相平行，科学家还开始尝试通过用来自人类抗体的那些氨基酸序列替代不同的啮齿动物氨基酸序列来“人源化”啮齿动物抗体。在一个典型的应用中，将鼠科Ig可变区与人类恒定结构域结合，或将鼠科互补决定区（CDR）嫁接到人类Ig构架上。将这种新的重组核酸构建体插入被转染至宿主细胞中的表达载体中，当培养时，这些宿主细胞可以产生大量的嵌合mAb。尽管这种技术已经为改善mAb在治疗应用的有用性做出了很多（通过减少人类抗啮齿动物免疫球蛋白反应），但是剩余的啮齿动物序列仍然可以引起不希望的抗mAb反应[例如，HAMA（人抗鼠抗体）反应]的发展，该抗mAb反应可以中和mAb或甚至在患者中引起严重的不良反应。

用于产生人类mAb的另一个途径已经是使用嵌合体动物，其中该宿主动物的Ig基因已经部分地被其人类对应部分替代。通过疫苗接种，这些敲除/敲入的动物产生人类Ab，并且它们的包含B细胞的脾脏可以用于使用常规的杂交瘤技术制备人类mAb。已经与这一技术相关联的不足之处包括：由于人类Ig相关基因的不完整的谱，多样性（特异性）和亲和力减少；不纯粹是人类的体液应答（“人源化”转基因动物保留其天然T细胞并且具有鼠科抗体应答的“渗漏”表达）；产生的抗体具有非人类糖基化模式（例如，人源化动物中的包含Galα1-3Gal的寡糖通常在人类中找不到并且因此被鉴定为异物）；以及在动物中经历发展的抗体不被针对在人类中的耐受性而“选择”-因此即使来自部分的人类序列，它们在人类中不一定是非免疫原性的（即，不是真正的人类的）。

聚合酶链式反应（PCR）方法的出现使得扩增整个的或部分的Ig基因成为可能，并且允许创建包含cDNA的质粒的文库，这些cDNA编码来自有待生产的外周血白细胞（PBL）的Ig重链可变区和Ig轻链可变区（V区）。传统上，用于噬菌体展示的文库产生涉及一组重链可变区的6个引物、κ链的可变区的4个引物、以及λ链的可变区的9个引物。（如描述于Barbas（巴尔巴斯）等人，《噬菌体展示：实验室手册》Cold SpringHarbor（冷泉港出版社），2001中）。可以使用来自这些文库的质粒转染细菌或其他宿主细胞（例如，酵母菌），然后可以针对Ag特异性Ig组分对其进行筛选。在噬菌体展示途径中，将人类Ig V区基因克隆进细菌噬菌体中，以便在细菌噬菌体颗粒的表面上展示Ab片段。将来自大量人类Ab基因文库的基因插入噬菌体的文库中。每个噬菌体可以潜在地携带不同V区的基因并且在其表面上展示出不同的V区。通常，可以使用这些噬菌体在细菌噬菌体表面上展示Ab构建体，该Ab构建体由被一个接头分开的Ig重链V区和Ig轻链V区组成（单链片段可变的Ab或scFv），这样使得每个重链V区和轻链V区能以一种接近地模拟mAb如何与Ag结合的方式与靶标抗原结合。类似于噬菌体展示，在酵母菌展示中，Ig组分作为与Aga2p蛋白的融合物以一种将该融合蛋白突出远离细胞表面的方式展示在酵母菌的表面上，。然后，可以使用流式细胞术选择那些表达与靶标Ag反应的Ig组分的酵母细胞。一旦被噬菌体展示或酵母菌展示所鉴定，就将表达的重链V区和/或轻链V区基因进行回收并且将其插入全长重链和/或轻链表达载体中。培养被此类载体转染的宿主细胞允许产生大量的mAb。

噬菌体展示或酵母菌展示技术的主要益处是可以针对Ag反应性对并入了多达1000亿相异的V区的巨大文库进行筛选。这些技术的一个弊端是在第一轮展示中分离的V区典型地具有非常低的亲和力。产生低亲和力抗体的常见原因是使用这种方法时决定性的高变序列（高变序列创建成熟的高亲和力抗体）的丢失的结果。产生高亲和力抗体的B淋巴细胞通常已经经历被称为体细胞高变的过程。在这个过程中，编码V区序列的种系经历基因突变，这样使得V区的基因序列被改变。这可以导致“成熟的”V区序列的产生，该“成熟的”V区序列对于给定抗原具有充分更高的亲和力。通常理解的是，体细胞高变是用于产生抗体多样性和高亲和力抗体的根本重要的事件。体细胞高变不会被发现于种系基因组序列中，并且仅在独特的B淋巴细胞克隆中表现。

使用噬菌体展示途径产生低亲和力抗体已经成为这种方法的主要局限性。该困难确实已经导致许多其他复杂途径的发展，包括如上所述的人源化小鼠以及体外体细胞高变。人类中的抗体经历了使得它们在人体中被耐受的选择过程。这些技术导致使用了并非基于人类体内选择过程的抗体序列，并且因此这些抗体在人类中可以是免疫原性的。无论如何，克服产生低亲和力抗体已经成为这些方法的主要挑战。

