KR20140044905A

KR20140044905A - 친화성 성숙 인간 항체의 동정

Info

Publication number: KR20140044905A
Application number: KR1020147003416A
Authority: KR
Inventors: 존 시마드
Original assignee: 엑스바이오테크, 인크.
Priority date: 2011-07-12
Filing date: 2012-07-12
Publication date: 2014-04-15
Also published as: IL230358B; US20200071388A1; US9394536B2; MX2014000431A; EP3034513B1; CN103687873A; RU2017134418A; EP3034513A3; AU2012281078A1; MX2018015450A; JP2014521316A; US20170233457A1; CA2841475A1; US9453217B2; IL262977A; KR102139388B1; EP2731965A4; US20130018173A1; RU2017134418A3; WO2013009967A3

Abstract

항원 특이적 면역 글로불린 V 영역은 리더 서열 특이적 정방향 프라이머를 이용하는 중합 효소 연쇄 반응을 이용하여 증폭된 핵산 라이브러리로부터 동정된다. 리더 서열 프라이머의 사용으로, 원래의 5’ V 유전자 분절 서열을 잃지 않고서도 (광범위한 5’ 말단 돌연변이를 포함하는 V 영역 서열을 비롯하여) 모든 V 영역 서열들이 증폭될 수 있게 한다. 이러한 라이브러리는, 증폭된 V 영역 암호화 핵산을 발현하도록 조작된 진핵 생물 세포를 이용하거나, 또는 박테리아 파지 전시 기술을 이용하여, 항원 특이적 V 영역들에 대해서 스크리닝될 수 있다. 박테리아 파지 전시 기술을 이용하는 경우, 제2 V 영역 라이브러리는, 통상의 5’ V 영역 프라이머 세트보다 크기가 큰 프라이머 세트를 사용하여 제조된다. 이러한 방법에 의해 증폭 생성물에 도입된 서열 오류들은, 리더 서열 프라이머들을 사용하여 제조된 라이브러리를 스크리닝하기 위해서 V 영역 프라이머에 의해 증폭된 생성물에서 얻어진 서열 정보를 이용하여 교정된다. 공여체 면역 글로불린의 단편으로부터 얻어진 아미노산 서열 정보는, 공여체 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 핵산의 동정을 도울뿐만 아니라, 이와 같은 핵산을 증폭하도록 프라이머를 설계하는데 사용될 수 있다.

Description

친화성 성숙 인간 항체의 동정{IDENTIFYING AFFINITY-MATURED HUMAN ANTIBODIES}

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2011년 7월 12일 출원한 미국 가출원 제61/506,749호의 우선권을 주장한다.

서열 목록

본 출원은 ASCII 형식으로 EFS-Web을 통해 제출되고 본원에 전체가 참조로 포함되어 있는 서열 목록을 포함한다. 2012년 7월 12일 제작된 상기 ASCII 복사본은 명칭이 54070121.txt이고, 크기가 40,628바이트이다.

본 발명의 분야

본 발명은 대체로 면역학 및 분자 생물학 분야에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 체세포 초돌연변이를 포함하는 “친화성 성숙(affinity-matured)”인간 항체(Ab)를 동정하기 위한 방법, 조성물 및 키트에 관한 것이다.

19세기 및 20세기 동안 과학자들 및 임상의들은 단일 생물 표적에 매우 특이적인 치료제를 주문 설계할 수 있게 되는 것을 꿈꿨다. 조직을 건강하게 유지시키면서 질병만을 선택적으로 공격함으로써, 이러한 “마법의 탄환(magic bullet)”은 이상적인 치료제인 것으로 생각되었다. 그러나 Kohler와 Milstein(Nature 256:495, 1975)이 항원(Ag) 특이적 모노클로날 항체(mAb)를 제조하는 획기적인 방법을 개발하게 되었던 1970년대 초에야 이 꿈은 실현되기 시작하였다. 이것은 아마도 현대 면역학의 역사에 있어서 가장 중요한 사건들 중 하나이었다. 이러한 신규 접근법을 사용하여 다수의 연구용, 진단용 및 치료용 제품들이 개발되었으며, 이들의 합친 시장 규모는 수천억 달러이다.

Kohler와 Milstein의 방법에 있어서, 각각 특유의 면역 글로불린(Ig)(즉, mAb)을 발현하는 설치류 B 세포들은 골수종 세포와의 융합에 의해 무한 증식되었다. 이러한 mAb를 분비하는 “하이브리도마”의 무한 복제 능력은, 소정의 Ag에 대한 친화성이 높은 mAb를 생산하는 하이브리도마가 동일한 mAb를 다량으로 생산하는 엔진으로서 선택될 수 있게 한다. 종국적으로, 이러한 방법에 의해 제조된 mAb는 인간의 치료제로 사용되었다. 유효하긴 하지만, 치료용 설치류 mAb가 다수 회 투여 후 항 설치류 Ig 면역 반응을 유도하며, 이는 mAb의 활성을 무력화하고 치료된 환자에서 자주 심각한 부작용을 야기하기 때문에, 얼마 지나지 않아 치료용 설치류 mAb의 사용은 결코 이상적이지 않다는 것이 발견되었다.

그러므로 인간의 B 세포를 골수종 세포에 융합함으로써 인간 mAb를 제조하는 Kohler와 Milstein의 설치류 방법을 조정하기 위한 시도들이 행하여졌다. 이러한 “인간 하이브리도마” 기술은 다수의 상이한 이유들로 인하여 예상보다 어려운 것으로 입증되었다. 첫 번째로, 윤리적 이유 또는 의학적 이유로 인해서, Ag를 사용하여 인간 피험체를 반복적으로 면역화시킴으로써 Ag 특이적 B 세포의 빈도를 늘리는 것은 종종 어려웠다. 두 번째, 역시 윤리적 이유 또는 의학적 이유로 인해서, B 세포를 얻기 위해 설치류에서는 비장 조직을 분리하는 것이 수행되지만, 인간의 비장 조직을 분리하는 것은 현실적이지 못하였다. 세 번째, 무한 증식성 mAb 생산 인간 세포주들은 확립되기가 쉽지 않았으며, 매우 적은 양의 mAb만을 생산하는 경향이 있었다. 그리고 네 번째, 개별 Ab 특이성을 가지는 인간 면역 글로불린 다양성, 또는 레파토리는 설치류의 레파토리보다 훨씬 더 크고(약 10¹² 대 약 10⁷ 개별 특이성), 사용된 스크리닝 방법은 소정의 샘플링시 약 10⁴ 이하의 특이성에 한정되었기 때문에, 원하는 특이성을 가지는 인간 mAb 분비 세포를 분리하는 것은 기술적으로 훨씬 더 어려운 일이다. 따라서, 이러한 기술에 의해 생성 빈도 특이성(frequency specificity)이 낮은 mAb를 동정하는 것은 “건초더미에서 바늘 찾기”의 고된 노력이 필요하다.

“인간 하이브리도마” 방법의 개발과 동시에, 과학자들은 또한 다양한 설치류의 아미노산 서열들을 인간 항체로부터 유래하는 아미노산 서열들로 대체함으로써 설치류 항체를 “인간화”하려는 시도를 행하기 시작하였다. 통상적인 적용에서, 쥣과동물의 Ig 가변 영역은 인간의 불변 도메인과 합쳐지거나, 또는 쥣과동물의 상보성 결정 영역(CDR)은 인간의 Ig 구조틀에 이식된다. 이러한 새로운 재조합 핵산 구조물은, 숙주 세포에 형질 감염되어 이 숙주 세포가 배양될 때 키메라 mAb를 다량으로 생산할 수 있는 발현 벡터에 삽입된다. (인간의 항 설치류 면역 글로불린 반응을 감소시킴으로써) 치료적 적용에서 mAb의 유용성을 개선하기 위한 이러한 기술이 많이 행하여졌지만, 잔류하는 설치류 서열들은 환자의 mAb를 무력화하거나 심지어 환자에서 심각한 부작용을 일으킬 수 있는 원치 않는 항mAb 반응[예를 들어, HAMA(인간 항마우스 항체) 반응]의 발생을 여전히 야기할 수 있다.

인간의 mAb를 생산하는 또 다른 접근법으로서는 키메라 동물을 사용하는 방법이 있는데, 여기서 숙주 동물의 Ig 유전자들은 부분적으로 인간 Ig 유전자들의 상응하는 일부로 대체된다. 백신화시, 이러한 녹아웃(knockout)/녹인(knockin) 동물들은 인간 Ab를 생산하고, 이러한 동물들의 B 세포 함유 비장은 통상의 하이브리도마 기술을 사용하여 인간 mAb를 제조하는데 사용될 수 있다. 이러한 기술과 연관된 단점들로는 인간 Ig 관련 유전자의 불완전한 레파토리로 인한 친화성 및 다양성(특이성)이 감소되는 점; 순전히 인간의 것이 아닌 체액 반응(“인간화된” 유전자 이식 동물들은 자신들의 원래 T 세포를 보유하므로, 쥣과동물의 항체 반응의“누설(leaky)” 발현이 있음)이 있는 점; 생산된 항체는 인간의 것이 아닌 당화 패턴을 가지는 점(예를 들어, 인간화된 동물에 있어서 Galα 1-3Gal 포함 올리고당체는 일반적으로 사람에서는 발견되지 않으므로 외래 물질로서 인식됨); 그리고 동물에서 발생된 항체들은 사람의 체내에서 관용성에 대해 “선택되지” 않으므로, 사람 서열의 일부로부터 유래될 지라도 이러한 항체는 사람에서 반드시 비면역원성인 것은 아닌(즉, 실제 인간의 것이 아닌) 점을 포함한다.

