DE60016806T2

DE60016806T2 - Selfantigen-impfstoffe zur behandlung von b-zell lymphomen und sonstigen krebsen

Info

Publication number: DE60016806T2
Application number: DE60016806T
Authority: DE
Inventors: J. Stephen REINL; H. Thomas TURPEN; Alison A. Mccormick; Daniel Tuse; John A. Lindbo
Original assignee: Large Scale Biology Corp
Current assignee: Large Scale Biology Corp
Priority date: 2000-03-10
Filing date: 2000-10-13
Publication date: 2005-12-15
Anticipated expiration: 2020-10-14
Also published as: CA2402086A1; DE60016806D1; ATE284897T1; AU2001212019B2; AU1201901A; EP1263779A1; WO2001068682A1; JP2003527399A; ZA200206798B; EP1263779B1

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung auf dem Gebiet der Molekularbiologie, Immunologie und Medizin betrifft eine in Pflanzen produzierte Polypeptid-Vakzine zur Induktion einer Immunreaktion gegen ein Selbst-Antigen (das normalerweise klonal exprimiert wird) an der Oberfläche gewisser Tumorzellen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Tumor ein B-Zell-Lymphom, das Selbst-Antigen ein B-Zell-Idiotyp und die Vakzine-Zusammensetzung ein lösliches Einzelketten-Antikörper-Polypeptid (scFv), das die V_L- und V_H-Domänen des Oberflächen-Immunglobulins des Lymphoms umfasst.
Hintergrund der Erfindung
Malignitäten von B-Lymphozyten, in erster Linie Nicht-Hodgkin-Lymphome („NHL"), auch B-Zell-Lymphome genannt, werden im Allgemeinen durch standardmäßige Antitumor-Regime der Strahlentherapie und Chemotherapie, gegebenenfalls in Kombination mit Stammzellentransplantation, behandelt. Leider ist in einer signifikanten Anzahl von Fällen keine dieser Modalitäten restlos erfolgreich. Demzufolge sind die meisten B-Zell-Lymphome, deren Häufigkeiten in Industrienationen zunehmen, unheilbar (L. Ries et al., SEER Cancer Statistics Review, 1973–1993 (1996): Tabellen und Grafiken (Natl. Cancer Inst., Bethesda); S.L. Parker et al., CA Cancer J. Clin. 47, 5–27 (1997)). Obgleich Reaktionen von B-Zell-Lymphomen auf eine Behandlung wie auch die Prognosen der Patienten weithin variieren (J.O. Armitage, CA Cancer J. Clin. 47, 323–325 (1997)), haben diese Tumoren trotzdem eine gemeinsame Eigenschaft: jedes B-Zell-Lymphom ist klonal, bestehend aus Nachkommen einer einzigen malignen B-Zelle, wovon jede ein einzigartiges Oberflächen-Immunglobulin- (Ig-) Molekül exprimiert, das für diesen Klon charakteristisch ist und als tumorspezifischer Marker dient.
Immunglobuline, Idiotypen und Idiotope
Intakte Immunglobulin- (Ig-) Moleküle (oder Antikörper) sind Proteine, die im Allgemeinen aus zwei identischen Schwer- (H-) und zwei identischen Leicht- (L-) Ketten bestehen. Eine L-Kette hat eine Molmasse von ungefähr 25 kDa, wogegen eine H-Kette ungefähr 50–70 kDa aufweist. Die Aminotermini von H- und L-Ketten sind die variablen (V-) Regionen oder Domänen, die eine Länge von ungefähr 100 bis 110 Aminosäureresten aufweisen. Die Kombination der V-Region der H-Kette (V_H) und L-Kette (V_L) ergibt eine Struktur, welche die Antigen-kombinierende Stelle des Ig-Moleküls bildet (auch Antigenbindungs- oder Antigenerkennungsstelle genannt).
Innerhalb der V_H- oder V_L-Regionen finden sich „hypervariable" Regionen, die Abschnitte von Aminosäuren an bestimmten Positionen sind, die unter den meisten Ig-Molekülen in einem Individuum unterschiedlich sind. Diese Aminosäurepositionen werden auch als Complementary-Determining-Regions (CDRs) bezeichnet, wogegen die verbleibenden Abschnitte der V-Regionen „Gerüstregionen" genannt werden.
Diejenige Region eines Antigens, die eigentlich mit einem Antikörper reagiert, wird antigene Determinante oder „Epitop" genannt. Überschlägig entspricht die tatsächliche Größe eines Epitops der Größe der kombinierenden Stelle des Antikörpers: z.B. ungefähr 5–6 Aminosäuren eines linearen Peptidantigens oder ungefähr 3–7 Hexosemoleküle eines Kohlenhydratantigens. Was üblicherweise als Antigen betrachtet wird, kann ein viel größeres Molekül mit mehreren nicht in Beziehung stehenden Epitopen sein. Dies kann illustriert werden, indem ein typisches globuläres Molekül, wie z.B. Myoglobin, betrachtet wird. Trotz seines relativ niedrigen Molekulargewichts (~17 kDa) weist es mehrere unterschiedliche Epitope auf; Antikörper, die mit einem der Epitope an der Oberfläche dieses Proteins reaktiv sind, reagieren nicht mit einem anderen Epitop. Wenn ein Ig-Molekül mit einer komplexen Struktur, z.B. einem vollständigen Virus, kombiniert, belegt das Molekül nur einen kleinen Bruchteil der Gesamtoberfläche des Virus. Diese Eigenschaft begründet teilweise unser Vermögen, Vakzinen herzustellen. Viren können so modifiziert werden, dass sie nicht länger in fektiös sind, obwohl viele ihrer Oberflächenepitope intakt verbleiben. Diese verbleibenden Epitope können die Produktion von Antikörpern stimulieren, die den unmodifizierten Virus bei einer zukünftigen Begegnung erkennen und damit kombinieren können.
Die hypervariable Region von einem Ig-Molekül (welche die Erfinder zu Illustrationszwecken „Ab-A" nennen) kann als antigene Determinante agieren, so dass ein anderer Antikörper (den die Erfinder hier Ab-B nennen), der an diese Region von Ab-A bindet, höchst spezifisch sein kann, d.h. nicht mit anderen IgGs im selben Einzeltier reagiert. Die Epitope der hypervariablen Regionen von Ab-A sind auch als idiotypische Determinanten oder „Idiotope" bekannt. Ein Idiotop ist ein einzelnes derartiges, in der Ig-V-Region befindliches Epitop. Der Satz an Idiotopen eines bestimmten Ig-Moleküls (oder Fragments) legt seinen „Idiotyp" oder „Id" fest. Ab-B ist in diesem Beispiel ein Anti-Idiotyp- (oder Anti-Id-) Antikörper; da er zumindest ein Epitop dieses Idiotyps erkennt, kann der Antikörper ebenfalls als Anti-idiotypisch betrachtet werden.
Die molekulare Basis der Idiotypie ist durch Aminosäuresequenzanalyse einzelner Ig-Moleküle, die Ids gemeinsam haben, aufgeklärt worden. Idiotypen (und ihre Epitop-Komponenten) befinden sich im Allgemeinen in V_H-Domänen isolierter H-Ketten oder V_L-Domänen von L-Ketten. Häufiger werden Idiotypen jedoch durch Beteiligung beider H- und L-Ketten-V-Regionen erzeugt und können auf eine Weise miteinander wechselwirken, so dass ein Idiotyp stabilisiert wird, der sich gänzlich auf einer Kette befinden kann.
Da die meisten Strukturepitope einer Ig-V-Region für ein bestimmtes Ig-Molekül einzigartig sind und den einzigartigen B-Zell-Klon identifizieren, von dem dieses Ig abstammte, können Idiotypen als V-Region-Epitope betrachtet werden. Derartige individuelle Idiotypen oder der Komposit-Idiotyp, den sie aufbauen, die durch die einzigartigen V-Regionen erzeugt werden, können als Marker für einen gegebenen Klon normaler B-Zellen oder für einen Tumor dienen, der aus einem derartigen Klon, z.B. einem B-Zell-Lymphom, entstand. Diese Marker sind als mögliche Ziele für eine Antitumor-Immunreaktion denkbar.
Spezifische Immuntherapie von Tumoren
Eine spezifische Tumorimmuntherapie erfordert das Vorhandensein tumorspezifischer Ziel-Antigene. Der Id der an der Oberfläche von NHL-Zellen exprimierten Ig ist tatsächlich ein solches tumorspezifisches Antigen. Die Tatsache, dass alle Lymphomzellen eines einzelnen Patienten denselben einzigartigen Id exprimieren, ist ein Beweis dafür, dass eine maligne Transformation zum Lymphom in einer B-Zelle aufgetreten ist, die bereits eine Ig-Gen-Umordnung durchgemacht hat.
Die passive Immuntherapie mit einem monoklonalen Antikörper (mAb), der für den idiotypischen Marker eines Lymphoms spezifisch ist und daran bindet, induzierte lange andauernde Remissionen in einer Reihe von NHL-Patienten (R.A. Miller, N. Engl. J. Med. 306, 517 (1982); D. Maloney et al., Blood 80, 1502 (1992); S. Brown, Blood 73, 651 (1989); T.C. Meeker et al., N. Engl. J. Med. 312, 1658 (1985)). Jedoch wurden einige Patienten, die anfänglich auf die Behandlung reagierten, mit dem Tumor rückfällig, der diese mAbs nicht länger band, obwohl die rückfälligen Tumorzellen nach wie vor ein Oberflächen-Ig exprimierten. Die Sequenzanalyse der für die V-Regionen des Tumor-Ig kodierenden Gene bewies den klonalen Ursprung aller Tumorzellen, offenbarte jedoch auch umfangreiche Punktmutationen. In der Tat wurden derartige Rückfälle dahingehend interpretiert, als dass sie auf Mutationen in den für das Oberflächen-Ig kodierenden Ig-V-Genen des entstehenden Lymphoms zurückzuführen sind (S. Levy et al., J. Exp. Med. 168, 475 (1988); M. Cleary et al., Cell 44, 97 (1986)). In der Tat waren diese Tumorzellmutanten oder „Varianten" tatsächlich in der ursprünglichen Tumorzellpopulation vor der Immuntherapie vorhanden. Somatische Mutationen in den ursprünglichen B-Zell-Klonen führten zu idiotypischen Varianten, die der Erkennung durch die mAbs entgingen. Nicht alle der beobachteten Mutationen führten zu Aminosäureänderungen, und nicht alle der Änderungen der Aminosäuresequenz verursachten den Verlust der Bindung durch die mAbs der Be handlung. Jedoch schien in den für den Rückfall verantwortlichen Tumorzellen eine Änderung von einer oder zwei Aminosäuren in der zweiten CDR (CDR2) der H-Kette für den Bindungsverlust verantwortlich zu sein. Folglich wurde ein bestimmter Idiotyp (im am besten untersuchten Fall der „7D11"-Idiotyp) in den Rückfall-Tumorzellen nicht mehr länger exprimiert (Maloney et al., s.o.).
Diese Befunde verlangen nach einer Änderung der Strategie: (1) aktive und nicht passive Immunisierung mit (2) Individuen-spezifischen Tumorvakzinen, die (3) fähig sind, eine polyklonale Immunreaktion im Patienten auszulösen (C.B. Caspar et al., Blood 90, 3699–3706 (1997)). Da eine polyklonale Antikörperpopulation mit breiter Spezifität verschiedene Epitope eines einzelnen Proteins erkennt, sollte eine Mutation in einem einzelnen Epitop des Proteins die Erkennung nicht umgehen. Folglich sollte die Induktion einer polyklonalen Immunreaktion in einem Lymphom-Patienten diesen Patienten mit Antikörpern ausstatten, die Tumorvarianten erkennen, die durch somatische Mutation entstanden (in diesem Fall von IgV-Genen).
Es wurde ein immuntherapeutisches Experiment auf Basis dieser Vorstellung durchgeführt: die Id-tragende Oberfläche eines B-Zell-Lymphoms wurde durch Konjugation an ein großes, fremdes Trägerprotein, Keyhole-Limpet-Hämocyanin (KLH), immunogen gemacht. Dieses Konjugat wurde zusammen mit Adjuvans als Vakzine an Patienten bei Chemotherapie-induzierter Remission verabreicht (L.W. Kwak et al., N. Engl. J. Med. 327, 1209–1215 (1992); F.J. Hsu et al., Ann. NY Acad. Sci. 690, 385-387 (1993)). Durch eine derartige Impfung ausgelöste Id-spezifische Immunreaktionen resultierten in einem überlegenen klinischen Ergebnis (E.L. Nelson et al., Blood 88, 580–589 (1996); F.J. Hsu et al., Blood 89, 3129–3135 (1997); M. Bendandi et al., Nature Med 5, 1171–1177 (1999)).
Leider sind die meisten gegenwärtigen Verfahren zur Produktion von maßgeschneiderten Tumorvakzinen für B-Zell-Lymphome unzureichend, um die gegenwärtige und erwartete zukünftige Nachfrage zu erfüllen. Ungefähr 20.000 bis 30.000 neue Fälle werden jährlich alleine in den Vereinigten Staaten diagnostiziert. Igs, die in Mengen produziert werden, die für die menschliche Therapie erforderlich sind, werden gegenwärtig durch Fusionieren der Tumorzellen eines Patienten mit einer transformierten Mensch/Maus-Heteromyelom-Zelllinie erzeugt, um Hybridome zu erzeugen (W.L. Carroll et al., J. Immunol. Methods 89, 61–72 (1986); K. Thielemans et al., J. Immunol. 133, 495–501 (1984)). Die Hybridomen werden auf Sekretion des Patientenspezifischen (Tumor-spezifischen), Id-tragenden Ig gescreent und dann für die Produktion des Ig-Proteins im großen Maßstab selektiert und vermehrt. Obgleich dieses System als Forschungswerkzeug erfolgreich war, ist es für die klinische Verwendung im Großmaßstab unpraktisch. Neben den Kosten und dem Arbeitsaufwand leiden Hybridom-Produktionssysteme an (1) unvorhersagbaren Verlusten von Chromosomen und (2) der Suppression tumorspezifischer Ig-Proteinexpression im Laufe der Zeit. Neulich sind Verfahren beschrieben worden, die amplifizierte Zelllinien einsetzen, die mehrere verschiedene rekombinante DNA-Sequenzen, einschließlich einen Amplifikationsvektor, einen Expressionsvektor und einen Selektionsvektor, enthalten, die gemeinsam exprimiert werden, was eine rasche und effiziente Isolierung der amplifizierten Zelllinien erlaubt, welche die Quelle des Vakzine-Proteins sind (US-Patente Nr. 5.776.746 und 5.972.334). Dieses Verfahren leidet an einigen derselben Nachteile wie die Hybridomproduktion. Beispielsweise sind großen Mengen an Serum erforderlich (insbesondere für schwache Produzenten), und wenn autologes Serum nicht ausreichend vorhanden ist, wäre normales menschliches Serum oder Serum aus anderen Säugetierquellen (z.B. fötales Rinderserum) erforderlich. Dies verursacht ein Risiko viraler Verunreinigungen. Der Expressionsbereich kann höchst variabel sein. Schließlich sind die Kosten des Zellwachstums bei diesem Ansatz, die Schwierigkeit der Maßstabsvergrößerung und die benötigte Zeit zur Produktion brauchbarer Produktmengen problematisch.
Die weit verbreitete Verwendung einer derartigen Immuntherapie wird durch die verschiedenen Einschränkungen der gegenwärtigen Produktionssysteme limitiert, welche die benötigten Mengen an Vakzine-Protein nicht bereitstellen können. Um den Handlungsspielraum einer Individualtherapie für Nicht-Hodgkin-Lymphome (NHL) zu erweitern, benötigt man eine reichliche Quelle von sicherem, leicht zu reinigendem Vakzine-Material, das de novo in Wochen und nicht in Monaten oder Jahren erzeugt werden kann. Der Erfolg dieses Ansatzes erfordert, dass die Expressionssysteme zur Produktion dieser individualisierten Proteinvakzine einer großen Auswahl an Aminosäuresequenzen Rechnung tragen. Wichtiger ist es vielleicht, dass das Expressionssystem fähig sein muss, ein Protein mit einer Konformation zu liefern, die jener der Ig-V-Region ähnelt, wie sie anfangs und natürlicherweise an der Oberfläche der malignen B-Zelle vorhanden ist.
Eine Alternative zu intakten H₂L₂Ig-Molekülen als Vakzine ist ein Einzelkettenmolekül der variablen Region („scFv"). Die Bezeichnung Fv entstand aus der Tatsache, dass ein Dimer der Ig-V_H-Region und der V_L-Region, das durch schonende Proteolyse enzymatisch aus einem intakten Ig freigesetzt wurde und neu assoziierte, sich korrekt neu falten und die Antigenbindungsaktivität beibehalten konnte (J. Hochman et al., Biochemistry 12, 1130–1135 (1973); J. Sharon et al., Biochemistry 15, 1591–1594 (1976)). Diese als scFv bezeichneten Einzelketten-Polypeptide umfassen die hypervariablen Regionen aus einem Ig von Interesse und bilden die Antigenbindungsstelle des nativen Ig nach, während sie nur einen Bruchteil der Größe eines intakten Ig aufweisen (A. Skerra et al., Science 240, 1038–1041 (1988); A. Pluckthun et al., Methods Enzymol. 178, 497–515 (1989); G. Winter et al., Nature 349, 293–299 (1991); Bird et al., Science 242, 423 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5879 (1988); US-Patente Nr. 4.704.692, 4.853.871, 4.946.778, 5.260.203, 5.455.030). Ladner (US-Patent Nr. 4.704.692) lehrte ein Verfahren zum Einsatz eines einzelnen (oder mehrerer) Linkers, um zwei natürlich aggregierte, jedoch chemisch getrennte Polypeptidketten zu einer einzelnen Polypeptidkette umzusetzen, die sich zu einer dreidimensionalen Struktur faltet, die der von zwei Polypeptidketten eingenommenen Struktur sehr ähnlich ist. Dieses Patent lehrte, dass die Zweiketten-V_H-V_L-Struktur durch Auswählen eines geeigneten Linkerpeptids oder einer geeigneten Polypeptidsequenz mit bekannten flexiblen Konformationen modifiziert werden konnte, die eine Verbindung zwischen der C-terminalen Region der H-Kette und der N-terminalen Region der L-Kette ermöglichen, die normalerweise Teile des Fv-Fragments sind, wodurch eine Polypeptidstruktur mit einer Sequenz erzeugt wird, die aus der Kombination der bekannten Sequenz der V_H- und V_L-Domänen und des Linkers besteht. Diese neue Polypeptidkette konnte dann mit vermindertem Risiko eines Fehlschlagens der erfolgreichen Faltung zur gewünschten Struktur hergestellt werden.
Die korrekte Faltung der V_H- und V_L-Regionen ist für die Erhaltung der Antigenbindungsfähigkeit eines scFv entscheidend, und die Länge und Sequenz der Linkerregion sind entscheidende Parameter für die korrekte Faltung und für die biologische Funktion. scFv-Ketten sind leichter zu exprimieren als Fv-Fragmente oder größere Ig-Polypeptidkomplexe. Mehrere scFv-Vakzinen riefen Idiotyp-spezifische Reaktionen in Tieren hervor (I. Hakim et al., J. Immunol. 157, 5503–5511 (1996); M.B. Spellerberg et al., J. Immunol. 159, 1885–1892 (1997)) und konnten die Tumorprogression in Maus-Lymphom blockieren (I. Hakim et al., s.o.; A.A. McCormick et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 703– 708 (19. Jänner 1999)).
Expressionssysteme
Eine Reihe von Expressionssystemen für heterologe Proteine ist wohlbekannt. Diese umfassen bakterielle Expressionssysteme, welche die Vorteile der raschen und reichlichen Produktion bieten, jedoch in vielen Fällen durch ihre Unfähigkeit eingeschränkt sind, richtig gefaltete und lösliche Proteine zu produzieren (es sein denn, die Proteine werden Zyklen der Denaturierung und Renaturierung unterzogen). Baculovirus-Systeme treiben die Expression über die Sekretionswege von Insektenzellen an, wodurch die Wahrscheinlichkeit einer verbesserten Proteinlöslichkeit erhöht wird (T. Kretzschmar et al., J. Immunol. Methods 195, 93–101 (1996); B. Brocks et al., Immunotechnology 3, 173–184 (1997)). Jedoch kann die Manipulation des Virus und das Wachstum von Insektenzellen zeitaufwendig und kostspielig sein, was das System zur Expression von tumorspezifischen/individuenspezifischen Proteinen, wie z.B. idiotypischem scFv, weniger geeignet macht. Es besteht daher auf dem Gebiet der Erfindung ein Bedarf an der Entwicklung geeigneter, rascher und ökonomischer Expressionssysteme zur Produktion von Vakzinen zur Behandlung von Malignitäten, wie z.B. B-Zell-Lymphomen. Die vorliegende Erfindung behandelt diesen Bedarf.
Zusammenfassung der Erfindung
Diese Erfindung stellt ein immunogenes Polypeptid-Selbst-Antigen und eine Vakzine-Zusammensetzung bereit, die dieses Individuums-spezifische, tumorspezifische, von Tumorzellen dieses Individuums abstammende Selbst-Antigen umfasst. Es ist wesentlich, dass das Polypeptid ohne eine notwendige Denaturierung oder Renaturierung hergestellt wird. Wenn es an einen Säugetier-Patienten, vorzugsweise einen Menschen, insbesondere bevorzugt dem Patienten, verabreicht wird, aus dem das Tumormaterial erlangt wurde, ist das Polypeptid fähig, eine systemische Immunreaktion (zellulär, humoral oder beides), vorzugsweise eine schützende Immunreaktion, hervorzurufen. Eine bevorzugte Eigenschaft des Polypeptids und der Vakzine ist die Fähigkeit, Tumor-einzigartige polyklonale Antikörper und T-Zellen im immunisierten Patienten zu induzieren, die auf den Tumor abzielen, für den sie spezifisch sind und die einen immuntherapeutischen Nutzen aufweisen.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Polypeptid vom Oberflächen-Ig eines B-Zell-Lymphoms hergeleitet und ahmt dieses nach und umfasst ein oder mehrere idiotypische Epitope dieses Ig, das für dieses Lymphom einzigartig kennzeichnend ist. Das immunogene Selbst-Protein kann eine einzelne Polypeptidkette sein, die ein Fragment eines tumorspezifischen Antigens ist. Das Polypeptid befindet sich vorzugsweise in wässriger Lösung. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das immunogene Selbst-Protein ein Einzelketten-Antikörper, der auch scFv genannt wird, der die V_H- und V_L-Regionen des einzigartigen Oberflächen-Ig des B-Zell-Lymphoms des Patienten umfasst und der hinreichend immunogen ist, um eine nachweisbare, vorzugsweise schützende Immunreaktion in diesem Patienten gegen sein B-Zell-Lymphom zu induzieren. Vorzugsweise ist der Patient ein Mensch, und die schützende Immunreaktion resultiert in der Zerstörung von Tumorzellen, im Stillstand der Tumorprogression und insbesondere bevorzugt in Langzeit-Remission oder Heilung.
Demgemäß stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Vakzine-Zusammensetzung für die Immuntherapie von B-Zell-Lymphom bereit, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:
(a) Bereitstellen eines scFv-Moleküls, das erhalten wird durch:
Bereitstellen von Nucleinsäuren, die für die Ig-VH- und die Ig-VL-Domäne des Ig eines B-Zell-Lymphoms eines Patienten kodieren;
Herstellen einer Bibliothek von Nucleinsäuremolekülen, die für scFv-Moleküle kodieren, in denen die für die Ig-VH- und Ig-VL-Domänen kodierenden Nucleinsäuren mit einem Element einer randomisierten Bibliothek von Linkern verbunden sind, die unterschiedliche Größen und Nucleotidsequenzen aufweisen, worin diese Linker ein wiederholtes Muster degenerierter, wiederholter Triplettnucleotide mit folgenden Eigenschaften aufweisen:
(i) Position 1 jedes wiederholten Tripletts kann nicht dasselbe Nucleotid wie Position 2 des wiederholten Tripletts sein; oder
(ii) Position 2 jedes wiederholten Tripletts kann nicht dasselbe Nucleotid wie Position 3 des wiederholten Tripletts sein; oder
(iii) Position 1 jedes wiederholten Tripletts kann nicht dasselbe Nucleotid wie Position 3 des wiederholten Tripletts sein;
Selektieren eines Elements der Bibliothek, das in der Lage ist, gefaltete scFv-Moleküle in einer pflanzlichen Wirtszelle zu exprimieren und zu sekretieren; und
(b) Herstellen einer Vakzine-Zusammensetzung, umfassend das von einem Pflanzenwirt exprimierte scFv und ein Adjuvans.
Ebenfalls bereitgestellt werden Vakzine-Zusammensetzungen, die ein von Pflanzen produziertes scFv-Molekül, das für die Ig-VH- und Ig-VL-Domänen des Ig eines B-Zell-Lymphoms eines Patienten kodiert, und ein Adjuvans umfassen, worin das scFv-Molekül mit dem oben beschriebenen Verfahren produziert worden ist. Die Erfindung stellt außerdem die Verwendung solcher Vakzine-Zusammensetzungen bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von B-Zell-Lymphom bereit.
Die Zusammensetzungen dieser Erfindung werden rekombinant durch Expression eines heterologen Gens oder einer heterologen Nucleinsäure in einem Pflanzenwirt produziert, der das Protein in löslicher Form produziert und vorzugsweise sekretiert. Ein „lösliches Protein" oder eine „lösliche Form" bezieht sich auf ein Protein, Polypeptid oder Peptid, das bei Produktion richtig gefaltet wird, so dass es nicht zuerst eine Denaturierung einer anfänglich unlöslichen Form, gefolgt von der Renaturierung zur löslichen Form erfordert. Ein wichtiger Beitrag der vorliegenden Erfindung ist das Mittel zur Produktion eines derartigen löslichen Proteins in einer Pflanze, während die verschiedenen schädlichen Wirkungen von einem oder mehreren Zyklen der Denaturierung und Renaturierung vermieden werden, die häufig benötigt werden, um ein rekombinantes heterologes Protein für seinen beabsichtigten Zweck brauchbar zu machen.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können in einer Zelle oder in einem Organismus, vorzugsweise in einer Pflanze, produziertes Polypeptid-Selbst-Antigen umfassen, sind als eine tumorspezifische Vakzine in einem Patienten mit Tumor oder einem Risiko der Entwicklung eines Tumors zweckdienlich und umfassen zumindest ein Polypeptid, das von einem Gen oder von Genen in den Zellen des Tumors kodiert wird, wobei das Polypeptid:
(a) ein Epitop oder Epitope umfasst, die für die Zellen des Tumors einzigartig sind oder von diesen überexprimiert werden, wodurch der Tumor von allen anderen Tumoren unterschieden wird, die:
(i) vom selben oder einem anderen histologischen Typ sind und
(ii) sich im Patienten oder in einem anderen Mitglied der Spezies des Patienten finden;
(b) in einer Zelle oder in einem Organismus produziert wird, der mit der vom Tumor des Patienten hergeleiteten Nucleinsäure transformiert oder transfiziert worden ist;
(c) von der Zelle oder von einem Organismus in korrekt gefalteter Form ohne die Notwendigkeit der Denaturierung und Renaturierung erlangt werden kann und das Epitop oder die Epitope in ihrer nativen Form nachahmt;
(d) zur Induktion einer Immunreaktion in einem Säugetier, einschließlich des Patienten, fähig ist, und zwar ohne die Notwendigkeit eines Adjuvans oder anderer immunologischer Materialien, so dass die Verabreichung des Polypeptids in einer Antikörper- oder Zell-vermittelten Immunreaktion gegen das Epitop oder die Epitope resultiert.
Das obige Polypeptid kann vorübergehend in einer transformierten oder transfizierten Pflanze produziert werden.
Das obige Polypeptid umfasst zwei Polypeptiddomänen. Der Tumor ist ein B-Zell-Lymphom, und das Tumorantigen ist ein Oberflächen-Ig-Epitop oder Epitope. Das Polypeptid umfasst vorzugsweise zumindest ein idiotypisches Epitop der V_H- oder V_L-Region des Ig.
Das Polypeptid umfasst zwei V-Region-Domänen des Ig, zumindest einen Abschnitt oder die gesamte V_H-Domäne und zumindest einen Abschnitt der oder die gesamte V_L-Domäne. Der Abschnitt der V_H-Region kann zumindest eine Complementary-Determining-Region (CDR), vorzugsweise CDR2 oder CDR3 in V_H und CDR1 und V_L, umfassen. Das obige Polypeptid ist ein Zweidomänen-Einzelketten-Antikörper (scFv), der jede der V_H- und V_L-Domänen vollständig oder teilweise umfasst.
Im obigen Zweidomänen-Polypeptid sind die Domänen durch einen Aminosäurelinker verbunden, der

(a) zwischen 1 und ungefähr 50 Reste, vorzugsweise 3 bis 25 Reste, umfasst;
(b) aus 2 bis 12 verschiedenen Aminosäuren besteht und
(c) die Sekretion und korrekte Faltung des Polypeptids erleichtert, um das Tumorepitop in seiner nativen Form in oder an der Tumorzelle nachzuahmen.