噬菌体展示通常产生低亲和力抗体的一个原因是它涉及使用基于种系V区序列的引物序列。使用基于种系序列的V区引物，存在两个可能的结果：(1)由于引物与高变序列之间的不匹配不能导致引物退火，所以这些引物将不能与体细胞突变序列杂交；或，(2)引物与高变序列之间的不匹配是保留的，这样使得退火确实发生，但是扩增导致由引物编码的种系序列而非潜在的高变序列的重演。在任何一种情况下，由于噬菌体展示方法涉及使用了编码种系V区序列的PCR引物序列进行决定性的PCR扩增步骤，并且由于这些引物从抗体V区的内部扩增Ig序列，所以使用种系引物序列产生的cDNA文库将不包含体细胞高变序列的完整的谱。此外并且重要的是，该谱将完全没有在V区（即由种系编码引物编码的区）的5’末端具有高变的抗体。

换言之，使用基于种系序列的引物重演种系V区序列，由此丢失了由引物序列编码的区域内的高变。该方法因此系统地消除了V区的这些区域中的高变并且导致高变抗体序列的整体丢失。在低频率Ab的情况中（即，低于受试者的Ag特异性的整个谱的0.1%、0.01%、0.001%、0.0001%、或0.00001%），对于它噬菌体展示系统是可论证地最适合的，发现可以用来制备高亲和力mAb的V区基因变得更加具有挑战性。

概述

本发明基于以下的改进方法的研发：鉴定在人类Ab谱中以低频率出现的Ag特异性Ig V区，这样使得可以使用这些V区制备Ag特异性人类mAb或其他靶向Ag的构建体。本发明还允许鉴定更完整的V区文库，特别是编码这样的抗体序列的那些：这些抗体序列包含用于产生高亲和力抗体的决定性的体细胞突变。

这种改进方法的研发是基于以下出人意料的发现：传统的噬菌体展示和酵母菌展示方法允许对靶标Ag具有高亲和力的人类外周血单核细胞（PBMC）中的许多V区逃过鉴定。在传统的噬菌体展示和酵母菌展示方法中，使用PCR以扩增对应于Ig重链和/或Ig轻链的V区的核酸序列。起动PCR扩增过程的正向引物具有与每个V区的5’种系末端互补的核酸序列，这样使得编码V区的cDNA将被扩增。

归因于负责产生Ab多样性的若干过程，成熟Ab的V区的氨基酸序列与种系序列不同并且彼此不同。哺乳动物中的Ig基因区段按可变（V）外显子、多样性（D）外显子、连接（J）外显子、以及恒定（C）外显子的组排列。人类重链的DNA包括约50个功能性VH区段、30个DH区段、以及6个JH区段。κ链包括约40个功能性Vκ区段、五个Jκ区段、以及1个Cκ区段。λ链DNA包含30个Vλ区段，以及Jλ和Cλ区段各自4个。连接多样性来自基因片段的不精确连接，并且在重组过程中，非模板核苷酸可以通过末端脱氧核苷酰转移酶被添加至邻接的基因区段之间，并且变为互补决定区（CDR）的一部分。然后，组装的V-D-J或V-J区段通过单个的核苷酸取代（体细胞高变）的逐步掺入而变得多样化，这导致更大程度的抗体多样性和亲和力成熟。

位于每个V区重链和轻链上的三个CDR区展示出最多的序列多样性。由于这种多样性，这些区也被称为高变区。重链和轻链的六个CDR对于决定Ab的Ag结合特异性而言是决定性的。因为每个V区的5’种系末端不在高变区内，所以认为使用针对在这个位点处的种系序列的正向引物的常规方法是没有问题的。并且确实，对于鉴定在高频人类Ab中的那些V区，该方法证明是非常有用的。

在本发明之前的工作中，尝试鉴定低频Ab。尽管可以使用例如ELISA（酶联免疫吸附测定）的技术在外周血样品中鉴定具有所希望的特异性的Ab，但是当在常规的噬菌体展示方法中使用这些样品时，不能产生高亲和力Ab。这在工业中是一个普遍问题并且已经研发了制造突变以创建V区的组合文库的复杂的体外方法。这些方法是困难的、费力的，并且不一定产生保留了天然人类序列的抗体。

本发明源于寻找噬菌体系统不能产生对这些低频抗体具有高亲和力的抗体的原因。当考虑他们先前的实验时，显示(a)在V区的5’末端的氨基酸序列中，存在远离种系的相当大比率的突变，并且(b)在CDR外部的V区区段中的两个氨基酸替换对Ab-Ag的亲和力具有显著的作用，令人吃惊的认识到，使用针对5’种系末端序列的引物扩增V区序列的常规方法导致丢失了许多那些在其5’末端具有突变的V区的文库，并且在PCR过程中，还在该区域引入了序列错误。即使在严格PCR条件下，这些种系序列引物也可与包含一些数目的体细胞突变的V区交叉杂交。因此，当扩增V区时，这些引物在cDNA中重演种系序列。具有真正高亲和力V区的体细胞高变将因此丢失。重要的是还认识到，就是那些丢失的V区预期被包含在最高亲和力的Ab中。V区中的前十个氨基酸可以并且通常的确包含体细胞高变。在该区域中的单个的氨基酸变化可以影响抗体结合。