중합효소 연쇄 반응(PCR) 법의 출현으로 Ig 유전자의 전체 또는 일부를 증폭시킬 수 있게 되었으며, 이로써 말초 혈액 백혈구(PBL)로부터 Ig의 중쇄 및 경쇄 가변 영역들(V 영역들)을 암호화하는 cDNA 함유 플라스미드 라이브러리가 제조될 수 있게 되었다. 전통적으로, 파지 전시를 위한 라이브러리 생성은 중쇄의 가변 영역에 대하여 6개의 프라이머, 카파 사슬의 가변 영역에 대하여 4개의 프라이머 및 람다 사슬의 가변 영역에 대하여 9개의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 수반하였다(문헌[Barbas et al., Phage Display: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, 2001]에 기술된 바와 같음). 이러한 라이브러리로부터 유래하는 플라스미드는 박테리아 또는 기타 다른 숙주 세포(예를 들어, 효모)를 형질 감염시키는 데 이용될 수 있어 Ag 특이적 Ig 성분들에 대하여 스크리닝될 수 있다. 파지 전시 접근법에 있어서, 인간 Ig V 영역 유전자는 박테리오파지에 클로닝되어, 박테리오파지 입자 표면에 Ab 단편들을 전시한다. 광범위한 인간 Ab 유전자 라이브러리로부터 유래하는 유전자들은 파지 라이브러리에 삽입된다. 각각의 파지는 잠재적으로 상이한 V 영역에 대한 유전자를 운반할 수 있으며, 자체의 표면에 상이한 V 영역을 전시한다. 일반적으로 이러한 파지는 박테리오파지 표면상에 링커에 의해 구분되는 Ig의 중쇄 및 경쇄 V 영역들로 이루어진 Ab 구조물(단일 사슬 단편 가변 Ab 또는 scFv)을 전시하는데 사용되며, 각각의 중쇄 및 경쇄 V 영역들은 mAb가 Ag와 결합하는 방식을 매우 근접하게 모방하는 방식으로 표적 항원과 결합할 수 있다. 파지 전시와 유사하게 효모 전시에 있어서, Ig 성분들은 세포 표면에서 멀리 떨어진 곳에서 융합 단백질을 방출하는 방식으로 효모의 표면상에 Aga2p 단백질에 대한 융합체로서 전시된다. 유동성 혈구 계측법은 표적 Ag와 반응하는 Ig 성분을 발현하는 효모 세포들을 선별하는데 사용될 수 있다. 일단 파지 또는 효모 전시에 의해 동정되면, 발현된 중쇄 및/또는 경쇄 V 영역 유전자들은 회수되고 전장 중쇄 및/또는 경쇄 발현 벡터에 삽입된다. 이와 같은 벡터들로 형질 감염된 숙주 세포의 배양으로, 다량의 mAb가 생산될 수 있게 한다.

파지 또는 효모 전시 기술의 주요 이점은, 무려 1천억개나 되는 개별 V 영역들을 통합한 대형 라이브러리가 Ag 반응성에 대해 스크리닝될 수 있다는 점이다. 이러한 기술의 단점은, 전시의 첫 라운드에서 분리된 V 영역들이 통상적으로 친화성이 매우 낮다는 점이다. 저 친화성 항체를 생성하는 일반적인 이유는 이러한 방법을 이용함으로써 (성숙한 고 친화성 항체를 생성하는) 결정적 초돌연변이 서열들을 제거하기 때문이다. 고 친화성 항체를 생산하는 B 림프구는 일반적으로 체세포 초돌연변이라 알려진 과정을 겪는다. 이 과정에서, 생식 세포 계열 암호화 V 영역 서열들은 유전자 돌연변이를 겪으므로, V 영역의 유전자 서열은 변형된다. 이는 실질적으로 소정의 항원에 대하여 친화성이 더 높은, “성숙한” V 영역 서열의 생산을 가져올 수 있다. 일반적으로, 체세포 초돌연변이는 항체 다양성과 고 친화성 항체를 생성하는데 있어서 근본적으로 중요한 현상이라는 것이 이해된다. 이러한 체세포 초돌연변이는 생식 세포 계열 게놈 서열에서는 볼 수 없으며, 오로지 특유한 B 림프구 클론에서만 나타난다.

파지 전시 접근법을 이용한 저 친화성 항체의 생성은 이 방법에 대한 주요 한계가 되어왔다. 이러한 난점은 실제로 상기 기술된 바와 같은 인간화된 마우스 및 시험관 내 체세포 초돌연변이를 비롯하여 다수의 기타 다른 복합적인 접근법들의 개발을 가져왔다. 인간의 항체들은, 이 항체들이 인간의 체내에서 관용성이 되도록 만들어주는 선별 과정을 거친다. 이러한 기술에서는 인간의 생체 내 선별 방법에 기반을 두지 않는 항체 서열을 이용하므로, 따라서 이러한 항체들은 사람의 체내에서 면역원성일 수 있다. 임의의 경우, 저 친화성 항체의 생산을 극복하는 것은 이러한 방법을 위한 주요 과제이었다.

파지 전시가 일반적으로 저 친화성 항체를 생성하는 이유는, 생식 세포 계열 V 영역 서열을 기반으로 하는 프라이머 서열의 이용을 수반하기 때문이다. 생식 세포 계열 서열을 기반으로 하는 V 영역 프라이머의 이용에 의해, (1) 프라이머와 초돌연변이 서열 간 미스매칭(mismatching)은 프라이머가 어닐링되지 못하게 하므로, 프라이머는 체세포 돌연변이 서열과 혼성화되지 못할 것이거나; 또는 (2) 프라이머와 초돌연변이 서열 간 미스매칭은 보존적이어서 어닐링은 일어나지만, 증폭은 내재하고 있던 초돌연변이 서열보다 오히려 프라이머에 의해 암호화되는 생식 세포 계열 서열의 반복 생산을 가져오는, 2가지의 가능한 결과가 존재한다. 상기 2가지의 경우 중 어느 하나에 있어서, 파지 전시 방법은 생식 세포 계열 V 영역 서열을 암호화하는 PCR 프라이머 서열을 이용하는 결정적 PCR 증폭 단계들을 포함하고, 이러한 프라이머들은 항체 V 영역 내부로부터 Ig 서열들을 증폭하므로, 생식 세포 계열 프라이머 서열을 이용하여 생성된 cDNA 라이브러리는 체세포 초돌연변이된 서열들의 전체 레파토리를 포함하지 않을 것이다. 추가로 그리고 중요하게도, 이러한 레파토리는 V 영역, 즉 생식 세포 계열 암호화 프라이머에 의해 암호화된 영역의 5’ 말단에 초돌연변이가 일어난 항체를 전혀 포함하지 않을 것이다.

다시 말해서, 생식 세포 계열 서열들을 기반으로 하는 프라이머의 이용으로 생식 세포 계열 V 영역 서열들을 반복해서 생산하고, 이로 인해서 프라이머 서열에 의해 암호화된 구역에서 초돌연변이를 없애게 된다. 따라서, 이러한 방법은 V 영역의 이러한 구역에서 초돌연변이를 체계적으로 제거하고, 초돌연변이된 항체 서열의 전반적인 손실을 가져온다. (Ag 특이성을 가지는 피험체의 전체 레파토리의 0.1%, 0.01%, 0.001%, 0.0001% 또는 0.00001% 미만의) 저 빈도 Ab의 경우, 파지 전시 시스템은 틀림없이 가장 적합한 것이므로, 고 친화성 mAb를 제조하는데 사용될 수 있는 V 영역 유전자들을 찾는 것은 모두 더 어려운 문제가 되었다.

본 발명은 친화성 성숙 인간 항체의 동정을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 Ag 특이적 Ig V 영역이 Ag 특이적 인간 mAb 또는 기타 다른 Ag 표적화 구조물을 제조하는데 이용될 수 있도록, 인간 Ab 레파토리에 낮은 빈도로 생성되는 이러한 V 영역을 동정하는 개선된 방법을 개발하는 것에 바탕을 두고 있다. 본 발명은 또한 더 완전한 V 영역 라이브러리, 특히 고 친화성 항체를 생성하기 위해 결정적 체세포 돌연변이를 포함하는 항체 서열을 암호화하는 라이브러리를 동정해낼 수 있게 한다.

이러한 개선된 방법의 개발은, 전통적인 파지 및 효모 전시 방법이 인간의 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC) 내 표적 Ag에 대하여 친화성이 큰 다수의 V 영역이 동정되지 않게 할 수 있다는 놀라운 발견에 바탕을 두었다. 전통적인 파지 및 효모 전시법에 있어서, PCR은 Ig의 중쇄 및/또는 경쇄의 V 영역에 상응하는 핵산 서열들을 증폭시키는데 사용된다. PCR 증폭 과정을 개시하는 정방향 프라이머는 각각의 V 영역의 5’ 생식 세포 계열 말단에 상보적인 핵산 서열을 가지므로, V 영역을 암호화하는 cDNA들은 증폭될 것이다.

Ab 다양성을 생성하는데 기여하는 몇 가지 과정들로 인해서, 성숙한 Ab들의 V 영역 아미노산 서열들은 생식 세포 계열 서열들과 서로 상이하다. 포유동물의 Ig 유전자 분절들은 가변(V) 엑손, 다양성(D) 엑손, 연접(J) 엑손 및 불변(C) 엑손 군에 배열된다. 인간 중쇄에 대한 DNA는 약 50개의 작용성 VH 분절, 약 30개의 DH 분절 및 약 6개의 JH 분절을 포함한다. 카파 사슬은 약 40개의 작용성 Vκ 분절, 약 5개의 Jκ 분절 및 약 1개의 Cκ 분절을 포함한다. 람다 사슬 DNA는 30개의 Vλ 분절, 그리고 Jλ 분절과 Cλ 분절을 각각 4개씩 포함한다. 접합부의 다양성은 유전자 분절들의 정확하지 않은 연결로 인하여 생성되며, 재조합 동안 주형이 아닌 뉴클레오티드들은 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제에 의해 이웃하는 유전자 분절들 사이에 부가될 수 있고, 상보성 결정 영역(CDR)의 일부가 될 수 있다. 이후, 조립된 V-D-J 분절들 또는 V-J 분절들은 단일 뉴클레오티드 치환부의 단계별 통합에 의해 다양화되어(체세포 초돌연변이), 항체의 다양성 및 친화성 성숙이 더 크게 이루어진다.

각각의 V 영역 중쇄 및 경쇄 상에 존재하는 3개의 CDR 영역들은 가장 많은 서열 다양성을 나타낸다. 이러한 다양성으로 인하여 이들 영역은 초가변 영역이라고도 칭하여진다. 중쇄 및 경쇄의 CDR 6개는 Ab의 Ag 결합 특이성을 결정하는데 있어서 결정적이다. 각각의 V 영역의 5’ 생식 세포 계열 말단은 초가변 영역 내에 존재하지 않으므로, 이 위치에서 생식 세포 계열 서열들을 향해 배향된 정방향 프라이머들을 이용하는 통상의 방법은 문제가 있다고 여겨지지 않는다. 그리고 실제로 고 빈도 인간 Ab 내에서 이러한 V 영역들을 동정함에 있어서 이러한 방법은 매우 유용한 것으로 판명되었다.

