RU2014102617A

RU2014102617A - Выявление аффинно-зрелых человеческих антител

Info

Publication number: RU2014102617A
Application number: RU2014102617/10A
Authority: RU
Inventors: Джон СИМАРД
Original assignee: ИксБиотеч, Инк.
Priority date: 2011-07-12
Filing date: 2012-07-12
Publication date: 2015-08-20
Also published as: CN103687873A; RU2017134418A; CA2841475C; MX2018015450A; US9234030B2; US20200071388A1; EP3034513A2; WO2013009967A2; AU2012281078B2; KR20140044905A; US20160362679A1; KR102139388B1; US9453217B2; MX2014000431A; EP3034513B1; RU2762685C2; AU2017210585A1; CN107090459A; AU2017210585B2; RU2636045C2

Abstract

1. Специфический по отношению к лидерной последовательности праймер для амплификации нуклеиновой кислоты, кодирующей V-область человеческого иммуноглобулина.2. Праймер по п. 1, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, которая связывается при строгих условиях гибридизации с комплементарной цепью нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:1-76.3. Праймер по п. 1, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:1-76.4. Набор специфических по отношению к лидерной последовательности праймеров для амплификации по меньшей мере 90% нуклеиновых кислот, кодирующих V-область человеческого иммуноглобулина в образце человеческой ткани.5. Набор по п. 4, отличающийся тем, что набор амплифицирует 100% нуклеиновых кислот, кодирующих V-область человеческого иммуноглобулина в образце человеческой ткани.6. Набор по п. 4, отличающийся тем, что набор содержит по меньшей мере 50 различных праймеров, и каждый из различных праймеров содержит отличающуюся последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:1-76.7. Набор по п. 4, отличающийся тем, что набор содержит по меньшей мере 32 различных праймера, и каждый из различных праймеров содержит отличающуюся последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:1-32.8. Набор по п. 4, отличающийся тем, что набор содержит по меньшей мере 15 различных праймеров, и каждый из различных праймеров содержит отличающуюся последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:33-48.9. Набор по п. 4, отличающийся тем, что набор содержит по меньшей мере 27 различных

Claims

1. Специфический по отношению к лидерной последовательности праймер для амплификации нуклеиновой кислоты, кодирующей V-область человеческого иммуноглобулина.

2. Праймер по п. 1, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, которая связывается при строгих условиях гибридизации с комплементарной цепью нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:1-76.

3. Праймер по п. 1, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:1-76.

4. Набор специфических по отношению к лидерной последовательности праймеров для амплификации по меньшей мере 90% нуклеиновых кислот, кодирующих V-область человеческого иммуноглобулина в образце человеческой ткани.

5. Набор по п. 4, отличающийся тем, что набор амплифицирует 100% нуклеиновых кислот, кодирующих V-область человеческого иммуноглобулина в образце человеческой ткани.

6. Набор по п. 4, отличающийся тем, что набор содержит по меньшей мере 50 различных праймеров, и каждый из различных праймеров содержит отличающуюся последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:1-76.

7. Набор по п. 4, отличающийся тем, что набор содержит по меньшей мере 32 различных праймера, и каждый из различных праймеров содержит отличающуюся последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:1-32.

8. Набор по п. 4, отличающийся тем, что набор содержит по меньшей мере 15 различных праймеров, и каждый из различных праймеров содержит отличающуюся последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:33-48.

9. Набор по п. 4, отличающийся тем, что набор содержит по меньшей мере 27 различных праймеров, и каждый из различных праймеров содержит отличающуюся последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:49-76.

10. Фаговая библиотека, содержащая по меньшей мере 10⁵ молекул нуклеиновых кислот, кодирующих тяжелые цепи иммуноглобулина, содержащие соматические гипермутации в первых 8 аминокислотах вариабельной области.

11. Очищенное антитело, содержащее последовательность вариабельной области, определенную путем скрининга библиотеки фагового дисплея, которая содержит последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие вариабельную область, выделенные путем ПЦР-амплификации В-лимфоцитов, выделенных из человека-субъекта с применением специфических по отношению к лидерной последовательности праймеров.

12. Способ, включающий этапы

(a) применения первого этапа ПЦР для амплификации нуклеотидных последовательностей тяжелых и легких цепей человеческого иммуноглобулина из образца человеческой ткани, содержащей В-лимфоциты, где для ПЦР-амплификации применяют специфические по отношению к лидерной последовательности праймеры;

(b) выделения продуктов амплификации, полученных на первом этапе ПЦР;

(c) создания первого набора конструктов путем встраивания выделенных продуктов амплификации, полученных на первом этапе ПЦР, в векторы экспрессии; и

(d) введения первого набора конструктов в первый набор клеток-хозяев для создания первой библиотеки нуклеотидных последовательностей человеческого иммуноглобулина.

13. Способ по п. 12, отличающийся тем, что специфические по отношению к лидерной последовательности праймеры содержат набор различных полинуклеотидов, каждый из которых связывается при строгих условиях гибридизации с комплементарной цепью отличающейся последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:1-76.

14. Способ по п. 12, дополнительно включающий этапы

(e) применения второго этапа ПЦР для амплификации нуклеотидных последовательностей человеческого иммуноглобулина из первой библиотеки или образца человеческой ткани, где для ПЦР-амплификации применяют специфические по отношению к вариабельной области праймеры;

(f) выделения второго набора продуктов амплификации, полученных на втором этапе ПЦР;

(g) создания второго набора конструктов путем встраивания второго набора выделенных продуктов амплификации в векторы экспрессии;

(h) введения второго набора конструктов во второй набор клеток-хозяев для создания второй библиотеки нуклеотидных последовательностей человеческого иммуноглобулина;

(i) проведения скрининга второй библиотеки в отношении нуклеотидной последовательности, которая кодирует вариабельную область, которая специфически связывается с целевым антигеном;

(j) получения последовательности нуклеотидной последовательности, кодирующей вариабельную область, которая специфически связывается с целевым антигеном;

(k) применения полученной информации о последовательности для создания обратного праймера, специфического по отношению к нуклеотидной последовательности, кодирующей вариабельную область, которая специфически связывается с целевым антигеном;

(l) применения обратного праймера и специфических по отношению к лидерной последовательности праймеров на третьем этапе ПЦР для амплификации нуклеотидной последовательности из первой библиотеки, которая соответствует последовательности иммуноглобулина в В-лимфоците в образце человеческой ткани, которая способствует связыванию иммуноглобулина с целевым антигеном.

15. Библиотека кДНК человеческого иммуноглобулина, содержащая полный набор подвергшихся соматическим гипермутациям последовательностей V-областей.