在此处所描述的创新途径中，不是使用5’V区序列的PCR引物来扩增V区，而是使用前导序列特异性正向引物来扩增V区。因为前导序列恰好在V区基因的上游，所以包括具有5’末端突变的那些序列的所有V区序列得以扩增。所以，产生的文库包含比通过常规方法（导致所有具有体细胞高变的V区序列丢失）所制备的那些更加完整的V区谱。因此，分离已经进行了体细胞突变的低频V区是可能的。可以对反向引物进行选择以允许Ig同种型的所有亚类（例如，γ、μ、α、κ、λ、等）的扩增，或重链的单独的亚类（例如，γ3或γ4）的扩增，以具有更加有针对性的文库。

使用前导序列引物扩增的V区核酸的表达导致前导肽被包含在V区蛋白产物中。当使用哺乳动物细胞（例如CHO细胞）来表达这些核酸时，内源的翻译后加工机制去除该前导肽，允许V区或多个V区（例如，重链和轻链）构建体的表达，而没有前导肽干扰Ag结合筛选测定。然而，在细菌噬菌体展示技术中，前导肽不能被去除。前导肽的存在可以干扰Ag结合筛选测定，并且由此妨碍对于对靶标Ag具有高亲和力的V区的检测。

为了克服这个问题，本发明还提供了第二V区文库的创建，该第二V区文库是使用比常规组的5’V区引物更大的引物来制备（“第二步”扩增）。与使用传统的引物组扩增的数目相比，更大组的引物允许扩增更多数目的V区序列。当然，因为这些引物是设计用来扩增种系序列而非体细胞突变的序列的，所以这些引物本身将在扩增产物中引入序列错误（即，使得这些体细胞突变被去除并且被种系序列取代）。在使用噬菌体展示以分离在表达scFv的噬菌体中的结合靶标Ag的那些V区之后，进而对编码经鉴定的V区的核酸进行测序。使用那一序列信息，特异性地扩增那些核酸的反向引物可被制得并且连同前导序列正向引物一起可被用来扩增来自第一文库的V区，以鉴定存在于用以制备第一文库的供体中的Ag特异性V区的真实且完整的（体细胞高变的）序列。

除了前述内容之外，还使用了一种蛋白质组学途径，其中血浆IgG被分离（例如，使用蛋白G色谱法，随后是Ag亲和色谱法）。通过毛细管等电聚焦进一步将生成的Ag特异性IgG混合物进行分离。然后，用蛋白酶消化IgG并且通过质谱法（MS）确定肽片段氨基酸序列。在第二步扩增不能产生适当的体细胞高变V区序列的事件中（即，V区种系引物不能与所希望的5’V区序列交叉杂交/退火，该5’V区序列包含来自第一轮扩增的体细胞突变序列），可以使用分离的Ag特异性IgG的从头测序信息来进行第一轮cDNA的V区产物的核酸测序。确切地说，使用来自MS从头蛋白测序的部分测序数据来设计V区反向引物。可以将这些反向引物与前导序列正向引物一起使用来对V区的5’末端进行鉴定并测序。一旦鉴定出这些高突变区，就可以使用常规PCR扩增完整的V区序列。然后，可以将这些V区组装成完整的具有体细胞高变的抗体。还可以使用MS肽序列信息来证实Ag特异性V区在文库筛选过程中被正确鉴定。

因此，本发明的特征在于前导区特异性引物，这些引物用于扩增对人类免疫球蛋白的V区进行编码的核酸。这些引物可以包括(a)在严格杂交条件下，与选自SEQ ID NO:1-76的核苷酸序列的互补物结合的核酸序列，或(b)选自SEQ ID NO:1-76的核酸序列。

在另一个方面中，本发明的特征在于一组前导区特异性引物，这些引物用于扩增至少90%（例如，至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%）的对人类组织（例如，外周血）样品中的人类免疫球蛋白V区进行编码的核酸。该组可以是扩增100%的对人类组织样品中的人类免疫球蛋白V区进行编码的核酸的一组。该组可以包括至少50个不同的引物，并且这些不同的引物中的每一个可以包括一个不同的核酸序列，例如SEQ ID NO:1-76的那些。该组还可以包括至少32个不同的引物，并且这些不同的引物中的每一个可以包括一个不同的核酸序列，例如SEQ ID NO:1-32的那些。该组可以包括至少15个不同的引物，并且这些不同的引物中的每一个可以包括一个不同的核酸序列，例如SEQID NO:33-48的那些。该组可以包括至少27个不同的引物，并且这些不同引物中的每一个可以包括一个不同的核酸序列，例如SEQ ID NO:49-76的那些。

还在本发明中的是一个噬菌体文库，该噬菌体文库包括至少10⁵（例如，至少10⁵、10⁶、或10⁷）个编码免疫球蛋白重链的核酸分子，这些免疫球蛋白重链在可变区的前8个氨基酸中具有体细胞高变。

本发明进一步包括一种纯化的抗体，该纯化抗体包括通过筛选噬菌体展示文库而确定的可变区序列，该噬菌体展示文库包括通过使用前导区特异性引物对分离自人类受试者的B淋巴细胞进行的PCR扩增而分离的编码可变区的核酸序列。