Ein Linker, der sich auf dem Gebiet der Erfindung als bei der scFv-Konstruktion zweckdienlich erwiesen hat, ist (Gly₄Ser)₃, obgleich die Linker der vorliegenden Erfindung überlegen sind.
Ein Linker der Erfindung ist ein Element einer randomisierten Bibliothek von Linkern, die unterschiedliche Größen und Sequenzen aufweisen, wobei die Bibliothek von Nucleinsäuren kodiert wird, die aus einem wiederholten Muster degenerierter Triplettnucleotide bestehen, welche die folgenden Erfordernisse aufweisen;
(i) Position 1 jedes wiederholten Tripletts kann nicht dasselbe Nucleotid wie Position 2 des wiederholten Tripletts sein;
(ii) Position 2 jedes wiederholten Tripletts kann nicht dasselbe Nucleotid wie Position 3 des wiederholten Tripletts sein; oder
(iii) Position 1 jedes wiederholten Tripletts kann nicht dasselbe Nucleotid wie Position 3 des wiederholten Tripletts sein;
Bei obigem kann das Nucleotid in der ersten und zweiten Position jedes wiederholten Tripletts aus beliebigen zwei von Desoxyadenosin (dA), Desoxyguanosin (dG), Desoxycytidin (dC) oder Desoxythymidin (dT) ausgewählt werden.
In einer der Ausführungsformen ist (i) Position 1 jedes wiederholten Tripletts dA oder dG; (ii) Position 2 jedes wiederholten Tripletts dC oder dG; und (iii) Position 3 jedes wiederholten Tripletts dT.
Bei allen obigen befindet sich das Polypeptid vorzugsweise in Lösung und kann Teil einer Vakzine-Formulierung sein, worin es an/in einen Träger oder an/in ein Abgabesystem adsorbiert, gebunden oder integriert ist.
Die von jedem der obigen Polypeptide induzierte Immunreaktion ist vorzugsweise eine schützende Anti-Tumor-Immunreaktion.
Das obige Polypeptid ist vorzugsweise eines, das bei Verabreichung an einen Säugetierwirt, einschließlich an den Patienten, von dem die kodierende Sequenz hergeleitet wurde, sowie an einen Maus-Wirt eine polyklonale Anti-idiotypische zellvermittelte Immunreaktion oder Antikörperreaktion induziert. Diese Reaktionen können durch Testen von Serum oder Peripherblutzellen des Wirts nachgewiesen werden. Die Antikörperreaktion wird vorzugsweise als Serumantikörper, beispielsweise in einem Enzym-Immuntest oder mittels Durchflusszytometrie, gemessen. In einer der Ausführungsformen ist das Polypeptid eines, das bei Verabreichung eine Immunreaktion auslöst, und zwar durch subkutane Immunisierung mit zumindest ungefähr 15 μg, vorzugsweise 30 μg, des Polypeptidantigens dreimal im Abstand von zwei Wochen. Die zelluläre Immunreaktion kann in einem T-Lymphozyten-Proliferationstest oder als T-Zell-Freisetzung von einem oder mehreren Cytokinen bei In-vitro-Stimulierung mit dem Polypeptid gemessen werden. Eine Zell-vermittelte Immunität kann außerdem in einem In-vivo-Test nachgewiesen werden, beispielsweise als verzögerte Hypersensitivitätsreaktion in einem immunisierten Patienten (Mensch oder Tier). Die Reaktion wird typischerweise durch subkutane oder intradermale Exposition mit dem Polypeptidantigen hervorgerufen.
Die vorliegende Erfindung kann ein Individuen-spezifisches immunogenes Produkt umfassen, welches das oben beschriebene Polypeptid umfasst, das durch ein Verfahren hergestellt wird, das die folgenden Schritte umfasst:

(a) Verbinden einer Nucleinsäure, die für die erste Domäne des Polypeptids kodiert, mit einer Nucleinsäure, die für einen ersten Abschnitt eines Linkers kodiert, um ein erstes Nucleinsäurefragment herzustellen;
(b) Verbinden der Nucleinsäure, die für einen zweiten Abschnitt des Linkers kodiert, mit einer Nucleinsäure, die für eine zweite Domäne des Polypeptids kodiert, um ein zweites Nucleinsäurefragment herzustellen;
(c) In-frame-Inkorporieren des ersten und des zweiten Fragments in einen vorübergehenden Pflanzenexpressionsvektor, so dass das Polypeptid bei Expression die erste und zweite Domäne trägt, die durch einen Linker getrennt sind;
(d) Transfizieren einer Pflanze mit dem Vektor, so dass die Pflanze vorübergehend das Polypeptid produziert; und
(e) Gewinnen des Polypeptids als lösliches, korrekt gefaltetes Protein.

Die erste Domäne ist die Ig-V_H-Domäne, und die zweite Domäne ist die Ig-V_L-Domäne, die beide einen Idiotyp (einen oder mehrere Idiotypen) des Ig des B-Zell-Lymphoms erzeugen und worin das Produkt eine Idiotyp-spezifische Immunreaktion induziert, die bei Verabreichung an einen Patienten gegen das Lymphom gerichtet ist.
Die „Pflanze", in der das Polypeptid produziert wird, kann eine Pflanzenzelle sein. Ebenfalls bereitgestellt werden Vakzine-Zusammensetzungen, die zur Induktion einer systemischen, tumorspezifischen Immunreaktion fähig sind, die (a) beliebige der oben erwähnten Polypeptide; und (b) einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Exzipienten umfassen. Das Polypeptid kann an/in einen Träger oder an/in ein Abgabesystem adsorbiert, gebunden oder integriert sein.
Die Vakzine-Zusammensetzung ist vorzugsweise eine, die eine systemische, Idiotypspezifische Anti-Lymphom-Immunreaktion induzieren kann, bevorzugter eine Reaktion gegen zumindest einen Idiotyp eines Oberflächen-Ig. Die Vakzine kann auch bezüglich ihrer Kapazität definiert werden, eine polyklonale Immunreaktion, wie z.B. eine Antikörperreaktion, gegen einen Idiotyp in einer Maus zu induzieren. Das Polypeptid der Vakzine-Zusammensetzung ist ein scFv, das die V_H- und V_L-Domänen umfasst.
Die obige Vakzine-Zusammensetzung sollte bei Verabreichung an einen Patienten, in dem der Tumor entstand, eine schützende Anti-Tumor-Immunreaktion hervorrufen, die eine polyklonale Anti-idiotypische Antikörperreaktion oder eine T-Zellvermittelte Reaktion sein kann.
Alle vorangehenden Vakzine-Zusammensetzungen können mit einem immunstimulierenden Cytokin, Lymphokin oder Chemokin ergänzt werden. Bevorzugte Cytokine sind GM-CSF (Granulozyten-Makrophagen-koloniestimulierender Faktor), Interleukin 1, Interleukin 2, Interleukin 12, Interleukin 18 oder Interferon γ.
Die Vakzine-Zusammensetzung liegt vorzugsweise in Einheitsdosisform vor, worin der Exzipient sterile Salzlösung ist und worin jede Einheit ungefähr 0,1 mg bis 10 mg des Polypeptids umfasst.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können in einem Verfahren der Induktion eines tumorspezifischen Antikörpers oder einer zellvermittelten Immun reaktion bei (i) einem Tumor-tragenden Patienten oder (ii) einem Patienten verwendet werden, der einen Tumor hatte und behandelt wurde, so dass kein Tumor klinisch oder radiographisch vorhanden ist, wobei das Verfahren die Verabreichung einer wirksamen Dosis einer hierin beschriebenen Vakzine-Zusammensetzung umfasst. Der Tumor ist B-Zell-Lymphom, und das Polypeptid ist das scFv, das einen Abschnitt der (oder die gesamten) V_H- und V_L-Domänen umfasst. Bei diesem Verfahren erfolgt die Verabreichung im Allgemeinen durch einen parenteralen Weg, wie z.B. den subkutanen, intradermalen, transdermalen oder intramuskulären Weg.
Beim vorliegenden Verfahren liegt das Polypeptid in Einheitsdosisform in wässriger Lösung in einer Konzentration zwischen ungefähr 0,1 mg/ml und 10 mg/ml vor.
Das Verfahren der Induktion einer systemischen Immunreaktion ist bei Tieren, vorzugsweise Menschen, zweckdienlich.
Das Verfahren der Herstellung des Polypeptids kann die folgenden Schritte umfassen:

Im vorhergehenden Verfahren ist das Polypeptid ein scFv, worin die erste Domäne die Ig-V_H-Domäne und die zweite Domäne die Ig-V_L-Domäne ist, wobei beide Domänen einen Idiotyp (einen oder mehrere Idiotypen) eines Oberflächen-Ig eines B-Zell-Lymphoms erzeugen und worin das Produkt bei Verabreichung an einen Patienten eine gegen das Lymphom gerichtete Idiotyp-spezifische Reaktion induziert.
Eine zur vorübergehenden Expression eines heterologen Proteins in einer Pflanze zweckdienliche Nucleinsäure umfasst:

(a) eine Nucleinsäuresequenz, die für eine Signalpeptidsequenz kodiert, die neu synthetisiertes Protein in den Sekretionsweg der Pflanze leitet;
(b) eine In-frame an (a) fusionierte Nucleinsäuresequenz oder Sequenzen, die für das Polypeptid aus irgendeinem der Ansprüche 1–15 kodiert;
(c) einen operativ an die Sequenz oder Sequenzen von (a) und (b) gebundenen nativen Pflanzen-Subgenom-Promotor, der die extrachromosomale Expression des Polypeptids in der Pflanze reguliert;
(d) Kontrollelemente, die mit der Expression des Polypeptids in der Pflanze kompatibel sind.

Hierin werden Beweise dafür dargelegt, dass eine vorübergehende Tobamovirus-Infektion die Expression eines löslichen scFv-Proteins in einer vollständigen Pflanze erfolgreich antreiben kann. Obgleich scFv-Proteine durch transgene Technologie produziert worden sind, ist die vorliegende Erfindung das erste Beispiel derartiger Immunogene, die in Pflanzen durch vorübergehende Virusexpression rasch produziert werden. Im Gegensatz zu herkömmlichen transgenen Ansätzen in Pflanzen, die Monate oder Jahre beanspruchen können, wurden Pflanzenproben, die das gewünschte Protein exprimierten, durch ELISA sowie Western-Analyse etwa vier Wochen nach molekularer Klonierung positiv identifiziert. Wegen der Geschwindigkeit der Expression und der Leichtigkeit der Isolation von Proteinen aus angereicherten Sekretionsfraktionen stellt der vorliegende Ansatz eine drastische Verbesserung der Effizienz der Produktion komplexer, biologisch aktiver Proteine in Pflanzen dar.
Allgemeine Literatur
Wenn nicht anders angegeben, setzt die praktische Umsetzung vieler Aspekte der vorliegenden Erfindung herkömmliche Technikender Molekularbiologie, rekombinanten DNA-Technologie und Immunologie ein, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind. Derartige Techniken werden ausführlicher in der wissenschaftlichen Literatur beschrieben, beispielsweise in J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausg., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, aktuelle Ausg.; B. Albers et al., Molecular Biology of the Cell, 2. Ausg., Garland Publishing Inc., New York, NY (1989); B.M. Lewin, Genes IV, Oxford University Press, Oxford (1990); J.D. Watson et al., Recombinant DNA, 2. Ausg., Scientific American Books, New York (1992); J.E. Darnell et al., Molecular Cell Biology, Scientific American Books Inc., New York, NY (1986); R.W. Old et al., Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering, 2. Ausg., University of California Press, Berkeley, CA (1981); DNA Cloning: A Practical Approach, Bd. I und II, D. Glover (Hrsg.); Oligonucleotide Synthesis, aktuelle Ausg., N. Gait (Hrsg.); Nucleic Acid Hybridization, aktuelle Ausg., B. Hames und S. Higgins (Hrsg.); Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques, Berger und Kimmel (Hrsg.) (1887); E. Hartlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1988), J.E. Coligan et al. (Hrsg.), Current Protocols in Immunology, Wiley-Interscience, New York (1991). Proteinstruktur und Funktion werden in G.E. Schulz et al., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York (1978), und T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco (1983), erörtert.
Definitionen
Der folgende Abschnitt stellt Abkürzungen und Definitionen bereit, die hierin verwendet werden und die über das hinausgehen können, was im Abschnitt „Hintergrund" dargelegt wurde.
Eine „Domäne" bezieht sich im Allgemeinen auf eine Region einer Polypeptidkette, die auf eine Weise gefaltet ist, die eine bestimmte biochemische Funktion verleiht. (Schulz et al., s.o.). Jedoch können Domänen hinsichtlich Struktur und Funktion definiert werden. Eine funktionelle Domäne kann eine einzelne Strukturdomäne sein, kann jedoch auch mehr als eine Strukturdomäne umfassen. Derartige Funktionen können enzymatische katalytische Aktivität, Ligandenbindung, Chelatierung eines Atoms oder endogene Fluoreszenz umfassen. Wie oben erörtert und von besonderer Bedeutung für diese Erfindung bilden V_H- und V_L-Regionen von Ig-Molekülen jeweils einzelne Strukturdomänen, die bei der Bildung einer Antigen-kombinierenden Stelle zusammenarbeiten. Die Funktion einer Domäne ist weitgehend von den unterschiedlichen Formen bestimmt, zu denen sie sich faltet. Obgleich am häufigsten zur Beschreibung von Proteinen verwendet, kann eine „Domäne" auch eine Region einer Nucleinsäure beschreiben, entweder die kodierende Sequenz einer Polypeptiddomäne oder eine Nucleinsäurestruktur, die eine bestimmte Funktion ausführt (z.B. die katalytische Aktivität eines Ribozyms oder Proteinbindung).
Der Ausdruck „immunogen" oder „Immunogenität" bezieht sich auf die Fähigkeit eines Moleküls oder einer anderen Zusammensetzung (einschließlich Zellen und Mikroorganismen), bei Verabreichung in geeigneter Form und durch einen geeigneten Weg an ein Säugetier eine antikörper- oder zellvermittelte Immunreaktion zu induzieren. Dieser Ausdruck steht dem Ausdruck „antigen" oder „Antigenität" gegenüber, der sich lediglich auf die Fähigkeit des Moleküls (oder der Zelle oder des Organismus) bezieht, von einem Antikörper erkannt zu werden, worunter im Allgemeinen die Bindung an einen Antikörper verstanden wird.
„Idiotyp" („Id") bezieht sich auf einen Satz von Epitopen, die in Ig-V-Domänen vorliegen. Diese Epitope werden auch „Idiotope" genannt. Typischerweise wird ein Idiotyp oder ein Epitop davon durch die Assoziation der hypervariablen oder Complementary-Determining-Regions (CDRs) von V_H- und V_L-Domänen gebildet.
Ein „Anti-idiotypischer Antikörper" („Anti-Id") bezieht sich auf einen für einen oder mehrere Idiotope spezifischen Antikörper.
Ein „Fv-Fragment" eines Ig-Moleküls ist ein Disulfid-verbundenes Fragment, dass ein Dimer zwischen einer V_H- und einer V_L-Domäne ist, das bei richtiger Faltung die natürliche Faltung dieser beiden Domänen widerspiegeln sollte, wie sie sich in einem intakten Ig-Molekül finden.
Ein „Einzelketten-Antikörper" („scFv", von anderen auch „scAb" genannt) ist ein Einzelketten-Polypeptidmolekül, worin eine Ig-V_H-Domäne und eine Ig-V_L-Domäne künstlich durch einen kurzen Peptidlinker verbunden sind, der es dem scFv ermöglicht, eine Konformation einzunehmen, welche die Spezifität und Bindungskapazität für das Antigen (oder Epitop) beibehält, gegen das der ursprüngliche Antikörper (von dem die V_H- und V_L-Domänen stammen) spezifisch war.
Ein „Selbst-Antigen" ist eine Komponente einer Zelle eines Individuums, die normalerweise vom Immunsystem des Individuums nicht auf eine Weise erkannt wird oder auf die das Immunsystem des Individuums zumindest nicht in der Weise reagiert, in der es auf ein fremdes Antigen reagiert. Selbst-Antigene sind durch verschiedene Manipulationen zu Immunogenen umgesetzt worden, wie z.B. durch Binden an ein Trägerprotein oder durch Expression in einem nicht-nativen Zusammenhang, wie z.B. als ein in einer Pflanzenzelle exprimiertes menschliches Selbst-Antigen. Im Zu sammenhang mit einer der Ausführungsformen dieser Erfindung ist ein „Selbst-Antigen" ein Selbst-Idiotyp oder -Idiotop, das größtenteils vom Genom des Individuums kodiert wird, jedoch eingesetzt werden kann, um eine Immunreaktion auf den Idiotyp eines B-Zell-Klons oder B-Zell-Lymphoms dieses Individuums zu induzieren, und zwar aufgrund der Art und Weise, in der Selbst-Antigen produziert oder behandelt worden ist. Das B-Zell-Lymphom-Selbst-Antigen wird ein ausreichendes Maß an idiotypischer Struktur des normalen Oberflächen-Ig der B-Zelle beibehalten oder diese Struktur nachahmen, so dass eine Immunreaktion dieses Selbst-Antigens auf die Lymphom-Zellen abgezielt wird.
Die Ausdrücke „B-Lymphozyt" und „B-Zelle" sind austauschbar und sehen die Definition jeglicher Zelle innerhalb der B-Zelllinie bis hinunter zu den B-Zell-Vorläufern, wie z.B. Prä-B-Zellen (B220⁺-Zellen, die begonnen haben, Ig-V_H-Gene umzuordnen) und bis hinauf zu reifen B-Zellen und selbst Plasmazellen vor. („Myelom"-Zellen sind ein Typ einer malignen Plasmazelle.)
Ein „B-Zell-Lymphom" ist ein Krebstyp, der aus einem malignen Klon von B-Lymphozyten besteht. Jeder dieser Klone exprimiert ein einzigartiges Zelloberflächen-Ig, das einen aus einem oder mehreren Idiotopen zusammengesetzten Idiotyp trägt. Der Ausdruck ist nicht durch das klinische Stadium oder den histopathologischen Subtyp des B-Zell-Lymphoms eingeschränkt und umfasst frühe, mittlere und späte Stadien. Derartige Lymphomzellen liegen üblicherweise als massiver Tumor vor, häufig im Inneren von organisiertem Lymphgewebe, wie z.B. Lymphknoten oder Milz.
Eine „B-Zell-Lymphom-Vakzine" bezieht sich auf eine Zusammensetzung, wovon der aktive Bestandteil ein immunogenes Molekül ist, das fähig ist, eine Immunreaktion gegen einen für dieses Lymphom kennzeichnenden B-Zell-Idiotyp zu induzieren. Diese Vakzine, alleine oder in Kombination mit anderen therapeutischen Modalitäten, ist zur Behandlung eines Patienten zweckdienlich, der dieses Lymphom trägt. Das Immunogen in einer B-Zell-Lymphom-Vakzine der vorliegenden Erfindung ist in der Tat ein Selbst-Antigen, da es ein normales Produkt von B-Zellen eines Patienten ist, das klonal an den Lymphomzellen exprimiert wird und als einzigartiges Ziel für einen Immunangriff dient.
Mit dem Ausdruck Immunglobulin-„Isotyp" wurden ursprünglich antigene Determinanten bezeichnet, die Igs aller Elemente einer bestimmten Tierspezies (z.B. Mensch) gemeinsam haben, die jedoch bei Individuen anderer Spezies (z.B. Maus) fehlen. (Dies steht im Gegensatz zu (1) „Allotypen", die aus Epitopen resultieren, die nur in einigen Individuen innerhalb einer Spezies vorkommen und Allele am Ig-H- oder L-Ketten-Locus widerspiegeln, und (2) „Idiotypen", die Individuen-spezifische Epitope sind.) Jedes normale Individuum einer Spezies weist ein Gen auf, das für jeden Isotyp kodiert. Bei der Entwicklung des Gebiets der Immunologie sind die Definitionen dieser Ausdrücke erweitert worden, so dass sich „Isotyp" auf jegliche Marker, nicht nur auf serologisch nachweisbare bezieht, die Ig-Ketten (z.B. γ1 von μ) oder vollständige Ig-Moleküle (z.B. IgG1 von IgM) unterscheiden.
Ein „polyklonales Antiserum" oder „polyklonales Serum" bezieht sich auf das Serum, das aus einem Tier (üblicherweise aus einer Maus) erhalten wurde, das mit einem Antigen (Immunogen) immunisiert worden ist, so dass das Serum eine Population von Antikörpern enthält, die von mehreren B-Zell-Klonen stammen (daher „polyklonal"), wobei einer oder mehrere dieser Antikörper verschiedene Epitope am immunisierenden Antigen erkennen.
„Pharmazeutisch annehmbare Exzipienten" umfassen jegliche mehr oder weniger inerte Substanz, die einer Vakzine oder einem aktiven pharmazeutischen Mittel zugegeben werden, um ihr/ihm eine geeignete Konsistenz oder Form zu verleihen oder die Abgabe der Vakzine oder des Mittels an den Patienten zu fördern und ihre/seine Effizienz zu verbessern.
Ein „Adjuvans" ist jegliche Substanz, die einem Immunogen oder einer Vakzine-Zusammensetzung zugegeben werden kann, um die immunstimulierenden Eigen schaften der immunogenen Gruppierung zu verstärken, wie z.B. ein Protein oder Polypeptid.
Ein „Cytokin" ist ein von Zellen freigesetztes Protein, das typischerweise auf Zellen in der Nachbarschaft („Paracrin") wirkt und ihr Verhalten beeinflusst. Cytokine umfassen Lymphokine (aus Lymphozyten), Chemokine (aus verschiedenen Zelltypen) und andere verwandte Signalmoleküle. Tumornekrosefaktor (TNF) und verschiedene Interferone sind Beispiele von Cytokinen. Interleukine sind eine wichtige Gruppe von Cytokinen; eine signifikante Anzahl an Interleukinen sind Lymphokine.
„Parenterale Verabreichung" bezieht sich auf jeglichen Verabreichungsweg einer Substanz, der nicht durch den Verdauungskanal erfolgt (z.B. Fütterung, Magenlavage). Beispiele parenteraler Wege sind subkutane, intradermale, transkutane, intravenöse, intramuskuläre, intraorbitale, intrakapsuläre, intrathekale, intraspinale, intrazisternale, intraperitoneale oder bukkale Wege usw.
Der Ausdruck „Denaturierung" bezieht sich typischerweise auf eine(n) reversible(n) oder irreversible(n) Verlust oder Verminderung der biologischen Aktivität eines Proteins, der/die aus einem Verlust oder einer Veränderung der Sekundär-, Tertiär- oder Quartärstruktur höherer Ordnung resultiert, der/die durch Exposition mit nichtphysiologischen Bedingungen induziert worden ist. Beispiele derartiger Bedingungen sind Extreme von pH, Temperatur, Salzkonzentration oder Exposition mit einem organischen Lösungsmittel. Der Ausdruck „Renaturierung" beschreibt die Umwandlung eines denaturierten Proteins in seine annähernd native Form zusammen mit der Wiederherstellung seiner biologischen/Liganden-bindenden Funktion. Im Zusammenhang mit dieser Erfindung beziehen sich Denaturierung und Renaturierung auf die Behandlungen, die notwendig sind, um ein Protein in seiner nativen Konformation zu erlangen, wenn es in bestimmten heterologen Expressionssystemen nach dem Stand der Technik produziert wird. In einem der Zusammenhänge beziehen sich die Ausdrücke auf jegliche induzierte Änderung der Konformation eines Ig-basierten Proteins/Peptids, welche die Zugänglichkeit ihrer Epitope für Zellen oder Moleküle des Immunsystems, in erster Linie für Antikörper, verändern könnte. Eine wichtiges Merkmal der vorliegenden Erfindung ist es, dass sie funktionelle Proteine, vorzugsweise scFv-Moleküle, ohne die Notwendigkeit einer Denaturierung und Renaturierung während ihrer Expression, Extraktion und Reinigung bereitstellt, was außerdem in höheren Ausbeuten des Produkts in einer gewünschten nativartigen Konformation resultiert, welche die Immunogenität beibehält.
Eine „Pflanze" ist als ein organisierter lebender Organismus aus dem Pflanzenreich oder als jeglicher Teil dieses Organismus definiert. Daher umfasst „Pflanze" ohne Einschränkung eine Pflanzenzelle, einen Pflanzen-Protoplasten, Pflanzengewebe oder jeglichen Pflanzenteil, einschließlich Wurzel, Stamm, Blatt, Blattader, Blüte, Samen oder interstitielle Flüssigkeit.
Kurzbeschreibung der Abbildungen
1 ist ein Satz von Western-Blots, der die Ergebnisse der SDS-PAGE von 9 einzelnen Klonen darstellt, die CJ-scFv in Pflanzen exprimieren, die mit dem für den Idiotyp von CJ spezifischen CJ-mAb 7D11 entwickelt wurden.
2 ist eine Grafik, die eine durch menschliches CJ-scFv-Protein induzierte Maus-Immunreaktion darstellt. Fünf Tiere wurden subkutan drei Mal alle zwei Wochen mit 30 μg Protein in steriler Salzlösung geimpft. Nach der dritten Impfung wurde den Tieren Blut abgenommen und die Seren mittels ELISA auf Antikörper gegen CJ und Antikörper gegen menschliches IgG getestet. Die Seren aller fünf Tiere wiesen für CJ spezifische Antikörper auf (polyklonale Reaktionen). Drei Tiere wiesen geringe, jedoch nachweisbare Mengen an „nicht-spezifischen" Antikörpern gegen menschliches IgG auf.
3 zeigt ein schematisches Diagramm des viralen Expressionsvektors, der zur Produktion des 38C13-scFv (von der Maus stammend) in Nicotiana-benthamiana-Wirtspflanzen verwendet wurde. Dargestellt sind die Nucleotidsequenzen, die für das Reis-α-Amylase-Signalpeptid kodieren, fusioniert In-frame an die Sphl-Stelle (unterstrichen), mittels PCR eingeführt 5' der für die 38C13-H-Kette kodierenden DNA-Sequenz. Ebenfalls in der linearen Karte bezeichnet sind die relativen Positionen der SP6-Transkriptionsstartstelle, der 126-kDa-, 183-kDa- und 30-kDa-Proteine aus TMV, des ToMV-Hüllproteins (Tep) und der pBR322-Sequenzen für die bakterielle Vermehrung.
4 ist eine Grafik, welche die Konzentration von in geimpften Mäusen produzierten Anti-38C13-Antikörpern darstellen. Zehn Tage nach der dritten Impfung (siehe Protokoll für 1) wurden die Seren aus 10 Mäusen (Stamm C3H) jeder Gruppe gepoolt und auf Bindung an natives 38C13-IgM getestet. Die Gruppen wurden mit Folgendem geimpft:
(a) 38C13-scFv („scFv"); (b) 38C13-scFv plus QS-21-Adjuvans („scFv+Q") und (c) 38C13-IgM, gekoppelt an KLH plus QS21 („IgM-KLH+Q"). Serumspiegel von IgG1- und IgG2a-Antikörper wurde unter Verwendung von 38C13-IgM als Testantigen gemessen. Es wurden Standards gereinigter Maus-Anti-38C13-Antikörper bekannten Isotyps verwendet. IgG1-Antikörper (schraffierter Balken) und IgG2a-Antikörper (voller Balken). Kontrollen, die QS-21-Adjuvans alleine erhielten, wiesen keine nachweisbaren Anti-38C13-Antikörper auf.
5 ist eine Überlebenskurvengrafik, die Schutz vor Tumorexposition in Mäusen zeigt, die mit Pflanzen-hergeleitetem scFv-Protein immunisiert waren. Der Tumorschutz (Überleben) wurde vom Zeitpunkt der Tumorimplantation an (Tag 0) gemessen. Die Gruppen sind im Hauptteil der Figur bezeichnet. Die Ergebnisse repräsentieren zwei Experimente. Alle 3 geimpften Gruppen unterschieden sich signifikant von den anfälligen Kontrollen (Gruppe 1) (p< 0,00001), unterschieden sich jedoch nicht signifikant untereinander (p-Werte sind zum Vergleich in der Figur dargelegt).
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren der Verwendung von Expressionssystemen auf Pflanzenbasis bereit, um individualisierte (oder Individuums-spezifische) tumorspezifische Imunogene herzustellen, die eigentlich an der Tumorzelloberfläche exprimiertes Selbst-Antigen sind, jedoch trotzdem Immunreaktionen induzieren, die auf den Tumor abzielen. Herkömmlicherweise mussten Selbst-Antigene oder andere tumorassoziierte Antigene für eine signifikante Immunogenität stark modifiziert werden. Das hierin beschriebene vorübergehende heterologe Expressionssystem auf Pflanzenbasis produziert korrekt gefaltete Polypeptide in überraschend hoher Menge und mit überraschend potenter Immunogenität. Diese Produkte sind als „inhärent immunogen" definiert, so dass potente Immunreaktionen gegen sie erzeugt werden, und zwar ohne die Notwendigkeit, auf die Konjugation an Trägermoleküle oder exogene T-Helferzellenepitope oder externe Adjuvantien zurückzugreifen. (Jedoch liegen Verfahren, die Adjuvantien, Träger und Helferepitope verwenden, trotzdem im Schutzumfang der Erfindung.) Dieses System ermöglicht die rasche und ökonomische Produktion brauchbarer Mengen derartiger Proteine oder Polypeptide.
Unter „vorübergehender" Expression wird eine Expression verstanden, die keine genetische Integration der exprimierten heterologen Nucleinsäure in das Genom der Wirtspflanze umfasst. Typischerweise kann eine vorübergehende Expression etwa vier Wochen andauern, obgleich der Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung ohne Weiteres anerkennen wird, dass dies einen großen Bereich an Intervallen umfasst.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind Vakzine-Zusammensetzungen und Verfahren zur Induktion einer systemischen Immunreaktion auf B-Zell-Lymphom (oder NHL) spezifisch, indem sie auf den Idiotyp der Oberflächen-Ig-Moleküle des Tumors abzielen. Die Schritte zur Produktion dieser neuen Vakzine-Zusammensetzungen beginnen mit der Isolierung von B-Lymphomzellen aus dem Tumor-tragenden Individuum. Die Oberflächen-Ig-Moleküle an den Lymphomzellen werden hinsichtlich der H-Ketten- und L-Ketten-Isotypen analysiert. Für die V_H- und V_L-Regionen der einzig artigen Ig-Marker des Tumors kodierende DNA-Sequenzen werden kloniert. Die V_H- und V_L-DNA-Sequenzen werden dann durch eine neue Linkersequenz (der Gegenstand der gemeinsam abgetretenen, ebenfalls anhängigen, unten ausführlicher beschriebenen Anmeldung USSN 60/155.978) verbunden, was in der Erzeugung eines DNA-Moleküls resultiert, das für ein antikörperartiges Einzelkettenprodukt, scFv, kodiert, das anschließend in Pflanzen exprimiert wird. Das scFv-Polypeptidprodukt ahmt die Struktur der V-Region-Domäne an der Lymphom-Zelloberfläche nach und hat den Idiotyp mit dieser Oberflächen-Ig-V-Domäne gemeinsam. Dieses scFv-Polypeptid ist eigentlich ein Selbst-Antigen, da seine maßgeblichen Epitope Produkte des Genoms des Patienten sind. Das scFv dient als das Immunogen, dem aktiven Bestandteil in Vakzine-Zusammensetzung dieser Erfindung.
Es wichtig anzuführen, dass im Gegensatz zum Stand der Technik ein scFv nicht aufgrund seiner Antigenbindungseigenschaften oder seiner Spezifität als Antigenerkennungsstelle eines Antikörpers (in modifizierter Form) verwendet wird. Es spielt keine Rolle, an welche Epitope (falls irgendwelche vorhanden sind) dieses scFv über seine Antigen-kombinierende Stelle binden kann. Die scFv-Moleküle des Stands der Technik werden durch Antigenselektion unter Verwendung eines Antigens gereinigt, gegen das das scFv spezifisch ist. In der vorliegenden Erfindung wird dies nicht deshalb durchgeführt, weil die Antigenspezifität unbekannt und bedeutungslos ist. Daher ist die ausreichende Sekretion und richtige Faltung des vorliegenden Polypeptids besonders wichtig. Die dreidimensionale Struktur und Faltung des vorliegenden scFv-Moleküls muss derart sein, dass die seinen Idiotyp umfassenden Epitope in einer Form vorliegen, die vom Immunsystem erkannt werden können, so dass das scFv seine immunogene Aufgabe ausführen kann. Abgesehen davon besteht keine Notwendigkeit für das scFv, irgendeine Antigenbindungsfähigkeit beizubehalten, eine Eigenschaft, die hierin keine Beziehung zum Nutzen dieses Moleküls hat. Kurz gesagt muss das scFv fähig sein, sich wie ein Antigen zu verhalten, jedoch nicht notwendigerweise wie ein Antikörper.
Die für das scFv-Produkt kodierende Nucleinsäure wird unter Verwendung eines geeigneten Pflanzenvirusvektors in Pflanzen eingeführt, der unten ausführlich beschrieben wird, was zur Expression und raschen Produktion von geeignet gefaltetem und höchst immunogenem scFv-Protein in Pflanzenzellen, Pflanzenteilen und vollständigen Pflanzen führt.
Die Auswahl von hierin beschriebenen (1) geeigneten Linkern und (2) des vorübergehenden Expressionssystems gewährleistet, dass die scFv-Moleküle von den Pflanzenzellen in einer Form sekretiert werden, die in Lösung gefaltet wird und darüber hinaus zu einer Konformation gefaltet wird, die den nativen IgV-Region-Domänen an den Tumorzellen des Patienten, die das genetische Material für das scFv lieferten, gleicht und sie nachahmt. Das scFv-Produkt wird leicht als die vorwiegende sekretierte Proteinspezies in jenen Pflanzenzellen identifiziert, in die es erfolgreich inkorporiert worden ist, was eine einfache Selektion und unkomplizierte rasche Reinigung für die hierin beschriebenen Verwendungen, vorzugsweise als Vakzine-Zusammensetzung, ermöglicht.
Wegen der korrekten Faltung ist das vorliegende Pflanzen-hergeleitete scFv-Molekül fähig, eine polyklonale Antikörper- oder zelluläre Immunreaktion in einem Säugetier, ganz besonders im autologen Individuum, zu stimulieren, aus dessen Tumor die für die scFv-Domänen kodierende mRNA entnommen wurde.
Eine Antikörperreaktion ist als die Gegenwart von Antikörpern im Serum bei einem mittels ELISA ermittelten Titer oder in einem Ausmaß von mehr als 2-mal über dem Hintergrund definiert, wobei die Antikörper für den B-Lymphom-Oberflächen-Ig-Idiotyp (das Selbst-Antigen) spezifisch ist. Eine proliferative T-Zell-Reaktion muss von einer ausreichender Größenordnung sein, so dass in Gegenwart von Antigen (gegenüber „kein Antigen"-Kontrollen) die T-Zellen einen Stimulationsindex von zumindest 2 oder eine statistisch signifikante Erhöhung der Aktivität (ob mittels kolorimetrischen Test oder Radionuklid-Aufnahme) von zumindest 20 % aufweisen.
Die mit den hierin offenbarten Verfahren hergestellten Zusammensetzungen dieser Erfindung können verwendet werden, um Immunreaktionen gegen jeglichen Typ von B-Zell-Lymphom, z.B. Lymphom im frühen, mittleren oder späten Stadium, in jeglichem Tier, vorzugsweise im Menschen, zu induzieren, und erzielen vorzugsweise eine therapeutische Wirkung. Jedoch ist ihr Nutzen nicht auf die Therapie beschränkt. Vielmehr können die scFv-Moleküle und andere Protein- oder Polypeptidprodukte dieser Erfindung als Immunogene verwendet werden, um Antiseren, Idiotypspezifische Hybridomzelllinien, monoklonale Antikörper, antigenspezifische T-Zellen und T-Zelllinien, einschließlich tumorspezifische CD4+-T-Helferzellen oder regulatorische Zellen oder CD8+-tumorspezifische zytotoxische T-Zellen und dergleichen, entweder für Forschungsanwendungen oder für weitere klinische (diagnostische und/oder therapeutische) Verwendungen zu erzeugen. Beispiele weiterer klinischer Verwendungen umfassen die passive Immunisierung. Derartige Zellen oder Zelllinien können mit Cytokin-Genen, z.B. GM-CSF, mit für Superantigene kodierenden Genen oder anderen immunstimulatorischen Produkten transduziert werden, wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist, und können selber als Therapiemittel eingesetzt werden.
Zusätzlich zu den tumorspezifischen/Selbst-Antigenen, die hier ausführlich beschrieben werden und Ig-V-Domänen umfassen, kann die vorliegende Erfindung direkt auf andere bekannte Tumorantigene/Selbst-Antigene angewendet werden, die auf ähnliche Weise durch Expression in Pflanzen zur Erlangung richtiger Faltung und verstärkter Immunogenität verwendet werden können. Beispiele umfassen Antigene, die nicht notwendigerweise klonal verteilt, sondern eher für einen bestimmten Tumortyp oder eine Familie von Tumoren typisch sind, wie z.B. karzinoembryonales Antigen (CEA), Prostata-spezifisches Antigen (PSA), das in Prostata-Adenokarzinomen vorhanden ist, in Melanomen vorhanden Tyrosinase und viele andere bekannte und bislang unentdeckte Tumor/Selbst-Antigene. Ein weiterer Typ von klonal verteiltem Selbst-Antigen, der Gegenstand dieser Erfindung ist, ist eine T-Zell-Rezeptor- (TCR-) Domäne, die einen Abschnitt einer TCR-α-, -β-, -γ- oder -δ-Ketten-V-Region (oder eine Kombination davon) umfasst. Derartige auf TCR basierte Selbst-Antigene können Marker und daher Ziele bei bestimmten T-Zell-Leukämien und Lymphomen sein. Darüber hinaus kann es möglich sein, bestimmte Autoimmunerkrankungen zu modifizieren oder zu behandeln, die mit identifizierbaren T-Zellklonen oder mit der Verwendung einer bestimmten TCR-Ketten-V-Region assoziiert sind, indem mit einem den TCR-V-Region-Polypeptiden entsprechenden Polypeptidantigen immunisiert wird, das gemäß den hierin beschriebenen Verfahren hergestellt wurde.
Wenn nicht anders angegeben, setzt die praktische Umsetzung der vorliegenden Erfindung herkömmliche Techniken der Molekularbiologie, DNA-Rekombinationstechnologie und Immunologie ein, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind. Derartige Techniken sind in den vorher aufgelisteten Literaturstellen ausführlicher beschrieben.
Erlangen von tumorspezifischen V_H- und V_L-Fragmenten und Genen aus einem B-Zell-Lymphom
Tumorgewebe oder losgelöste Tumorzellen werden von einem Patienten unter Verwendung herkömmlicher Techniken erlangt, die Feinnadelaspiration, Lymphknotenbiopsie oder Knochenmarksaspiration umfassen. Vorzugsweise werden Einzelzellsuspensionen hergestellt. Die isolierten Zellen können verwendet werden, um Hybridome herzustellen, oder können direkt analysiert werden. Gesamt-RNA wird aus den Tumor-B-Zellen unter sterilen Bedingungen nach Standardprotokollen isoliert, die auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt sind. Die isolierte RNA wird als Templat für cDNA verwendet, und zwar unter Verwendung reverser Transkription, gefolgt von DNA-Amplifikation mittels Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) nach Standardprotokollen (z.B. PCR Protocols: A Guide to methods ans Applications, Innis et al. (Hrsg.) (1990)).
Parallel dazu wird der Isotyp (Klasse oder Subklasse) der H- und L-Ketten des einzigartigen Ig-Produkts des Tumors ermittelt. Die H-Kette ist im Allgemeinen vom μ-, γ1- oder γ2-Isotyp und in seltenen Fällen vom γ3- γ4- oder α-Isotyp, während die L- Kette entweder ein κ- oder λ-Isotyp ist. Jeder Isotyp kann weiter in Allotypen oder in Familien unterteilt werden (deren Anzahl für jeden Isotyp variiert), und zwar auf Basis von DNA-Sequenzähnlichkeiten im Translationsleader. Auf Basis von klonierten Keimbahn-Genen können H-Ketten-V-Gene in 7 Familien unterteilt werden, während κ- und λ-L-Ketten-V-Gene in 6 Familien bzw. 10 Familien unterteilt werden können. Reagenzien (Antikörper), die diese verschiedenen Ig-H- und -L-Ketten-Isotypen erkennen, sind im Handel erhältlich und können in einem beliebigen einer Reihe von Standardimmuntests verwendet werden, um das von irgendeiner gegebenen B-Zellen- (oder Lymphom-) Population produzierte Ig-Molekül zu identifizieren und zu charakterisieren. Für diesen Zweck geeignete Standardimmuntests oder analytische Verfahren umfassen Enzymimmuntests (EIA), Dot-Blot, Western-Blot, Immunfärbung und Durchflusszytometrie. Die durchflusszytometrische Analyse ermöglicht den gleichzeitigen Nachweis mehrerer Marker unter Verwendung unterschiedlicher fluoreszierender Marker, von denen jeder an einen anderen Bindungspartner gebunden ist und die direkte Beurteilung des Isotyps des von einer Lymphomzelle exprimierten Ig-Moleküls erlaubt.
Die PCR-Amplifikation von DNA unter Verwendung der C-Region-3'- und -Verbindungs- (J-) Region-Primer oder, vorzugsweise, -5'-Leader-Primer, ermöglicht die Klonierung aller Elemente der bekannten Ig-Genfamilien.
Erzeugung von DNA, welche die Tumor-IgV-Region-Gene repräsentiert
Ein bevorzugterer Ansatz zur Herstellung der DNA in 12 Schritten ist unten dargelegt.
Schritt 1. Erzeugung von RNA aus gefrorenen Einzelsuspensionen aus einem Lymphknoten
Dieser Schritt setzt RNeasy^TM ein, ein RNA-Herstellungsset von Qiagen. Alternative Probenpräparationen erfolgen aus gefrorenem, eingebettetem Gewebe oder aus einer Feinnadelaspiration.
Tumorzellen (0,5–10 × 10⁶) werden gefroren als Zellpellet oder in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelagert. Gefrorene Zellen in 50–100 μl werden sofort für die RNeasy-RNA-Extraktion in 350 μl RLT lysiert (Qiagen-Set-Reagens frisch hergestellt mit 10 μl 14,5 M β-Mercaptoethanol (βME) pro ml). Zellen in DMSO werden bei 37 °C rasch aufgetaut, in 10 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) resuspendiert und bei 1.500 U/min zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren. (Zentrifugationsparameter unter Annahme der Verwendung einer standardmäßigen Eppendorf-Mikrozentrifuge oder gleichwertig; folglich entsprechen die unten angegebenen U/min der „g"-Kraft auf Basis der Parameter derartiger Mikrozentrifugen). Die Zellpellets werden resuspendiert und in RLT lysiert. Wenn ausreichend Material verfügbar ist, werden die Proben in zweifacher Ausführung verarbeitet.
Die Zellen werden in 350 μl RLT lysiert, wiederholt pipettiert, bis die Klumpen verschwinden und auf eine Qiashredder/TM9-Säule aufgegeben, um eine vollständige Lyse zu erzielen. Das Präparat wird für 2 Minuten bei 14.000 U/min zentrifugiert, und die Lysate werden gewonnen. 350 μl 70%iges Ethanol (Goldshield) werden zugegeben und das Material durch Pipetieren gut vermischt. Die Lösung wird auf eine RNeasy^TM-Säule aufgegeben (einschließlich jegliches gebildete Präzipitat). Die Säulen werden 30 Sekunden bei 14.000 U/min zentrifugiert. Der Durchlauf wird verworfen und der Rest falls notwendig nochmals zentrifugiert.
Die Säulen werden mit 700 μl RW1 (im Set bereitgestellt) gewaschen, 30 Sekunden bei 14.000 U/min zentrifugiert und in ein sauberes Auffangröhrchen überführt, wo sie mit 500 μl RPE +EtOH gewaschen werden. Die Röhrchen werden 30 Sekunden bei 14.000 U/min zentrifugiert, der Durchfluss wird verworfen und die Säulen mit 500 μl RPE + EtOH gewaschen. Wiederum werden sie für 2 Minuten bei 14.000 U/min zentrifugiert, und der Durchfluss wird verworfen.
Die Säulen werden in 1,5-ml-Auffangröhrchen überführt. RNAse-freies Wasser (50 μl, im Set bereitgestellt) wird direkt auf die Säulenmembran pipettiert und die Säulen für 1–2 Minuten für die bestmögliche RNA-Gewinnung inkubiert. Schließlich werden die Säulen für 2 Minuten bei 14.000 U/min zentrifugiert.
Schritt 2: Quantifizierung von RNA mittels Absorption (A260)
Das Material wird verdünnt (4 μl in 395 μl RNAse-freiem Wasser) und die Absorption gemessen. Die RNA-Konzentration wird unter Verwendung der folgenden Formel berechnet: Absorption × Verdünnung × 0,04 = Konzentration in μg/μl
Im Allgemeinen werden aus einem Anfangspräparat von 5 × 10⁶ Zellen 0,1 bis 0,5 μg/μl erhalten. Die RNA wird mit 2 μg/Röhrchen aliquotiert und bis zur Verwendung bei –80 °C gelagert.
Schritt 3: cDNA-Synthese unter Verwendung von Superscript II (Gibco BRL)
Eine RNA-Probe wird aufgetaut und während der Zusammenstellung der Reaktionen auf Eis gehalten. Die Primer liegen in einer Konzentration von ungefähr 50 μM vor (bei Einzelverwendungsaliquoten). Um eine Kreuzkontamination von Primern aus der Matrize zu vermeiden, wird eine 2- bis 5-μl-Allquote jedes Primers vorverteilt und für eine Einzel-cDNA-Synthese eingefroren.
Das endgültige Reaktionsvolumen (RNA plus Primer) beträgt 20 μl. 1 μl jedes 3'-Primers wird gemeinsam mit RNA in ein 0,5-ml-Eppendorf-Röhrchen gegeben.
Primer-Satz 1
Cμ1 gtt ctt gta ttt cca gga gaa ag Seq.-ID Nr. 1
Cκ1 gtc ctg ctc tgt gac act ct Seq.-ID Nr. 2
β2M atc cag cgt act cca aag att Seq.-ID Nr. 3
Primer-Satz 2
Cγ1 gtg cac gcc gct ggt cag Seq.-ID Nr. 4
Cλ1 ctc cac tcc cgc ctt gtc Seq.-ID Nr. 5
β2M cat gtc tcg atc cca ctt aac Seq.-ID Nr. 6
Das Gemisch wird bei 65 °C für 5 Minuten erwärmt und die Röhrchen auf Eis überführt. Ein 20 μl-Gemisch der folgenden Reagenzien wird je Reaktion zugegeben:

8 μl 5X RT-Puffer (Gibco BRL)
4 μl 0,1 M DTT (Gibco BRL)
2 μl 10 mM dNTP (Amersham)
2 μl RNAsin (Promega)
4 μl Superscript II (Gibco BRL) (Omniscript^TM, ein Qiagen-cDNA-Syntheseenzym, kann anstelle der Superscript II-Polymerase verwendet werden)

Die Röhrchen werden kurz zentrifugiert und bei 42 °C für 60 Minuten und 50 °C für 30 Minuten in einem Thermocycler inkubiert.
Schritt 4: Reinigung der cDNA
200 μl PB (aus dem Qiagen-Gelextraktionsset) werden zugegeben und die Lösung gut vermischt. 240 μl dieses Gemischs werden auf die Qiaquick-Gelextraktionssäulen aufgegeben, die für 30 Sekunden bei 14.000 U/min zentrifugiert werden. Der Durchfluss wird verworfen. Die Säule wird mit 750 μl PE (im Set bereitgestellt; EtOH wird vor der Verwendung wie beschrieben zugegeben) gewaschen. Der Durchfluss wird verworfen. Die Säulen werden für 2 Minuten bei 14.000 U/min zentrifugiert, um die Säulen zu trocknen, die dann in saubere 1,5-ml-Eppendorf-Auffangröhrchen überführt werden.
Die Elution wird unter Verwendung (Einzelverwendungsaliquote) von sterilem Wasser durchgeführt. Wasser oder EB (40 μl) werden direkt auf die Säulenmembran aufgegeben. Für eine bestmögliche Gewinnung werden die Säulen 1–2 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen, bevor sie für 2 Minuten bei 14.000 U/min zentrifugiert werden, um das Eluat zu erhalten. Die cDNA kann bei –20 °C gelagert oder dem „G-Tailing" unterzogen werden.
Schritt 5: G-Tailing von cDNA unter Verwendung terminaler Desoxynucleotidyltrans ferase (TdT)
Zum cDNA-Präparat (z.B. 38,5 μl) werden die folgenden Reagenzien zugegeben: 5 μl New England Biolabs- (NEB-) Puffer 4; 5 μl 2,5 mM CoCl₂ (mit dem Enzym bereitgestellt); 1 μl 10 mM dGTP; und 0,5 μl TdT-Enzym. Die Bestandteile werden gut vermischt und bei 37 °C für 30 Minuten inkubiert.
In diesem Stadium werden zwei unabhängige Umläufe von PCR1 und PCR2 für Hund L-Ketten für insgesamt acht Reaktionen angesetzt. Vorzugsweise werden PCR1A (H- und L-Kette) und PCR2A (H- und L-Kette) zu anderen Zeiten als PCR1B (H- und L-Kette) und PCR2B (H- und L-Kette) durchgeführt.
Schritt 6: Erstumlauf-PCR-Amplifikation mit Nested-Primern Eine der Reaktionen wird für μ-, κ-, γ- und δ-Ketten in einem 0,5-ml-PCR-Röhrchen in einem Reaktionsendvolumen von 100 μl angesetzt. β2-Mikroglobulin (β2M) ist eine Kontrolle für jede Synthese. 3 μl cDNA werden zu 35 μl H₂O (voraliquotiert für Einzelverwendung), 10 μl 10X Cloned Pfu-Puffer (Stratagene) und den folgenden Primern zugegeben:
Gemeinsam: 1 μl 5'-C-Primer 50 μM (oder β2M-5'-Primer)
Einzigartig: 1 μl 3'-G-Region-Nested-Primer 2 (oder β2M-3'-Primer)
PCR1-5'-Primer
C-Anker 1 gac cac gcg tat cga tgt cga ccc ccc ccc ccc ccc cd
Seq.-ID Nr. 7. Das obige mit „d" bezeichnete terminale Nucleotid ist ein beliebiges Nucleotid außer C und beabsichtigt die Verankerung der Sequenz am ersten Rest vor dem G-Schwanz.
kPCR1-3'-Primer
Cμ2 aac ggc cac gct gct cgt a Seq.-ID Nr. 8
Cκ2 gtt att cag cag gca cac aac Seq.-ID Nr. 9
Cγ2 tga gtt cca cga cac cgt c Seq.-ID Nr. 10
Cλ2 gtc act tat sag aca cac cag Seq.-ID Nr. 11
Ein Gemisch von Pfu-Turbo-Enzym und Nucleotid für jede Reaktion wird wie folgt hergestellt: 2,5 μl 10 mM dNTP, 1 μl Pfu-Turbo (Stratagene) und 46,5 μl H₂O. Die Reagenzien werden gut vermischt und auf Eis gelagert.
Das cDNA-Templat und die Primer werden bei 94 °C für 4 Minuten erhitzt und kurz zentrifugiert, um jegliches Kondensat zu entfernen. Es werden sofort 50 μl des Enzym-dNTP-Gemischs zusammen mit 2 Tropfen Mineralöl (falls zur Kondensatminimierung notwendig) zugegeben. Dieses Reaktionsgemisch wird sofort bei 95 °C in einen Thermocycler gegeben und nach dem folgenden Schema zyklisiert:

1 Zyklus: 5 Minuten bei 95 °C

35 Zyklen: 1 Minute bei 55 °C 1 Minute bei 72 °C

1 Minute bei 95 °C

1 Zyklus: 10 Minuten bei 72 °C

Halten 4 °C
Das Material kann auf geeignete Produktgröße mittels 1,5%iger Agarosegelelektrophorese kontrolliert werden. Jedoch ist die Reinigung des Produkts aus der PCR1 für den nächsten Schritt nicht notwendig.
Schritt 7: Zweitumlauf-PCR-Amplifikation mit Nested-Primern
In einem Reaktionsendvolumen von 100 μl wird 1 μl des PCR-1-Gemischs mit 38 μl H₂O (voraliquotiert für Einzelverwendung), 10 μl 10X Cloned Pfu-Puffer (Stratagene) und den folgenden Primern kombiniert:
Gemeinsam: 1 μl 5'-P-Primer (50 μM)
Einzigartig: 1 μl 3'-C-Region-Nested-Primer 3
PCR2-5'-Primer
P-Anker 2 gac cac gcg tat cga tgt cg
PCR2-3'-Primer
Cμ3 gga att ctc aca gga gac ga Seq.-ID Nr. 12
Cκ3 aac aga ggc agt tcc aga ttt c Seq.-ID Nr. 13
Cγ3 ctt gac cag gca gcc cag Seq.-ID Nr. 14
Cλ3 tgt ggc ctt gtt ggc ttg aa Seq.-ID Nr. 15
Ein Pfu-Turbo-Enzym- und Nucleotidgemisch für jede Reaktion wird wie im Schritt 6 hergestellt. cDNA-Templat und Primer werden bei 95 °C für 4 Minuten erhitzt und kurz zentrifugiert, um jegliches Konjugat zu entfernen. Sofort werden 50 μl des En zym-dNTP-Gemischs zugegeben (zusammen mit 2 Tropfen Mineralöl, falls notwendig).
Dieses Reaktionsgemisch wird sofort bei 95 °C in einen Thermocycler gegeben und nach dem folgenden Schema zyklisiert:

1 Zyklus 5 Minuten bei 95 °C

25 Zyklen: 1 Minute bei 55 °C 1 Minute bei 72 °C 1 Minute bei 95 °C

1 Zyklus: 10 Minuten bei 72 °C

Halten 4 °C
Schritt 8: Reinigung des PCR-2-Produkts
Das PCR-2-Reaktionsgemisch (60 μl) wird entfernt, zu 15 μl 5X Gelbeladungspuffer zugegeben und mittels Elektrophorese an einem 1,5%igen Aragose-1X-TAE-Gel getrennt. Das die vorwiegende Bande bei 450–600 nt umgebende Gel wird herausgeschnitten. Die DNA wird aus dem Gelstück unter Verwendung des Qiaquick^TM-Gelextraktionssets von Qiagen wie folgt extrahiert: 500 μl QG (bereitgestellt) werden dem Gelstück zugegeben und bei 50 °C für 10 Minuten inkubiert oder bis das Gelstück nicht länger sichtbar ist. Das Gemisch wird auf eine Qiaquick^TM-Gelextraktionssäule aufgegeben und für 30 Sekunden bei 14.000 U/min zentrifugiert. Der Durchfluss wird verworfen, die Säule mit 750 μl PE (bereitgestellt; man gebe vor der Verwendung EtOH wie beschrieben zu) gewaschen, wobei der Durchfluss wiederum verworfen wird. Die Säule wird durch Zentrifugation für 2 Minuten bei 14.000 U/min getrocknet und in ein sauberes 1,5-ml-Eppendorf-Auffangröhrchen überführt. 40 μl 10 mM Tris pH 8,5 (bereitgestellt) werden direkt auf die Säulenmembran aufgegeben und die Säule für 1–2 Minuten bei Raumtemperatur für bestmögliche Gewinnung stehen gelassen. Die Säule wird für 2 Minuten bei 14.000 U/min zentrifugiert, um die PCR-Insert-DNA zu eluieren, die bei –20 °C gelagert wird.
Schritt 9: Klonierung der Insert-DNA
Zu diesem Zeitpunkt hat man zwei unabhängige PCR-Inserte für die H-Kette und zwei unabhängige PCR-Inserte für die L-Kette. Alle 4 Inserte werden in einen geeigneten Vektor kloniert. Das Pfu-Enzym erzeugt ein stumpfendiges Insert, das herkömmlicherweise schwierig zu klonen ist. Invitrogen hat ein Zero Blunt^TM genanntes Klonierungsset entwickelt, um stumpfendige Inserte effizient zu klonen.
3 μl gereinigtes PCR-Insert werden mit 1 μl Zero-Blunt^TM-Vektor, 1 μl 10× Ligase-Puffer (bereitgestellt), 1 μl T4-DNA-Ligase (bereitgestellt) und 4 μl H₂O vermischt. Dieses Gemisch wird bei 16 °C für 1–2 Stunden inkubiert (oder kann über Nacht stehen gelassen werden).
Die DNA wird in Top Ten^TM (bereitgestellt) oder ein beliebiges hocheffizientes chemisch Kompetentes transformiert, wie z.B. jenen mit Cobaltchlorid und Rubidiumchlorid läsionierten. Das Ligationsgemisch in 3 μl wird zu 50 ml voraliquotierten, auf Eis aufgetauten Zellen zugegeben und durch kurzes Schnalzen vermischt. Die Zellen werden für 50–60 Minuten auf Eis inkubiert und einem Hitzeschock bei 42 °C für 50 Sekunden unterzogen. Es werden 250 μl SOC-Gewinnungsmedium (bereitgestellt) zugegeben und bei 37 °C für 30–45 Minuten inkubiert. Zellen in 50–100 μl werden auf LB-Agar-Kanamycin- (50 μg/ml) Platten ausplattiert. Invertierte Platten werden bei 37 °C über Nacht inkubiert.
Es werden Kolonien entnommen und Einzelkolonien sterilen 15-ml-Röhrchen zugegeben, die 2-ml-Aliquoten von Kanamycin in LB-Bouillon enthalten (50 μg/ml).
Für jedes der H-Ketten-Inserte und L-Ketten-Inserte werden vorzugsweise 12 Kolonien entnommen (6 aus einer unabhängigen PCR/6 aus einer anderen). Die Zellen werden über Nacht (14–16 Stunden) bei 37 °C in einem Schüttler (220–300 U/min) gezüchtet.
Schritt 10: Reinigung und Sequenzierung einzelner Klone mittels Qiaprep-Miniprep-Set
Aliquoten (1,5 ml) der obigen Bakterien-Übernachtkulturen werden in ein 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen überführt, das bei 4.000 U/min für 5 Minuten zentrifugiert wird, wobei der Überstand verworfen wird. Die Röhrchen werden mittels Vortex geschüttelt, um das Bakterienpellet zu dispergieren, und es werden 250 μl P1-Puffer mit RNAse (bereitgestellt) zusammen mit 250 μl P2-Lysepuffer zugegeben und die Röhrchen für 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Danach werden 50 μl N3-Neutralisierungspuffer zugegeben, die Röhrchen verschlossen und durch 2- bis 3-maliges Rotieren der Röhrchen über Kopf vermischt. Die Röhrchen werden dann bei 14.000 U/min für 10 Minuten zentrifugiert und der Überstand auf eine Qiaprep-Säule geleert. Die Säule wird 30 Sekunden bei 14.000 U/min zentrifugiert und der Durchfluss verworfen. Die Säulen werden zwei Mal mit 750 μl PE (bereitgestellt) gewaschen, der Durchfluss verworfen und die Säulen durch Zentrifugieren für 2 Minuten bei 14.000 U/min getrocknet. Die Säulen werden in saubere 1,5-ml-Eppendorf-Auffangröhrchen überführt und 40 μl 10 mM Tris pH 8,5 (bereitgestellt) direkt auf die Säulenmembran aufgegeben. Nach dem Stehenlassen für 1–2 Minuten bei Raumtemperatur (für bestmögliche Gewinnung) werden die Röhrchen für 2 Minuten bei 14.000 U/min zentrifugiert, um die DNA zu eluieren. Diese Miniprep-DNA wird bei –20 °C gelagert oder zur Sequenzierung verwendet.
Die direkte Sequenzierung der Miniprep-DNA wird wie folgt durchgeführt. Zu 5 μl Miniprep-DNA werden 1 μl des geeigneten 3'-Primers (üblicherweise Primer 3) und 4 μl Big-Dye-Terminator^TM-Gemisch zugegeben. Um die Sequenz der Klone zu bestätigen, sollten 5 μl des ursprünglichen PCR2-Inserts aus zwei unabhängigen PCR-Reaktionen gleichzeitig sequenziert werden. Die DNA wird den Zyklen für die PCR-Sequenzierung wie von Perkin Elmer angegeben an einem 9600-Zyklensequenzierer unterzogen. Die Sequenzierungsreaktionen werden mit Princeton-Separatoren oder durch ein ähnliches Säulenfiltrationsverfahren unter Verwendung einer 96-Napf-Platte gereinigt.
Die Säulenmatrix wird für 2–3 Stunden mit H₂O hydratisiert, für 2 Minuten bei 3.500 U/min zentrifugiert (oder für 5 Minuten bei 2.000 U/min ausplattiert) und in ein sauberes Röhrchen (oder in eine 96-Napf-Platte) überführt. Die Sequenzreaktion wird zugegeben und das Röhrchen für 2 Minuten bei 3.500 U/min zentrifugiert (oder die Platte für 5 Minuten bei 2.000 U/min zentrifugiert). Von der Säule eluiertes Material wird für die Sequenzierung an einem Gel getrocknet oder direkt auf einen Kapillarelektrophorese-Sequenzierer aufgegeben.
Schritt 11: Analysieren der Sequenzdaten
Die ABI-Big-Dye-Sequenzierung erzeugt zwei Datenformate, einen linearen DNA-Code aus einer algorithmischen Prozessierung der Daten in „Base calls" oder ein graphisches Format, das „Elektropherogramm-Datei" genannt wird. Die graphische Datei ist eine Pseudo-Darstellung der Fluoreszenzpeaks für jede Base, wie sie den Detektor durchläuft. Unter Verwendung der graphischen Darstellung kann man Fehler des „base callings" durch Untersuchung der Peakhöhen und Überlappungen detektieren sowie mehrdeutige „calls" auflösen. Außerdem offenbaren Elektropherogramm-Dateien, wo im Gen mehrere Nucleotide im selben Verhältnis an derselben Position vorliegen, was ein wichtiger Vorteil für die Untersuchung der Sequenz aus PCR2-Inserten ist, die eine heterologe DNA-Population repräsentieren.
„Sequencher", ein zur Analyse von Sequenzdaten geschriebenes Programm, wird verwendet, um Elektropherogramm-Daten zu importieren und diese wie Sequenzen gemeinsam in einer einzigen Datei zu assemblieren. Unter Verwendung von Sequencher ist es möglich, „base calls" zwischen Klonen und PCR2-Insert-Sequenzen anzugleichen, zu editieren und zu interpretieren und festzustellen, welcher Klon die tumorspezifische V-Region darstellt. H- und L-Ketten-Sequenzen werden, wenn sie einmal identifiziert sind, auf Leseraster-Abnormalitäten untersucht und mit der Kabat-Datenbank von Immunglobulin-Gensequenzen verglichen, wenn eine Klassifizierung notwendig ist.
Um zu gewährleisten, dass vorhergehende Sequenzen des Patienten nicht reamplifiziert und kloniert wurden, gibt es eine laufende Master-Sequenzdatei für die μ-, κ-, γ- und λ-Klassen von V-Region-Sequenzen. Jede neue Patientensequenz wird mit allen vorhergehenden Sequenzen in der maßgeblichen Klasse verglichen und der Datei zugefügt. Die Klone werden durch einzigartige Nucleotidzusammensetzung in den hypervariablen CDR-Regionen bestätigt. Digitale Daten jedes Patienten und Ausdrucke der maßgeblichen Sequenzen werden an zwei unabhängigen Orten gelagert. Eine Mikrofilm-Sicherungskopie der Sequenzdaten wird ebenfalls angefertigt.
Schritt 12: Aufreinigung
Für jeden Patienten werden RNA-Proben, G-tailed cDNA, PCR2-lnserte und Zero-Blunt-Ligationen sowie die Miniprep-DNA für jeden maßgeblichen Klon gemeinsam bei –80 °C gelagert. Miniprep-DNA wird als Sicherung an einem zweiten Ort gelagert. Alle anderen Reaktionen werden verworfen.
Amplifikation unter Verwendung von V-Region-Primern
In einer weiteren Ausführungsform kann eine Amplifikation des H-Ketten-Gens unter Verwendung eines beliebigen der sechs in der untenstehenden Tabelle aufgelisteten 5'-Primer (V_H1, V_H2, V_H3, V_H4, V_H5 oder V_H6) in Kombination mit einem beliebigen der μ-, γ- oder J-3'-Primer durchgeführt werden. Gleichermaßen wird die Amplifikation des κ-Ketten-Gens unter Verwendung der 5'-Primer Vκ1, Vκ2, Vκ3 oder Vκ4 zusammen mit entweder den C- oder J-3'-Primern für das κ-Gen erzielt. Das λ-Ketten-Gen wird amplifiziert, indem beliebige der Primer Vλ1, Vλ2, Vλ3, Vλ4 oder Vλ5 und entweder der J- oder C-3'-Primer für das λ-Gen in Kombination verwendet werden. Die Amplifikation des Beta₂-Microglobulin- (β2M-) Gens unter Verwendung der 5'- und 3'-β2M-Primer dient als Kontrolle, um die Qualität der cDNA-Synthese für jede Probe zu testen.
5'-Primer: H-Kette-3'-Primer:
5'-Primer: κ-Ketten-3'-Primer:
5'-Primer : λ-Ketten-3'-Primer
Kontrollprimer
Die resultierenden PCR-Produkte können durch Sequenzierung unter Verwendung von Standardprotokollen analysiert werden. Jede Bande am Sequenzierungsgel, die lesbare Sequenzdaten liefert, kann als Tumorzellen-V-Region-DNA betrachtet werden. Falls von keiner der PCR-Banden eine lesbare Sequenz erhalten wird, kann die tumorspezifische V-Region-Sequenz erlangt (oder bestätigt) werden, indem die PCR an der cDNA unter Verwendung eines anderen Primerpaars einer Familie, die eine Bande erzeugt, wiederholt und die DNA in Bakterienzellen unter Verwendung standardmäßiger rekombinanter DNA-Techniken kloniert werden. Die resultierenden Klone können dann mittels PCR-Amplifikation und Sequenzierung analysiert werden. Die Sequenzinformation wird dann zwischen den verschiedenen Klonen und dem ursprünglichen PCR-Produkt verglichen. Die Identifizierung von Lymphom-spezifischer V-Region-DNA wird bestätigt, wenn zwei identische Sequenzen durch eine beliebige Kombination von unabhängigen Verfahren erhalten werden.
Die vorliegende Erfindung sieht technische Modifizierungen und Verbesserungen der Verfahren zur Durchführung der vorhergehenden Ausführungsformen vor, da solche Veränderungen auf dem Gebiet der Erfindung eingeführt werden und von Fachleuten leicht verstanden werden.
Erzeugung variabler Längen und Sequenzen in der Linkerregion
Die Aminosäure-Linker dieser Erfindung weisen vorzugsweise zwischen 3 und 25 Aminosäuren auf. Ein vorgegebener Linker ist aus 2 bis 12 verschiedenen Aminosäuren aufgebaut.
Der bevorzugte Ansatz, um ein optimales tumorspezifisches/Selbst-Antigen, ob von einer B-Zelle, einem Lymphom oder einer anderen Tumorart zu erlangen, ist die Erzeugung einer Bibliothek von Zwei-Domänen- (oder Zwei-Epitop-) Polypeptiden, wo die Elemente der Bibliothek sich hinsichtlich ihrer Linkerregion unterscheiden. Dies ermöglicht die Erzeugung eines Felds von Produkten im Pflanzenexpressionssystem, aus denen man ein optimal gefaltetes, optimal funktionsfähiges Produkt aus wählen kann. In der bevorzugten B-Zell-Lymphom-Ausführungsform sind die V_H- und V_L-Domänen die bevorzugten beiden Domänen, die an der Lymphom-Zelloberfläche exprimiert werden. Diese beiden klonierten Domänen werden amplifiziert, und es wird ein Linker variabler Länge und variabler Sequenz zwischen diese Domänen unter Verwendung eines Amplifikationsverfahrens, wie z.B. PCR, eingeführt.
Ein Abschnitt des 3'-Endes des Stromab-Primers für die Stromauf-Domäne und des 3'-Endes des Stromauf-Primers für die Stromab-Domäne ist zur entsprechenden amplifizierten Domänensequenz komplementär. Jedoch sind ein Abschnitt des 5'-Endes des Stromab-Primers für die Stromauf-Domäne und/oder des 5'-Endes des Stomauf-Primers für die Stromab-Domäne zur entsprechenden amplifizierten Domäne nicht komplementär. Dieses nicht-komplementäre Segment des Primers wird eine „Nontemplated-Sequenz" genannt und enthält ein wiederholtes Muster degenerierter Triplettbasen, das als die Nucleinsäure-Linkerregion dient, welche die Stromauf- an die Stomab-Domäne bindet.
Der Ausdruck „wiederholtes Muster degenerierter Triplettbasen" bezieht sich auf eine Nucleinsäuresequenz, worin ein Satz von drei Basen (Triplett) in der Nontemplated-Sequenz wiederholt wird, was ein wiederholendes Motiv erzeugt, wo die einzelnen Basen im wiederholten Triplett aus einem definierten Feld unabhängig gewählt werden. Der Nucleotidcode für Positionen, worin verschiedene Kombinationen von mehr als einer Base möglich sind, scheint unten in Tabellenform auf.

r = g oder a (Purin)
y = t oder c (Pyrimidin)
s = g oder c
w = a oder t
v = a, g oder c
n = a, g, c oder t

Folglich kann, wenn das wiederholte Triplett nws ist, n ein beliebiges von a, c, g oder t sein; w kann a oder t, und s kann g oder c sein, was das wiederholte Muster degeneriert macht. Hierin sind diese wiederholten Tripletts zueinander benachbart. Die „Nontemplated-Sequenz" des Amplifikationsprimers, der dieses „wiederholte Muster degenerierter Triplettbasen" enthält, wird in vitro hergestellt.
Die Stromauf- und Stromab-Primer für die entsprechenden amplifizierten Domänen werden mit DNA-Polymerase und anderen, für die Amplifikation notwendigen Reaktanten vermischt. Siehe Innis et al., s.o., für Einzelheiten. Das Reaktionsgemisch wird mehreren Temperaturzyklen unterzogen, um DNA-Duplexe zu schmelzen, die Anellierung von Primern an die Templat-DNA und die Polymerisation des PCR-Produkts zu ermöglichen. Während des ersten Zyklus wird die DNA-Polymerase die „Erststrang"-Synthese fortsetzen, bis die Temperatur erhöht wird, um Duplexe zu schmelzen. Wenn die Temperatur auf die Anellierungstemperatur gesenkt wird, werden die Primer an die Erststrang-DNA anellieren. Die DNA-Polymerase wird anschließend einen „Zweitstrang" herstellen, wenn die Polymerisationstemperatur des Zyklus erreicht ist. Dies resultiert in einer exponentiellen Anreicherung der amplifizierten Domäne. Wegen der Nontemplated-Sequenzen werden die amplifizierten Domänen eine Population von Nucleinsäuren mit einem wiederholten Muster degenerierter Nucleotidbasen am 5'-Ende des Stromab-Produkts und am 3'-Ende des Stromauf-Produkts bilden.
Wegen der Natur des wiederholten Musters degenerierter Triplettbasen in Nontempated-Sequenzen von Amplifikationspaaren sind die PCR-Produkte hinsichtlich der Sequenz und Länge der Linkerregion unterschiedlich. Die Längenverschiedenheit ist höchstwahrscheinlich auf Duplexbildung der Linkerregion der Primer mit Fehlpaarungen in der Mitte zurückzuführen, die eine Blase oder Schleife bilden. Die 3'-5'-Exonuclease- und die 5'-3'-Polymerase-Aktivitäten dienen der Deletion oder Extension der Länge der Primersequenz.
Um die Linkersequenz zu kürzen, wird ein Primer, der das wiederholte Triplett enthält, an einen komplementären Strang anelliert, der sich bereits in die Linkersequenz inkorporiert hat. Der degenerierte Primer kann dann anellieren, um einen Duplex mit einer Blase an der Stelle ungepaarter Basen zu bilden und eine ungepaarte 3'-Extension (Überhang) wie unten graphisch dargestellt zu hinterlassen.
Duplex mit Blase und 3'-Überhang
Falls ein Enzym mit 3'-5'-Exonucleaseaktivität, wie z.B. PFU oder Vent, vorhanden ist, wird die 3'-Extension in 5'-Richtung des komplementären Strangs abgebaut, bis sie den anellierten Abschnitt des Duplex erreicht. Auf diese Weise können ein oder mehrere Triplettwiederholungen vom PCR-Produkt entfernt werden. Dies würde den Peptidlinker um eine oder mehrere Aminosäuren kürzen.
Zur Extension des Linkers kann der obere Strang an den komplementären Strang anellieren, so dass ein Duplex mit einer 5'-Extension wie folgt gebildet wird:
Duplex mit Blase und 5'-Überhang
Die in der Amplifikationsreaktion vorliegende Polymerase, z.B. Taq-Polymerase, kann das PCR-Produkt um ein oder mehrere Triplett-Wiederholungscodons verlängern. Wegen seiner 5'-3'-Polymeraseaktivität kann das Enzym die 5'-Extension ausfüllen, wodurch die Linkerregion um ein oder mehrere wiederholte Tripletts verlängert wird. Dies wird den Peptidlinker um eine oder mehrere Aminosäuren verlängern. Falls der Polymerase in der PCR die 3'-5'-Exonucleaseaktivität fehlt und falls kein Enzym mit 3'-5'-Exonucleaseaktivität vorhanden ist, dann sollten nur Extensionen von Triplett-Nucleotiden auftreten..
Um die Blasenbildung zu fördern, muss das 5'-Ende von zumindest einem Primer dieselben degenerierten Basen in zumindest zwei terminalen Codons enthalten, um einen „Rutsch"-Effekt zu verhindern. Das heißt, es müssen zwei Triplettwiederholun gen mit derselben Sequenz (z.B. 5'rst-rst3' oder 5'ysa-ysa3') am 5'-Ende von zumindest einem verwendeten Primer vorliegen, um eine Domäne zu amplifizieren.
Um das richtige Leseraster beizubehalten, was wichtig ist, falls die fusionierte Nucleinsäure zur Expression eines Proteins verwendet wird, wie es für scFv der Fall ist, sollten mehrere Regeln bei der Konstruktion der Degeneration der Nontemplated-Region des die Linkerregion bildenden Primers beachtet werden. Die degenerierten Triplettwiederholungen sollten eine der folgenden Regeln befolgen:

(a) Position 1 des Tripletts kann nicht dieselbe Base wie Position 2 enthalten;
(b) Position 2 des Tripletts kann nicht dieselbe Base wie Position 3 enthalten; oder
(c) Position 1 des Tripletts kann nicht dieselbe Base wie Position 3 enthalten;

Beispielsweise befolgt ein wiederholtes Triplett rst und ysa diese Regeln. Die folgenden Kombinationen von Basen erfüllen diese Regeln: rst = agt, act, ggt, gct und ysa = tca, tga, cca, cga. Alternativ dazu können andere degenerierte Sequenzen die Regeln erfüllen. Beispielsweise könnten str (das gta, gtg, cta oder ctg sein kann) oder ayr (das aca, acg, ata oder atg sein kann) als wiederholtes Triplett dienen.
Eine weitere in dieser Erfindung zweckdienliche Triplettsequenz ist nvt, das ein beliebiges von 12 verschiedenen Codons sein kann, die für 11 verschiedene Aminosäuren kodieren. Das degenerierte Triplett csy erfüllt diese Regeln nicht, da es ccc sein könnte, das nicht entspricht. Gleichermaßen würde jede andere degenerierte Sequenz, die ein Triplett identischer Basen sein kann (z.B. ccc, aaa, ggg oder ttt), diese Regeln nicht befolgen und wäre als wiederholtes Triplett ausgeschlossen.
Es können Restriktionsenzymerkennungssequenzen in die Primer inkorporiert werden, um die Klonierung und Ausrichtung der IgV- (oder beliebiger anderer Polypeptid-) Domänen zueinander zu erleichtern. Beispielsweise kann eine Stelle für eine Restriktionsendonuclease in das 5'-Ende des Stromauf-Amplifikationsprimers für die erste Domäne inkorporiert werden. Dies wird die Ligation des 5'-Endes der Stromauf-Domäne an das 5'-Ende eines restringierten Vektors erleichtern, in den dieses Fragment subkloniert wird. Gleichermaßen kann dieselbe oder eine andere Restriktionsstelle in das 5'-Ende des Stromab-Amplifikationsprimers für die Stromab-Domäne inkorporiert werden. Das resultierende PCR-Produkt kann dann mit der/den entsprechenden Endonuclease(n) für anschließende Ligation in einen Vektor restringiert werden, der (eine) komplementäre Sequenzen) zu den PCR-Produkten aufweist. Alternativ dazu kann dieselbe Restriktionsstelle verwendet und die Subklone mittels DNA-Sequenzierung, PCR, Restriktionsverdauungen usw. gescreent werden, um zu ermitteln, ob die korrekte Ausrichtung erzielt worden ist.
Die gebräuchlichste Linkersequenz, die auf dem Gebiet der Erfindung verwendet worden ist, um V_H- und V_L-Domänen zu einem scFv zu verbinden, ist die folgende Sequenz von 15 Aminosäuren: GGGGSGGGGSGGGGS (Seq.-ID Nr. 38), die üblicherweise mit (Gly₄-Ser)₃ abgekürzt wird. Eine Reihe anderer Linker für die scFv-Produktion ist in Lawrence et al., FEBS Letters 425, 479–484 (1998), Solar et al., Protein Engineering 8, 717–723 (1995), Alfthan et al., Protein Engineering 8, 725–731 (1995), Newton et al. Biochemistry 35, 545–553 (1996), Ager et al. Human Gene Therapy 7, 2157–2164 (1996), und Koo et al., Applied and Environmental Microbiolo gy 64, 2490–2496 (1998), beschrieben worden. Der vorliegende Bibliotheks-Ansatz würde zahlreiche darüber hinausgehende zweckdienliche Linker erzeugen.
Linker sind auf Basis ihrer Fähigkeit gewählt worden, zwei Polypeptiddomänen zu fusionieren und gleichzeitig die Reinigung und Charakterisierung von einer der Domänen zu erleichtern. Mehrere Beispiele, die Fusionen mit bekannten Proteinen umfassen, umfassen ein Fusionsprotein mit Glutathion-S-Transferase (GST), das an Glutathion-Agarose gereinigt werden konnte (Smith et al., Gene 67, 31–40 (1988)). Der in dieser Untersuchung verwendete Linker wurde später verändert, um einen Glycin-reichen Linker einzuführen (Guan et al., Anal. Biochem. 192, 262–267 (1991)), der auch als „Glycin-Linker" mit der Aminosäuresequenz PGISGGGGG (Seq.-ID Nr. 39) bekannt ist, der die Abspaltung von GST von seinem Fusionspartner (in diesem Beispiel eine Protein-Tyrosinphosphatase) erleichtert. Vektoren zur Herstellung dieser Art von Fusionsproteinen sind im Handel erhältlich. Beispielsweise stellt New England Biolabs einen Vektor, pMAL-p2, bereit, der für ein maltosebindendes Protein kodiert, das an eine Domänensequenz fusioniert werden kann, die in den Vektor kloniert wird. Bei pMAL-p2 ist die Aminosäuresequenz des Linkers zwischen dem maltosebindenden Protein und der Domänensequenz NNNNNNNNNLGIEGR (Seq.-ID Nr. 40). Der Abschnitt von Asparaginen erleichtert die Reinigung des Fusionsproteins an einer Amylosesäule.
Ligation des PCR-Produkts
Das 3'-Ende des Stromauf-PCR-Produkts und des 5'-Endes des Stromab-PCR-Produkts können aneinander ligiert werden (Berger und Kimmel, s.o.). Falls beide Enden des Produkts stumpf sind, können die 5'-Phosphate mittels T4-Polynucleotidkinase phosphoryliert und die Reaktionsprodukte mit T4-DNA-Ligase ligiert werden. Falls beide Enden des PCR-Produkts komplementär sind oder über Restriktionsendonucleaseverdau komplementär gemacht werden können, dann kann eine Ligation der kohäsiven Enden durchgeführt werden, worin die komplementären Enden mit T4-DNA-Ligase ligiert werden. Gleichermaßen können das 5'-Ende des Stromauf- PCR-Produkts und/oder das 3'-Ende des Stromab-PCR-Produkts in einer Ligation stumpfer oder kohäsiver Enden an einen restringierten Vektor ligiert werden.
Um die Sequenz und Längenkomplexität der Linkerregion der Population dualer Domänenmoleküle, wie z.B, des bevorzugten scFv zu erhöhen, können mehrere PCR-Reaktionsprodukte der ersten und zweiten Domäne kombiniert werden. Beispielsweise kann eine PCR-Reaktion der ersten Domäne und/oder zweiten Domäne, wo das degenerierte Triplett 6-mal wiederholt wird, mit PCR-Reaktionen der ersten und/oder zweiten Domäne, wo das Triplett 9-mal wiederholt wird, kombiniert und in den geeigneten Vektor ligiert werden. Die Kombination der PCR-Produkte wird die in der Linkerregion beobachtete Längen- und Sequenzkomplexität erhöhen.
Expressionssystem zur Produktion der Vakzine-Zusammensetzung
Die immunogenen tumorspezifischen idiotypischen Selbst-Antigene dieser Erfindung haben die Vorteile, dass sie (1) in hohen Mengen produziert werden können, (2) leicht zu reinigen sind und (3) in geeigneter Weise gefaltet sind, um die Konformation des/der nativen Epitops/Epitope nachzuahmen, die an der Tumorzelloberfläche präsentiert werden. Eine Reihe wohlbekannter heterologer Expressionssysteme in Bakterien, Insekten, Säugetieren und Pflanzen ist im Abschnitt „Hintergrund" erörtert worden, wobei jedes seine Vor- und Nachteile hat. Die Erfinder haben die Pflanzenexpression ausgewählt.
Eine Reihe von Transformationsverfahren erlauben die Expression heterologer Proteine in Pflanzen. Manche umfassen die Konstruktion einer transgenen Pflanze durch Integration von DNA-Sequenzen, die für das Protein von Interesse kodieren, in das Pflanzengenom. Die erforderliche Zeit, um transgene Pflanzen zu erlangen, ist für das vorliegenden Ziel der raschen Produktion von Vakzine-Zusammensetzungen zu lange. Eine ansprechende Lösung (eine Alternative zu einer derartigen stabilen Transformation) ist die vorübergehende Transfektion von Pflanzen mit Expressionsvektoren. Sowohl Virus-, als auch Nicht-Virus-Vektoren sind verfügbar, die zu einer derartigen vorübergehenden Expression fähig sind, obgleich Virus-Vektoren einfacher in Wirtszellen einzuführen sind und sich durch Infektion verbreiten, um die Expression zu amplifizieren. Daher sind Virus-Vektoren bevorzugt.
Chimäre Gene, Vektoren und rekombinante Virus-Nucleinsäuren dieser Erfindung werden unter Verwendung herkömmlicher Techniken der Molekularbiologie konstruiert. Ein Virusvektor, der heterologe Proteine in Pflanzen exprimiert, umfasst typischerweise (1) einen nativen subgenomischen Pflanzenpromotor, (2) gegebenenfalls einen oder mehrere nicht-native subgenomische Pflanzenpromotoren, (3) eine für Virushüllprotein kodierende Sequenz (nativ oder nicht) und (4) für das gewünschte heterologe Protein kodierende Nucleinsäure. Die subgenomischen Promotoren ermöglichen die extrachromosomale Replikation der viralen Nucleinsäure. Die Virusvektoren werden vom kodierten Virushüllprotein verkapselt, was einen rekombinanten Pflanzenvirus hervorbringt. Dieser rekombinante Virus wird verwendet, um geeignete Wirtspflanzen zu infizieren. Die rekombinante virale Nucleinsäure kann replizieren, sich systemisch in der Wirtspflanze ausbreiten und die RNA- und Proteinsynthese steuern, um das gewünschte heterologe Protein in der Pflanze zu liefern. Außerdem erhält der rekombinante Vektor stabil die nicht-virale heterologe kodierende Sequenz und Kontrollelemente.
Die rekombinante virale Nucleinsäure wird aus der Nucleinsäure eines beliebigen geeigneten Pflanzenvirus hergestellt, obgleich die Tobamovirusfamilie bevorzugt ist. Die nativen vitalen Nucleotidsequenzen können durch bekannte Techniken unter der Voraussetzung modifiziert werden, dass die notwendigen biologischen Funktionen der vitalen Nucleinsäure (Replikation, Transkription usw.) erhalten bleiben. Wie erwähnt, können ein oder mehrere subgenomische Promotoren insertiert werden. Diese sind fähig, die Expression der benachbarten heterologen kodierenden Sequenzen in infizierten oder transfizierten Pflanzenwirten zu regulieren. Es kann natives Virushüllprotein von dieser DNA kodiert werden oder es kann diese Hüllproteinsequenz deletiert und durch eine Sequenz ersetzt werden, die für ein Hüllprotein eines anderen Pflanzenvirus kodiert („Nicht-nativ" oder „fremd viral"). Ein fremdes virales Hüll proteingen kann unter die Kontrolle eines entweder nativen oder nicht-nativen subgenomischen Promotors gestellt werden. Das fremde virale Hüllprotein sollte fähig sein, die rekombinante virale Nucleinsäure zu verkapseln, um funktionsfähige, infektiöse Virionen zu produzieren. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Hüllprotein ein fremdes virales Hüllprotein, das von einer Nucleinsäuresequenz kodiert wird, die entweder einem nativen Viruspromotor oder einem nicht-nativen subgenomischen Promotor benachbart platziert wird. Vorzugsweise wird die für das heterologe Protein kodierende Nucleinsäure, das heißt, das in der Pflanze zu exprimierende immunogene Protein/Peptid unter die Kontrolle eines nativen subgenomischen Promotors gestellt.
Eine wichtige Komponente dieser Erfindung, die teilweise für die richtige Faltung und reichliche Produktion des heterologen Proteins (vorzugsweise des immunogenen scFv-Proteins) verantwortlich ist, ist die Gegenwart einer Signalpeptidsequenz, die das neu synthetisierte Protein in den Sekretionsweg der Pflanze leitet. Die für das Signalpeptid kodierende Sequenz wird In-frame mit der für das zu exprimierende Protein/Peptid kodierenden DNA fusioniert. Ein bevorzugtes Signalpeptid ist das α-Amylase-Signalpeptid.
In einer weiteren Ausführungsform wird außerdem eine für ein Bewegungsprotein kodierende Sequenz in den Virusvektor inkorporiert, da Bewegungsproteine eine rasche Bewegung des Virus von Zelle zu Zelle in der Pflanze fördern, was die systemische Infektion der gesamten Pflanze erleichtert.
Es sind entweder RNA- oder DNA-Pflanzenviren zur Verwendung als Expressionsvektoren geeignet. Die DNA oder RNA kann einzel- oder doppelsträngig sein. Einzelsträngige RNA-Viren können vorzugsweise einen Plus-Strang aufweisen, obgleich ein Minus-Strang-RNA-Virus ebenfalls vorgesehen ist.
Die rekombinante virale Nucleinsäure wird durch Klonieren in eine geeignete Produktionszelle hergestellt. Herkömmliche Klonierungstechniken (für DNA sowie RNA) sind wohlbekannt. Beispielsweise kann bei einem DNA-Virus ein mit der Produktionszelle kompatibler Replikationsstartpunkt an die Virus-DNA gespleißt werden.
Bei einem RNA-Virus wird zunächst eine Volllängen-DNA-Kopie des Virusgenoms durch herkömmliche Verfahren hergestellt: beispielsweise wird die Virus-RNA revers transkribiert, um subgenomische DNA-Stücke zu bilden, die unter Verwendung von DNA-Polymerasen doppelsträngig gemacht werden. Die DNA wird in einen geeigneten Vektor kloniert und in eine Produktionszelle kloniert. Die DNA-Stücke werden kartiert und in passender Sequenz kombiniert, um eine Volllängen-DNA-Kopie des Virusgenoms herzustellen. Subgenomische Promotorsequenzen (DNA) werden mit oder ohne ein Hüllproteingen in nicht-essentielle Stellen der viralen Nucleinsäure wie hierin beschrieben insertiert. Nicht-essentielle Stellen sind jene, welche die biologischen Eigenschaften der viralen Nucleinsäure oder des assemblierten Pflanzenvirions nicht beeinträchtigen. Zur Virus-RNA komplementäre cDNA wird unter die Kontrolle eines geeigneten Promotors gestellt, so dass (rekombinante) Virus-RNA in der Produktionszelle produziert wird. Falls die RNA für Infektiosität einem Capping unterzogen werden muss, wird dies mittels herkömmlicher Techniken durchgeführt.
Beispiele geeigneter Promotoren umfassen die Iac-, Iacuv5-, trp-, tac-, Ip1- und ompF-Promotoren. Ein bevorzugter Promotor ist der Phagen-SP6-Promotor oder T₇-RNA-Polymerase-Promotor.
Produktionszellen können prokaryotische oder eukaryotische Zellen sein und umfassen Escherichia coli-, Hefe-, Pflanzen- und Säugetierzellen.
Es sind zahlreiche Virusvektoren verfügbar, die dem Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt sind (D. Grierson et al., Plant Molecular Biology, Blackie, London, S. 126–146 (1984); Y. Gluzman et al., Communications in Molecular Biology: Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, S. 172–189 (1988)). Der Virusvektor und seine Kontrollelemente müssen klarerweise mit dem zu infizierenden Pflanzenwirt kompatibel sein. Für die vorliegende Erfindung sind geeignete Viren

(a) jene aus der Tabakmosaikvirus- (TMV-) Gruppe, wie z.B. TMV, Cowpea-Mosaikvirus (CMV), Luzernemosaikvirus (AMV), Cucumber-Green-Mottle-Mosaikvirus (Wassermelonen-Stamm) (CGMMV-W), Hafer-Mosaikvirus (OMV),
(b) Viren aus der Trespenmosaikvirus- (BMV-) Gruppe, wie z.B. BMV, Broad-Bean-Mottle-Virus und Cowpea-Chlorotic-Mottle-Virus,
(c) andere Viren, wie z.B. Reisnekrosevirus (RNV), Geminiviren, wie z.B. Tomato-Golden-Mosaikvirus (TGMV), Cassava-Latent-Virus (CLV) und Maisstrichelvirus (MSV).

