TWI619727B - 抗體之原位親和力成熟作用 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於一種模擬生發中心反應而直接在融合瘤中生成具有不同結合性質或較高親和力之抗體的方法。為方便而快速地進行抗體之親和力成熟作用，開發了一種可控制型活化誘導胞苷去胺酶(AID)表現系統，其可在融合瘤中誘導體細胞高頻突變。藉由螢光活化細胞分選技術，可從會優先與經螢光標記之抗原結合之融合瘤中選出高親和力抗體。本發明亦關於一種具有可調式抗體親和力之融合瘤的新生成方法，其係藉由生成具有可控制型AID表現之骨髓瘤融合伴侶而達成。

Description

抗體之原位親和力成熟作用
本發明係關於一種模擬生發中心反應而直接在融合瘤中生成具有不同結合性質或較高親和力之抗體的方法。
單株抗體(monoclonal antibody，mAb)目前廣泛應用於測定及治療。抗體療法是一門價值數十億元的生意，而要達成有效的治療與診斷，抗體的抗原結合親和力非常地重要1,2。
目前已開發了三種用來創造並篩選單株抗體(mAb)的主要技術，包括從經免疫之動物生成融合瘤3-6、從微生物展示庫中篩選出重組抗體7-10，以及使從人類患者分離得出的B淋巴球不死化(immortalization)11-13。雖然對基因轉殖動物進行免疫是一種能夠生成對抗許多抗原之抗體的有效方法，但還是很難得到對抗T細胞獨立型抗原(如腫瘤相關之碳水化合物14,15及PEG16)且具有高親和力的抗體。此外，在治療及診斷應用上，由微生物展示庫(microbial display libraries)篩選出來的抗體不僅可能在結合親和力方面不是最好的1,2，還會缺少適當的糖化作用。再者，由於不可能對人體任意進行抗原免疫，因此得自人類患者的不死化B淋巴球，僅限於結合對抗該患者的致病抗原。因此，開發一個可在哺乳類細胞為主的表現系統中結合抗體基因之持續突變及糖化抗體之功能性表現的通用型抗體篩選系 統，或可提供一種工具從小型抗體資料庫(reportoire libraries)分離出高親和力抗體，包括那些利用低免疫原性T細胞獨立型半抗原(hapten)免疫後所得到的抗體資料庫。
或者可藉由投予低劑量抗體而引發劑量毒性低之類似療效 來增加親和力較高之抗體的治療係數。因此，目前已開發出許多可增強抗體結合親和力的突變及工程策略，包括互補決定區(complementarity determining region，CDR)的突變17-21、易錯PCR(error-prone PCR)及DNA改組(DNA shuffling)22-25。雖然這些方法通常會使親和力變好9，但抗體基因的選殖及後續的親和力成熟作用在技術仍相當困難、耗時又昂貴。進一步言之，噬菌體庫可得到只和重鏈可變區結合、而不和輕鏈可變區結合的抗體26。相對地，更自然的體細胞高頻突變(somatic hypermutation，SHM)可促進那些很難用分子選殖及噬菌體庫取得之新穎抗體生成26,27。在此，我們發明了一種與生發中心(germinal center)B細胞當中所發生之的自然親和力成熟作用十分類似的新穎抗體親和力增強技術。
在哺乳類免疫系統中，骨髓中的前B細胞(pre-B cell)會經 過重鏈及輕鏈基因的V-D-J重組，而生成主要的B-細胞受體(BCR，表面免疫球蛋白)庫28。使B細胞在生發中心中接觸同源抗原(cognate antigen)，會引發胞苷的活化誘導胞苷去胺酶(AID)依賴性去胺反應，隨後發生易錯的DNA修復，這會在中心B母細胞(centroblast B cell)之免疫球蛋白(Ig)基因的V區引入點突變29-32。在親和力成熟作用期間篩選好的突變會生成能夠製造高親和力IgG、IgA及IgE抗體的B細胞33。在分化後的漿細胞34-36和融合瘤37中，AID表現會降低。在融合瘤中，AID的人為過度表現可能會在內 源性抗體基因的V區中誘導突變38。
在此，我們直接在融合瘤中模擬生發中心的反應，生成具有 不同性質或較高親和力的抗體。親和力係取決於其應用及抗原而定，但一般是在解離常數KD=10-8至10-10M的範圍內較恰當。KD可用Biacore儀器上用表面電漿子共振來測量，或者用流式細胞儀或ELISA來測量。為便利而快速地進行抗體的親和力成熟作用，我們開發了一可在融合瘤內誘導體細胞高頻突變的可控制型AID表現系統。可對會優先與經螢光標記之抗原結合的融合瘤進行螢光活化細胞分選，以篩選出高親和力抗體(第一圖)。要進行抗體親和力成熟作用，這是一種常用而有效的方法。一般常用的方法列舉如下：1)使會表現誘導型或組成型AID的慢病毒粒子感染目標融合瘤，並以嘌呤黴素進行篩選；2)AID表現會在抗體可變區基因誘導體細胞高頻突變，而生成一群具有不同親和力分布的融合瘤；3)加入限定量經螢光標記之抗原(在本案為PEG)，並在螢光活化細胞分選器中對融合瘤進行分選，之後收集會表現在膜上錨定(membrane-anchored)之高親和力抗體的融合瘤。 重覆進行這個方法，直到所分離之融合瘤會表現(分泌)親和力夠高之抗體為止。可藉由移除去氧羥四環素(doxycycline)、或藉由CRE重組移除AID盒來終止高頻突變。此外，我們進一步將這項技術延伸到具有可調式抗體親和力(tunable antibody affinity)之融合瘤的新生成方法，其係藉由生成具有可控制型AID表現之骨髓瘤融合伴侶來達成。