在另一个方面中，本发明的特征在于一种包括以下步骤的方法：(a)使用第一PCR来扩增来自包括B淋巴细胞的人类组织样品的人类免疫球蛋白重链和轻链核苷酸序列，其中在PCR扩增中使用前导区特异的特异性引物；(b)将扩增产物从该第一PCR步骤中分离；(c)通过将来自该第一PCR步骤的分离的扩增产物插入表达载体中来创建第一组构建体；并且(d)将第一组构建体引入第一组宿主细胞中，以创建人类免疫球蛋白核苷酸序列的一个第一文库。在这个方法中，这些前导区特异性引物可以包括一组不同的多核苷酸，这些不同的多核苷酸中的每一个在严格杂交条件下与选自由SEQ ID NO:1-76组成的组的不同的核酸序列的互补物结合。该方法还可以包括以下步骤中的一个或多个：(e)使用第二PCR来扩增来自第一文库或人类组织样品的人类免疫球蛋白的核苷酸序列，其中在PCR扩增中使用可变区特异的特异性引物；(f)从该第二PCR步骤分离第二组扩增产物；(g)通过将第二组分离的扩增产物插入表达载体中来创建第二组构建体；(h)将第二组构建体引入第二组宿主细胞中，以创建人类免疫球蛋白核苷酸序列的一个第二文库；(i)针对编码特异性地结合靶标抗原的可变区的核苷酸序列对该第二文库进行筛选；(j)获得编码特异性地结合靶标抗原的可变区的核苷酸序列的序列；(k)使用获得的序列信息来产生反向引物，该反向引物特异性地针对这样的核苷酸序列，这些核苷酸序列编码特异性地结合靶标抗原的可变区；并且(l)在第三PCR中使用该反向引物以及前导区特异性引物，以扩增来自该第一文库的核苷酸序列，该核苷酸序列对应于人类组织样品中的B淋巴细胞中的免疫球蛋白的序列，该B淋巴细胞促进免疫球蛋白与靶标抗原的结合。在此处所描述的本发明的方法中还可以使用蛋白质组学。

额外地，在本发明之内的是一个人类免疫球蛋白cDNA文库，该cDNA文库包括完整组的体细胞高变V区序列。

除非另外定义，否则在此所使用的所有技术术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。通常理解的生物学术语的定义可以在列赫尔（Rieger）等人的《遗传学词汇：经典及分子》，第五版，施普林格出版社：纽约，1991（Rieger et al.,Glossary of Genetics:Classical and Molecular,5th edition,Springer-Verlag:New York,1991）；以及卢因（Lewin）的《基因V》，牛津大学出版社：纽约，1994（Lewin,GenesV,Oxford University Press:New York,1994）中找到。通常理解的医学术语的定义可以在《斯特曼的医学辞典》(Stedman's Medical Dictionary)，第27版，利平科特(Lippincott)，Williams & Wilkins(威廉姆斯和威尔金斯)，2000,中找到。

如在此使用，一种“抗体”或“Ab”是一种免疫球蛋白（Ig）、相同的或异源的Ig的溶液、或Ig的混合物。一种“抗体”还可以指代Ig的片段和工程化版本，例如Fab、Fab’、以及F(ab’)₂片段；以及scFv、杂共轭（heteroconjugate）Ab、以及利用Ig衍生的CDR来赋予抗原特异性的类似的人工分子。一种“单克隆抗体”或“mAb”是由一个克隆B细胞系表达的一种Ab或仅含有能够与一种特定抗原的特定表位发生免疫反应的抗原结合位点的一个种类的Ab分子群。一种“多克隆抗体”或“多克隆Ab”为异源Ab的一种混合物。典型地，一种多克隆Ab将包括结合特定抗原的大量不同的Ab分子，其中这些不同Ab中的至少一些与该抗原的不同表位发生免疫反应。如在此使用，一种多克隆Ab可以是两种或更多种mAb的混合物。

一种Ab的“抗原结合部分”被包含在Ab的Fab部分的可变区内并且是赋予对Ab的抗原特异性的Ab的部分（即，典型地由Ab的重链和轻链的CDR形成的三维口袋）。“Fab部分”或“Fab区”是木瓜蛋白酶消化的Ig的蛋白水解片段，该片段包含那个Ig的抗原结合部分。“非Fab部分”是不在该Fab部分内的Ab的那个部分，例如，“Fc部分”或“Fc区”。Ab的“恒定区”是在可变区外的Ab的那个部分。

当提及一种蛋白分子（例如Ab）时，“纯化的”意味着与天然伴随此类分子的组分分离。典型地，当一种Ab或蛋白按重量计至少约10%（例如，9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、99.9%和100%）不含其天然关联的非Ab蛋白或其他天然存在的有机分子时，它是纯化的。可以通过任何适当的方法，例如柱色谱法、聚丙烯酰胺凝胶电泳或HPLC分析来测量纯度。一种化学合成的蛋白或在一种细胞类型（不是该蛋白天然存在的细胞类型）中产生的其他重组蛋白是“纯化的”。

“结合”（bind、binds）或“与…反应”意指一个分子识别并且粘附一个样品中的特定的第二分子，但是基本上不识别或粘附该样品中的其他分子。通常，“特异性结合”另一个分子的Ab具有对于该另一分子而言大于约10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、或10¹²升/摩尔的K_d。