Ein bevorzugter Wirt ist Nicotiana benthamiana. Die Wirtspflanze kann, so wie der Begriff hier verwendet wird, eine vollständige Pflanze, eine Pflanzenzellen, ein Blatt, ein Wurzelspross, eine Blüte oder ein beliebiger anderer Pflanzenteil sein. Die Pflanze oder Pflanzenzelle wird unter Verwendung herkömmlicher Verfahren gezüchtet.
Ein bevorzugter Virusvektor zur Verwendung mit N. benthamiana ist ein modifizierter TTO1A-Vektor, der eine Hybridfusion von TMV und Tomatenmosaikvirus (ToMV) enthält. Die insertierten subgenomischen Promotoren müssen mit der TMV-Nucleinsäure kompatibel und fähig sein, die Transkription von geeignet gelegenen (z.B. benachbarten) Nucleinsäuresequenzen in der infizierten Pflanze zu steuern. Das Hüllprotein muss eines sein, das dem Virus die systemische Infektion des Pflanzenwirts ermöglicht. Es ist bekannt, dass das TMV-Hüllprotein die systemische Infektion von N. benthamiana fördert.
Die Infektion der Pflanze mit dem rekombinanten Virusvektor kann unter Verwendung einer Reihe von herkömmlichen Techniken erzielt werden, von deren bekannt ist, dass sie die Infektion fördern. Diese umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf Blattabrasion, Abrasion in Lösung und Hochgeschwindigkeitswasserstrahl. Der Virusvektor kann händisch, mechanisch oder mittels Hochdruckstrahlen einzelner Blätter zugeführt werden.
Reinigung des in der Pflanze produzierten immunogenen Proteins/Peptids Zur Verwendung in Vakzine-Zusammensetzungen wird das in Pflanzen produzierte immunogene Protein oder Polypeptid vorzugsweise unter Verwendung von Standardtechniken gewonnen und gereinigt. Geeignete Verfahren umfassen die Homogenisierung oder Mahlung der Pflanze oder der produzierenden Pflanzenteile in Flüssigstickstoff, gefolgt von der Extraktion des Proteins. Falls es aus irgendeinem Grund erwünscht ist, das Pflanzenmaterial nicht zu homogenisieren, kann das gewünschte Protein mittels Vakuuminfiltration und Zentrifugation, gefolgt von Sterilfiltration entfernt werden. Die Proteinausbeute kann durch jegliche Technik abgeschätzt werden. Nach der Isolierung des gesamten sekretierten Proteins aus dem Pflanzenmaterial können weitere Reinigungsschritte durchgeführt werden. Die Proteine werden nach Größe, isoelektrischem Punkt oder anderen physikalischen Eigenschaften gereinigt. Immunologische Verfahren, wie z.B. Immunpräzipitation oder vorzugsweise Affinitätschromatographie mit für das gewünschte Protein spezifischen Antikörpern können verwendet werden.
Um die Reinigung zu erleichtern, kann der Virusvektor so konstruiert werden, dass das Protein mit einem Affinitätsmarker produziert wird, der im Reinigungsstadium genutzt werden kann. Eines der Beispiele eines derartigen Markers ist der Histidin-(His-) Marker, der die Reinigung an einer Metall- (z.B. Nickel-) Affinitätssäule ermöglicht. Andere Affinitätsmarker sind auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt und bedürfen hier keiner Beschreibung.
Es können bei den vorliegenden Verfahren verschiedene feste Träger verwendet werden: Agarose^®, Sephadex^®, Derivate von Cellulose oder anderen Polymeren. Beispielsweise kann an Sepharose immobilisiertes Protein A (oder Protein L) aus Staphylococcus verwendet werden, um das Zielprotein zu isolieren, indem das Prote in zunächst mit spezifischen Antikörpern in Lösung inkubiert und das Gemisch dann mit immobilisiertem Protein A kontaktiert wird, das den Antikörper-Zielprotein-Komplex bindet und zurückhält.
Unter Verwendung von irgendeinem der vorhergehenden oder anderen wohlbekannten Verfahren wird das immunogene Protein/Peptid aus dem Pflanzenmaterial auf eine Reinheit von mehr als ungefähr 50 %, bevorzugter mehr als ungefähr 75 %, noch bevorzugter mehr als ungefähr 95 % gereinigt.
Ermittlung der korrekten Faltung
Ein wichtiger Aspekt dieser Erfindung ist es, die Immunogenität des Pflanzenhergeleiteten Vakzine-Proteins zu gewährleisten. Entscheidend für die Immunogenität ist die Konformation des Proteins in Lösung. Die Konformation der maßgeblichen Epitope (idiotope im Falle eines für ein B-Zell-Lymphom kennzeichnenden idiotypischen scFv-Proteins) in Lösung sollte dieselben Epitope des nativen Proteins nachahmen oder diesen ähneln, wie sie an der Oberfläche der Tumorzelle auftreten.
Durch Produktion der Polypeptide in Pflanzen und Abzielen auf den Sekretionsweg der Pflanze haben die Erfinder sichergestellt, dass das Polypeptid in löslicher, optimal gefalteter Form sekretiert wird. Ein bevorzugtes Reagens ist ein spezifischer Antikörper, wie z.B. ein idiotypischer Antikörper, der an ein Epitop davon bindet, wenn die Ketten korrekt gefaltet sind, der jedoch nicht bindet, wenn die Epitope denaturiert sind. Der Antikörper wird in beliebigen einer Reihe von Test verwendet, einschließlich Dot-Blot, Western-Blot, Immunpräzipitation, Radioimmuntest (RIA) und EIA. In bevorzugten Ausführungsformen, wenn derartige Antikörper verfügbar sind, und dies wird nicht immer der Fall sein, können Western-Blots und ELISAs eingesetzt werden, um die korrekte Faltung der maßgeblichen Teile des in der Pflanze produzierten Proteins zu verifizieren.
Ermittlung der Immunogenität des in der Pflanze produzierten Proteins
Derartige Tests können durchgeführt werden, wenn die geeigneten Reagenzien verfügbar sind, was wahrscheinlich nicht für jedes einzelne produzierte LymphomscFv der Fall ist. Bei derartigen Tests beurteilt man die Fähigkeit des Proteins oder Polypeptids, eine spezifische Immunreaktion, vorzugsweise eine Antikörperreaktion in einem geeigneten Wirtstier zu induzieren. In der bevorzugten Ausführungsform wird das Protein, ein scFv-Protein, das dem Idiotyp der Lymphomzellen entspricht, in Mäuse injiziert und die sich ergebende Immunreaktion beurteilt. Es werden Gruppen von Mäusen unter Verwendung von Standardprotokollen immunisiert. Ein bewährter Ablaufplan für diese Art von Immunogen umfasst die subkutane Immunisierung der Mäuse in 2-wöchigen Intervallen für insgesamt drei Impfungen (Hakim et al., s.o.). Jedoch wäre jeder Ablaufplan oder jedes Protokoll geeignet, das in einer Immunreaktion in Mäusen resultiert.
Geeignete Formulierungen für das Immunogen für ein derartiges Testen sind ähnlich jenen für das Impfen von klinischen Patienten, vorzugsweise Menschen (unten beschrieben). Beispielsweise kann das getestete Material mit einem Adjuvans, wie z.B. QS-21 formuliert und subkutan verabreicht werden. Da vom in Pflanzen produzierten Material, wie die Erfinder gefunden haben, erwartet wird, dass es in Abwesenheit von Adjuvantien reichlich immunogen ist, sollte das Testen das Protein/Peptid ohne Adjuvans umfassen.
Antikörperreaktionen in Mäusen werden beurteilt, indem das Serum z.B. durch Schwanzblutung zu verschiedenen Zeiten nach der Immunisierung erlangt wird. Beispielsweise werden Seren 10 oder mehr Tage nach der Impfung, vorzugsweise 10 Tage nach der zweiten und dritten Impfung unter Verwendung des Ablaufplans von Hakim et al., s.o., getestet. Die Reaktivität der Antiseren mit dem Tumorantigen, z.B. dem für B-Zell-Lymphom einzigartigen Ig, wird durch Vergleichen des in der Pflanze exprimierten Proteins mit dem Antigen in seiner nativen Form getestet, wie es sich an der Oberfläche intakter Lymphomzellen findet. Dies kann mit jeglichem Verfahren erzielt werden, das die Bindung des Antikörpers an Antigen misst. Wie oben angegeben, sind bevorzugte Techniken ELISA oder, für ganze Zellen, Immunfluoreszenz und Durchflusszytometrie. Es kann ein kompetitiver Immuntest verwendet werden. Er misst die Fähigkeit des „Test"-Proteins, die Bindung eines Antikörpers, der bekanntermaßen für das jeweilige Tumorantigen spezifisch ist, an ein Standardpräparat des Tumorantigens zu hemmen. Dieses Standardpräparat kann sich in Lösung befinden oder in Form intakter Zellen vorliegen, die das Antigen exprimieren. Die kompetitive Hemmaktivität des von der Pflanze exprimierten Proteins kann mit jener eines „Standard"-Präparats des nativen Proteins (das bekanntermaßen korrekt gefaltet ist) verglichen werden.
Folglich nehme man als hypothetisches Beispiel dafür, wie dies durchgeführt werden kann, ein als „Lymphom 33" bezeichnetes menschliches B-Zell-Lymphom an, das einen einigartigen, als „Id33" bezeichneten Idiotyp an seiner Oberfläche (ein oder mehrere Idiotypen umfassend) exprimiert. Id33 resultiert aus der 3D-Struktur der gefalteten Ig-V_μ- und V_κ Domänen eines IgM-Moleküls (μ₂Κ₂), wie sie an der Oberfläche von Lymphom 33 exprimiert werden. Wir können dieses IgM-Molekül IgM^1-5 nennen, um anzudeuten, dass 50 Epitope mit dem gesamten 4-Ketten-Protein assoziiert sind.
Um ein immunogenes Protein herzustellen, das als Vakzine eine tumorspezifische Immunreaktion gegen Lymphom 33 auslöst, ist ein den Id33-Idiotyp tragendes scFv-Fragment wie oben beschrieben konstruiert, in Pflanzen exprimiert und gereinigt worden; dieses Molekül wird als scFv33 bezeichnet. Der Test ist daraufhin, festzustellen, ob scFv33 dieselbe oder eine sehr ähnliche Konformation in Lösung wie die native Konformation von Id33 aufweist, wie es an der Oberfläche der Lymphom 33-Zellen vorliegt.
Ein mAb (als Anti-Id33 bezeichnet) ist für Id33 in seiner nativen Konformation spezifisch und wurde durch Immunisieren einer Maus mit Lymphom 33-Zellen, Herstellen von Hybridomen usw. und Selektieren des resultierenden mAb mit der gewünschten Spezifität hergestellt. Anti-Id33 bindet an Lymphom 33-Zellen und an ein vollständi ges IgM-Molekül (gereinigt aus Lymphom 33-Zellen) in Lösung, das sich nativ faltete, so dass die Id33-Struktur am IgM in Lösung vorhanden und exponiert ist. Anti-Ig33 ist ein geeignetes Reagens für diese Bestimmung, da es an eine Determinante (Id33) bindet, die durch die Assoziation der H- und L-Ketten (genauer gesagt: der V_μ- und V_κ Domänen) von IgM^1-5 am Lymphom 33 erzeugt wurde. Dies ist deshalb so, weil der Antikörper nur mit diesem IgM unter nicht-reduzierenden Bedingungen reagiert; wenn IgM^1-5 reduziert wird, so dass die H- und L-Ketten dissoziieren, verschwindet Ig33. Folglich muss in diesem Beispiel die korrekte Assemblierung der beiden V-Domänen auftreten, damit der Idiotyp existiert und damit er vom mAb „Anti-Id33" erkannt wird.
Die Bindung von Anti-Id33 an intakte Lymphom 33-Zellen kann auf verschiedene Weisen gemessen werden. Beispielsweise kann man zuerst einen nachweisbaren Marker, z.B. eine fluoreszierende Gruppierung an Anti-Id33 binden, wodurch das Reagens „FI-Anti-Ig33" erzeugt wird. Die Bindung von FI-Anti-Id33 an Lymphom 33 wird mittels Fluoreszenzmikroskopie, vorzugsweise mittels Durchflusszytometrie nachgewiesen.
Das gewünschte immunogene Protein der Erfindung, scFv in diesem Beispiel, wird nun durch direkte Bindung an einen festen Träger getestet und mit Anti-Id33 und einem nachweisbar markierten zweiten Antikörper, z.B. einem für den Anti-Id33-Idiotyp spezifischen getestet. Gegebenenfalls kann ein „Standard"- (nicht Pflanzenhergeleitetes) Präparat des Tumorantigens, z.B. Id33-tragende IgM-Moleküle, z.B. direkt von der Oberfläche von Lymphom 33-Zellen gereinigt, parallel zum Pflanzenexprimierten Protein getestet werden.
Bei einem weiteren Test auf die „native" Konformation von scFv33 mittels Western-Blot werden die scFv33 enthaltenden gereinigten Pflanzenextrakte der Elektrophorese unterzogen und mit dem mAb Anti-Id33 sondiert. Dieser Antikörper wird keine Banden an Extrakten von Kontrollpflanzen zeigen, die nicht mit einem für scFv33 kodierenden Virusvektor transfiziert wurden. Jedoch reagiert eine Bande der erwarteten Molekülmasse von scFv sehr wohl mit dem mAb-Reagens.
Außerdem würde man das scFv33 testen, indem Mäuse immunisiert werden, um eine polyklonale Immunreaktion zu erzeugen, beispielsweise durch Testen, ob polyklonale Antikörper Lymphom 33-hergeleitete intakte Ig-Moleküle (unter der Voraussetzung, dass vollständiges Ig verfügbar ist) erkennen und daran binden. Es wird angenommen, dass das vollständige Tumor-Ig im Falle der meisten Patientenspezifischen scFv-Proteinpräparate für das Testen nicht verfügbar sein werden.
Ein Fachkundiger auf dem Gebiet der Erfindung wird sofort einsehen, wie eine derartige Analyse eines in Pflanzen exprimierten heterologen Protein-Kandidat-Immunogens variiert werden kann, z.B. kann sie direkt anstatt kompetitiv durchgeführt werden, als kolorimetischer anstatt als fluorimetrischer Test durchgeführt werden, mittels ELISA anstatt Western-Blot usw., um dieselbe Information über die Konformation von scFv33 und seine Ähnlichkeit zum nativen Id33 an der Lymphom-Zelloberfläche (oder an richtig gefaltetem, isoliertem, Id33-tragendem IgM) zu erlangen.
Ermittlung der Wirksamkeit der Erzeugung einer Anti-Tumor-Reaktion
Das Vakzine-Präparat, eine lösliche immunogene Form eines B-Zell-Lymphom-Ig-Idiotyps, insbesondere bevorzugt ein scFv-Fragment, das den Oberflächen-Ig-V-Region-Isotyp nachahmt, wird an einen das Lymphom beherbergenden Patienten in einer Menge verabreicht, die wirksam ist, um eine tumorspezifische Reaktion, vorzugsweise eine Antikörperreaktion hervorzurufen. Es wird bevorzugt, dass die Immunreaktion eine ist, die bekanntermaßen mit einer positiven Behandlungswirkung verbunden ist, obgleich dies nicht erforderlich ist. Eine „Behandlungswirkung" oder „therapeutische Reaktion" sieht vor, beliebige und alle bekannten und auf dem Gebiet der Erfindung anerkannten Messungen der Stabilisierung oder Regression von Primärtumorläsionen und/oder Metastasen (oder von Tumoren, die an sekundären Stellen auftreten) zu umfassen. Beispielsweise sind Kriterien, die in dieser Definition umfasst sind, (1) eine Verminderung oder Stabilisierung der Lymphom-Tumorbelastung; (2) eine Verminderung oder Stabilisierung der Anzahl oder Größe von Tumormetastasen oder Tumorzentren an sekundären Stellen; (3) Verlängerung der tumorfreien Zeitspanne vor Rückfall; und (4) verlängertes Überleben des Patienten. Jedes einzelne oder mehrere dieser Kriterien qualifizieren sich als hierin vorgesehene therapeutische Reaktionen. Das Vorliegen einer therapeutischen Wirkung kann auf einem Vergleich mit historischen Kontrollpatienten gründen, die keine einzige Art von Immuntherapie erhielten.
Ein therapeutischer Erfolg ist auf dem Gebiet der Onkologie üblicherweise als Stabilisierung oder Regression des Tumors bei zumindest 25 % der Patientenpopulation anerkannt. Es ist allgemein anerkannt, dass eine Stabilisierung bedeutet, dass keine Tumorprogression, d.h. kein Anstieg (eigentlich ein Stillstand des Anstiegs) der Anzahl oder Größe von Primär- oder Metastaseläsionen auftritt. Eine Regression bezeichnet eine Abnahme der Größe und Anzahl von Läsionen (einschließlich Metastaseläsionen) bis hinunter zu einem vollständigen Verschwinden nachweisbarer Läsionen. „Tumorbelastung" ist bei Verwendung hierin und auf dem Gebiet der Erfindung die Summe der Flächen (Produkte der maximalen lotrechten Flächen) jeder messbaren Läsion. Gemäß dieser Erfindung kann die Tumorbelastung als Reaktion auf Behandlung entweder (a) stabilisieren, was das Fehlen der Zunahme der Tumorbelastung bedeutet, d.h. keine neuen Läsionen und kein Anstieg der Fläche jeglicher Läsion, oder (b) abnehmen (siehe unten stehende Definition von PR und CR).
Darüber hinaus können therapeutische Reaktionen vollständig oder partiell sein; beide sind auf dem Gebiet der Erfindung anerkannt und hier vorgesehen. Reaktionen, insbesondere auf Immuntherapie, umfassen im Allgemeinen partielle Reaktionen (PR) oder vollständige Reaktionen (CR). Die Surgery Branch of the National Cancer Institute ist ein tragendes Zentrum für die Entwicklung und Testung verschiedener Formen der Krebsimmuntherapie gewesen. Kriterien für Behandlungsreaktionen auf Immuntherapie, wie sie in Veröffentlichungen dieser Abteilung (sowie anderer Quel len) dargelegt sind, haben als Maßstäbe auf dem Gebiet der Erfindung gedient und andere Instanzen, wie z.B. die Weltgesundheitsorganisation haben ähnliche Beurteilungskriterien dargelegt. Die Definition von Behandlungsreaktionen, wie sie in einer Reihe von (unten zitierten) Veröffentlichungen angegeben werden, sind die auf dem Gebiet der Erfindung anerkannten Definitionen und werden hierin angewendet. Die folgenden Definitionen sind anerkannt:
PR: =50 % Anstieg der Summe der Produkte maximaler lotrechter Durchmesser für alle messbaren Läsionen ohne Anzeichen neuer Läsionen oder Progression jeglicher vorher bestehenden Läsionen.
CR: das Verschwinden aller Krankheitsanzeichen für zumindest einen Monat.
Mehrere beispielhafte Veröffentlichungen (hierin in ihrer Gesamtheit durch Verweis aufgenommen), die diese Definitionen nennen und einsetzen sind: S.A. Rosenberg et al., JAMA 272, 907–913 (1994), S.A. Rosenberg et al., J. Natl. Canc. Inst. 86, 1159–1166 (1994), J.C. Yang et al., J. Clin. Oncol. 12, 1572–1576 (1994), S.A. Rosenberg et al., Nature Medicine 4, 321–327 (1988).
Eine der hierin vorgesehenen „Behandlungswirkungen" ist eine messbare systemische Immunreaktion auf ein Tumorantigen (den Isotyp oder dessen Komponenten-Idiotyp), wobei diese Immunreaktion vorzugsweise auf dem Gebiet der Erfindung bekanntermaßen mit einer klinische Reaktion entweder in einer Patienten- (typischerweise Menschen-) Population oder in einem Tier-Tumormodell verbunden ist.
Eine wirksame Menge des immunogenen Proteins dieser Erfindung wird z.B. vom jeweiligen Präparat, der Verabreichungsweise, dem Stadium und Schweregrad des behandelten B-Zell-Lymphoms, dem Gewicht und allgemeinen Zustand des Patienten abhängen.
Zweckdienliche Dosen des immunogenen Polypeptids werden unten beschrieben. Verschiedene geeignete Impfpläne werden ebenfalls unten beschrieben. Eine wirksame Antikörperreaktion oder zellvermittelte Reaktion bei einem Menschen ist jede Reaktion, die an oder über der Nachweisgrenze, beispielsweise des ELISA, der T-Zell-Proliferation, T-Zell-Cytokinsekretion usw, liegt.
Die Tumorbelastung und Progression kann durch verschiedene Verfahren beurteilt werden, welche die Messung von Tumorabmessungen und Volumen, Messung der Größe des befallenen Lymphknotens (zervikal, axillär, inguinal und retroperitoneal usw.) oder der befallenen Milz umfassen, die radiographisch oder mittels Abtasten durchgeführt wird.
Formulierung der Polypeptid-Vakzine
Die Protein/Peptid-Zusammensetzung, die als Vakzine formuliert wird, kann das gesamte Zielprotein oder können Fragmente davon sein. Eine bevorzugte Vakzine für ein B-Zell-Lymphom umfasst den Idiotyp, der als einzigartiger Marker für dieses Lymphom dient. Folglich kann eine) V_H- oder V_L-Fragment oder Domäne des Lymphom-Oberflächen-Ig verwendet werden. Da jedoch von den meisten Idiotypen erwartet wird, dass sie das Resultat der Wechselwirkung der V_H- mit der V_L-Domäne sind, kombinieren bevorzugtere Zusammensetzungen beide dieser Regionen. Eine insbesondere bevorzugte Zusammensetzung ist ein scFv-Molekül.k.
Die Pflanzenexpressionssysteme der vorliegenden Erfindung verleihen dem Protein/Peptid-Immunogen ein Ausmaß an inhärenter Immunogenität, so dass wirksame Immunreaktionen in Abwesenheit von exogenen (oder Fusionsprotein-) Adjuvantien, Immunstimulantien, Depotmaterialien usw. erzeugt werden.
In manchen Fällen kann die Immunogenität oder Wirksamkeit des Proteins/Peptids aus seiner Konjugation an einen geeigneten Träger Nutzen ziehen, der üblicherweise ein anderes größeres Proteinmolekül ist, das dem immunisierten Wirt fremd ist.
Bei einem derartigen Konstrukt können mehrere Kopien des Polypeptids an ein einziges größeres Trägermolekül konjugiert werden. Der Träger kann Eigenschaften aufweisen, die den Transport, die Bindung, Absorption oder den Transfer des Polypeptidimmunogens erleichtern. Die Konjugation zwischen proteinartigen Materialien kann leicht unter Verwendung herkömmlicher Verfahren, wie z.B, bifunktionellen Vernetzern als Bindungsmittel erzielt werden (Means et al., Bioconjugate Chem. 1, 2-12 (1990)). Beispiele geeigneter Träger sind das Tetanus-Toxoid, das Diphtherie-Toxoid, Serumalbumin, Keyhole-Limpet-Hämocyanin und dergleichen. Konjugate, die diese „universellen" Träger umfassen, können T-Zell-Reaktionen (z.B. Helferzellen für Antikörperreaktionen) in einer weniger MHC-beschränkten Weise stimulieren, als sie ohne diese auftreten würden.
Das Pflanzen-exprimierte immunogene Protein/Peptid kann mit verschiedenen Flüssigkeiten und mit anderen, auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Substanzen kombiniert oder vermischt werden. Das Polypeptid wird herkömmlicherweise unter Verwendung von Verfahren formuliert, die für die Formulierung solcher Vakzinen wohlbekannt sind. Der aktive Bestandteil wird im Allgemeinen in einem annehmbaren Träger, wie z.B. Wasser, Salzlösung oder phosphatgepufferter Salzlösung aufgelöst oder suspendiert.
Die Vakzine-Zusammensetzung kann außerdem ein oder mehrere Adjuvantien oder immunstimulierende Mittel umfassen. Beispiele von Adjuvantien und Mitteln, welche die Wirksamkeit des Proteins als Immunogen erhöhen können, umfassen Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat, Aluminiumkaliumsulfat (Alaun), Berylliumsulfat, Kieselerde, Kaolin, Kohlenstoff, Wasser-in-Öl-Emulsionen, Öl-in-Wasser-Emulsionen, Muramyldipeptid, bakterielles Endotoxin, Lipid X, ganze Organismen oder subzelluläre Fraktionen der Bakterien Propionobacterium acnes oder Bordetella pertussis, Polyribonucleotide, Natriumalginat, Lanolin, Lysolecithin, Vitamin A, Saponin und Saponinderivate (wie z.B. das hierin als Beispiel dienende QS21), Liposomen, Levamisol, DEAE-Dextran, Blockcopofymere oder andere synthetische Adjuvantien. Ein weiteres Adjuvans ist ISAF-1 (siehe Beispiele). Derartige Adjuvanti en sind von einer Reihe von Handelsquellen erhältlich, beispielsweise Merck Adjuvant 65 (Merck und Company Inc., Rahway, NJ) oder Freundsches inkomplettes Adjuvans oder komplettes Adjuvans (Difco Laboratories, Detroit, MI), Amphigen (Öl-in-Wasser), Alhydrogel (Aluminiumhydroxid), oder ein Gemisch aus Amphigen und Alhydrogel. Aluminium ist für die Verwendung am Menschen zugelassen. Das Vakzine-Material kann an Kügelchen, wie z.B. Latex- oder Goldkügelchen, ISCOMs und dergleichen adsorbiert oder konjugiert sein. Allgemeine Verfahren zur Herstellung von Vakzinen sind in Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company Easton, PA (neueste Ausgabe) beschrieben.
Liposomen sind pharmazeutische Zusammensetzungen, in denen das aktive, entweder dispergiert oder andersartig vorliegende Protein in Korpuskeln enthalten ist, die aus wässrigen konzentrischen Schichten bestehen, die an Lipidschichten anhaften. Das aktive Protein liegt vorzugsweise in der wässrigen Schicht und in der Lipidschicht, innen oder außen, oder auf jeden Fall in einem nicht-homogenen System vor, das im Allgemeinen als eine liposome Suspension bekannt ist. Die hydrophobe Schicht, oder Lipidschicht, umfasst im Allgemeinen, jedoch nicht ausschließlich Phospholipide, wie z.B. Lecithin und Sphingomyelin, Steroide, wie z.B. Cholesterin, mehr oder weniger oberflächenaktive Substanzen, wie z.B. Dicetylphosphat, Stearylamin oder Phosphatidsäure und/oder andere Materialien hydrophober Natur. Adjuvantien, einschließlich Liposomen, werden in den folgenden Veröffentlichungen erörtert, die hierin durch Verweis aufgenommen sind: G. Gregoriades et al., Immunological Adjuvants and Vaccines, Plenum Press, New York (1989), S.M. Michalek et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 146, 51–58 (1989).
Weitere Erörterungen der Vakzine-Konstruktion, insbesondere von Systemen mit kontrollierter Freisetzung, finden sich in M.F. Powell et al. (Hrsg.), Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, M.F. Powell et al. (Hrsg.), Plenum Press, New York, S. 389–412 (1995). Systeme mit kontrollierter Freisetzung werden bei Menschen bereits als „Depots" verwendet, um Medikamente und Hormone abzugeben (R. Langer, Science 249, 1527–1533 (1990)). Derartige Systeme könnten eine signi fikante Auswirkung auf die Immunisierung haben, da sie konstruiert werden können, um kontrollierte Antigenmengen kontinuierlich oder in regelmäßigen Pulsen mit vorherbestimmten Geschwindigkeiten abzugeben (Cohen et al., Pharm. Res. 8, 713-720 (1991); Eldridge et al., Mol. Immunol. 28, 287–294 (1991a); Gander et al., on: Proc. Int. Syn. Control. Rel. Bioact. Mater., Controlled Release Society, Washington, DC, S. 65–66 (1993)), während gleichzeitig nicht abgegebenes Antigen vor dem raschen Abbau in vivo geschützt wird. Mikrokügelchen mit kontrollierter Freisetzung haben ein beträchtliches Potential für die orale Immunisierung (Edelman et al., Vaccine 11, 155–158 (1993); Eldridge et al., J. Control. Rel. 11, 205–214 (1990); McQueen et al., Vaccine 11, 201–206 (1993); Moldoveanu et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 146, 91–99 (1989); O'Hagan et al., Vaccine 11, 149–154 (1993b); Reid et al., Vaccine 11, 159–167 (1993)). Andere mögliche Vorteile polymerer Systeme mit kontrollierter Freisetzung umfassen : niedrigere Dosierungserfordernisse, was zu (1) einer verminderten Wahrscheinlichkeit unerwünschter Nebenwirkungen und (2) verminderten Kosten führt; lokalisierte oder zielgerichtete Abgabe von Antigen an Antigen-präsentierende Zellen oder an das Lymphsystem; es kann mehr als ein Antigen verkapselt werden, was die Konstruktion einer Formulierung erleichtert, die ein Individuum gegen mehr als eine Krankheit oder gegen mehrere Epitope eines gegebenen Tumors (oder mikrobiellen Pathogens) mit einer einzigen Injektion immunisieren kann; und verbesserte Befolgung durch den Patienten. Außerdem können Systeme mit kontrollierter Freisetzung letztlich die Anzahl der für die erfolgreiche Impfung erforderlichen Vakzine-Dosen auf eine einzige Injektion herabsetzen.
Mikrokügelchen sind als Vakzine-Träger für die kontrollierte Freisetzung aus zwei Gründen besonders geeignet: (1) Teilchen mit mehr als 10 μm Durchmesser sind fähig, für eine Langzeitpersistenz von Antigen an der Injektionsstelle zu sorgen, die für eine anhaltende Antikörper-Immunreaktion im hohen Ausmaß erforderlich sein kann, und (2) Mikroteilchen im Größenbereich von 1–10 μm werden von Makrophagen leicht phagozytiert (Eldridge et al., Adv. Exp. Med. Biol. 251, 192202 (1989); Tabata et al., Biomaterials 9, 356–362 (1988); J. Biomed Mater. Res. 22, 837–858), was eine direkte intrazelluläre Abgabe von Antigen an Antigen-präsentierende Zellen bewirkt.
Die Mikrokügelchen-Phagozytose durch Makrophagen kann durch Verändern der Oberflächeneigenschaften erhöht werden, da Mikrokügelchen mit hydrophoben Oberflächen im Allgemeinen leichter phagozytiert werden als jene mit hydrophilen Oberflächen (Tabata et al., Biomaterials 9, 356–362 (1988), Tabata et al., Crit. Rev. Ther Drug Carrier Syst. 7, 121–148 (1990)).
Unter den Vorteilen der Verwendung von Polymer-Mikrokügelchen für die Vakzine-Abgabe ist das Vermögen, die Zeit nach der Verabreichung zu kontrollieren, zu der das Antigen freigesetzt wird. Dieses Vermögen ermöglicht die Erzeugung einer Einzelinjektionsformulierung, die mehrere „Pulse" von Vakzine zu vorherbestimmten Zeiten nach der Verabreichung freisetzt (Gilley et al., in: Proc. Int. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater, Controlled Release Society, Orlando, S. 110–111 (1992)). Antigen-Freisetzungskinetiken aus Polymer-Mikrokügelchen können in einem hohen Ausmaß durch einfache Manipulation derartiger Variablen wie Polymerzusammensetzung und Molekulargewicht, Gewichtsverhältnis von Vakzine zu Polymer (d.h. der Vakzine-Beladung) und Mikrokügelchengröße kontrolliert werden (Hanes et al., in: Reproductive Immunology, R. Bronson et al. (Hrsg.), Blackwell, Oxford (1995)).
Vakzine-Formulierungen, die eine Kombination von kleinen (1–10 μm) und größeren (20–50 μm) Mikrokügelchen enthalten, können höhere und länger andauernde Antikörperspiegel im Vergleich zur Verabreichung der in Mikrokügelchen verkapselten Vakzine mit Durchmessern von ausschließlich 1–10 oder 20–50 μm produzieren (Eldridge et al., Mol. Immunol. 28287–294 (1991a)). In einer der Studien wurden Tetanus-Toxoid (TT) enthaltende Mikrokügelchen maßgeschneidert, um eine starke Priming-Antigen-Dosis zu produzieren, die über die ersten Tage nach der Injektion freigesetzt wurde, gefolgt von zwei „Boosting"-Dosen, die nach 1 Monat bzw. 3 Monaten freigesetzt wurden, um herkömmliche Impfpläne nachzuahmen (Gander et al., s.o.).
Die Schleimhautoberflächen, einschließlich Lunge, Nase, Vagina und Auskleidung des GI-Trakts, sind die Eintrittsstelle der meisten Pathogene in den Körper. Aus diesem Grund haben Mikrokügelchen, da sie aus dem Darm durch die Peyer'schen Plaques aufgenommen werden, ein beträchtliches Potential für die orale Immunisierung (Eldridge et al., s.o.; O'Hagan, Adv. Drug Deliv. Res. 5, 265–285 (1990)). Von der Polymerwand der Mikrokügelchen wird erwartet, dass sie verkapselte Vakzinen vor dem Abbau durch den niedrigen pH des Magens und vor der Proteolyse im Darm schützt. Vakzine-Protein (ein Toxin) enthaltende, oral verabreichte Mikrokügelchen induzierten nicht nur zirkulierende IgM, IgG- und IgA-Antitoxin-Antikörper, sondern auch eine verbreitete Schleimhaut-IgA-Reaktion in Mäusen. Im Gegensatz dazu resultierte die orale Immunisierung mit derselben Menge flüssigem Antigen in minimalen oder fehlenden Antikörpertitern aller Klassen (Eldridge et al. (1990), s.o.) Die für eine Vakzine-Mikroverkapselung am meisten verwendeten Polymere sind die auf Milch- und Glykolsäure basierenden Polyester gewesen. Diese Polymere haben mehrere Vorteile, einschließlich der umfangreichen Daten über ihre Abbaugeschwindigkeiten in vitro und in vivo (Lewis, in: Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems, Chasin und Langer (Hrsg.), Dekker, New York, S. 1–41 (1990); Tice und Tabibi, in: Treatise on Controlled Drug Delivery, A. Kydonieus (Hrsg.), Dekker, New York, S. 315–339 (1992)) und FDA-Zulassung für eine Reihe klinischer Anwendungen beim Menschen, wie z.B. Operationsnähte (Gilding et al., Polymer 20, 1459-1464 (1979); Schneider (1972), US-Patent Nr. 3.636.956) und ein auf Mikrokügelchen basiertes, kontrolliertes Abgabesystem für Leuproidacetat (Lupron-Depot) für 30 Tage, das bei der Behandlung von Prostatakrebs und Endometriose verwendet wird (Okada et al., Pharm. Res. 8, 787–791 (1991)).
Es gibt mehrere interessante Alternativen zu den Lactid/Glykolid-Polyestern. Beispielsweise werden manche bioabbaubare Polymere abgebaut, um Moleküle mit Adjuvans-Eigenschaften zu liefern und könnten sich als besonders zweckdienlich als Träger von schwach immunogenen Antigenen erweisen. Wegen der bekannten Adjuvanswirkung von L-Tyrosin-Derivaten (Wheeler et al., Int. Arch. Allergy Appl. Im munol. 69, 113–119 (1982); Wheeler et al., Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 75, 294-299 (1984)) wurde ein auf ein Dityrosin-Derivat basierendes Polymer von Langer und Mitarbeitern (Kohn et al., Biomaterials 7, 176–182 (1987)) synthetisiert und unter Verwendung des Modellantigens Rinderserumalbumin (BSA) untersucht (Kohne et al., J. Immunol. Methods 95, 31–38 (1986)). Es wurde bioabbaubares Poly(CTTH-Iminocarbonat) ausgewählt, da sein Hauptabbauprodukt, N-Benzoyloxycarbonyl-L-tyrosyl-L-tyrosinhexylester (CTTH), sich als ein genauso potentes Adjuvans wie Freund'sches Adjuvans (CFA) und Muramyldipeptid (MDP) erwies, wenn eine Serumantikörperreaktion gegen BSA in Mäusen über ein Jahr gemessen wurde.
Wegen seiner inhärenten Neigung, durch Makrophagen phagozytiert zu werden (Tabata et al., J. Bioact. Compat. Polym. 1, 32–46 (1986)), und seiner extensiven Verwendung bei pharmazeutischen und medizinischen Anwendungen, ist Gelatine ein zweckdienliches Polymer für die Vakzine-Mikroverkapselung (Tabata et al., Proc. Int. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater., Controlled Release Society, Washington, DC, S. 392–393 (1993)). Gelatine-Mikrokapseln sind auch verwendet worden, um Immunstimulatoren, wie z.B. MDP und Interferon-α zu verkapseln (Tabata et al., J. Pharni. Pharmacol. 39, 698–704 (1987); Pharm. Res. 6, 422–427 (1989b)). In Gelatine mikroverkapseltes MDP potenziert die das Tumorwachstum hemmende Aktivität von Makrophagen (Tabata et al. (1987), s.o.). Mikroverkapseltes MDP aktivierte Makrophagen in viel kürzerer Zeit als freies MDP und hemmte das Wachstum von Tumorzellen bei ungefähr 2.000-mal niedrigeren Konzentrationen. Eine Kombination von MDP und Vakzine-enthaltenden Gelatine-Mikrokügelchen könnte eine sehr potente Vakzine-Formulierung liefern.
Liposomen sind in vivo häufig instabil, höchstwahrscheinlich wegen ihrer raschen Zerstörung durch Makrophagen und Lipoprotein hoher Dichte (Schreier et al., J. Control. Rel. 5, 187–192 (1987)), und stellen daher nur eine kurze Antigen-Depot-Wirkung bereit, wenn sie subkutan oder intramuskulär injiziert werden (Eppstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3688–3692 (1985); Weiner et al., J. Pharm. Sci. 74, 922–925 (1985)). Einer der Ansätze zur Verlängerung der In-vivo-Halbwertszeit von Liposomen (Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 10440–10444 (1991)) war die Verwendung von Alginat-Polymeren zur Verkapselung von Vakzineenthaltenden Liposomen in Mikrokügelchen, wodurch sie vor der raschen Zerstörung in vivo geschützt wurden. Fünfzig Tage nach der Injektion in Ratten wurden nahezu 50 % der Modell-Vakzine rückgewonnen, wenn die Liposomenformulierung vor der Injektion mikroverkapselt worden war. Im Gegensatz dazu wurde kein radioaktives BSA an den Injektionsstellen nach 50 Tagen detektiert, wenn Liposomen alleine als Träger verwendet wurden. Die erhöhte Antigen-Zurückhaltungszeit korrelierte mit den höheren und länger andauernden Anti-BSA-Antikörpertitern, die bei ihren Maximalspiegeln mit MELs 2- bis 3-mal höher als mit nicht verkapselten Liposomen waren (13). Enzymatisch aktivierte, mikroverkapselte Liposomen (MELs), die fähig sind, pulsierende Vakzine-Freisetzungskinetiken bereitzustellen, sind ebenfalls hergestellt worden (Kibat et al., FASEB J. 4, 2533–2539 (1990)). Von MELs wird auch erwartet, dass sie eine erhöhte Stabilität als Träger für orale Verabreichung zeigen.
Mikrokügelchenproduktion
Es kann eine Vielzahl von Verfahren verwendet werden, um mit Vakzine beladene Polymer-Mikrokügelchen herzustellen, die zu einem breiten Spektrum von Freisetzungsmustern und Freisetzungsdauern fähig sind. Das Verfahren der Wahl wird üblicherweise von der relativen Kompatibilität der Prozessbedingungen mit dem Antigen (z.B. das Verfahren, das im geringsten Verlust an Vakzine-Immunogenität resultiert) und dem verwendeten Polymerexzipienten bestimmt, kombiniert mit dem Vermögen des Verfahrens, Mikrokügelchen geeigneter Größe zu produzieren.
Lösungsmittelverdampfungstechniken sind aufgrund ihrer relativ einfachen Aufbereitung, Zugänglichkeit für Maßstabsvergrößerung und deshalb beliebt, weil hohe Verkapselungseffizienzen erlangt werden können. Von besonderer Bedeutung für Vakzinen, die gegen organische Lösungsmittel empfindlich sind, könnte die Mehrfach-Emulsionstechnik sein (Cohen et al., Pharm. Res. (1991), s.o.). Sprühtrocknungs- und Filmumhüllungstechniken sind ebenfalls verwendet worden, um monolithische Polymer-Mikrokügelchen herzustellen.
Mikrokapseln bestehen aus einem Vakzine-beladenen Kern, der von einer dünnen Polymermembran umgeben ist, und werden daher häufig als „Reservoir"-Systeme bezeichnet.
Träger- und Vakzine-Stabilität während der Vorrichtungsentwicklung, Lagerung und In-vivo-Deponierung müssen bedacht werden. Polypeptide können fragile dreidimensionale Strukturen aufweisen, die für die lmmunogenität der Vakzine entscheidend sind. Diese dreidimensionale Struktur kann beeinträchtigt werden oder verloren gehen, wenn das Antigen denaturiert oder aggregiert. Exposition mit organischen Lösungsmitteln, Rehydratisierung nach Lyophilisierung bei Exposition mit Feuchtigkeit oder komplexe chemische Wechselwirkungen mit dem Polymerexzipienten oder mit anderen Chemikalien im Präparat einer Vorrichtung mit kontrollierter Freisetzung könnten im Verlust oder in einer Verminderung der lmmunogenität der Proteinbasierten Vakzine resultieren. Die folgenden Dokumente beschreiben die Stabilisierung komplexer Antigene (Arakawa et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 10, 1–28 (1993); Liu et al., Biotechnol. Bioeng. 37, 177–184 (1991); Volin und Klibanov, in: Protein Function: A Practical Approach, T.E. Creighton (Hrsg.), IRL Press, Oxford, S. 1–24 (1989)).
Ein Vorteil von Polymer-Mikrokügelchen-Formulierungen ist es, dass viele Polymere bei Raumtemperatur für längere Zeiträume stabil sind, wenn sie trocken gehalten werden. Beispielsweise ist von Lactid/Glykolid-Polyestern berichtet worden, dass sie stabil sind, wenn sie trocken und unter etwa 40 °C gehalten werden (Aguado et al., Immunobiology 184, 113–125 (1992)). Außerdem können Vakzinen im trockenen Zustand in den Mikrokügelchen-Formulierungen gelagert werden, was in Anbetracht der Empfindlichkeit mancher Proteine auf durch Feuchtigkeit ausgelöste Aggregation ein wichtiger Vorteil ist (Liu et al., s.o.).
Die Vakzine-Zusammensetzungen enthalten vorzugsweise (1) eine wirksame Menge des immunogenen Polypeptids zusammen mit (2) einer geeigneten Menge eines Trägermoleküls oder gegebenenfalls eines Trägervehikels und, falls erwünscht, (3) Konservierungsmitteln, Puffern und dergleichen. Beschreibungen von Vakzine-Formulierungen finden sich in A. Voller et al., New Trends and Developments in Vaccines, University Park Press, Baltimore, Maryland (1978).
In einer ihrer Ausführungsformen umfasst die Vakzine-Zusammensetzung ein oder mehrere Cytokine. GM-CSF ist ein potentes immunstimulatorisches Cytokin mit Wirksamkeit bei der Förderung einer Antitumorreaktion, insbesondere von T-Zell-Reaktionen (M. Bendandi et al., s.o.). In einer verwandten Ausführungsform können pro-entzündliche Chemokine zugegeben werden, z.B. Interferon-induzierbares Protein 10 und MCP-3 (A. Biragyn et al., Nature Biotechnology 17, 253–258 (1999)). Im Allgemeinen scheint es, dass jegliches Cytokin oder Chemokin für die vorliegende Vakzine-Formulierung zweckdienlich ist, das entzündliche Reaktionen auslöst, Antigen-präsentierende Zellen (APC) zum Tumor rekrutiert und, möglicherweise bedeutsamer, das Abzielen Antigen-präsentierender Zellen (APC) auf Chemokin-Rezeptorvermittelte Aufnahme des Polypeptidantigens fördert, was zur Erzeugung entscheidender Effektor-T-Zellen führt.
Wie bei allen immunogenen Zusammensetzungen zum Hervorrufen von Antikörpern oder zellvermittelter Immunität müssen die immunogen wirksamen Mengen der Polypeptide der Erfindung empirisch ermittelt werden. Zu berücksichtigende Faktoren umfassen die Immunogenität des nativen Polypeptids, ob das Polypeptid mit einem Adjuvans oder Trägerprotein oder einem anderen Träger komplexiert oder daran kovalent gebunden wird oder nicht, und den Verabreichungsweg und die Anzahl zu verabreichender Immunisierungsdosen. Solche Faktoren sind auf dem Gebiet der Vakzinen bekannt, und fachliche geschulte Immunologen können derartige Ermittlungen ohne übermäßiges Experimentieren sehr wohl vornehmen.
Das Verhältnis von Proteinimmunogen und Adjuvans kann über einen weiten Bereich variiert werden, solange beide in wirksamen Mengen vorliegen. Beispielsweise kann Aluminiumhydroxid in einer Menge von ungefähr 0,5 % des Vakzine-Gemischs zugegen sein (auf Basis von Al₂O₃).
Nach der Formulierung kann die Vakzine-Zusammensetzung in einen sterilen Behälter aufgenommen werden, der versiegelt und bei niedrigen Temperaturen, beispielsweise 4 °C oder –20 °C oder –80 °C gelagert wird. Alternativ dazu kann das Material lyophilisiert werden, was eine Langzeitlagerung in einer stabilisierten Form ermöglicht.
Verabreichung und Dosierung
Die Vakzinen werden so verabreicht, wie es auf dem Gebiet der Erfindung allgemein üblich ist. Für gewöhnlich erfolgt eine systemische Verabreichung mittels Injektion; jedoch sind andere wirksame Verabreichungswege bekannt. Bei geeigneter Formulierung können Polypeptid-Vakzinen über die Schleimmembran hinweg unter Verwendung von Eindringmitteln, wie z.B. Gallensalzen oder Fusidinsäure in Kombination, üblicherweise mit einem Tensid verabreicht werden. Transkutane Verabreichung von Polypeptiden ist ebenfalls bekannt. Orale Formulierungen können ebenfalls verwendet werden.
Dosierungsausmaße hängen vom Verabreichungsmodus, der Veranlagung des Patienten und der Beschaffenheit der Träger/Ajuvans-Formulierung ab. Vorzugsweise liegt eine wirksame Dosis des Proteins oder Polypeptids zwischen ungefähr 0,01 μg/kg und ungefähr 1 mg/kg Körpergewicht. Die Menge des Immunogens pro Dosis kann im Bereich von ungefähr 0,01 mg bis 100 mg Protein pro Patient pro Injektion liegen. Ein bevorzugter Bereich ist von ungefähr 0,2 bis 2 mg pro Dosis. Ein geeignetes Einheitsdosisausmaß beträgt ungefähr 0,5 ml. Demgemäß könnte eine Einheitsdosisform für subkutane Injektion 0,5 mg Immunogen, vermischt mit 0,5 % Aluminiumhydroxid in 0,5 ml umfassen.
Die Verabreichung erfolgt vorzugsweise durch Injektion bei einer oder mehreren Gelegenheiten, um eine systemische Immunität hervorzurufen. Im Allgemeinen werden mehrere Verabreichungen der Vakzinen in einem Standardimmunisierungsprotokoll verwendet, wie es auf dem Gebiet der Erfindung die Norm ist. Beispielsweise können die Vakzinen in etwa zwei- bis sechswöchigen Intervallen, vorzugsweise monatlich für eine Dauer von einer bis sechs Impfungen verabreicht werden, um für Schutz zu sorgen.
Die Vakzine kann über jeglichen herkömmlichen Weg, einschließlich oral und parenteral verabreicht werden. Beispiele parenteraler Wege sind subkutan, intradermal, transkutan, intravenös, intramuskulär, intraorbital, intrakapsulär, intrathekal, intraspinal, intrazisternal, intraperitoneal usw.
Die Impfung mit der Vakzine-Zusammensetzung wird in einer systemischen Immunreaktion resultieren, die entweder eine Antikörperreaktion oder eine zellvermittelte Immunreaktion oder beides umfasst. Dies sollte für eine therapeutische Antitumorwirkung sorgen und/oder in Antikörpern und aktivierten T-Lymphozyten verschiedener Klassen resultieren, die selbst als therapeutische Mittel verwendet werden, beispielsweise zur Hervorbringung passiver Immunität bei Tumor-tragenden Patienten. Außerdem haben derartige Antikörper oder T-Zellen eine Reihe von Forschungsverwendungen, die den Fachkundigen auf dem Gebiet der Erfindung offensichtlich sind.
Da nun die Erfindung allgemein beschrieben worden ist, kann dieselbe durch Bezugnahme auf die folgenden Beispiele leichter verstanden werden, wobei die Beispiele zu illustrativen Zwecken bereitgestellt werden und, wenn nicht anders angegeben, nicht die Einschränkung der vorliegenden Erfindung beabsichtigen.
Die folgenden Beispiele werden ausschließlich zu illustrativen und nicht zu einschränkenden Zwecken bereitgestellt. Fachlich Geschulte werden eine Vielzahl nicht entscheidender Parameter erkennen, die verändert oder modifiziert werden könnten, um im Wesentlichen ähnliche Ergebnisse zu erlangen.
Beispiel 1
Erlangen von Genen, die für V_H- und V_L-Regionen der Lymphom-B-Zellen kodieren
Dieses Beispiel beschreibt Verfahren zum Erlangen von Nucleinsäuren, die für V_H- und V_L-Domänen aus einem B-Zell-Lymphom kodieren.
Zellen aus dem Lymphom wurden durch Knochenmarksaspiration isoliert. Für die RNA-Isolierung wurden Einzelzellsuspensionen von 0,5 bis 1 × 10⁷ Zellen verwendet. Für die anschließenden Schritte wurden die Zellen entweder frisch oder nach Einfrieren und Lagerung bei –80 °C in 10 % DMSO und 90 % Fötalkälberserum (FCS) verwendet. Gefrorene Zellen wurden bei 37 °C schnell aufgetaut und in eiskaltes, steriles PBS überführt. Frische sowie gefrorene Zellen wurden mehrere Male in PBS durch Zentrifugation bei 1.500 U/min (klinische IEC-Zentrifuge) gewaschen. Nach dem letzen Waschvorgang wurde das PBS vorsichtig entfernt und die RNA aus dem Zellpellet isoliert.