본 발명에 이르게 한 과정에서, 저 빈도 Ab를 동정하기 위한 시도들이 행하여졌다. 기술, 예를 들어 ELISA(효소 결합 면역 흡착 검정법)를 이용하여 원하는 특이성을 가지는 Ab들이 말초 혈액 샘플 중에서 동정될 수 있었지만, 이러한 샘플이 통상의 파지 전시 방법에 사용되었을 때 고 친화성 Ab들은 생성될 수 없었다. 이는 산업 분야에서의 일반적인 문제이고, V 영역들의 조합형 라이브러리를 제조하기 위하여 돌연변이를 만드는 복합적 시험관 내 방법이 개발되었다. 이러한 방법들은 어렵고 노력이 많이 드는 것이지만, 원래의 인간 서열들을 보유하는 항체들을 반드시 만들어내야 하는 것은 아니다.

본 발명은, 파지 시스템이 저 빈도 항체들을 위하여 친화성이 높은 항체들을 생성하지 못하는 원인을 찾아내는 것으로부터 기인한다. (a) V 영역 5’ 말단의 아미노산 서열에서 생식 세포 계열로부터 멀리 떨어진 곳에서의 돌연변이 발생률 상당하고, (b) CDR 외부에 존재하는 V 영역 구획 내에서 일어난 2회의 아미노산 치환은 Ag에 대한 Ab의 친화성에 상당한 영향을 미친다는 것을 나타내는, 선행 실험들을 고려하였을 때, 놀랍게도 5’ 생식 세포 계열 말단 서열에 대한 프라이머를 이용하여 V 영역 서열들을 증폭시키는 통상의 방법이 자체의 5’ 말단부에 돌연변이가 일어난 V 영역들 대다수를 손실한 라이브러리를 생성하고, 또한 PCR 과정 동안 이러한 구역 내에 서열 오류(sequence error)를 도입한다는 것을 인식하였다. 심지어 엄중한 PCR 조건 하에서 조차도, 생식 세포 계열 서열 프라이머들은 체세포 돌연변이들 중 일부를 포함하는 V 영역들과 상호 혼성화된다. 따라서 프라이머가 V 영역들을 증폭시킬 때, 이 프라이머는 cDNA에서 생식 세포 계열 서열을 반복적으로 생성한다. 따라서, 진정 고 친화성 V 영역의 체세포 초돌연변이는 손실될 것이다. 중요하게도, 상기 체세포 초돌연변이는, 친화성이 가장 높은 Ab에 포함되어 있을 것으로 예상될 V 영역들을 결실하는 것이라는 점도 인식되었다. V 영역 내 처음 10개의 아미노산들은 체세포 초돌연변이들을 포함할 수 있으며 종종 포함하기도 한다. 이러한 영역 내에서의 단일 아미노산 변화는 항체의 결합에 영향을 미칠 수 있다.

5’ V 영역 서열에 대한 PCR 프라이머를 이용하여 V 영역들을 증폭시키는 방법이 아닌 본원에 개시된 혁신적인 접근법에 있어서, V 영역들은 리더 서열 특이적 정방향 프라이머를 이용하여 증폭된다. 리더 서열은 단지 V 영역 유전자들의 바로 상류에 있으므로, 5’ 말단에 돌연변이가 있는 V 영역 서열들을 포함하여 모든 V 영역 서열들은 증폭된다. 그러므로, 생성된 라이브러리는 (체세포 초돌연변이된 V 영역 서열들 모두의 손실을 가져오는) 통상의 방법에 의해 제조된 V 영역 레파토리보다 더 완전한 V 영역 레파토리를 포함한다. 따라서, 체세포 돌연변이된 저 빈도 V 영역들을 분리하는 것이 가능하다. 역방향 프라이머는, Ig 이소타입의 모든 종속 군들(예를 들어, 감마, 뮤, 알파, 카파, 람다 등), 또는 중쇄의 개별 종속 군들(예를 들어, 감마3 또는 감마4)을 증폭시켜 더 집약된 라이브러리를 가질 수 있게 하는 것으로 선택될 수 있다.

리더 서열 프라이머를 이용하여 증폭된 V 영역 핵산의 발현으로, V 영역 단백질 생성물 내에 리더 펩티드가 포함되게 된다. 이러한 핵산들을 발현하기 위해 포유동물 세포, 예를 들어 CHO 세포가 사용될 때, 내생적 번역후 가공 기작은 리더 펩티드를 제거하게 되어, Ag 결합 스크리닝 검정법을 방해하는 리더 펩티드들을 포함하지 않는 V 영역 또는 다중 V 영역(예를 들어, 중쇄 및 경쇄) 구조물의 발현을 가능하게 한다. 그러나, 박테리아 파지 전시 기술에 있어서, 리더 펩티드들은 제거되지 않는다. 리더 펩티드의 존재는 Ag 결합 스크리닝 검정법을 간섭할 수 있으므로, 이에 의하여 표적 Ag에 대한 친화성이 높은 V 영역들의 검출을 방지한다.

이러한 문제점을 극복하기 위해서, 본 발명은 또한 통상의 5’ V 영역 프라이머 세트보다 크기가 더 큰 프라이머 세트를 이용하여 제조된 제2 V 영역 라이브러리의 제조 방법을 제공한다(“제2 단계”증폭법). 이러한 크기가 더 큰 프라이머 세트는 전통적인 프라이머 세트를 이용하여 증폭되는 수에 비하여 더 많은 수의 V 영역 서열들이 증폭될 수 있게 한다. 물론 이러한 프라이머는 체세포 돌연변이된 서열이 아닌 생식 세포 계열 서열들을 증폭하도록 설계되므로, 프라이머 자체는 증폭 생성물에 서열 오류(sequence error)를 도입시킬 것이다(즉, 체세포 돌연변이는 제거되고, 생식 세포 계열 서열들로 치환됨). scFv 발현 파지에서 표적 Ag와 결합하는 V 영역들을 분리하는데 파지 전시법이 사용된 다음, 동정된 V 영역들을 암호화하는 핵산들이 서열 결정된다. 서열 정보를 이용함으로써 이러한 핵산들을 특이적으로 증폭시키는 역방향 프라이머들이 제조되고, 이 역방향 프라이머들은 제1 라이브러리로부터 V 영역들을 증폭시키도록 리더 서열 정방향 프라이머와 함께 사용되어, 제1 라이브러리가 제조된 공여체에서 나타나는 Ag 특이적 V 영역들의 실질적이면서 완전한 (체세포 초돌연변이된) 서열들을 동정한다.

상기한 바 이외에도, (예를 들어, G 단백질 크로마토그래피를 이용한 이후 Ag 친화성 크로마토그래피를 수행하여) 혈장 IgG를 분리하는, 단백질체학적 접근법이 또한 사용된다. 생성된 Ag 특이적 IgG 혼합체는 모세관 등전점 전기 영동법에 의해 추가로 분리된다. 이후, IgG는 프로테아제로 분해되고, 펩티드 단편 아미노산 서열들은 질량 분광 분석법(MS)에 의해 결정된다. 제2 단계 증폭법이 적절한 체세포 초돌연변이 V 영역 서열들을 생성하는데 실패하는 경우(즉, V 영역 생식 세포 계열 프라이머가, 제1 라운드 증폭으로부터 유래하는 체세포 돌연변이 서열을 포함하였던 원하는 5’ V 영역 서열과 상호 혼성화/어닐링되는데 실패함), 분리된 Ag 특이적 IgG의 새로 얻어진 서열 결정 정보는 제1 라운드 cDNA의 V 영역 생성물의 핵산 서열 결정을 수행하는데 사용될 수 있다. 구체적으로, MS 신규 단백질 서열 결정법으로부터의 일부 서열 결정 데이터는 V 영역 역방향 프라이머를 설계하는데 사용된다. 이러한 역 프라이머는 리더 서열 정방향 프라이머와 함께 사용될 수 있어, V 영역의 5’ 말단을 동정 및 서열 결정할 수 있다. 일단 이러한 초돌연변이된 영역들이 동정되면, 통상의 PCR을 이용하여 완전한 V 영역 서열들이 증폭될 수 있다. 이후, 이러한 V 영역들은 체세포 초돌연변이된 완전 항체로 조립될 수 있다. MS 펩티드 서열 정보는 또한 Ag 특이적 V 영역들이 라이브러리 스크리닝 방법으로 올바르게 동정되었음을 확인하는데 사용될 수도 있다.

따라서, 본 발명은 인간 면역 글로불린의 V 영역을 암호화하는 핵산을 증폭하기 위한 리더 특이적 프라이머를 제공하는 것을 특징으로 한다. 본 프라이머는 (a) 엄중한 혼성화 조건 하에서 서열 번호 1 내지 서열 번호 76의 서열로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열의 상보체에 결합하는 핵산 서열, 또는 (b) 서열 번호 1 내지 서열 번호 76의 서열로부터 선택되는 핵산 서열을 포함할 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 인간의 조직(예를 들어, 말초 혈액) 샘플 중 인간 면역 글로불린의 V 영역을 암호화하는 핵산의 90% 이상(예를 들어 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상)을 증폭시키기 위한 리더 특이적 프라이머 세트를 제공하는 것을 특징으로 한다. 상기 세트는 인간 조직 샘플 중 인간 면역 글로불린의 V 영역을 암호화하는 핵산의 100%를 증폭시키는 것일 수 있다. 상기 세트는 50개 이상의 상이한 프라이머를 포함할 수 있으며, 상이한 프라이머들은 각각 상이한 핵산 서열, 예를 들어 서열 번호 1 내지 서열 번호 76의 서열을 포함할 수 있다. 상기 세트는 또한 32개 이상의 상이한 프라이머를 포함할 수도 있으며, 상이한 프라이머들은 각각 상이한 핵산 서열, 예를 들어 서열 번호 1 내지 서열 번호 32의 서열을 포함할 수 있다. 상기 세트는 15개 이상의 상이한 프라이머를 포함할 수 있으며, 상이한 프라이머들은 각각 상이한 핵산 서열, 예를 들어 서열 번호 33 내지 서열 번호 48의 서열을 포함할 수 있다. 상기 세트는 27개 이상의 상이한 프라이머를 포함할 수 있으며, 상이한 프라이머들은 각각 상이한 핵산 서열, 예를 들어 서열 번호 49 내지 서열 번호 76의 서열을 포함할 수 있다.