如在此相对于核酸和氨基酸而使用的，术语“百分比序列一致性”意指两个比对序列之间的完全匹配的数目除以较短的序列的长度并且乘以100。可以如描述于Smith（史密斯）和Waterman（沃特曼），Advancesin Applied Mathematics（《应用数学进展》）2:482-489（1981）中的进行核酸序列的比对，并且如描述于Dayhoff（戴浩夫），Atlas of ProteinSequences and Structure（《蛋白质序列和结构图集》），M.O.Dayhoff（戴浩夫）编辑，增刊53:353-358，National Biomedical Research Foundation（国家生物医学研究基金会），华盛顿，美国，以及Gribskov（哥博斯科夫）（1986）Nucl.Acids Res.（《核酸研究》）14:6745中的进行氨基酸序列的比对。如使用以上方法所确定的，当两个DNA序列、或两个多肽序列在这些分子的定义长度上展示出至少约80%-85%、至少约85%-90%、至少约90%-95%、或至少约95%-98%的序列一致性时，这些序列彼此“基本上同源”。如在此使用的，基本上同源还指展示出与指定的DNA或多肽序列完全一致的序列。例如在如为那个具体的系统所定义的严格条件下，可以在DNA印迹杂交实验中鉴定基本上同源的DNA序列。定义适当的杂交条件在本领域的技术之内。参见，例如，Sambrook（萨姆布鲁克）等人，Molecular Cloning（《分子克隆》）:A Laboratory Manual（《实验室手册》），第二版，（1989）Cold Spring Harbor（冷泉港出版社）,N.Y.；Nucleic AcidHybridization:A Practical Approach（《核酸杂交：实用方法》），B.D.Hames（哈姆斯）和S.J.Higgins（希金斯）编著，（1985）牛津；华盛顿；IRL出版社。

如在此使用的，术语“严格杂交条件”意指在45℃下、在6X氯化钠/柠檬酸钠（SSC）中，随后在至少60℃下、在0.2X SSC、0.1%SDS中洗涤。

虽然类似或等同于在此所述的那些的方法和材料可用于本发明的实践或测试，但以下描述了适合的方法和材料。本文所提及的全部出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用方式以其全文结合。在发生冲突的情况下，将以本说明书（包括定义）为准。另外，以下所讨论的具体实施例仅仅是说明性的而不旨在是限制性的。

附图简要说明

图1是在本发明的重链PCR扩增策略中的一个步骤的示意图。

图2是在本发明的重链PCR扩增策略中的另一个步骤的示意图。

图3是在本发明的轻链PCR扩增策略中的一个步骤的示意图。

图4是在本发明的轻链PCR扩增策略中的另一个步骤的示意图。

图5是一个图表，该图表显示重链可变区亦或轻链可变区上游的前导肽的存在抑制ScFv片段与其抗原结合。当与没有前导区（LC-HC）的ScFv片段相比时，包含重链上的前导区（LC-LHC）、轻链上的前导区（LLC-HC）以及重链和轻链上的前导区（LLC-LHC）的ScFv片段减少了与该抗原的结合。

详细说明

本发明涵盖涉及包含体细胞高变的人类抗体序列的鉴定的方法、组合物、以及试剂盒。以下描述的优选实施例说明了这些方法、组合物、以及试剂盒的调适。虽然如此，根据这些实施例的说明，基于以下提供的说明可以完成和/或实践本发明的其他方面。

一般方法

在此描述了涉及常规免疫学和分子生物学技术的方法。免疫学方法（例如，用于抗原Ab复合物的检测和定位的测定，免疫沉淀法，免疫印迹等）通常在本领域是已知的，并且描述于方法学专著中，例如CurrentProtocols in Immunology（《当代免疫学实验手册》），Coligan（科尔根）等人编辑，约翰威利父子出版公司（John Wiley&Sons），纽约。分子生物学的技术详细描述于以下专著中，例如Sambrook（萨姆布鲁克）等人编著的《分子克隆：实验室手册》，第2版，第1-3卷，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，2001（Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd ed.,vol.1-3,Sambrook et al.,ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y.,2001）；以及Ausubel（奥苏贝尔）等人编著的《当代分子生物学实验手册》，格林出版与威利交叉科学，纽约（Current Protocolsin Molecular Biology,Ausubel et al.,ed.,Greene Publishing andWiley-Interscience,New York）。Ab方法描述于《治疗性Ab手册》（Handbookof Therapeutic Abs），杜贝尔·S（Dubel,S.）编著，威利-VCH出版社（Wiley-VCH），2007中。

概述

在用于鉴定Ag特异性Ig V区的传统噬菌体展示和酵母菌展示方法中，使用PCR来扩增对应于Ig重链和/或Ig轻链的V区的核酸序列。起动PCR扩增过程的正向引物具有作为每个V区的5’种系末端的互补物的核酸序列，这样使得编码V区的cDNA将被扩增。在由于体细胞高变而使5’V区基因区段不同于种系的情况中，该PCR过程优先扩增具有5’种系序列的产物，该5’种系序列导致噬菌体展示文库和酵母菌展示文库中多样性的丢失。