Die RNA-Isolierung wurde bei Raumtemperatur rasch durchgeführt (wobei der Laborant Handschuhe trägt und steril verschlossene Spitzen verwendet, um eine Kreuzkontamination zu verhindern). Es wurde das Protokoll des RNeasy Gesamt-RNA-Sets von Qiagen (Kat.-Nr. 74104) wie unten zusammengefasst befolgt. Die Zellen wurden in 350 μl RLT (im Set bereitgestellt) gelöst, das mit 10 μl konzentriertem β-Mercaptoethanol pro ml Suspension ergänzt war, das unmittelbar vor Verwendung zugegeben wurde. Das Zellpellet wurde mittels Pipettieren resuspendiert. Wenn Zellklumpen verblieben, wurden weitere 350 μl RLT zugegeben und die Probe in zwei Teile geteilt, bevor mit der Reinigung fortgefahren wurde. Falls notwendig, wurden die Zelllysate für eine spätere Verarbeitung in RLT eingefroren.
Die Zellen wurden durch wiederholte Passage durch eine Injektionsnadel Nr. 17 (4- bis 5-mal) lysiert und es wurden dem Lysat 350 μl 70%iges Ethanol zugegeben und vermischt. RNA-Präzipitate waren als trübe oder klebrige weiße Fäden sichtbar. Das Gemisch wurde auf die RNeasy-Zentrifugiersäule aufgegeben und bei 8.000 × g für 15 Sekunden zentrifugiert. Nach dem Verwerfen des Durchflusses wurde die Säule mit 700 μl Puffer RW1 (im Set bereitgestellt) gewaschen und bei 8.000 × g für 15 Sekunden zentrifugiert. Der Durchfluss wurde wiederum verworfen. Die Säule wurde in ein sauberes Röhrchen (bereitgestellt) überführt und mit 500 μl RPE (bereitgestellt) mit zugesetztem Ethanol gewaschen. Nach einer Zentrifugation bei 8.000 × g für 15 Sekunden wurde der Durchfluss verworfen und die Säule mit weiteren 500 μl RPE + Ethanol gewaschen. Die Säule wurde bei 8.000 g für 2 Minuten wiederum zentrifugiert und dann getrocknet. Die Säule wurde in ein sauberes RNA-se-freies Röhrchen (bereitgestellt) überführt und mit 30–50 μl RNAse-freiem Wasser (bereitgestellt) eluiert. Nach 1 Minute Zentrifugation bei 8.000 x g wurde die Säule verworfen und das RNA-Produkt entweder auf Eis gehalten oder gefroren bei –80 °C gelagert. Dieses RNA-Produkt wurde als Templat für die Synthese von cDNA verwendet.
In einem 0,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen wurden 1 μl 100 mM pdN6-Zufallsoligonucleotid-Hexamere oder Oligo-dT in RNAse-freiem Wasser zu 10 μl RNA-Lösung zugegeben. Das Gemisch wurde in einem Thermocycler oder in einem Wasserbad für 10 Minuten auf 85 °C erhitzt und für 5-10 Minuten auf Eis gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde in einem gesonderten Röhrchen wie folgt hergestellt: 4 μl 5x-Erststrangsynthesepuffer, 2 μl 0,1 mM DTT, 1 μl 25 mM dNTP-Gemisch (RNAse-frei), 1 μl RNAsin (Promega), 2 μl Superscript II (Gibco BRL) und 1 μl 100 mM Konstantregion-spezifische Primer (siehe oben) oder 1 μl 100 mM pdN6-Zufallshexamere. Auf Eis wurden 10 μl des Gemischs zu 10 μl RNA zugegeben und die cDNA-Synthese in einem Thermocycler fortgesetzt, der auf 23 °C 10 Minuten, 42 °C 85 Minuten, 95 °C 5 Minuten, 4 °C Halten eingestellt war. Die Proben wurden vom Thermocycler entfernt und entweder sofort für die spezifische PCR-Amplifikation verwendet oder bei –20 °C eingefroren bis zur Verwendung gelagert.
Die PCR-Reaktionen wurden in 0,5-ml-PCR-Röhrchen angesetzt, und zwar in Gegenwart von 1 μl Templat-cDNA, 1 μl 50 μM 5'-Primer, 1 μl 50 μM 3'-Primer, 10 μl 10X-PCR-Puffer und 37 μl Wasser. Die Proben wurden für 5 Minuten aufgekocht, zur Pelletverdichtung zentrifugiert und dann auf Eis gegeben.
Die RT-PCR-Amplifikation wurde durch Zugabe von 50 μl eines Gemischs ausgelöst, das 1 μl 25 μM dNTP, 1 μl PFU- oder Taq-Polymerase und 48 μl Wasser enthielt. Es wurde Öl zugegeben, die Röhrchen wurden dicht verschlossen und die Proben vom Eis auf einen auf 95 °C vorgewärmten PCR-Heizblock überführt. Die PCR-Zyklen umfassten (1) einen ersten Zyklus von 10 Minuten bei 95 °C, (2) 30–35 Zyklen, die 1 Minute bei 50 °C, 1 Minute bei 72 °C und 1 Minute bei 95 °C umfassten, (3) einen weiteren Zyklus von 10 Minuten bei 72 °C und schließlich (4) eine Inkubation bei 4 °C, sobald die Reaktion beendet war.
Nach den Thermozyklen wurden 10 μl Probenvolumen an einem 1,5%igen Agarose/TAE-Gel mit 0,01 % Ethidiumbromid analysiert. Banden wurden unter UV-Licht sichtbar gemacht und herausgeschnitten. Die DNA wurde mit dem Qiagen-Gelreinigungsset (Nr. 28706) nach einem Standardprotokoll gereinigt. Das Material wurde in 40 μl Wasser eluiert. Die Nucleotidsequenz des PCR-Produkts wurde mittels Didesoxysequenzierung verifiziert, die in Perkin Elmer-PCR-Röhrchen unter Verwendung des 9600 PCR-Apparats mit dem heißen Aufsatz in Gegenwart von 5 μl DNA-Templat, 4 μl „Big Dye"-Sequenzierungsgemisch (Cetus) und 1 μl von entweder 5'- oder 3'-spezifischem, oben beschriebenen Primer durchgeführt wurde. Die Röhrchen wurden verschlossen und die PCR-Sequenzierung wurde unter Verwendung von 25 Zyklen von 10 Sekunden bei 96 °C, 5 Sekunden bei 50 °C und 4 Minuten bei 60 °C ausgelöst, gefolgt von Inkubation bei 4 °C, sobald die Amplifikationszyklen beendet waren. Die Reaktionsprodukte der Sequenzierung wurden mittels Princeton-Separatorsäule gereinigt, getrocknet und an einem Perkin Elmer-Sequenzierapparat der Elektrophorese unterzogen.
Beispiel 2
Erzeugung eines Selbst/Tumor-Antigens aus Patienten- CJ, das den Idiotyp von CJ-B-Zell-Lymphom umfasst
Das als „CJ" bezeichnete immunogene scFv-Protein stammte von einem Lymphom-Patienten (mit den Initialen CJ) und wies als seinen Linker (Gly₄Ser)₃ auf. Der Patient CJ ist in einem frühen passiven Immuntherapieversuch behandelt worden. Das CJ-Molekül (im Speziellen seine) V-Region-Epitop oder Epitope) wird vom einem 7D11 genannten Anti-Id-mAb erkannt.
In einem anfänglichen Ansatz, ein menschliches scFv-Polypeptid herzustellen, wurden CJ-V-Region-Gene sequenziert und unter Verwendung eines (Gly₃Ser)₄-Linkers in ein bakterielles Expressionssystem kloniert. Obgleich es mit einem PEL-b-Leader auf das Periplasma abgezielt war, wurde das CJ-scFv-Protein in unlösliche Einschlusskörperchen sequestriert. Wenn Mäuse mit in Bakterien hergestelltem CJ-scFv-Protein immunisiert wurden, konnten keine Anti-CJ-Anti-Idiotyp-Antikörperreaktionen nachgewiesen werden.
CJ-Derivate wurden unter Verwendung eines neuen Verfahrens der Herstellung von Linkern mit Zufallslänge und Sequenz erzeugt, das Teil einer allgemeinen, auf PCR basierenden Klonierungsstrategie war, die in der ebenfalls anhängigen, gemeinsam abgetretenen vorläufigen Patentanmeldung beschrieben ist (USSN 60/1555.978, angemeldet am 24. September 1999, mit dem Titel „Creation of Variable Length and Sequence Linker Regions for Two Domain Molecules"). Es wurden vier Reaktionen durchgeführt. In der ersten und zweiten wurde die für die V_H-Domäne kodierende Sequenz aus einem cDNA-Klon der Lymphomzellen vom Patienten CJ unter Verwendung der folgenden synthetischen Oligonucleotide amplifiziert:
V_HF: 5' gtg gca tgc agg ttc aac tgg tgg agt ctg (Seq.-ID Nr. 41)
V_HR: 5' (asy)_x tga gga gac ggt gac cag ggt tc (Seq.-ID Nr. 42)
Die Sphl-Restriktionsstelle ist unterstrichen. In der ersten Reaktion war x gleich 6 und in der zweiten Reaktion war x gleich 9.
In der dritten und vierten PCR-Reaktion wurde die für die V_L-Domäne kodierende Sequenz aus einem cDNA-Klon von CJ unter Verwendung der folgenden synthetischen Oligonucleotide amplifiziert:
V_LF: 5' (rst)_n gac att cag atg acc cag tct cct tc (Seq.-ID Nr. 43)
V_LR: 5' cac cct agg cta tcg ttt gat cag tac ctt ggt ccc ctg (Seq.-ID Nr. 44)
Die Avrll-Stelle ist unterstrichen. In der dritten Reaktion war n gleich 6 und in der vierten Reaktion war n gleich 9.
Nach der Amplifikation wurden die vier PCR-Produkte gereinigt und mit den Restriktionsenzymen Sphl für das V_H-Ketten-PCR-Produkt und Avrll für das V_L-Ketten-Produkt verdaut. Die Digests wurden an der Elektrophorese an Agarosegelen unterzogen und die vier verdauten PCR-Fragmente wurden gereinigt, kombiniert und in einen Geneware-Expressionsvektor, pBSG1250 (pTTOSA-Derivat), ligiert, der mit den Restriktionsenzymen Sphl und Arvll verdaut worden war. In dem speziellen Geneware-Vektor liegt die Sphl-Stelle stromab des subgenomischen TMV-U1-CP-Promotors und der α-Amylasesignalpeptidsequenz. Nach Ligation der beiden V_H- und V_L-PCR-Fragmente in den Geneware-Vektor, wurde die DNA mit Polynucleotidkinase + ATP behandelt, um Phosphate an den stumpfen 5'-Enden des anfänglichen PCR-Produkts zu inkorporieren.
Nach der Kinasereaktion wurde die DNA an sich selbst rückligiert, um zirkuläre Plasmide zu erzeugen. Die ligierte DNA wurde in E. coli transformiert (mittels Elektrophorese) und die transformierten Zellen wurden auf die 50 μg/ml Ampicillin enthaltenden Selektivmediumsplatten ausplattiert. Die Plasmid-DNA wurde aus einzelnen Ampicillin-resistenten E. coli-Kolonien gereinigt und mit T7-RNA-Polmerase transkribiert, um infektiöse Transkripte einzelner Klone zu erzeugen.
Die Transkripte wurden in Pflanzenprotoplasten (N. tobacum) unter Verwendung eines im Wesentlichen in Lindbo et al., Plant Cell 5, 1749–1759 (1993) beschriebenen, PEG-basierten Transfektionsprotokolls transfiziert und die transfizierten Protoplasten dann in Protoplastenkulturmedium für mehrere Tage inkubiert. Dieses Medium enthielt 265 mM Mannit, 1X-Murashige-Minimal-Organics-Medium (GibcoBRL), 1,5 mM KH₂PO₄, 0,0002 mg/ml 2,4-Dichlorpehnoxyessigsäure, 0,0001 mg/ml Kinetin und 5 % Kokosnusswasser. Im Allgemeinen wurden die Protoplasten bei einer Dichte von ungefähr 10⁶ Zellen/ml kultiviert. Plasmid-DNA wurde aus zumindest 10 bis 50 einzelnen Kolonien aus jedem Klonierungsexperiment gereinigt.
Ungefähr 1–4 Tage nach der Transfektion wurden Proteinproben aus den einzelnen transfizierten Protoplastenproben gesammelt. 200–500 μl Kulturmedium wurden mittels Speedvac-Verdampfung oder Microcon-Probenkonzentrator etwa 10fach konzentriert.
Da diese Klonierungsstrategie eine Signalpeptidsequenz umfasste, die zur Sekretion des Proteinprodukts durch die Pflanzenzellen in das Kulturmedium konstruiert war, wurden Mediumsproben mittels SDS-PAGE, gefolgt von Coomassieblau-Färbung und/oder Western-Blots analysiert.
Das Anfangs-scFv inkorporierte die Standard-(Gly₄-Ser)₃-Linkersequenz; die anderen scFv-Ketten wurden zufällig aus den Transformanten selektiert, die aus dem Linker-Bibliothek-Klonierungsexperiment erlangt wurden, das die aus den obigen vier Primern Seq.-ID Nr. 25–28 erzeugten, klonierten PCR-Produkte einsetzte. Kulturüberstände aus der gleichen Anzahl von Zellen wurden der Elektrophorese (SDS-PAGE) unterzogen und die Gele auf Nitrozellulosemembranen für Western-Analyse mit mAb 7D11 transferiert (siehe oben).
Einige selektierte Linker-Bibliothek-Elemente, die statistisch gescreent wurden, schienen genauso viel CJ-Protein zu exprimieren und anzureichern wie das CJ-scFv mit dem Linker (Gly₄-Ser)₃.
Die DNA jener Bibliothekselemente, die besonders hohe Mengen an CJ-scFv exprimierten, wurde sequenziert. Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Plasmid-DNA für selektierte Klone wurde unter Verwendung von Standardverfahren hergestellt und sequenziert. Aus den Nucleotidsequenzen der verschiedenen, CJ-hergeleiteten Konstrukte wurde die Linkersequenz einzelner Klone abgeleitet. Tabelle 1 listet einige der erhaltenen Nucleotid- und Aminosäure-Linkersequenzen auf und weist auf „relative Expression" hin, worunter die Menge an Expression relativ zum selben Protein, jedoch mit dem (Gly₄Ser)₃-Linker verstanden wird.
Tabelle 1 Analyse selektierter Elemente des CJ-Linkerbibliothek-Experiments in Pflanzenprotoplasten
Die DNA-Sequenzierung offenbarte eine Nucleotid- und Aminosäurediversität. Die Klone hatten nicht dieselben Nucleotid- oder Aminosäuresequenzen, sondern zeigten stattdessen eine Aminosäure- und Nucleotid-Längendiversität. Die obige Tabelle 1 zeigt eine Auswahl von Klonen mit Linkerregionen im Bereich von 13 bis 20 Aminosäuren. Dies beruhte anscheinend auf einer falschen Primeranlagerung während der PCR-Amplifikation der für V_H- und V_L kodierenden Sequenzen. Da die für die Linker kodierenden Sequenzen der in diesem Experiment verwendeten Oligonucleotide Abschnitte von Nucleotidsequenzen niedriger Komplexität enthalten (d.h. rst_x und asy_n), besteht die Wahrscheinlichkeit, dass mehrere Ereignisse falscher Primeranlagerung auftreten, die in Verbindung mit den während der PCR vorhandenen DNA-Polymerase/Exonuclease-Aktivitäten zu einer Erhöhung oder Erniedrigung der Anzahl von Codons in den Linkersequenzen führen.
Es bestand außerdem eine Verschiedenheit hinsichtlich der produzierten CJ-scFv-Proteinmengen (bezüglich des CJ-scFv mit dem (Gly₄Ser)₃). Dies zeigt an, dass die Länge und Aminosäuresequenz der Linkerregion die Menge an Protein beeinflusst, welche die Pflanzenzellen oder Pflanzen produzieren.
Beispiel 3
Expression des scFv-Produkts in vollständigen Pflanzen
Das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren wird wiederholt mit der Ausnahme, dass vollständige Pflanzen zusammen mit einem geeigneten Expressionssystem zur Produktion der scFv-Produkte verwendet werden. Die exprimierten Produkte werden mittels SDS-PAGE/Coomassieblau-Färbung und/oder Western-Blotting gescreent. Die Ergebnisse weisen auf ein variable Menge an produziertem scFv-Produkt hin. Die Klone mit den höchsten Ausbeuten werden für die Produktion des Vakzine-scFv gewählt.
Expressionssystem
Die für die Doppeldomänen-scFv-Fragmente mit den V-Regionen des menschlichen CJ-Lymphoms kodierenden DNA-Fragmente wurden wie in Beispiel 1 erzeugt und in einen modifizierten TTO1A-Vektor kloniert, der eine Hybridfusion von TMV und ToMV enthielt (M.H. Kumagai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 1679–1683 (1995)). In diesem Vektor ist ein subgenomischer TMV-Hüllproteinpromotor stromauf der Insertionsstelle der CJ-Sequenz lokalisiert. Nach der Infektion steuert dieser subgenomische TMV-Hüllproteinpromotor die Initiation der CJ-RNA-Synthese in Pflanzenzellen am Transkriptionsstartpunkt („tsp"). Das Reis-α-Amylase-Signalpeptid (S.D. O'Neill et al., Mol. Gen. Genet. 221, 235–244 (1990)), In-frame fusioniert an die CJ-Sequenz, kodiert für ein 31-Reste-Polypeptid, das Proteine in den Sekretionsweg leitet (S. Firek et al., Transgenic Res. 3, 326–331 (1994)) und anschließend zwischen dem C-terminalen Gly des Signalpeptids und dem N-terminalen Net des exprimierten CJ-scFv-Proteins gespalten wird. Die für CJ-scFv kodierende Sequenz ist zwischen den 30K-Bewegungsprotein- und ToMV-Hüllprotein- (Tcp-) Genen eingeführt worden. Ein SP6-Phagenpromotor ist stromauf der Virus-cDNA eingeführt worden, was die Transkription infektiöser genomischer Plus-Strang-RNA ermöglicht.
Infektiöse Cap-RNA wurde in vitro aus 1 μg Pmel-linearisiertem Plasmid unter Verwendung eines SP6-Message-Sets von Ambion hergestellt. Die Synthese der Message wurde mittels Gelelektrophorese quantifiziert und ungefähr 2 μg der in vitro transkribierten Virus-RNA wurde mit einem Schleifmittel auf die unteren Blätter (Größe ungefähr 1–2 cm) von N. Benthamiana aufgebracht (W.O. Dawson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 1832–1836 (1986)). Die Transkription der für das CJ-scFv-Protein kodierenden subgenomischen RNA wird nach Infektion am bezeichnete Transkriptionsstartpunkt initiiert. Hohe Ausmaße an subgenomischen RNA-Spezies werden in Virus-infizierten Pflanzenzellen synthetisiert (M.H. Kumagai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 427–430 (1993)) und dienen als Template für die Translation und anschließende Anreicherung von CJ-scFv-Protein.
Charakterisierung der Klone
Anzeichen einer Infektion waren 5–6 Tage als leichte Blattdeformation mit etwas Blattsprenkelung und Wachtumsverlangsamung sichtbar. Elf bis vierzehn Tage nach der Beimpfung wurden sekretierte Proteine isoliert. Blatt- und Stammmaterial wurde geerntet, gewogen und dann einem Hg-Vakuum von 700 mm für 2 Minuten in Infiltrationspuffer (100 mM Tris-HCl, pH 7,5, und 2 mM EDTA) unterzogen. Die sekretierten Proteine (hiernach als „Interstitialfraktion" bezeichnet) wurden aus infiltrierten Blättern durch schonende Zentrifugation bei 2.000 g (Beckman JA-14) an unterstützten Nylonnetzscheiben gewonnen und in Centricon-10-Konzentratoren (Amicon) ungefähr 10fach konzentriert. Gesamtprotein wurde mittels Bradford-Verfahren gemessen (M. Bradford, Anal. Biochem. 72, 248–254 (1976)) und bis zur Verwendung bei – 80 °C gelagert.
Das sekretierte Material wurde auf die Gegenwart von löslichem CJ-scFv-Protein mittels SDS-PAGE, gefolgt von Western-Blotting mit dem für den Idiotyp von CJ spezifischen CJ-mAb 7D11 analysiert. Ungefähr 3 μg IF-Protein wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt und in Standard-Tris-Glycin-Puffer mit 20 % Methanol bei 150V für 1 Stunde auf Nitrocellulosemembranen transferiert. Nach dem Transfer wurden die Blots für 20 Minuten bei Raumtemperatur mit Blockpuffer (50 mM Tris, pH 8, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2,5 % fettfreie Milch, 2,5 % BSA und 0,05 % Tween 20) behandelt, gefolgt von einer 16-stündigen Inkubation bei 4 °C in Blockpuffer plus 1 μg/ml gereinigtem 7D11-Antikörper. Nach drei 15-minütigen Waschungen (100 mM Tris, pH 8, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA und 0,1 % Tween 20) wurden die Membranen für 1 Stunde in Blockpuffer plus 1 μg/ml Ziege-Anti-Maus-IgG-HRP (Southern Biotechnology) inkubiert. Nach drei 15-minütigen Waschungen wurden die Western-Blots mittels Enhanced Chemiluminescence (ECL) (Amersham) nach den Vorschriften des Herstellers entwickelt. Expositionszeiten reichten von 1 bis 5 Sekunden. Es wurde keine Kreuzreaktivität mit Pflanzenproteinen beobachtet (Testen von IF-Extrakten aus kontrollinfizierten Pflanzen).
Einzelne Klone wurden sequenziert, hinsichtlich Leseraster- und Aminosäureidentität gegenüber der ursprünglichen CJ-Ig-Sequenz analysiert und dann auf Proteinsekretion in infizierten Pflanzen gescreent. 1 zeigt die Ergebnisse von 9 einzelnen CJ-scFv-exprimierenden Klonen, die verschiedene Ausmaße an Proteinanreicherung zeigten. Die Klone 20 und 30 zeigen hohe Expressionsausmaße sowie eine Anreicherung von Proteindimeren. Klon C enthielt eine Modifizierung des (Gly₃Ser)₄-Linkers.
Aus den Sequenzdaten wurden die Linkersequenzen für einzelne Klone abgeleitet. Die Klon-Nummern in Tabelle 2 sind dieselben wie die in Tabelle 1 aufgelisteten. Wie oben bezieht sich die relative Expression auf das scFv-Protein mit dem (Gly₄Ser)₃-Linker.
Tabelle 2 Analyse selektierter Elemente des CJ-Linker-Bibliothek-Experiments in vollständigen Pflanzen
Wie oben wurden Unterschiede hinsichtlich der Expression verschiedener CJ-scFv-basierter Klone in vollständigen Pflanzen beobachtet. Interessanterweise wurden manche Klone, die in Pflanzenprotoplasten exprimiert wurden, in vollständigen Pflanzen nicht exprimiert. Beispielsweise wurde Klon Nr. 16, der in Pflanzenprotoplasten stark exprimiert wurde, in vollständigen Pflanzen nicht exprimiert. Trotzdem ermöglichen die zur Erzeugung der Linkerregionen mit variierender Längen und Sequenz offenbarten Verfahren das Screening einer großen Anzahl von Klonen auf ihre Fähigkeit hin, entweder in Pflanzenprotoplasten oder in vollständigen Pflanzen zu exprimieren.
Die mittels Zufalls-Linker-Bibliothek optimierte Qualität des CJ-Proteins wurde mit zwei Verfahren bestätigt. Erstens wurde das CJ-Protein mittels Affinitätschromatographie unter Verwendung des immobilisierten Anti-Idiotyp-mAb 7D11 gereinigt. Dieses Verfahren erfordert, dass das CJ-Protein unter physiologischen Bedingungen an die Anti-Id-Säule bindet. Eine solche Bindung wird nicht erfolgen, wenn das Protein nicht korrekt gefaltet ist. Das Protein wurde unter normalem pH gebunden und mit 50 mM Diethylamin, pH 11,1, eluiert und dann sofort gegen normale Salzlösung dialysiert. Das Material wurde mittels ELISA unter Verwendung von 7D11 unter Verwendung der Standard-Proteinbestimmung quantifiziert.
Der zweite, stringentere Test zur Beurteilung der Qualität des CJ-Proteins war ein funktioneller Test in Tieren. Klon CJLL20 (für Linker-Bibliothek-Auswahl Nr. 20) wurde mittels 7D11-Affinitätschromatographie gereinigt und fünf Mäusen in 3 zweiwöchentlichen Immunisierungen zu je 30 μg verabreicht. Zehn Tage nach der dritten Injektion wurden Serumproben abgenommen. Unter Verwendung des nativen Idiotyps (1D12) oder eines Isotyp-passenden irrelevanten menschlichen Antikörpers in einem Sandwich-ELISA wurden die Seren auf spezifische Reaktionen auf den CJ-Idiotyp getestet. Ergebnisse sind in 2 dargestellt.
Obgleich menschliche Gerüstsequenzen im CJ-Protein vorkommen, was zu Bedenken führte, dass die Mäuse unspezifisch auf xenogene menschliche Ig-Determinan ten ansprechen könnten, wurden derartige Anti-Mensch-Antikörper in sehr niedrigen Ausmaßen in nur 3 der 5 Tiere produziert. Diese wurde als minimale Kreuzreaktivität des Maus-Serums mit einem dazu nicht in Beziehung stehenden menschlichen Antikörper nachgewiesen.
Die Seren aller 5 Mäuse hatten hohe Titer von Anti-CJ-Antikörpern (2). Folglich war die durch die Vakzine induzierte Immunreaktion, wie vorhergesagt und erwünscht, höchst spezifisch für V_H- und V_L-Regionen des ursprünglichen Ig. Diese Ergebnisse legen nahe, dass das in Pflanzen produzierte Protein korrekt gefaltet wurde, so dass es eine geeignete Immunreaktion in immunisierten Patienten induzieren könnte.
Obgleich es ein Ziel dieser Erfindung ist, einen Tumorschutz in menschlichen Patienten im klinischen Rahmen zu erzeugen, gibt es kein praktisches Mittel, das Vermögen einer menschlichen scFv-Vakzine zu testen, eine Tumorimmunität unter reinen Laborbedingungen zu testen. Daher wählten die Erfinder ein Mausmodell, das 38C13-Lymphom, das die Ermittlung einer Idiotyp-spezifischen Reaktivität im Serum immunisierter Mäuse und der Gegenwart einer sich gegen den maßgeblichen Tumor-Idiotyp richtenden Reaktion ermöglicht, die in Schutz gegen den Tumor resultiert.
Beispiel 4
Produktion von immunogenem, idiotypischem Maus-Lymphom-scFv-Selbst-Antigen in Pflanzen
Die Verfahren von McCormick et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 703–708 (1999) befolgend wurde ein ldiotyp-tragendes scFv unter Verwendung genetischen Materials aus dem 38C13-Maus-B-Zell-Lymphom hergestellt. cDNA wurde unter Verwendung von für Maus-38C13-Sequenzen spezifischen Primern PCR-amplifiziert. Die in GenBank mit den Zugangsnummern X14096 und X14099 aufgelisteten spezifischen Primer wurden verwendet, um die für 38C13-V_H- und V_L kodierenden Sequenzen zu amplifizieren. Um diese DNA in Pflanzen zu exprimieren, wurde ein für den 38C13-Maus-Lymphom-Idiotyp kodierendes Fragment in einen modifizierten TTO1A-Vektor kloniert, der eine Hybridfusion von TMV und ToMV enthält (Kumagai et al. (1995), s.o.) (3). In diesem Vektor ist ein subgenomischer TMV-Hüllproteinpromotor stromauf der Insertionsstelle der 38C13-scFv-Sequenz lokalisiert.
Nach der Infektion steuert dieser subgenomische TMV-Hüllproteinpromotor die Initiation der subgenomischen 38C13-Transkription in Pflanzenzellen am tsp (3). Das Reis-α-Amylase-Signalpeptid (O'Neill et al., s.o.) wird In-frame an die 38C13-scFv-Sequenz fusioniert und kodiert für ein 31-Aminosäuren-Polypeptid, das die Proteine in den Sekretionsweg leitet (Firek et al., s.o.) und anschließend zwischen dem C-terminalen Gly des Signalpeptids und dem N-terminalen Met des exprimierten 38C13-scFv-Proteins gespalten wird (in 3 fettgedruckt und als Aminosäure 1 vermerkt). Der lineare Aufbau des 11,2 kb-Plasmids, in dem die TMV-cDNA erhalten wird, ist ebenfalls in 3 dargestellt. Die für 38C13-scFv kodierende Sequenz ist zwischen den 30K-Bewegungsprotein- und ToMV-Hüllprotein- (Tcp-) Genen eingeführt worden. Ein SP6-Phagenpromotor ist stromauf der Virus-cDNA eingeführt worden, was die Transkription der infektiösen genomischen Plus-Strang-RNA ermöglicht. Infektiöse Cap-RNA wurde in vitro aus 1 μg Pmel-linearisiertem Plasmid unter Verwendung eines Message-Sets von Ambion hergestellt.
Die Synthese der Message wurde mittels Gelelektrophorese quantifiziert und ungefähr 2 μg der in vitro transkribierten Virus-RNA wurde mit einem Schleifmittel auf die unteren Blätter (Größe ungefähr 1–2 cm) von N. Benthamiana-Pflanzen aufgebracht (W.O. Dawson et al., s.o.). Die Transkription der für 28C13-scFv kodierenden subgenomischen RNA wird nach Infektion am bezeichneten tsp initiiert. Hohe Ausmaße an subgenomischen RNA-Spezies werden in Virus-infizierten Pflanzenzellen synthetisiert (M.H. Kumagai et al., s.o.) und dienen als Template für die Translation und anschließende Anreicherung von 38C13-Protein. Symptome der Pflanzeninfektion waren 5–6 Tage als leichte Blattdeformation mit etwas Blattsprenkelung und Wach tumsverlangsamung sichtbar. Elf bis vierzehn Tage nach der Beimpfung wurden sekretierte Proteine isoliert. Blatt- und Stammmaterial wurde geerntet, gewogen und dann einem Hg-Vakuum von 700 mm für 2 Minuten in Infiltrationspuffer (100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl₂ und 2 mM EDTA) unterzogen. Die sekretierten Proteine wurden aus infiltrierten Blättern durch schonende Zentrifugation bei 4.000 U/min (x 2.000 g, Beckman JA-14) an unterstützten Nylonnetzscheiben gewonnen (hiernach als Interstitialfraktion oder IF abgekürzt), dann unter sterilen Bedingungen durch eine 0,2 μm-Membran filtriert und bis zur Reinigung bei –80 °C gelagert.
Das sekretierte Material wurde auf die Gegenwart von 38C13-scFv-Protein mittels SDS-PAGE und Coomassie-Brilliantblau-Färbung analysiert. 10 μl des sekretierten Materials aus 38C13-scFv-infizierten Blättern wurden an einem gekauften, vorgegossenen 12%igen Polyacrylamidgel (Novex) aufgetrennt. Um die Proteine sichtbar zu machen, wurden die Gele für 1 Stunde in 0,2 % Coomassie-Brilliantblau (Sigma) in 50 % Methanol gefärbt, für 2 Stunden in 10 % Methanol mit 20 % Essigsäure entfärbt und zwischen Cellophanfolien (BioRad) getrocknet. Zwei starke Banden waren im Extrakt aus 38C13-scFv-infizierten Blättern bei ungefähr 30 und 60 kDa sichtbar, die in einem IF-Extrakt einer virusinfizierten Kontrollpflanze nicht vorhanden waren.
Es wurden mehrere Tests eingesetzt, um die Expressionsausmaße zu quantifizieren und um zu ermitteln, ob die variablen 38C13-scFv-Regionen in Lösung eine ähnliche Konformation zu jener des nativen IgM-Proteins einnehmen. S1C5, ein Anti-Id-mAb, der natives 38C13-IgM (D.G. Maloney et al., Hybridoma 4, 191–209 (1985)) und bakteriell produziertes 38C13-scFv erkennt (Hakim et al.), bindet an eine durch die Assoziation von H- und L-Ketten erzeugte Determinante. Der Antikörper reagiert ausschließlich mit 38C13-IgM oder seinen Derivate unter nicht-reduzierenden Bedingungen, was nahe legt, dass die korrekte Assemblierung von 38C13-V-Regionen für die Erkennung erforderlich sein muss.
Der S1C5-mAb wurde aus in Nacktmäusen mittels Standardverfahren hergestellten Aszites gewonnen und mittels Protein-A-Affinitätschromatographie gereinigt. Dieser Antikörper wurde verwendet, um 38C13-scFv-spezifische Banden in IF-Extrakten mittels Western-Blot zu identifizieren. Dafür wurde 1 μl sekretiertes Material aus 38C13-scFv-infizierten Blättern mittels SDS-PAGE aufgetrennt und mittels Semi-dry-Transfer (Janise Life Sciences) auf Nitrozellulose in Standard-Tris-Glycin-Puffer mit 20 % Methanol bei 150 V für 1 Stunde transferiert. Nach dem Transfer wurden die Blots für 20 Minuten bei Raumtemperatur mit Blockpuffer (50 mM Tris, pH 8, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2,5 % fettfreie Trockenmilch, 2,5 % BSA und 0,05 % Tween 20) behandelt, gefolgt von 1 Stunde Inkubation in Blockpuffer plus 1 μg/ml gereinigtem S1C5-Antikörper. Nach drei 15-minütigen Waschungen (100 mM Tris, pH 8, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA und 0,1 % Tween 20) wurden die Blots für 1 Stunde in Blockpuffer plus 1 μg/ml Ziege-Anti-Maus-IgG-HRP (Southern Biotechnology) inkubiert. Nach drei 15-minütigen Waschungen wurden die Western-Blots mittels ECL (Amersham) entwickelt. Expositionszeiten reichten von 1 bis 5 Sekunden. Es wurde keine Kreuzreaktivität mit Pflanzenproteinen in aus infizierten Kontrollpflanzen hergestellten IF-Extrakten beobachtet. Sowohl die 30 kDa-Bande, als auch die 60 kDa-Bande reagierten stark mit S1C5 unter nicht-reduzierenden Bedingungen und entsprachen den korrekten Größen für ein scFv-Monomer und ein spontan assemblierendes scFv-Dimer. Eine Nebenbande bei 40 kD ist höchstwahrscheinlich auf Proteolyse des Dimers zurückzuführen.
Als Kontrolle wurde eine schonende Disulfidreduktion von Rohextrakt-IF in Infiltrationspuffer durchgeführt, der 1 mM Ascorbinsäure und 0,04 % Natriumbisulfit enthielt. Die Deletion des Cysteins an Position 3 wurde außerdem über PCR durch Verändern des 5'-Primers erzeugt, um die für die dritte Aminosäure von 38C13-scFv kodierenden 3 Nucleotide wegzulassen. Beide Veränderungen resultieren in einer einzigen Bande von 38C13-scFv-Monomeren im IF-Rohmaterial. Diese Experimente bestätigen, dass die in den virusinfizierten Pflanzenzellen synthetisierten und anschließend von der Pflanze sekretierten 38C13-scFv-Ketten richtig gefaltet sind.
Die sekretierten Pflanzenrohproteine wurden dann mittels Affinitätschromatographie gereinigt. Der S1C5-Antikörper (10 mg) wurde an 1 g CNBr-Sepharose (Pharmacia) gekoppelt; alle Puffer für Kopplung, Blocken und Waschen waren endotoxinfrei, wie mittels Amöbocytenlysat-Test (Associates of Cape Cod Inc.) ermittelt wurde. Gefrorene Pflanzenextrakte wurden auf Eis aufgetaut, nochmals filtriert und es erwies sich, dass sie weniger als 0,06 Endotoxin-Einheiten (EU)/ml enthielten. 38C13-scFv-Protein wurde dann auf eine S1C5-Säule in Infiltrationspuffer aufgegeben, mit 50 ml PBS gewaschen und als 1-ml-Faktionen in endotoxinfreiem 50 mM Triethanolamin, pH 12,6, direkt in 100 μl 2 M Tris-HCl-Puffer, pH 8, eluiert.
Die 38C13-scFv-Protein enthaltenden Fraktionen wurden dann vereinigt und über Nacht gegen PBS dialysiert. Die Ausbeute an 38C13-scFv-Protein wurde mittels ELISA mit dem Anti-Id-S1C5 bestimmt und Gesamtprotein wurde mittels Coomassie- und Standard-Silberfärbung von SDS-PAGE-Gelen bestimmt (C.R. Merril et al., Methods Enzymol. 182, 477–488 (1990)). Für den ELISA wurden Platten (Nunc, Maxi-Sorp) über Nacht bei 4 °C mit 2 μg/ml SiC5 in Natriumcarbonatpuffer, pH 9, 50 μl/Napf, beschichtet, dann für 20 Minuten bei Raumtemperatur in Blockpuffer (100 mM Tris, pH 7,5, mit 0,5 % Tween 20 und 2 % BSA) inkubiert. Die Platten wurden fünf Mal gewaschen, bevor sie mit Anfangsverdünnungen der Proteine in PBS plus 2 BSA von 1:10 (Vol./Vol.) inkubiert wurden. Bakteriell produziertes 38C12-myc-scFv mit 300 ng/ml wurde als Positivkontrolle und zur Quantifizierung verwendet (Hakim et al., s.o.). Nach 1 Stunde bei Raumtemperatur wurden die Platten wiederum fünf Mal gewaschen und 1 Stunde bei Raumtemperatur mit 1 μg/ml Protein-A-Meerrettichperoxidase (HRP, Sigma) inkubiert, das eine Stelle in der V_H-Region von 38C13-scFv erkennt (K.N. Potter et al., Int. rev. Immunol. 14, 291–308 (1997); P.W. Roben et al., J. Immunol. 154, 6437–6445 (1995)). Die Platten wurden gewaschen und dann durch eine zehnminütige Inkubation bei Raumtemperatur mit 0,15 % ABTS (2,2'-Azino-di-[3-ethylbenzthiazolinsulfonsäure], Sigma) in 100 mM Natriumcitratpuffer, pH 8m5, und 0,001 % Wasserstoffperoxid entwickelt. Die Platten wurden bei 405 und 490 nm mit einem Absorptionsplattenleser (Molecular Devices) gemessen und die Daten mittels SoftMax analysiert.
Ungefähr zu 90–95 % reines 38C13-scFv wurde mit diesem Verfahren aus Pflanzen-IF-Extrakt gewonnen. Das 38C13-scFv-Protein reicherte sich im IF über den untersuchten Zeitraum von 11 bis 18 Tagen weiterhin an, was darauf hinweist, dass sowohl der Virusvektor, als auch das Protein stabil sind. Eine Zusammenfassung der Reinigungsergebnisse für zwei Chargen von 38C13-scFv ist in Tabelle 3 dargestellt.
Tabelle 3. Reinigung von scFv-Proteinen
Pflanzenproduziertes 38C13-scFv aus zwei unabhängigen Infektionen wurde mittels Anti-Id-S1C5-ELISA quantifiziert. IF-Extrakte enthielten 20 bis 60 μg/ml spezifisches Protein. Ein Vergleich der Quantifizierung mittels ELISA unter Bedingungen, welche die Anti-Idiotyp-Erkennung in Lösung begünstigen, mit der Quantifizierung mittels Coomassie-Blau-Färbung und Gesamtproteinbestimmung zeigte, dass die Hauptfraktion von 38C13-scFv in Pflanzen-IF-Extrakten löslich und korrekt gefaltet war. Die Proteinausbeute entsprach oder überstieg jene von transgenen Pflanzen (A. Schouten et al., Plant Mol. Biol. 30, 781–793 (1996); A.M. Bruyns et al., FEBS Lett. 386, 5-10 (1996); S. Firek, Plant Mol. Biol. 23, 861–870 (1993)) und war ähnlich zu in einem optimierten bakteriellen System exprimiertem scFv (S.M. Kipriyanov et al., Protein Eng. 10, 445–453 (1997)). Dieses Verfahren produziert daher große Mengen an gereinigtem, korrekt gefaltetem Lymphom-hergeleitetem 38C13-scFv.
Beispiel 5
Ermittlung eines geeigneten Selbst-Antigens
Damit das Pflanzen-produzierte 38C13-scFv-Protein entsprechend immunogen ist, muss es sich zu einer Konformation falten, die das native Protein an der Oberfläche der Tumorzellen nachahmt. Wie im obigen Beispiel mittels Western-Blot und ELISA illustriert wurde, ist es ein inhärenter und hauptsächlicher Vorteil dieser rekombinanten Expressionstechnik, dass sich alle der sekretierten, von den transfizierten Pflanzen produzierten Proteine in Lösung zu einer Konformation falten, die dem nativen IgM-Protein gleicht. Das diese Expressionstechnik die korrekte Faltung aller sekretierten Proteine gewährleistet, wird jedes produzierte Protein die erforderlichen immunogenen Eigenschaften aufweisen.
Um die immunogene Aktivität weiter zu bestätigen, wurde die Fähigkeit von Pflanzenproduziertem 38C13-scFv evaluiert, eine Anti-38C13-Reaktion hervorzurufen und Mäuse vor einer 38C13-Tumorexposition zu schützen.
C3H-Mäuse wurden mit 38C13-scFv-Protein unter Verwendung eines Impfplans immunisiert, der sich in einer früheren Studie mit bakteriell exprimiertem 38C13-scFv als für einen Tumorschutz ausreichend erwiesen hat (Hakim et al., s.o.). Im Gegensatz zu früheren Untersuchungen, die ein Fusionsprotein mit einem zusätzlichen immunverstärkenden 9-Reste-Peptid aus IL1-1β einsetzten (W. Beckers et al., J. Immunol. 151, 1757–1764 (1993)), wurde hier 38C13scFv ohne dieses stimulatorische IL1-1β-Peptid verwendet. Die Vakzine wurde entweder mit oder ohne QS-21-Adjuvans, einem gereinigten Saponinderivat (A.C. White et al., Adv. Exp. Med. Biol. 303, 207–210 (1991)) verwendet, das nunmehr klinisch verwendet wird (F. Helling et al., Cancer Res. 55, 2783–2788 (1995); T.A. Davis et al., Blood 90, 509A (Abstr.) (1997)). Fünfzehn μg gereinigtes 38C13-scFv-Protein alleine oder mit 10 μg QS-21 in einem Gesamtvolumen von 200 μl PBS wurden SC in die Hinterfläme von C3H-Mäusen (Harlan-Sprague-Dawley) in zweiwöchigen Intervallen für insgesamt drei In jektionen injiziert. Als Positivkontrolle wurde Gesamt-38C13-IgM durch Glutaraldehyd-Vernetzung an KLH konjugiert (M.S. Kaminski et al., J. Immunol. 138, 1289-1296 (1987)) und 50 μg des Konjugats SC mit QS-21 gleichzeitig mit der zweiten und dritten scFv-Impfung verabreicht. Co-Injektionen von 38C13-scFv (15 μg) mit TEPC 183 (50 μg, Sigma) oder Ovalbumin wurden wie oben beschrieben ohne Adjuvans durchgeführt. Kontrolltiere erhielten QS-21 alleine in PBS.
Seren wurden mittels Schwanzblutung erlangt und Reaktionen gegen Anti-38C13-Serum wurden mittels 38C13-IgM-ELISA 10 Tage nach der zweiten und dritten Impfung wie früher beschrieben (Hakim et al., s.o.) gemessen. Eine Ig-Isotyp-Analyse wurde an gepoolten Seren aus jeder Vakzine-Gruppe nach der dritten Impfung wie beschrieben (Hakim et al., s.o.) durchgeführt. Nach der dritten Impfung erhöhten sich die mittleren IgG₁-Anti-38C13-Spiegel von 3 auf 21,6 μg/ml in Tieren, die 38C13-scFv alleine erhielten, und auf 105 μg/ml in Tieren, denen QS-21 mit verabreicht wurde (4, schraffierte Balken). Anti-38C13-Konzentrationen in Mäusen, denen 38C13-KLH +Qs-21 verabreicht wurde, betrugen 116 μg/ml. Die Verabreichung von 38C13-scFv mit QS-21 induzierte nicht nur stärkere Antikörperreaktionen, sondern induzierte außerdem den IgG2a-Isotyp (13 μg/ml), was der für die 38C13-KLH +QS-21-Behandlung ähnlich war (4, volle Balken). IgG2a-Antikörperttiter sind mit erweitertem Tumorschutz korreliert worden (M.S. Kaminski et al., J. Immunol. 136, 1123–1130 (1986)). Es wurden keine Antikörper gegen TEPC 183 oder Ovalbumin festgestellt, was anzeigt, dass das scFv nicht als Adjuvans für Immunreaktionen gegen andere Proteine agiert.
Das Pflanzen-produzierte 38C13-scFv war daher fähig, eine Antikörperreaktion zu erzeugen, die sich gegen den Id des B-Zell-Lymphoms richtet.
Um das Vermögen der Immunreaktion festzustellen, Tiere vor Tumorexposition zu schützen, wurden 38C13-Tumorzellen in immunisierte Mäuse oder Kontrollmäuse zwei Wochen nach der dritten Impfung injiziert und das Überleben für 60 Tage überwacht (5). Ungefähr 10⁸ 38C13-Tumorzellen wurden aufgetaut, gewaschen, in 10 ml mit L-Glutamin, 10 % Fötalkälberserum (FCS), 1X-Penicillin/Streptomycin, 50 μM 2-Mercaptoethanol ergänztem 10 ml RMPI-Medium (CellGrowth) resuspendiert und bei 5 % CO₂ in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C gezüchtet. Einen Tag später wurden die Zellen 1:50 (Vol./Vol.) in vollständigem Medium aufgeteilt und am folgenden Tag für die Tumorexposition verwendet. Die Zellen wurden geerntet, zweimal in RMPI gewaschen, um FCS zu entfernen, gezählt und mit 4 × 10² Zellen/ml in RMPI resuspendiert; eine Gesamtdosis von 200 Zellen in 0,5 ml wurde IP verabreicht.
Nach zwei Wochen wurden die Tiere auf sichtbare Abdominaltumoren geprüft und Todesfälle wurden danach täglich aufgezeichnet. Tiere, die QS-21 alleine erhielten, entwickelten tastbare Abdominaltumoren 15 Tage nach der Implantation und verendeten innerhalb von 21 Tagen. 38C13-scFv-Vakzine-Gruppen waren im Vergleich zu QS-21 alleine signifikant geschützt (p<0,00001). Tiere, die zwei Impfungen von 38C13-IgM-KLH + QS-21 erhielten, dem „Goldstandard" für die Id-Impfung, wiesen 60 Tage nach der Tumorexposition ein Überleben von 80 % auf. Gruppen von Mäusen, die Pflanzen-produzierte Vakzinen, entweder 38C13-scFv alleine oder 38C13-scFv + QS-21, erhielten, zeigten ein hohen Schutzgrad (70 % bzw. 90 % Überleben 60 Tage nach Tumorexposition). Die von den in Pflanzen produzierten Vakzinen induzierten schützenden Reaktionen waren statistisch äquivalent zu der des Goldstandards (siehe Einfügung, 5). Trotz des niedrigeren Antikörperspiegels in den 38C13-scFv-geimpften Mäusen im Vergleich zu entweder 38C13-scFv + QS-21- oder 38C13-IgM-KLH-geimpften Mäusen und trotz des Fehlens nachweisbarer Antikörper des IgG2a-Isotyps waren jene Mäuse, die 38C13-scFv erhielten, trotzdem gleich gut vor der Tumorexposition geschützt. Seren aus mit 38C13-scFv immunisierten Mäusen wurden bei einer Western-Analyse an IF oder gereinigtem 38C13-scFv verwendet; nur monomere und dimere 38C13-scFv-Proteine wurden sichtbar gemacht, was nahe legt, dass das 38C13-scFv und nicht irgendeine Pflanzenverunreinigung die wirksame Vakzine darstellte.
Die Impfung von Mäusen mit dem Pflanzen-produzierten 38C13-scFv ist folglich in der Lage, sie vor einer letalen Tumorexposition zu schützen.
Beispiel 6
Nachdem die Wirksamkeit von 38C13 in einem Tiermodell und die erfolgreiche Expression von CJ-scFv mittels Randomisierung des Linkers gezeigt worden ist, war es wichtig, diese Beobachtung auf die Expression anderer menschlicher scFv-Sequenzen auszuweiten. Eine Reihe von Patienten-V-Region-Sequenzen waren als klonierte H- und L-Ketten-DNAs verfügbar. Ein Satz von 10 wurde ausgewählt, um sie als scFv-Proteine in den TMV-Vektor mittels hierin offenbartem Zufallslinker-Bibliothek-Ansatz einzubauen. Die Ergebnisse sind in untenstehender Tabelle 4 dargestellt.
Von jenen, die in Pflanzen eingebaut und exprimiert wurden, waren 1 von 10 als Proteine entweder mittels Coomassie- oder Western-Analyse nicht nachweisbar (Da3). 2 weitere dieser 10 (Ly1 und Ey2) wiesen eine messbare Expression auf, jedoch war das Ausmaß zu gering, um eine Reinigung im Großmaßstab zu rechtfertigen. Von den verbleibenden 7 wurden alle in großer Menge mittels Standardchromatographietechniken gereinigt und zur Impfung von Mäusen verwendet. In allen Fällen produzierte der Großteil der Mäuse für das Patienten-Ig spezifische Antikörper, ob QS-21-Adjuvans ebenfalls verwendet wurde oder nicht. Ausgewählte scFv-Proteine wurden außerdem mittels Western und mittels ELISA hinsichtlich Erkennung durch gegen das Tumor-Ig hergestellte polyklonale Maus-Antikörper analysiert. Alle getesteten scFvs reagierten auf Anti-Ig-Serum.
Tabelle 4 Ausgangsmaterial: klonierte DNA der variablen Region
Zusätzlich zum Arbeiten mit klonierten Patienten-spezifischen DNA-Proben zum Testen des Expressionssystems veranlassten die Erfinder außerdem die Verarbeitung aus Zelllysaten, um die Klonierung tumorspezifischer Sequenzen aus Patienten-Biopsiematerial zu beginnen. Mittels zweier unabhängiger PCR-Reaktionen wurde klonales Material erzeugt, das die Tumor-Ig-V-Region-Gensequenzen repräsentiert. Eine Bestätigung wurde in manchen Fällen auch durch Vergleich mit unabhängig hergeleiteten Hybridom-V-Region-Gensequenzen bestätigt. Von insgesamt 11 klonierten scFv-Polypeptiden, die für die Produktion in Pflanzen getestet wurden (siehe untenstehende Tabelle 5), sind fünf ausreichend maßstabsvergrößert worden und 3 davon (S9, S11 und T12) werden zurzeit in Mäusen als Kandidat-Vakzine evaluiert.
Tabelle 5 Ausgangsmaterial: Patienten-Biopsie-RNA
Beispiel 7
Formulierung und Verabreichung des Antigens
Das den Idiotyp tragende Selbst-Antigen wird in Menschen mit geringgradigem B-Zell-Lymphom als Vakzine verwendet. Die Vakzine wird wie oben beschrieben hergestellt und gereinigt. Die Vakzine wird durch aufeinander folgende SC-Injektionen von 0,5 mg des Antigens verabreicht.
a. Mit GM-CSF
Das Cytokin GM-CSF (100 μg) wurde nach der Vakzine an einer benachbarten Stelle verabreicht (siehe Bendandi et al. s.o.)
b. In Adjuvans
Die Vakzine wird in ISAF-1-Adjuvans (5 % Squalen, 2,5 % Pluronic L121, 0,2 % Tween 80 in phosphatgepufferter Lösung mit 0,4 mg Threonyl-muramyl-dipeptid) nach einem genauen Plan verabreicht (L.W. Kwak et al., N. Engl. J. Med. 327, 1209-1238 (1992)).
Nach der ersten Dosis der Vakzine erhalten die Patienten weitere Injektionen einmal monatlich für 5 Monate. Booster-Injektionen werden jährlich verabreicht.
Beispiel 8
Behandlung eines Lymphom-Patienten mit der scFv-Polypeptid-Vakzine
Ein Idiotyp-tragendes scFv wird aus Lymphomzellen eines menschlichen Patienten (als „JJ" bezeichnet) unter Verwendung von mRNA aus den Lymphomzellen produziert, um cDNA herzustellen, die unter Verwendung geeigneter Primer wie oben zur Amplifikation der für V_H und V_L kodierenden Sequenzen beschrieben amplifiziert wird. Diese DNA wird in einer N. benthamiana-Pflanze wie oben beschrieben durch Klonieren in den Tobamovirus-Vektor unter Verwendung des hierin beschriebenen Zufallsprimer-Bibliothek-Ansatzes exprimiert.
Das dem Lymphom-Oberflächen-Id-Idiotyp von JJ entsprechende scFv wird aus den Pflanzen wie oben beschrieben erlangt und zu einer Vakzine formuliert (siehe oben). JJ wird dem Immunisierungsprotokoll von Beispiel 7 unterzogen.
Die Reaktion von JJ wird mittels Labortests und klinischer Beobachtung beurteilt. Für eine Beschreibung der klinischen Beurteilung siehe: F.J. Hsu et al. (1997), s.o.; Bendandi et al., s.o. Es werden die folgenden Ergebnisse erhalten.