본 발명에는 또한 가변 영역의 처음 8개 아미노산에 체세포 초돌연변이가 있는 면역 글로불린 중쇄를 암호화하는 핵산 분자를 10⁵개 이상(예를 들어, 10⁵개, 10⁶개 또는 10⁷개 이상) 포함하는 파지 라이브러리가 속한다.

본 발명은 리더 특이적 프라이머를 이용하여 인간 피험체로부터 분리된 B 림프구를 PCR 증폭함으로써 분리되는, 가변 영역 암호화 핵산 서열을 포함하는 파지 전시 라이브러리를 스크리닝함으로써 결정된 가변 영역 서열을 포함하는 정제된 항체를 추가로 포함한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 (a) B 림프구를 포함하는 인간 조직 샘플로부터 인간 면역 글로불린의 중쇄 및 경쇄 뉴클레오티드 서열들을 증폭하기 위해 제1 PCR을 이용하는 단계(여기서, 리더 특이적 특이적 프라이머가 PCR 증폭에 사용됨); (b) 제1 PCR 단계로부터 증폭 생성물을 분리하는 단계; (c) 제1 PCR 단계로부터 분리된 증폭 생성물을 발현 벡터에 삽입함으로써 구조물의 제1 세트를 제조하는 단계; 및 (d) 구조물 제1 세트를 숙주 세포 제1 세트에 도입하여, 인간 면역 글로불린 뉴클레오티드 서열의 제1 라이브러리를 제조하는 단계를 포함하는 방법을 제공하는 것을 특징으로 한다. 이러한 방법에 있어서, 리더 특이적 프라이머는 상이한 폴리뉴클레오티드 세트를 포함할 수 있으며, 상기 프라이머는 각각 엄중한 혼성화 조건 하에서 서열 번호 1 내지 서열 번호 76의 서열들로 이루어진 군으로부터 선택되는 상이한 핵산 서열의 상보체와 결합한다. 본 방법은 또한, (e) 제1 라이브러리 또는 인간 조직 샘플로부터 인간 면역 글로불린 뉴클레오티드 서열을 증폭하기 위해 제2 PCR을 이용하는 단계(여기서, 가변 영역 특이적 특이적 프라이머가 PCR 증폭에 사용됨); (f) 제2 PCR 단계로부터 증폭 생성물의 제2 세트를 분리하는 단계; (g) 분리된 증폭 생성물의 제2 세트를 발현 벡터에 삽입함으로써 구조물의 제2 세트를 제조하는 단계; (h) 구조물의 제2 세트를 숙주 세포의 제2 세트에 도입하여 인간 면역 글로불린 뉴클레오티드 서열의 제2 라이브러리를 제조하는 단계; (i) 제2 라이브러리를, 표적 항원과 특이적으로 결합하는 가변 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 대해 스크리닝하는 단계; (j) 표적 항원과 특이적으로 결합하는 가변 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 서열을 구하는 단계; (k) 구하여진 서열 정보를 이용하여, 표적 항원과 특이적으로 결합하는 가변 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 특이적인 역방향 프라이머를 생성하는 단계; 및 (l) 제3 PCR에서 역방향 프라이머와 리더 특이적 프라이머를 이용하여, 표적 항원과 면역 글로불린의 결합을 촉진시키는, 인간 조직 샘플 중 B 림프구에서 면역 글로불린의 서열에 상응하는 제1 라이브러리 유래 뉴클레오티드 서열을 증폭시키는 단계 중 하나 이상의 단계들을 포함할 수 있다. 단백질체학도 또한 본원에 기술된 본 발명의 방법에 이용될 수 있다.

추가적으로, 본 발명에는 체세포 초돌연변이된 V 영역 서열의 완전한 세트를 포함하는 인간 면역 글로불린 cDNA 라이브러리가 속한다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에 이용된 모든 기술 용어들은 본 발명이 속한 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로 이해되는 생물학적 용어의 정의들은 문헌[Rieger et al., Glossary of Genetics: Classical and Molecular, 5th edition, Springer-Verlag: New York, 1991]; 및 [Lewin, Genes V, Oxford University Press: New York, 1994]에서 찾아보 수 있다. 일반적으로 이해되는 의학 용어의 정의들은 문헌[Stedman’s Medical Dictionary, 27^th Edition, Lippincott, Williams & Wilkins, 2000]에서 찾아볼 수 있다.

본원에 사용된 “항체” 또는 “Ab”는, 면역 글로불린(Ig), 동일 또는 이종 Ig의 용액 또는 Ig의 혼합체이다. “항체”는 또한 Ig의 단편들 및 항원 특이성을 부여하도록 조작된 Ig의 형태, 예를 들어 Fab, Fab’및 F(ab’)₂ 단편; 및 scFv’, 이종 접합 Ab, 그리고 Ig 유래 CDR을 이용하는 유사 인공 분자를 말할 수 있다. “모노클로날 항체” 또는 “mAb”는, 특정 항원의 특정 에피토프와 면역 반응할 수 있는 항원 결합 위치를 한 가지 종류만 함유하는 Ab 분자군 또는 하나의 클론성 B 세포주에 의해 발현되는 Ab이다. “폴리클로날 항체” 또는 “폴리클로날 Ab”는 이종 Ab들의 혼합체이다. 통상적으로 폴리클로날 Ab는 무수히 많은 상이한, 항원의 상이한 에피토프와 면역 반응하는 상이한 Ab들 중 적어도 일부를 가지는, 특정 항원과 결합하는 Ab 분자들을 포함할 것이다. 본원에 사용된 폴리클로날 Ab는 2개 이상의 mAb의 혼합체일 수 있다.

Ab의 “항원 결합부”는 Ab의 Fab부의 가변 영역 내에 포함되며, Ab에 항원 특이성을 부여하는 Ab의 일부(즉, 통상적으로 Ab의 중쇄 및 경쇄의 CDR에 의해 형성되는 3차원 포켓)이다. “Fab부” 또는 “Fab 영역”은 Ig의 항원 결합부를 포함하는 파파인 분해 Ig의 단백 분해 단편이다. “비Fab부”는 Fab부에 포함되지 않는 Ab의 일부, 예를 들어 “Fc부” 또는 “Fc 영역”이다. Ab의 “불변 영역”은 가변 영역의 외부에 존재하는 Ab의 일부이다.

단백질 분자, 예를 들어 Ab를 나타낼 때, “정제된”이란 천연적으로 이와 같은 분자가 동반되는 성분들로부터 분리된 상태를 의미한다. 통상적으로 Ab 또는 단백질은, 이것의 약 10중량% 이상(예를 들어 9%, 10%, 20%, 30% 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.9% 및 100%)이 천연 상태에서 결합되어 존재하는 비 Ab 단백질들 또는 기타 다른 천연 생성되는 유기 분자들로부터 분리되어 존재할 때, 정제된 것이다. 순도는 임의의 적절한 방법, 예를 들어 컬럼 크로마토그래피, 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동 또는 HPLC 분석에 의해 측정될 수 있다. 화학 합성된 단백질 또는 천연 상태에서 원래 단백질을 생산하는 세포류 이외의 세포류에서 생산된 기타 다른 재조합 단백질은“정제된”것이다.

“결합하다”, “결합한다” 또는 “~와 반응하다”란, 하나의 분자가 샘플 중 제2의 특정 분자를 인지하고 이에 부착되지만, 샘플 중 기타 다른 분자들은 실질적으로 인지하지 않거나 이것들에 부착되지 않는 경우를 의미한다. 일반적으로 다른 분자와 “특이적으로 결합”하는 Ab는 K_d가, 기타 다른 분자에 대하여 약 10⁵리터/몰, 10⁶리터/몰, 10⁷리터/몰, 10⁸리터/몰, 10⁹리터/몰, 10¹⁰리터/몰, 10¹¹리터/몰 또는 10¹²리터/몰 정도 더 크다.

핵산 및 아미노산에 관하여 본원에 사용된 “서열 동일성%”란 용어는, 2개의 정렬된 서열들 간 정확히 매칭되는 부분들의 수를 길이가 더 짧은 서열들의 길이로 나누고, 이를 다시 100으로 곱한 결과를 의미한다. 핵산 서열의 정렬은 문헌[Smith 및 Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981)]에 기술된 바와 같이 실행될 수 있으며, 아미노산 서열에 대해서는 문헌[Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M. O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USA], 및 [Gribskov (1986) Nucl. Acids Res. 14:6745]에 기술된 바와 같이 실행될 수 있다. 2개의 DNA 서열들 또는 2개의 폴리펩티드 서열들은, 이 서열들이 상기 방법을 이용하여 측정되는 바와 같이 한정된 길이의 분자에 대해서 약 80% 내지 85%이상, 약 85% 내지 90% 이상, 약 90% 내지 95% 이상, 또는 약 95% 내지 98% 이상의 서열 동일성을 나타낼 때 서로 “실질적으로 상동성”이다. 또한 본원에 사용된 “실질적으로 상동성”이란, 지정된 DNA 또는 폴리펩티드 서열에 대해서 완전한 동일성을 나타내는 서열을 말한다. 실질적으로 상동성인 DNA 서열들은, 예를 들어 특정 시스템에 대해 한정된 엄중한 조건 하에서 서던 혼성화 실험으로 동정될 수 있다. 적절한 혼성화 조건을 한정하는 것은 당업자의 이해 범위 내에 있다. 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.]; [Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, editors B. D. Hames and S. J. Higgins, (1985) Oxford; Washington, D.C.; IRL Press]을 참조한다.

본원에 사용된 “엄중한 혼성화 조건”이란 용어는, 45℃, 6× 염화나트륨/시트르산나트륨(SSC)에서의 세정 후, 60℃ 이상, 0.2× SSC, 0.1% SDS에서의 세정을 의미한다.