在本发明的一个方面中，使用前导序列特异性正向引物扩增V区。因为前导序列恰好在V区基因的上游，所以包括具有大量5’末端突变的那些序列的所有V区序列得以扩增，而没有丢失原始的5’V区基因区段序列。所以，与通过常规方法制备的那些文库相比，用该方法制备的文库包含更加完整的V区谱。可以使用被工程化为表达所扩增的V区编码核酸的哺乳动物细胞，针对Ag特异性V区对这些文库进行筛选。内源的翻译后加工机制去除该前导肽，允许V区或多个V区（例如，重链和轻链）构建体的表达，而没有前导肽干扰Ag结合筛选测定。在细菌噬菌体展示技术中，在前导肽可以干扰Ag结合筛选测定的情况下，本发明还提供了第二V区文库的创建，该第二V区文库是使用比常规组的5’V区引物更大的引物制备的。与使用传统的引物组扩增的数目相比，更大组的引物允许扩增更大数目的V区序列，但是如前所述的，会导致序列错误被引入扩增产物中。使用噬菌体展示来筛选以高亲和力结合靶标Ag的scFv中的那些V区。然后对编码经鉴定的V区的核酸进行测序，并且使用该序列信息，特异性地扩增那些核酸的反向引物可被制得并且连同前导序列正向引物一起可被用来扩增来自第一文库的V区，以鉴定存在于用以制备第一文库的供体中的Ag特异性V区的真实且完整的序列。来自供体Ig的片段的氨基酸序列信息可以用于辅助编码了供体Ab的重链和轻链的核酸的鉴定，以及用于设计用来扩增此类核酸的PCR引物。

PCR引物

本发明的一个方面包括正向PCR引物，用于从编码其前导序列的核苷酸扩增重链和轻链人类Ig V区。可以用来扩增100%的这些序列的一组（例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、或更多个）这样的引物优选用来捕获低频V区，尽管还可以使用捕获小于100%（例如，70%-99%、70%-75%、75%-80%、80%-85%、85%-90%、90%-95%、或95%-99%）的这些序列的一组引物。一组这些引物的一个实例列举于下表1A、1B、和1C中。使用这些引物组（或具有与表1A、1B、和1C中的那些基本上同源的引物的引物组）以及适当的反向引物，因为前导序列恰好在V区基因的上游，所以包括具有大量5’末端突变的那些序列的所有V区序列可以得到扩增。

表1A：重链前导区正向引物

表1B：κ链前导区正向引物

表1C：λ链前导区正向引物

在本发明的另一个方面中，可以使用一组V区PCR引物来扩增对重链Ig可变区和轻链Ig可变区进行编码的核酸。此类引物的优选组是与使用传统的引物组扩增的数目相比，允许扩增更大数目的V区序列的那些。可以用来扩增100%的这些序列的一组这样的引物优选用来捕获低频V区，尽管还可以使用捕获小于100%（例如，70%-99%、70%-75%、75%-80%、80%-85%、85%-90%、90%-95%、或95%-99%）的这些序列的一组引物。这样的引物组的实例列举于下表2和3中。使用这些引物组（或具有与表2和3中的那些基本上同源的引物的引物组）以及适当的反向引物，大部分（如果不是全部）V区序列可以通过PCR得以扩增，尽管这个过程在具有高变5’V区的那些链中引入错误（如在此所描述的可以被修正）。为了创建scFv，可以将每个在此所描述的正向引物工程化为包括适当的接头序列，例如longlink（长连接）序列GGTGGTTCCTCTAGATCTTCCTCCTCTGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGG[SEQ ID NO:176]（可以处于重链的引物序列的5’处并且可以与适合的反向引物（例如在表2的底部示出的SEQ NO:99）一起使用）或在SEQ ID NO:142-175中的引物序列的上游示出的接头（与相对应的反向引物一起使用，例如SEQ ID NO:114、133、和134）。

表2

表3A：κ链

[注释：R表示在那个位置的A或G；Y表示在那个位置的C或T；M表示在那个位置的A或C；并且S表示在那个位置的G或C]

表3B：λ链

本发明还可能包括一组反向PCR引物，用于从位于编码V区的核苷酸的3’处的序列（例如，编码铰链区或恒定区的核酸序列）扩增重链和轻链人类Ig V区。可以将反向引物选择为允许Ig同种型的所有亚类（例如，γ、μ、α、ε、κ、λ、等）的扩增，或重链的单独的亚类（例如，γ1、γ2、γ3、γ4、α1以及α2）的扩增，以具有更加有针对性的文库。本领域的普通技术人员可以根据Ig同种型的已公开的序列来确定这样的反向引物的具体序列。代表性实例示于下表4中：

表4

尽管前述特异性引物是优选的，但是还可以使用其他引物，这些其他引物在用于PCR扩增的杂交条件或严格杂交条件下与在此列举的这些特定序列的互补物杂交。例如，与在此列举的这些特定序列的互补物具有至少75%（例如，至少80%、85%、90%、或95%）的序列一致性的、与其是基本上同源的、和/或在严格杂交条件下与其结合的引物。这些引物的长度范围可以为从约（+/-5核苷酸）15-100、17-50、18-40、或20-30个核苷酸。

V区文库

可以使用在PCR中用前述引物制备的重链和轻链Ig扩增产物来创建V区文库。例如，可以将编码Ig链的核酸插入载体中，并且可以将生成的构建体引入宿主细胞（例如，原核细胞（例如细菌）或真核细胞（例如酵母菌或哺乳动物细胞））中以制备文库。