1. Das Serum von JJ enthält Antikörper, die für das Vakzine-Immunogen spezifisch sind und mit einem monoklonalen Ig reagieren (der dem idiotypischen Lymphom-Oberflächen-Ig entspricht). Die Antikörper werden in einem ELISA-Test und mittels FACS-Analyse unter Verwendung tieftemperaturkonservierter Lymphomzellen aus JJ nachgewiesen.
2. Die Peripherblut-T-Lymphozyten von JJ reagieren in vivo signifikant auf das Vakzine-Polypeptid (oder auf die Lymphomzellen als Stimulatoren) durch Proliferation, gemessen als ³H-Thymidin-Inkorporation, und durch Sekretion von Interferon-γ. Die einkernigen Peripherblutzellen von JJ produzierten ebenfalls TNFα als Reaktion auf diese Stimuli.
3. Die klinische Reaktion von JJ ist durch den radiographischen Nachweis des Fehlens der Tumorprogression und durch allmähliches Verschwinden des Lymphoms gekennzeichnet. Es bestehen keine offenkundigen radiographischen oder anderen klinischen Anzeichen eines Rückfalls über einen Beobachtungszeitraum von einem Jahr.

Behandlung weiterer Patienten
Einzelne scFv-Polypeptide werden aus den Lymphomen von zwanzig Patienten in derselben Weise wie oben für den Patienten JJ beschrieben hergestellt. Diese Patienten werden unter Verwendung des hierin beschriebenen Protokolls entweder mit oder ohne GM-CSF immunisiert. Reaktionen im Labor oder klinische Reaktionen werden wie oben beurteilt.
Die Ergebnisse zeigen an, dass zumindest 6 der 20 Patienten sowohl immunologische, als auch klinische, einschließlich radiographische Anzeichen eines Therapieerfolgs zeigen. Das heißt, dass ihre Seren signifikante Titer von Antikörpern aufweisen, die für den Idiotyp ihrer Lymphomzellen und das zu ihrer Immunisierung verwendete scFv-Polypeptid spezifisch sind. Ihre T-Zellen reagieren in vitro auf die scFv-Polypeptide. Klinisch zeigen sie keine Anzeichen einer Tumorprogression und einen statistisch signifikant verlängerten krankheitsfreien Zeitraum nach der Impfung im Vergleich zu historischen Kontrollen. Die molekulare Analyse ihrer Lymphozyten-DNA unter Verwendung einer PCR über das bcl-2/Igh hinweg, einem molekularen Marker von menschlichem NHL, bestätigt weitergehend, dass ihr Lymphom erfolgreich behandelt worden ist.