적당한 방법 및 재료가 이하에 기술되어 있지만, 본원에 기술된 방법 및 재료와 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 본 발명을 실시 또는 테스트하는데 이용될 수 있다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 다른 참고 문헌들은 본원에 전체가 참조로 포함되어 있다. 분쟁이 있을 경우, 용어의 정의를 포함하여 본원의 명세서가 우선할 것이다. 추가적으로, 이하 논의된 특정 구체예들은 오로지 예시적인 것일 뿐 한정적인 것으로 의도되지 않는다.

도 1은, 본 발명의 중쇄 PCR 증폭 전략에서 한 단계를 개략적으로 예시한 것이다.
도 2는, 본 발명의 중쇄 PCR 증폭 전략에서 또 다른 단계를 개략적으로 예시한 것이다.
도 3은, 본 발명의 경쇄 PCR 증폭 전략에서 한 단계를 개략적으로 예시한 것이다.
도 4는, 본 발명의 경쇄 PCR 증폭 전략에서 또 다른 단계를 개략적으로 예시한 것이다.
도 5는, 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역 중 어느 하나의 상류의 리더 펩티드의 존재는 ScFv 단편이 이 자체의 항원과 결합하는 것을 억제하였음을 나타내는 그래프이다. 중쇄 상에 리더를 포함하는 ScFv 단편(LC-LHC), 경쇄 상에 리더를 포함하는 ScFv 단편(LLC-HC), 그리고 중쇄와 경쇄 상에 리더를 포함하는 ScFv 단편(LLC-LHC)은, 리더를 포함하지 않는 ScFv 단편(LC-HC)의 경우와 비교하였을 때 항원에 대한 결합성을 감소시킨다.

본 발명은 체세포 초돌연변이를 포함하는 인간 항체 서열의 동정과 관련된 방법, 조성물 및 키트를 포함한다. 이하 기술된 바람직한 구체예들은 이러한 방법, 조성물 및 키트의 응용예를 예시한다. 그럼에도 불구하고, 이러한 구체예들의 설명으로부터 본 발명의 기타 다른 양태들이 이하 제공된 상세한 설명을 기반으로 수행될 수 있고/있거나 실시될 수 있다.

일반적 방법론

통상의 면역학적 기술 및 분자 생물학적 기술을 수반하는 방법들이 본원에 기술되어 있다. 면역학적 방법(예를 들어, 항원-Ab 복합체를 검출 및 국소화하기 위한 검정법, 면역 침전법, 면역 블롯팅 등)은 일반적으로 당업계에 공지되어 있으며, 방법에 관한 학술 논문, 예를 들어 문헌[Current Protocols in Immunology, Coligan et al., ed., John Wiley & Sons, New York]에 기술되어 있다. 분자 생물학적 기술은 학술 논문, 예를 들어 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, Sambrook et al., ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001]; 및 [Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., ed., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York]에 상세히 기술되어 있다. Ab 방법들은 문헌[Handbook of Therapeutic Abs, Dubel, S., ed., Wiley-VCH, 2007]에 기술되어 있다.

개관

Ag 특이적 Ig V 영역을 동정하기 위한 전통적인 파지 및 효모 전시 방법에 있어서, PCR은 Ig의 중쇄 및/또는 경쇄의 V 영역들에 상응하는 핵산 서열들을 증폭시키는데 사용된다. PCR 증폭 과정을 개시하는 정방향 프라이머는 각각의 V 영역의 5’ 생식 세포 계열 말단부의 상보체인 핵산 서열을 가지므로, V 영역들을 암호화하는 cDNA들은 증폭될 것이다. 체세포 초돌연변이로 인해 5’ V 유전자 분절이 생식 세포 계열과 상이한 경우, 이러한 PCR 방법은 5’ 생식 세포 계열 서열을 가지는 생성물을 우선적으로 증폭하여, 파지 및 효모 전시 라이브러리에 있어서 다양성의 손실로 이어진다.

본 발명의 하나의 양태에서, V 영역들은 리더 서열 특이적 정방향 프라이머를 이용함으로써 증폭된다. 리더 서열은 단지 V 영역 유전자들의 상류이므로, 예를 들어 광범위한 5’ 말단 돌연변이를 가지는 V 영역 서열들을 비롯한 모든 V 영역 서열들은 원래의 5’ V 유전자 분절 서열을 잃지 않으면서 증폭된다. 그러므로, 이러한 방법으로 제조된 라이브러리들은 통상의 방법에 의해 제조된 라이브러리보다 더 완전한 V 영역 레퍼토리를 포함한다. 이러한 라이브러리들은 증폭된 V 영역 암호화 핵산을 발현하도록 조작된 포유동물 세포를 이용하여 Ag 특이적 V 영역들에 대해 스크리닝될 수 있다. 내생적 번역후 가공 기작은 리더 펩티드를 제거하게 되어, Ag 결합 스크리닝 검정법을 방해하는 리더 펩티드를 포함하지 않는 V 영역 또는 다중 V 영역(예를 들어, 중쇄 및 경쇄) 구조물의 발현을 가능하게 한다. 박테리아 파지 전시 기술에 있어서 리더 펩티드가 Ag 결합 스크리닝 검정법을 간섭할 수 있을 경우, 본 발명은 또한 5’ V 영역 프라이머의 통상적인 세트보다 크기가 더 큰 프라이머 세트를 이용하여 제조된 제2의 V 영역 라이브러리의 제조를 제공한다. 이와 같이 크기가 더 큰 프라이머 세트는, 전통적인 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 수에 비하여 더 많은 수의 V 영역 서열들이 증폭될 수 있게 하지만, 상기 기술된 바와 같이, 크기가 더 큰 프라이머 세트는 서열 오류들이 증폭 생성물에 도입되게 한다. 파지 전시법은, 표적 Ag와 고 친화도로 결합하는 scFv 내 V 영역들을 스크리닝하는데 사용된다. 그 다음, 동정된 V 영역들을 암호화하는 핵산은 서열 결정되고, 서열 정보를 이용하여 상기 핵산들을 특이적으로 증폭시키는 역방향 프라이머가 제조되며, 이 역방향 프라이머는 리더 서열 정방향 프라이머와 함께 사용되어, 제1 라이브러리로부터 V 영역을 증폭할 수 있고, 그 결과 제1 라이브러리가 제조되었던 공여체에 생기는 Ag 특이적 V 영역들의 실질적이면서 완전한 서열들을 동정한다. 공여체 Ig의 단편으로부터 얻어진 아미노산 서열 정보는, 공여체 Ab들의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 핵산을 동정하는 것을 돕는데 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 이와 같은 핵산들을 증폭하기 위한 PCR 프라이머들을 설계하는데에도 이용될 수 있다.

PCR 프라이머

본 발명의 하나의 양태는 자체의 리더 서열들을 암호화하는 뉴클레오티드들로부터 중쇄 및 경쇄 인간 Ig V 영역들을 증폭시키기 위한 정방향 PCR 프라이머들을 포함한다. 이러한 서열들을 100% 증폭시키는데 사용될 수 있는 이와 같은 프라이머 세트(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개 또는 이 이상의 프라이머들로 이루어진 세트)는 저 빈도 V 영역들을 포착하는데 바람직하지만, 이러한 서열들을 100% 미만(예를 들어, 70% 내지 99%, 70% 내지 75%, 75% 내지 80%, 80% 내지 85%, 85% 내지 90%, 90% 내지 95% 또는 95% 내지 99%) 포착하는 프라이머 세트도 또한 이용될 수 있다. 이러한 프라이머 세트의 일례가 이하 표 1A, 표 1B 및 표 1C에 제시되어 있다. 리더 서열은 단지 V 영역 유전자의 상류이므로, 이러한 프라이머 세트(또는 이하 표 1A, 표 1B 및 표 1C에 제시된 프라이머들과 실질적으로 상동성인 프라이머들을 포함하는 프라이머 세트) 및 적절한 역방향 프라이머를 이용함으로써 광범위한 5’ 말단 돌연변이를 포함하는 V 영역 서열을 비롯한 모든 V 영역 서열들이 증폭될 수 있다.

[표 1A]

중쇄 리더 정방향 프라이머

[표 1B]

카파 사슬 리더 정방향 프라이머

[표 1C]

람다 사슬 리더 정방향 프라이머

본 발명의 다른 양태에서, V 영역 PCR 프라이머 세트는 중쇄 및 경쇄 Ig 가변 영역들을 암호화하는 핵산을 증폭시키는데 이용될 수 있다. 이와 같은 프라이머들의 바람직한 세트들은 전통적인 프라이머 세트를 이용하여 증폭되는 수에 비하여 더 많은 수의 V 영역 서열이 증폭될 수 있도록 하는 것들이다. 이러한 서열들을 100% 증폭시키는데 이용될 수 있는 이와 같은 프라이머의 세트는 저 빈도 V 영역들을 포착하는 것이 바람직하지만, 이러한 서열들을 100% 미만(예를 들어, 70% 내지 99%, 70% 내지 75%, 75% 내지 80%, 80% 내지 85%, 85% 내지 90%, 90% 내지 95% 또는 95% 내지 99%) 포착하는 프라이머 세트도 이용될 수 있다. 이와 같은 프라이머 세트의 예들이 이하 표 2 및 3에 제시되어 있다. 이러한 프라이머 세트(또는 이하 표 2 및 3에 제시된 프라이머들과 실질적으로 상동성인 프라이머들을 포함하는 프라이머 세트) 및 적절한 역방향 프라이머를 이용함으로써, PCR 과정으로 초돌연변이된 5’ V 영역들을 포함하는 사슬들에 오류(본원에 기술된 바와 같이 교정될 수 있음)를 도입하지만, 전부는 아닐지라도 대부분의 V 영역 서열들이 PCR에 의해 증폭될 수 있다. scFv를 생성함에 있어서, 본원에 기술된 정방향 프라이머들은 각각 길이가 긴 링크 서열 GGTGGTTCCTCTAGATCTTCCTCCTCTGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGG[서열 번호 176]과 같은 적절한 링커 서열들(중쇄 증폭용 프라이머 서열에 대해 5' 위치에 위치하여 표 2의 아래에 나타낸 서열 번호 99의 적당한 역방향 프라이머와 함께 사용될 수 있음), 또는 서열 번호 142 내지 서열 번호 175에 제시된 프라이머 서열들의 상류에 나타낸 링커들(상응하는 역방향 프라이머, 예를 들어 서열 번호 114, 서열 번호 133 및 서열 번호 134의 서열들과 함께 사용됨)을 포함하도록 조작될 수 있다.