作为一个实例，可以从包含B淋巴细胞的供体样品（例如，外周血单核细胞、分离的B细胞或浆细胞、血沉棕黄层、骨髓、淋巴结、脾脏、或CNS样品）中获得对天然存在的Ig进行编码的核酸。典型地，从先前被确定为拥有特异性地针对感兴趣靶标Ag的Ab的人类供体中（例如，通过ELISA或RIA）获得这些样品。对于鉴定针对自身Ag的Ab，优选的供体是具有细胞因子特异性自身抗体（例如，针对干扰素γ、肿瘤坏死因子α、白细胞介素4和白细胞介素10、GM-CSF、红细胞生成素、IL-6、IL-17、IL-22、干扰素-α、干扰素-β、IL-2、IL-8、血管内皮生长因子、和/或粒细胞集落刺激因子）的那些，以及患有自身免疫性疾病（例如类风湿性关节炎或狼疮）的那些。

在一种方法中，从这些细胞中提取总RNA并且使用聚腺苷酸（polyA）引物进行逆转录。将生成的cDNA用作PCR扩增的模板，使用上述引物以及一种适合的PCR策略（例如在下面的实例中描述的）。可以在琼脂糖凝胶上将具有正确大小的PCR产物可视化、切离、并且纯化。然后，用一种适合的限制性内切酶（例如，针对V重链的NotI或NcoI以及针对V轻链的SfiI或SalI）消化这些纯化产物。可以将消化的片段再次进行凝胶纯化并且用连接酶（例如，T4DNA连接酶）连接进载体（例如，预先用NotI/NcoI亦或SfiI/SalI线性化的噬菌粒载体）中。可以将连接产物电穿孔至感受态宿主细胞（例如，大肠杆菌）中以制备重链和轻链文库。可以使用特异性地针对同种型或亚类的反向引物制备同种型特异性文库和亚类特异性文库。

展示文库

可以使用重链和轻链文库创建细胞的其他文库，这些其他文库展示包含重链和轻链的Fab、scFv、或其他Ab样构建体。可以通过以下方式创建此类文库：经由上述方法分离对重链和轻链进行编码的核酸或通过将这些核酸从已经存在的V区文库中再次纯化。通过将编码重链和轻链的分离的核酸插入适合的载体中并且在宿主细胞中表达这些构建体，可以针对Ag结合对重链和轻链的组合进行评估，和/或使重链和轻链的组合经受多轮选择以鉴定以高亲和力结合靶标Ag的那些。这些重链和轻链的组合可以通过测序来表征。参见，例如，Clackson（克拉克森）等人，Nature（《自然》）352:624-628,1991；McCafferty（麦卡弗蒂）等人，Nature（《自然》）348:552-554,1990；以及Kang（康）等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.（《美国科学院院刊》）88:4363-4366,1991。

对于scFv文库的制备，在琼脂糖上对扩增的VH和VL基因进行凝胶纯化，并且使用VH和VL片段作为模板，通过重叠PCR组装这些scFv基因。首先，在没有引物的情况下，通过PCR用接头组装VH和VL，其中在该接头的末端处短区域的互补性促进不同片段的杂交。首先在没有引物的情况下进行PCR，并且然后在添加外引物后进行PCR。用一种适合的限制性内切酶消化scFv，进行琼脂糖凝胶纯化，并且然后将其连接进已经用同一限制性内切酶剪切的噬菌体展示载体中。将连接产物插入（例如，电穿孔）进感受态宿主细胞（例如，细菌、酵母菌、或哺乳动物细胞）中，并且将这些细胞铺板并且培养，并且然后将适合的克隆从这些平板刮进适合的冻存培养基中并且冷冻（例如，在-70℃下，在具有10%甘油的超级肉汤培养基中）。即使不使用接头，也能以类似方式制备Fab文库。可以通过筛选细菌噬菌体展示、酵母菌展示、和/或哺乳动物细胞展示文库技术，使用选择方法（例如淘选、细胞分选），使用自动筛选器/选择器（例如，CLONEPIX^TM系统），以及磁珠分离来获得Ag特异性Fab和scFv。

使用前导序列引物扩增的V区核酸的表达导致前导肽被包含在V区蛋白产物中。当使用哺乳动物细胞（例如CHO细胞）来表达这些核酸时，内源的翻译后加工机制去除该前导肽，允许V区或多个V区（例如，重链和轻链）构建体的表达，而没有前导肽干扰Ag结合筛选测定。然而，在细菌噬菌体展示技术中，前导肽不能被去除。前导肽的存在可以干扰Ag结合筛选测定，并且由此妨碍对靶标Ag具有高亲和力的V区的检测。

为了克服这个问题，本发明还提供了第二V区文库的创建，该第二V区文库是使用比常规组的5’V区引物大的引物制备的。与使用传统的引物组扩增的数目相比，更大组的引物允许扩增更大数目的V区序列。当然，因为这些引物是设计用来扩增种系序列而非体细胞突变的序列的，所以这些引物本身将在扩增产物中引入序列错误（即，使得这些体细胞突变被去除并且被种系序列取代）。使用噬菌体展示来筛选以高亲和力结合靶标Ag的scFv中的那些V区。然后对编码经鉴定的V区的核酸进行测序，并且使用该序列信息，特异性地扩增那些核酸的反向引物可被制得并且连同前导序列正向引物一起可被用来扩增来自第一文库（其产物用前导序列引物进行扩增）的V区，以鉴定存在于用以制备第一文库的供体中的Ag特异性V区的真实且完整的序列。