Claims

Verfahren zur Herstellung einer Vakzine-Zusammensetzung für die Immuntherapie von B-Zell-Lymphom, umfassend: (a) Bereitstellen eines scFv-Moleküls, das erhalten wird durch: Bereitstellen von Nucleinsäuren, die für die Ig-VH- und die Ig-VL-Domäne des Ig eines B-Zell-Lymphoms eines Patienten kodieren; Herstellen einer Bibliothek von Nucleinsäuremolekülen, die für scFv-Moleküle kodieren, in denen die für die Ig-VH- und Ig-VL-Domänen kodierenden Nucleinsäuren mit einem Glied einer randomisierten Bibliothek von Linkern verbunden sind, die unterschiedliche Größen und Nucleotidsequenzen aufweisen, worin diese Linker ein wie derholtes Muster degenerierter, wiederholter Triplettnucleotide mit folgenden Eigenschaften aufweisen: (i) Position 1 jedes wiederholten Tripletts kann nicht dasselbe Nucleotid wie Position 2 des wiederholten Tripletts sein; oder (ii) Position 2 jedes wiederholten Tripletts kann nicht dasselbe Nucleotid wie Position 3 des wiederholten Tripletts sein; oder (iii) Position 1 jedes wiederholten Tripletts kann nicht dasselbe Nucleotid wie Position 3 des wiederholten Tripletts sein; Selektieren eines Glieds der Bibliothek, das in der Lage ist, gefaltete scFv-Moleküle in einer pflanzlichen Wirtszelle zu exprimieren und zu sekretieren; und (b) Herstellen einer Vakzine-Zusammensetzung, umfassend das von einem Pflanzenwirt exprimierte scFv und ein Adjuvans.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der Linker 3 bis 25 Aminosäuren umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin das Nucleotid an der ersten und zweiten Position jedes wiederholten Tripletts aus beliebigen zwei von Desoxyadenosin, Desoxyguanosin, Desoxycytidin oder Desoxythymidin ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 3, worin (i) Position 1 jedes wiederholten Tripletts Desoxyadenosin oder Desoxyguanosin; (ii) Position 2 jedes wiederholten Tripletts Desoxycytidin oder Desoxyguanosin; und (iii) Position 3 jedes wiederholten Tripletts Desoxythymidin ist.
Verwendung einer Vakzine-Zusammensetzung, umfassend (a) ein von Pflanzen produziertes scFv-Molekül, das für die Ig-VH- und Ig-VL-Domänen des Ig eines B-Zell-Lymphoms eines Patienten kodiert, und (b) ein Adjuvans zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung des B-Zell-Lynphoms dieses Patienten; worin das scFv-Molekül mittels eines Verfahrens abgeleitet wurde, umfassend: Bereitstellen von Nucleinsäuren, die für die Ig-VH- und Ig-VL-Domänen des Ig des B-Zell-Lymphoms des Patienten kodieren; Herstellen einer Bibliothek von Nucleinsäuremolekülen, die für scFv-Moleküle kodieren, in denen die für die Ig-VH- und Ig-VL-Domänen kodierenden Nucleinsäuren mit einem Glied einer randomisierten Bibliothek von Linkern verbunden sind, die unterschiedliche Größen und Nucleotidsequenzen aufweisen, worin diese Linker ein wie derholtes Muster degenerierter, wiederholter Triplettnucleotide mit folgenden Eigenschaften aufweisen: (i) Position 1 jedes wiederholten Tripletts kann nicht dasselbe Nucleotid wie Position 2 des wiederholten Tripletts sein; oder (ii) Position 2 jedes wiederholten Tripletts kann nicht dasselbe Nucleotid wie Position 3 des wiederholten Tripletts sein; oder (iii) Position 1 jedes wiederholten Tripletts kann nicht dasselbe Nucleotid wie Position 3 des wiederholten Tripletts sein; und Selektieren eines Glieds der Bibliothek, das in der Lage ist, gefaltete scFv-Moleküle in einer pflanzlichen Wirtszelle zu exprimieren und zu sekretieren.
Verwendung nach Anspruch 5, worin der Linker wie in einem der Ansprüche 2 bis 4 definiert ist.
Verwendung nach Anspruch 5 oder 6, worin das scFv-Molekül eine polyklonale, anti-idiotypische Antikörperreaktion oder eine zellvermittelte Immunreaktion induziert.
Verwendung nach einem der Ansprüche 5 bis 7, worin das scFv durch subkutane Immunisierung mit zumindest etwa 15 μg des scFv dreimal etwa zwei Wochen auseinander verabreicht wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 5 bis 8, worin das Medikament weiters ein immunstimulierendes Zytokin oder ein Chemokin umfasst.
Verwendung nach Anspruch 9, worin das Zytokin aus der aus Interleukin 1, Interleukin 2, Interleukin 12, Interleukin 18 und Interferon-γ bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Zusammensetzung, umfassend ein scFv und ein Adjuvans, worin das scFv Ig-VH- und Ig-VL-Domänen des Ig des B-Zell-Lymphoms eines Patienten umfasst, worin das Molekül durch Nucleinsäuren kodiert wird, die eine Linkerregion umfassen, die Nucleinsäuren verbinden, die für die Ig-VH- und Ig-VL-Domänen kodieren, dadurch gekennzeichnet, dass der Linker 3 bis 25 Reste enthält, die durch wiederholte Tripletts mit den folgenden Eigenschaften kodiert werden: (i) Position 1 jedes wiederholten Tripletts kann nicht dasselbe Nucleotid wie Position 2 des wiederholten Tripletts sein; oder (ii) Position 2 jedes wiederholten Tripletts kann nicht dasselbe Nucleotid wie Position 3 des wiederholten Tripletts sein; oder (iii) Position 1 jedes wiederholten Tripletts kann nicht dasselbe Nucleotid wie Position 3 des wiederholten Tripletts sein.
Zusammensetzung nach Anspruch 11, worin das scFv in einer pflanzlichen Wirtszelle produziert wird.
Zusammensetzung nach Anspruch 11 oder 12, worin der Linker wie in Anspruch 3 oder 4 definiert ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 11 bis 13, die weiters ein immunstimulierendes Zytokin oder ein Chemokin umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 14, worin das Zytokin aus der aus Interleukin 1, Interleukin 2, Interleukin 12, Interleukin 18 und Interferon-γ bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 11 bis 15 in Einheitsdosierungsform in steriler Salzlösung, worin jede Einheit zwischen 0,1 mg und 10 mg scFv enthält.