[표 2]

[표 3A]

카파 사슬[주: R은 해당 위치에 존재하는 A 또는 G를 나타내고; Y는 해당 위치에 존재하는 C 또는 T를 나타내며; M은 해당 위치에 존재하는 A 또는 C를 나타내고; S는 해당 위치에 존재하는 G 또는 C를 나타냄]

[표 3B]

람다 사슬

본 발명은 또한 V 영역을 암호화하는 뉴클레오티드의 3’ 말단에 위치하는 서열(예를 들어, 힌지 영역 또는 불변 영역을 암호화하는 핵산 서열)로부터 중쇄 및 경쇄 인간 Ig V 영역들을 증폭시키기 위한 역방향 PCR 프라이머 세트를 포함할 수도 있다. 역방향 프라이머는 Ig 이소타입의 모든 종속 군들(예를 들어, 감마, 뮤, 알파, 엡실론, 카파, 람다 등) 또는 중쇄의 개별 종속 군들(예를 들어, 감마1, 감마2, 감마3, 감마4, 알파1 및 알파2)의 증폭으로 더 집약된 라이브러리들을 가질 수 있게 하도록 선택될 수 있다. 이와 같은 역방향 프라이머의 특정 서열들은 Ig 이소타입의 공개된 서열들을 바탕으로 당업자에 의해 결정될 수 있다. 대표적인 예들이 이하 표 4에 나타내어져 있다.

[표 4]

비록 상기한 특이적 프라이머들이 바람직하지만, PCR 증폭에 이용되는 혼성화 조건 또는 엄중한 혼성화 조건 하에서 본원에 제시된 특이적 서열들의 상보체에 혼성화되는 기타 다른 프라이머들도 또한 이용될 수 있다. 예를 들어, 엄중한 혼성화 조건 하에서 본원에 제시된 특이적 서열의 상보체와의 서열 동일성이 75% 이상인(예를 들어, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상인) 프라이머들은 실질적으로 상기 상보체와 상동성이고/상동성이거나 상기 상보체와 결합한다. 이러한 프라이머들의 길이는 약 15개 내지 100개, 17개 내지 50개, 18개 내지 40개 또는 20개 내지 30개 뉴클레오티드(±5개 뉴클레오티드)의 범위일 수 있다.

V 영역 라이브러리

PCR로 상기한 프라이머들을 이용하여 제조된 중쇄 및 경쇄 Ig 증폭 생성물은 V 영역 라이브러리를 제조하는데 이용될 수 있다. 예를 들어, Ig 사슬들을 암호화하는 핵산들은 벡터에 삽입될 수 있으며, 생성된 구조물들은 숙주 세포(예를 들어, 원핵 생물 세포, 예를 들어 박테리아 또는 진핵 생물 세포, 예를 들어 효모 또는 포유동물 세포)에 도입되어 라이브러리를 제조할 수 있다.

일례로서, 천연 생성되는 Ig들을 암호화하는 핵산들은 B 림프구들을 함유하는 공여체 샘플(예를 들어, 말초 혈액 단핵구 세포, 분리된 B 세포 또는 혈장 세포, 버피코트, 골수, 림프 소절, 비장 또는 CNS 샘플)로부터 얻어질 수 있다. 통상적으로 샘플들은, 관심 있는 표적 Ag에 특이적인 Ab를 보유하는 것으로 (예를 들어, ELISA나 RIA에 의해) 사전에 결정된 인간 공여체로부터 구하여진다. 자기 Ag에 대한 Ab를 동정함에 있어서 바람직한 공여체는 (예를 들어, 인터페론 감마, 종양 괴사 인자 알파, 인터루킨 4 및 인터루킨 10, GM-CSF, 에리스로포이에틴, IL-6, IL-17, IL-22, 인터페론-α, 인터페론-β, IL-2, IL-8, 혈관 내피 성장 인자 및/또는 과립구-콜로니 자극 인자에 대한) 사이토카인 특이적 자기 항체들을 가지는 개체와, 자가 면역성 질환, 예를 들어 류머티즘성 관절염 또는 루푸스가 있는 개체이다.

하나의 방법에서, 전체 RNA는 이러한 세포들로부터 추출되어 폴리A 프라이머를 이용하여 역 전사된다. 생성된 cDNA는 상기 기술된 프라이머를 이용하는 PCR 증폭용 주형, 그리고 적당한 PCR 전략, 예를 들어 이하 실시예에 기술된 주형으로서 사용된다. 적당한 크기를 가지는 PCR 생성물들은 아가로스 겔 상에서 가시화된 다음, 절개되고 나서, 정제될 수 있다. 이후, 정제된 생성물들은 적당한 제한 효소(예를 들어, NotI 또는 NcoI(V 중쇄용), 그리고 SfiI 또는 SalI(V 경쇄용))로 분해될 수 있다. 분해된 단편들은 다시 겔 정제된 다음, 리가제(예를 들어, T4 DNA 리가제)에 의해 벡터(예를 들어, 사전에 NotI/NcoI 또는 SfiI/SalI 중 어느 하나에 의해 선형화된 파지미드 벡터)로 결찰될 수 있다. 결찰된 생성물들은 수용성(competent) 숙주 세포(예를 들어, 이.콜라이(E.coli))에 전기 천공되어 삽입될 수 있어, 중쇄 및 경쇄 라이브러리를 제조할 수 있다. 이소타입 특이적 라이브러리 및 종속 군 특이적 라이브러리는 이 이소타입 또는 종속 군들에 특이적인 역방향 프라이머를 이용하여 제조될 수 있다.

전시 라이브러리

중쇄 및 경쇄 라이브러리는, 중쇄 및 경쇄를 포함하는 Fab, scFv 또는 기타 다른 Ab 유사 구조물을 전시하는 세포의 기타 다른 라이브러리를 제조하는데 이용될 수 있다. 이와 같은 라이브러리는, 상기 기술된 방법에 의해 중쇄 및 경쇄 암호화 핵산들을 분리하거나 또는 기존의 V 영역 라이브러리로부터 이러한 핵산들을 재정제함으로써 제조될 수 있다. 분리된 중쇄 및 경쇄 암호화 핵산을 적당한 벡터에 삽입하고, 이러한 구조물을 숙주 세포 내에서 발현시킴으로써, 중쇄 및 경쇄의 조합체는 Ag 결합성에 대해 평가될 수 있고/있거나 다수의 선별 라운드를 거쳐 고 친화도로 표적 Ag와 결합하는 중쇄 및 경쇄의 조합체를 동정할 수 있다. 이러한 조합체들은 서열 결정에 의해 특징지어질 수 있다. 예를 들어, 문헌[Clackson et al., Nature 352:624-628, 1991]; [McCafferty et al., Nature 348:552-554, 1990]; 및 [Kang et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. 88:4363-4366, 1991]을 참조한다.

scFv 라이브러리를 제조함에 있어서, 증폭된 VH와 VL 유전자들은 아가로스 상에서 겔 정제되며, scFv 유전자들은 VH 및 VL 단편들을 주형으로서 이용하는 중첩 PCR(overlap PCR)에 의해 조립된다. 우선, VH 및 VL은 PCR에 의해 링커와 함께 조립되는데, 이때 프라이머는 사용되지 않으며, 링커의 말단부에 있으면서 상보성을 가지는 짧은 영역은 다양한 단편들의 혼성화를 촉진한다. 처음에는 프라이머 부재 하에 PCR이 수행되고, 그 다음에는 외부 프라이머가 도입된 상태에서 PCR이 수행된다. scFv는 적당한 제한 효소로 분해된 다음, 아가로스 겔로 정제된 후, 상기 제한 효소와 동일한 제한 효소로 절단된 파지 전시 벡터로 결찰된다. 결찰된 생성물들은 (예를 들어, 전기 천공에 의해) 수용성 숙주 세포(예를 들어, 박테리아, 효모 또는 포유동물 세포)에 삽입되고, 이 숙주 세포는 평판에 도말된 다음 배양되어 적당한 클론을 형성하게 되며, 이후 평판 상에 형성된 클론은 긁어져서 적당한 동결 배지에 접종된 상태로 동결된다(10% 글리세롤을 포함하는 수퍼브로쓰(superbroth) 배지, -70℃). Fab 라이브러리는 링커를 사용하지 않을지라도 유사한 방식으로 제조될 수 있다. Ag 특이적 Fab 및 scFv는, 예를 들어 패닝(panning) 또는 세포 분리법(cell sorting)과 같은 선별 방법을 이용하거나, 자동화 스크리너(screener)/피커(picker)(예를 들어, 클론픽스(CLONEPIX)™ 시스템), 및 자성 비드 분리법을 이용하여 박테리아 파지 전시 라이브러리, 효모 전시 라이브러리 및/또는 포유동물 세퍼 전시 라이브러리를 스크리닝하는 기술에 의해 얻어질 수 있다.

리더 서열 프라이머를 이용하여 증폭된 V 영역 핵산의 발현으로, V 영역 단백질 생성물 중 리더 펩티드들의 포함을 가져온다. 포유동물 세포, 예를 들어 CHO 세포가 이러한 핵산들을 발현시키는데 이용될 때, 내생적 번역후 가공 기작은 리더 펩티드를 제거하게 되어, Ag 결합 스크리닝 검정법을 방해하는 리더 펩티드들을 포함하지 않는 V 영역 또는 다중 V 영역(예를 들어, 중쇄 및 경쇄) 구조물의 발현을 가능하게 한다. 그러나, 박테리아 파지 전시 기술에 있어서, 리더 펩티드들은 제거되지 않는다. 리더 펩티드의 존재는 Ag 결합 스크리닝 검정법을 간섭할 수 있으므로, 이에 의하여 표적 Ag에 대한 친화도가 높은 V 영역들의 검출을 방지한다.