Ag特异性人类mAb或其他靶向Ag的构建体

可以使用经鉴定为有助于结合特定靶标Ag的重链和/或轻链V区（或其部分，例如CDR）来制备靶向Ag的构建体，这些构建体包括全长Ab、Ab片段、工程化Ab、以及融合蛋白。全长Ab以及其他靶向Ag的构建体可以包括对特异性地针对特定同种型或亚类（例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA1、IgA2、IgE、或IgM）的Ig序列进行编码的非V区序列。Fab片段可以是Fab’、F(ab)2、F(ab’)₂、F(ab)₃、Fv、scFv、)、dsFv、Fd、或dAb。工程化Ab可以是微型抗体（minibody）、双链抗体（diabody）、三链抗体（triabody）、四链抗体（tetrabody）、或κ体（kappabody）。可以使用重组体或蛋白质工程技术制备Ag结合构建体，例如，其中在核酸水平上，将V区或CDR嫁接进构建体的剩余部分中。

蛋白质组学

除了前述内容之外，还使用蛋白质组学途径，其中使用已知技术（例如，蛋白G、蛋白A、蛋白L、或离子交换色谱法，随后是Ag亲和色谱法）来分离供体组织样品（例如，血浆IgG）中的Ag特异性Ab。例如通过毛细管等电聚焦进一步将生成的Ag特异性Ab混合物进行分离。然后，用蛋白酶消化Ig并且通过MS确定肽片段氨基酸序列。然后，可以使用肽序列信息来确认Ag特异性V区在文库筛选过程中被正确鉴定，并且还可以对PCR引物进行设计以扩增来自早前制备的文库的Ag特异性V区。

试剂盒

可以将在此所描述的这些PCR引物组和/或在此所描述的文库中的一个或多个包装在试剂盒中，该试剂盒可以包括使用说明书。

实例

实例1：PCR策略

现在参照图1，针对重链进行三轮PCR并且针对轻链进行两轮PCR。将从人类PBMC制备的cDNA文库用作模板，并且用不同的前导区正向引物（参见表1A）以及位于重链CH2区中的反向引物进行第一轮PCR。取决于IgG的亚类，生成的PCR产物的大小是905-1046个核苷酸。第二轮PCR使用与第一轮相同的正向引物，但是使用的反向引物位于四种不同类别的IgG重链的铰链区中，使用列于表4中的反向引物。这个步骤导致亚类特异性重链扩增。参照图2，针对重链的第三轮PCR使用位于V区的5’末端的正向引物（参见表3）以及位于CH1结构域的5’末端的反向引物。这些正向引物具有引入ScFv片段的长接头的适配子，并且该反向引物具有引入Sfi I位点的适配子。

对于轻链而言，参照图3，还将PBMC cDNA文库用作模板，并且使用前导区正向引物以及位于κ链和λ链的Cκ和Cλ区中的反向引物进行第一轮PCR。使生成的PCR产物在琼脂糖凝胶上跑胶，并且针对κ链，将～550bp产物进行凝胶纯化并且在第二轮PCR反应中将其用作模板。针对λ链，将～630产物进行凝胶纯化并且在第二轮PCR反应中将其用作模板。反向引物列于表4中。参照图4，针对轻链的第二轮PCR使用位于V区的5’末端的正向引物以及位于Cκ或Cλ结构域的5’末端的反向引物。这些正向引物具有引入Sfi I位点的适配子并且该反向引物具有引入长接头序列的适配子。

进行重叠延伸PCR，其中将第三轮重链产物与相等比例的κ链和λ链第二轮产物混合，以产生重叠产物。使用轻链适配子特异性正向引物以及重链适配子特异性反向引物扩增这些重叠产物，以产生ScFv片段。用Sfi I消化这些ScFv片段并且将其克隆进pComb3X载体中。

实例2：使用V区引物的PCR

进行以下实验以测试前导序列对噬菌体结合的作用。产生具有和不具有重链前导区和轻链前导区的测试ScFv片段，并且将其在噬菌体上进行表达。在针对特异性抗原的ELISA中使用这些噬菌体。图5示出重链可变区亦或轻链可变区上游的前导肽的存在抑制ScFv片段与其抗原结合。

基于以上结果，V区特异性引物是在引入了长接头和Sfi I位点的最后一轮PCR中。当对高亲和力抗原特异性候选ScFv片段进行测序时，将引物设计在框架2区中作为反向引物，并且在重链的第二PCR产物和轻链的第一PCR产物上使用前导区特异性正向引物，以获得V区的正确的5’序列。使用修正的V区以产生用于生物活性测定的全长抗体。

实例3：结合人类细胞因子的重链和轻链的发现。

使用上述方法和组合物，鉴定出编码针对人类细胞因子的两种不同的单克隆抗体的人类重链和轻链基因。这两种单克隆抗体都展示出针对抗原的高结合亲和力（在纳摩尔范围至皮摩尔范围内）。这证明，本发明的方法和组合物对于从人类基因组中鉴定低频（在这种情况下，这些抗体对抗自身抗原）抗体是有用的。

其他实施方案

应理解，虽然已经结合详细描述，对本发明进行了描述，但前面的描述旨在说明而非限制本发明的范围，本发明的范围由所附的权利要求书的范围限定。其他方面、优点以及改动都在所附权利要求书的范围之内。