이러한 문제점을 극복하기 위해서, 본 발명은 또한 통상의 5’ V 영역 프라이머 세트보다 크기가 더 큰 프라이머 세트를 이용하여 제조된 제2 V 영역 라이브러리의 제조 방법을 제공한다. 이러한 크기가 더 큰 프라이머 세트는 전통적인 프라이머 세트를 이용하여 증폭되는 수에 비하여 더 많은 수의 V 영역 서열들이 증폭될 수 있게 한다. 물론 이러한 프라이머는 체세포 돌연변이된 서열이 아닌 생식 세포 계열 서열들을 증폭하도록 설계되므로, 프라이머 자체는 증폭 생성물에 서열 오류를 도입시킬 것이다(즉, 체세포 돌연변이는 제거되고, 생식 세포 계열 서열들로 치환됨). 파지 전시법은 고 친화도로 표적 Ag와 결합하는, scFv 중 V 영역들을 스크리닝하는데 이용된다. 그 다음, 동정된 V 영역들을 암호화하는 핵산이 서열 결정되고, 이로부터 얻어진 서열 정보를 이용함으로써 이러한 핵산들을 특이적으로 증폭시키는 역방향 프라이머들이 제조되고, 이 역방향 프라이머들은 제1 라이브러리(이 자체의 생성물은 리더 서열 프라이머와 함께 증폭됨)로부터 V 영역들을 증폭시키도록 리더 서열 정방향 프라이머와 함께 사용되어, 제1 라이브러리가 제조된 공여체에서 나타나는 Ag 특이적 V 영역들의 실질적이면서 완전한 서열(들)을 동정한다.

Ag 특이적 인간 mAb 또는 기타 다른 Ag 표적화 구조물

특정 표적 Ag과의 결합에 기여하는 것으로 확인된 중쇄 및/또는 경쇄 V 영역들(또는 이의 일부, 예를 들어 CDR)은, 전장 Ab, Ab 단편, 조작된 Ab 및 융합 단백질을 포함하는 Ag 표적화 구조물을 제조하는데 이용될 수 있다. 전장 Ab 및 기타 다른 Ag 표적화 구조물은 특정 이소타입 또는 종속 군, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA1, IgA2, IgE 또는 IgM에 특이적인 Ig 서열을 암호화하는 비 V 영역 서열을 포함할 수 있다. Fab 단편은 Fab', F(ab)2, F(ab')₂, F(ab)₃, Fv, scFv, dsFv, Fd 또는 dAb일 수 있다. 조작된 Ab는 미니바디(minibody), 다이아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody) 또는 카파 바디(kappa body)일 수 있다. Ag 결합성 구조물은 재조합체 또는 단백질 조작 기술을 이용하여 제조될 수 있는데, 예를 들어 V 영역 또는 CDR은 핵산 수준에서 구조물의 나머지 부분에 이식된다.

단백질체학

상기한 바에 더하여, 단백질체학적 접근법이 또한 이용되는데, 이 경우 공여체 조직 샘플 중 Ag 특이적 Ab(예를 들어, 혈장 IgG)는 공지된 기술(예를 들어, G 단백질, A 단백질, L 단백질 또는 이온 교환 크로마토그래피, 그 후 Ag 친화성 크로마토그래피)을 이용하여 분리된다. 생성된 Ag 특이적 Ab 혼합체는, 예를 들어 모세관 등전점 전기 영동법에 의해 추가로 분리된다. 이후, Ig들은 프로테아제로 분해되고, 펩티드 단편 아미노산 서열들은 MS에 의해 결정된다. 그 다음, 펩티드 서열 정보는, Ag 특이적 V 영역이 라이브러리 스크리닝 방법에서 올바르게 동정되었는지 여부를 확인하는데 이용될 수 있으며, PCR 프라이머는 또한 미리 제조하였던 라이브러리로부터 Ag 특이적 V 영역들을 증폭하도록 설계될 수도 있다.

키트

본원에 기술된 PCR 프라이머 세트들 및/또는 본원에 기술된 라이브러리들 중 1개 이상은, 사용 지침을 포함할 수 있는 키트 내에 포장될 수 있다.

실시예

실시예 1: PCR 전략

이제 도 1과 관련하여, 중쇄 증폭용 PCR 3라운드들과 경쇄 증폭용 PCR 2라운드들를 수행한다. 인간 PBMC로 제조된 cDNA 라이브러리가 주형으로 사용되고, PCR의 제1 라운드는 중쇄의 CH2 영역에 위치하는 역방향 프라이머와, 상이한 리더 정방향 프라이머(표 1A 참조)를 사용하여 수행된다. 생성된 PCR 생성물의 크기는 IgG의 종속 군에 따라서 905개 내지 1046개 뉴클레오티드이다. PCR의 제2 라운드에서는 제1 라운드와 동일한 정방향 프라이머를 이용하지만, 역방향 프라이머는 IgG 중쇄의 상이한 군들 4개의 힌지 영역에 위치하며 표 4에 나열된 역방향 프라이머를 이용한다. 본 단계로 종속 군 특이적 중쇄 증폭이 일어난다. 도 2와 관련하여, 중쇄 증폭용 제3 PCR 라운드에서는 V 영역의 5’ 말단에 위치하는 정방향 프라이머(표 3 참조)와, CH1 도메인의 5’ 말단에 위치하는 역방향 프라이머를 이용한다. 정방향 프라이머는 길이가 긴 scFv 단편용 링커를 도입하는 어댑터(adapter)를 가지고, 역방향 프라이머는 Sfi I 위치를 도입하는 어댑터를 가진다.

도 3과 관련하여, 경쇄에 있어서 PBMC cDNA 라이브러리는 또한 주형으로서 이용되고, PCR의 제1 라운드는 카파 및 람다 사슬의 Ck 및 Cλ 영역에 위치하는 역방향 프라이머와 리더 정방향 프라이머를 이용하여 수행된다. 생성된 PCR 생성물은 아가로스 겔 상에서 전개되고, 카파 사슬의 경우 약 550bp의 생성물이 겔 정제되며, 이는 제2 라운드 PCR 반응에서 주형으로서 이용된다. 람다 사슬의 경우, 약 630의 생성물이 겔 정제되며, 이는 제2 라운드 PCR 반응에서 주형으로서 이용된다. 역방향 프라이머들은 표 4에 나열되어 있다. 도 4와 관련하여, 경쇄 증폭용 PCR의 제2 라운드에서는 V 영역의 5’ 말단에 위치하는 정방향 프라이머와, Ck 및 Cλ 도메인의 5’ 말단에 위치하는 역방향 프라이머를 이용한다. 정방향 프라이머는 Sfi I 위치를 도입하는 어뎁터를 가지고, 역방향 프라이머는 길이가 긴 링커 서열을 도입하는 어댑터를 가진다.

중첩 연장 PCR이 수행되는데, 여기서 제3 라운드 중쇄 생성물은 동일한 비율의 카파 및 람다 사슬 제2 라운드 PCR 생성물과 혼합되어, 중첩 생성물을 생성한다. 중첩 생성물은 경쇄 어댑터 특이적 정방향 프라이머 및 중쇄 어댑터 특이적 역방향 프라이머를 이용하여 증폭되어, ScFv 단편을 생성한다. 상기 ScFv 단편은 Sfi I로 분해되고, pComb3X 벡터에 클로닝된다.

실시예 2: V 영역 프라이머를 이용하는 PCR

이하 기술된 실험은 파지 결합성에 리더 서열들이 미치는 영향을 테스트하기 위해 수행되었다. 테스트 ScFv 단편을, 중쇄 및 경쇄 리더를 사용하고 그리고 사용하지 않고 생성하며, 파지 상에 발현시켰다. 파지는 ELISA에서 특이적 항원에 대하여 이용되었다. 도 5는, 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역 중 어느 하나의 상류의 리더 펩티드의 존재는 scFv 단편이 이 자체의 항원과 결합하는 것을 억제하였음을 나타낸다.

상기 결과를 바탕으로 하여, V 영역 특이적 프라이머는 길이가 긴 링커와 Sfi I 위치가 도입되는 PCR의 마지막 라운드에 존재한다. 일단 고 친화성 항원 특이적 후보 ScFv 단편이 서열 결정되면, 프라이머는 구조틀 2 영역에서 역방향 프라이머로서 설계되고, 리더 특이적 정방향 프라이머는 중쇄의 제2 라운드 PCR 생성물과 경쇄의 제1 라운드 PCR 생성물 상에서 이용되어, V 영역의 올바른 서열을 얻게 된다. 교정된 V 영역은 생물 활성 검정법을 위하여 전장 항체를 생성하는데 이용된다.

실시예 3: 인간의 사이토카인과 결합하는 중쇄 및 경쇄의 발견

상기 기술된 방법과 조성물을 이용하여, 인간 사이토카인에 대한 2개의 상이한 모노클로날 항체를 암호화하는 인간의 중쇄 및 경쇄 유전자가 동정되었다. 이러한 모노클로날 항체들은 둘 다 항원에 대하여 높은(나노몰~피코몰 범위) 결합 친화도를 나타냈다. 이는, 본 발명의 방법과 조성물이 인간 게놈으로부터 저 빈도 항체(이 경우, 항체는 자기 항원에 대한 것임)를 동정하는데 유용하다는 것을 입증한다.

기타 구체예

본 발명은, 본 발명의 상세한 설명과 함께 기술되었지만, 상기 상세한 설명은 본 발명을 예시하기 위한 것이지, 본원에 첨부된 특허청구범위의 범주에 의해 한정되는 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니라는 것이 되어야 한다. 기타 양태, 이점 및 변형예들은 이하 특허청구범위의 범주에 속한다.

SEQUENCE LISTING <110> XBIOTECH, INC. <120> IDENTIFYING AFFINITY-MATURED HUMAN ANTIBODIES <130> 5407-0121 <140> <141> <150> 61/506,749 <151> 2011-07-12 <160> 178 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 1 atggactgga cctggaggat cctcttc 27 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 2 atggactgga cctggaggat cctctttttg 30 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 3 atggactgga cctggagcat ccttttc 27 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 4 atggactgca cctggaggat cctc 24 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 5 atggactgga cctggagaat cctcttcttg 30 <210> 6 <211> 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Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 37 atggacatga gggtgcccgc 20 <210> 38 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 38 atagacatga gggtccccgc tcag 24 <210> 39 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 39 atgaggctcc ctgctcagct cc 22 <210> 40 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 40 atgaggctcc ttgctcagct tctgg 25 <210> 41 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 41 atggaaaccc cagcgcagct tc 22 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 42 atggaagccc cagcgcagct 20 <210> 43 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 43 atggaagccc 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 50 atggcctggt ctcctctcct cctcac 26 <210> 51 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 51 atggccagct tccctctcct cctc 24 <210> 52 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 52 atggccggct tccctctcct cc 22 <210> 53 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 53 atgacctgct cccctctcct cctcac 26 <210> 54 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 54 atggcctggg ctctgctcct c 21 <210> 55 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 55 atggcctggg ctctgctgct c 21 <210> 56 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 56 atggcctggg ctctgctatt cctcac 26 <210> 57 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 57 atggcatgga tccctctctt cctcggc 27 <210> 58 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 58 atggcctgga ccgctctcct tctg 24 <210> 59 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 59 atggcctgga cccctctcct gc 22 <210> 60 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 60 atggcctgga tccctctcct gctc 24 <210> 61 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 61 atggcctgga cccctctctg gc 22 <210> 62 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 62 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Synthetic primer <400> 81 cagatcacct tgaaggagtc tgg 23 <210> 82 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 82 caggtcacct tgarggagtc tgg 23 <210> 83 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 83 cgggtcacct tgagggagtc tgg 23 <210> 84 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 84 gargtgcagc tggtggagtc tgg 23 <210> 85 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 85 caggtgcagc tggtggagtc tgg 23 <210> 86 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 86 gaggtgcagc tgttggagtc tgg 23 <210> 87 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 87 gaggtgcagc tggtggag 18 <210> 88 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Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 94 caggtgcagc tgcaggactc ggg 23 <210> 95 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 95 caggtgcggc tgcaggagtc ggg 23 <210> 96 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 96 gargtgcagc tggtgcagtc tgg 23 <210> 97 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 97 caggtacagc tgcagcagtc agg 23 <210> 98 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 98 caggtscagc tggtgcaatc tgg 23 <210> 99 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 99 cctggccggc ctggccacta gtgaccgatg ggcccttggt gga 43 <210> 100 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 100 atccagatga cccagtctcc 20 <210> 101 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 101 atccagttga cccagtctcc 20 <210> 102 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 102 atccrgatga cccagtctcc 20 <210> 103 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 103 atctggatga cccagtctcc 20 <210> 104 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 104 attgtgatga cccagactcc ac 22 <210> 105 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 105 rttgtgatga ctcagtctcc actc 24 <210> 106 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 106 attgtgatga cccagactcc ac 22 <210> 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Sequence: Synthetic primer <400> 119 tatgwgctga ctcagccacy c 21 <210> 120 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 120 tatgagctga cacagcyacc 20 <210> 121 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 121 tctgagctga ctcaggaccc 20 <210> 122 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 122 tatgagctga tgcagccacc 20 <210> 123 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 123 tatgagctga cacagccatc ctc 23 <210> 124 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 124 tatgagctga ctcagccaca ctc 23 <210> 125 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 125 tctgggccaa ctcaggtgcc 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Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 138 tgtgtgagtt ttgtcacaag atttgggctc 30 <210> 139 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 139 cggtgggcac tcgacacaac atttgcgctc 30 <210> 140 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 140 agttgtgtca ccaagtgggg ttttgagctc 30 <210> 141 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 141 tgatgggcat gggggaccat atttggactc 30 <210> 142 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 142 gggcccaggc ggccracatc cagatgaccc agtctcc 37 <210> 143 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 143 gggcccaggc ggccgmcatc cagttgaccc agtctcc 37 <210> 144 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 144 gggcccaggc ggccgccatc crgatgaccc agtctcc 37 <210> 145 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 145 gggcccaggc ggccgtcatc tggatgaccc agtctcc 37 <210> 146 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 146 gggcccaggc ggccgatatt gtgatgaccc agactccac 39 <210> 147 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 147 gggcccaggc ggccgatrtt gtgatgactc agtctccact c 41 <210> 148 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 148 gggcccaggc ggccgagatt gtgatgaccc agactccac 39 <210> 149 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 149 gggcccaggc ggccgaaatt 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Sequence: Synthetic primer <400> 155 gggcccaggc ggccgatgtt gtgatgacac agtctccagc t 41 <210> 156 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 156 gggcccaggc ggcccagtct gtgctgactc agccrcc 37 <210> 157 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 157 gggcccaggc ggcccagtct gtgytgacgc agccrcc 37 <210> 158 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 158 gggcccaggc ggcccagtct gtcgtgacgc agccrcc 37 <210> 159 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 159 gggcccaggc ggcccagtct gccctgactc agcctssctc 40 <210> 160 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 160 gggcccaggc ggcctcctat gwgctgactc agccacyc 38 <210> 161 <211> 37 <212> DNA <213> 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Sequence: Synthetic primer <400> 172 gggcccaggc ggcccagrct gtggtgactc aggagcc 37 <210> 173 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 173 gggcccaggc ggcccagact gtggtgaccc aggagcc 37 <210> 174 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 174 gggcccaggc ggcccagcct gtgctgactc agccacc 37 <210> 175 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 175 gggcccaggc ggcccaggca gggctgactc agccacc 37 <210> 176 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 176 ggtggttcct ctagatcttc ctcctctggt ggcggtggct cgggcggtgg tggg 54 <210> 177 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 177 cctgtgctga ctcagccacc 20 <210> 178 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 178 gcagggctga ctcagccacc 20

Claims

인간 면역 글로불린의 V 영역을 암호화하는 핵산을 증폭시키기 위한 리더 특이적 프라이머.
제1항에 있어서, 엄중한 혼성화 조건 하에서 서열 번호 1 내지 서열 번호 76의 서열들로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열의 상보체와 결합하는 핵산 서열을 포함하는 프라이머.
제1항에 있어서, 서열 번호 1 내지 서열 번호 76의 서열들로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 포함하는 프라이머.
인간 조직 샘플 중 인간 면역 글로불린의 V 영역을 암호화하는 핵산 90% 이상을 증폭하기 위한 리더 특이적 프라이머 세트.
제4항에 있어서, 세트는 인간 조직 샘플 중 인간 면역 글로불린의 V 영역을 암호화하는 핵산 100%를 증폭시키는 세트.
제4항에 있어서, 세트는 50개 이상의 상이한 프라이머들을 포함하고, 상이한 프라이머들은 각각 서열 번호 1 내지 서열 번호 76의 서열들로 이루어진 군으로부터 선택되는 상이한 핵산 서열을 포함하는 세트.
제4항에 있어서, 세트는 32개 이상의 상이한 프라이머들을 포함하고, 상이한 프라이머들은 각각 서열 번호 1 내지 서열 번호 32의 서열들로 이루어진 군으로부터 선택되는 상이한 핵산 서열을 포함하는 세트.
제4항에 있어서, 세트는 15개 이상의 상이한 프라이머들을 포함하고, 상이한 프라이머들은 각각 서열 번호 33 내지 서열 번호 48의 서열들로 이루어진 군으로부터 선택되는 상이한 핵산 서열을 포함하는 세트.
제4항에 있어서, 세트는 27개 이상의 상이한 프라이머들을 포함하고, 상이한 프라이머들은 각각 서열 번호 49 내지 서열 번호 76의 서열들로 이루어진 군으로부터 선택되는 상이한 핵산 서열을 포함하는 세트.
가변 영역의 처음 8개 아미노산에 체세포 초돌연변이들이 있는 면역 글로불린 중쇄를 암호화하는 핵산 분자를 10⁵개 이상 포함하는 파지 라이브러리.
리더 특이적 프라이머를 이용하여 인간 피험체로부터 분리된 B 림프구의 PCR 증폭에 의해 분리되는, 가변 영역 암호화 핵산 서열을 포함하는 파지 전시 라이브러리를 스크리닝함으로써 결정된, 가변 영역 서열을 포함하는 정제된 항체.
(a) B 림프구를 포함하는 인간 조직 샘플로부터 인간 면역 글로불린의 중쇄 및 경쇄 뉴클레오티드 서열들을 증폭하기 위해 제1 PCR을 이용하되, 리더 특이적 프라이머가 PCR 증폭에 이용되는 단계;
(b) 제1 PCR 단계로부터 증폭 생성물을 분리하는 단계;
(c) 제1 PCR 단계로부터 분리된 증폭 생성물을 발현 벡터에 삽입함으로써 구조물의 제1 세트를 제조하는 단계; 및
(d) 구조물의 제1 세트를 숙주 세포의 제1 세트에 도입하여, 인간 면역 글로불린 뉴클레오티드 서열의 제1 라이브러리를 제조하는 단계
를 포함하는 방법.
제12항에 있어서, 리더 특이적 프라이머는 상이한 폴리뉴클레오티드들의 세트를 포함하며, 상기 프라이머는 각각 엄중한 혼성화 조건 하에서 서열 번호 1 내지 서열 번호 76의 서열들로 이루어진 군으로부터 선택되는 상이한 핵산 서열의 상보체와 결합하는 방법.
제12항에 있어서,
(e) 제1 라이브러리 또는 인간 조직 샘플로부터 인간 면역 글로불린 뉴클레오티드 서열을 증폭하기 위해 제2 PCR을 이용하되, 가변 영역 특이적 프라이머가 PCR 증폭에 이용되는 단계;
(f) 제2 PCR 단계로부터 증폭 생성물의 제2 세트를 분리하는 단계;
(g) 분리된 증폭 생성물의 제2 세트를 발현 벡터에 삽입함으로써 구조물의 제2 세트를 제조하는 단계;
(h) 구조물의 제2 세트를 숙주 세포의 제2 세트에 도입하여, 인간 면역 글로불린 뉴클레오티드 서열의 제2 라이브러리를 제조하는 단계;
(i) 표적 항원과 특이적으로 결합하는 가변 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 대해 제2 라이브러리를 스크리닝하는 단계;
(j) 표적 항원과 특이적으로 결합하는 가변 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 서열을 구하는 단계;
(k) 구하여진 서열 정보를 이용하여, 표적 항원과 특이적으로 결합하는 가변 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 특이적인 역방향 프라이머를 생성하는 단계; 및
(l) 제3 PCR에서 역방향 프라이머와 리더 특이적 프라이머를 이용하여, 표적 항원과 면역 글로불린의 결합을 촉진시키는, 인간 조직 샘플 중 B 림프구에서 면역 글로불린의 서열에 상응하는 제1 라이브러리 유래 뉴클레오티드 서열을 증폭시키는 단계
를 추가로 포함하는 방법.
체세포 초돌연변이된 V 영역 서열의 완전 세트를 포함하는 인간 면역 글로불린 cDNA 라이브러리.