在活體外模擬生發中心反應的優點包括：不必選殖抗體基因 即可改變或增強抗原結合的能力、可用於任一種融合瘤的廣用性，以及駕馭自然體細胞高頻突變以獲得對抗「高難度」抗原(如很難從噬菌體庫取 得的聚(乙二醇)或碳水化合物)之高親和力抗體的能力。可將AID轉導到任一種既有的融合瘤中，而開始在抗體可變區基因進行體細胞高頻突變。之後可使用螢光活化細胞分選來有效地鑑定出會表現高親和力抗體變異體(antibody variant)的融合瘤。免疫球蛋白基因需要進行適當的摺疊才能在表面表現，所以這個篩選方法同時也會鑑定出那些能夠適當摺疊並有穩定表現的抗體。進一步言之，這個技術也可對任一新形成的融合瘤賦予經受體細胞高頻突變及親和力成熟作用的能力，其係藉由使用以一可控制的方式表現AID之骨髓瘤細胞株(融合伴侶)的標準融合瘤技術達成。因此，不需要選殖抗體基因、也不需要實施在既有融合瘤技術以外的步驟，即可進行親和力成熟作用而生成單株抗體。這項技術與那些會分泌完全人源性抗體(fully human antibodies)之融合瘤(如那些由人類B細胞、或轉人抗體基因小鼠(transgenic human anibody mice)(即UltiMab平台及Xenomouse)之B細胞所生成的融合瘤)也是相容的。這是透過對這些小鼠進行免疫、以及使用表現AID之骨髓瘤細胞生成融合瘤而達成的。在以上種種應用中，可在達成理想的親和力後輕易地終止體細胞高頻突變，這可藉由簡單移除去氧羥四環素、或將CRE重組酶轉染至細胞內來達成。我們也預期本發明的技術可能會產生較少的免疫原性人類抗體，因為突變是以一緊密模擬活體內自然親和力成熟作用的方法「自然地」引入的。
第一圖係為親和力成熟作用策略的示意圖。
第二圖係為用於可控制型AID表現的載體示意圖。
第三圖係以圖表形式顯示在其表面表現了免疫球蛋白的融 合瘤。
第四圖顯示了融合瘤的特異性免疫螢光染色結果。
第五圖顯示融合瘤之功能性抗原結合。
第六圖係帶有loxp之mAID構築體的示意圖。
第七圖係為使用螢光活化細胞分選分析進行AID盒之Cre切除的流式細胞分析示意圖。
第八圖係為AID盒之Cre切除的流式細胞分析示意圖。
第九圖係為TetOn-mAID及偵測AID活性之策略示意圖。
第十圖顯示以不同濃度之去氧羥四環素誘導3T3/Tet-On-mAID纖維母細胞後所得的流式細胞圖表。
第十一圖顯示AID的可誘導表現。
第十二圖顯示mAID係為功能性。
第十三圖係以3.3/loxP-mAID細胞進行PEG結合的圖表分析。
第十四圖顯示得自3.3/loxP-mAID次選殖體(subclone)之免疫球蛋白V基因序列的胺基酸序列及其比對。
第十五圖顯示抗PEG抗體變異體之溫度依賴性結合。
第十六圖顯示抗PEG抗體變異體之熱穩定性。
第十七圖顯示FO及FO-AID骨髓瘤細胞中的eGFP表現。
第十八圖係為融合瘤中eGFP表現的示意圖。
第十九圖係為融合瘤中mAID表現的示意圖。
第二十圖顯示FO-AID細胞及融合瘤中的mAID表現。
第二十一圖係為4個被篩選出來的抗人類β-葡萄糖醛酸苷酶融合瘤選殖體的酵素連結免疫吸附分析法圖表示意圖，其中前述融合瘤選殖體係由FO-AID骨髓瘤融合伴侶所生成。
第二十二圖顯示1-3-4及1-3-4-S5融合瘤的流式細胞抗原結合分析。
第二十三圖顯示AGP4抗PEG之IgM單株抗體的親和力成熟作用：第I輪。
第二十四圖顯示AGP4抗PEG之IgM單株抗體的親和力成熟作用：第II輪。
第二十五圖顯示AGP4抗PEG之IgM單株抗體的親和力成熟作用：第III輪。
第二十六圖顯示AGP4抗PEG之IgM單株抗體的親和力成熟作用：與親代及第II輪與第III輪之AFP4融合瘤細胞的染色比較。
第二十七圖顯示AGP4抗PEG之IgM單株抗體的親和力成熟作用及類別轉換。
第二十八圖顯示AGP4抗PEG之IgM單株抗體經類別轉換後成為IgG。
第二十九圖顯示經類別轉換的AGP4抗PEG之IgG單株抗體仍保有抗原結合能力。
第三十圖顯示AGP4經類別轉換之IgG單株抗體的親和力成熟作用：第IV輪。
第三十一圖顯示抗黑色素瘤細胞3D8之IgM的類別轉換。
第三十二圖顯示可將AID引入未被病毒感染的新融合瘤細胞。
實施例
在本發明的第一具體實施例中，係將AID基因轉導到會分泌抗體之融合瘤中，而在抗體可變區基因中誘導體細胞高頻突變。AID的表現是可控制的，所以當抗體有足夠的抗原結合活性時，就可以終止體細胞高頻突變。我們生成了兩個載體，可使AID進行可控制的表現。在第一個慢病毒載體中，AID和GFP兩者的表現都是可誘導的；而在第二個慢病毒載體中，AID和GFP的表現都是組成性的(constitutive)，但可藉由將CRE重組酶轉染至細胞中而移除表現盒(expression cassette)，進而終止其表現(第二圖)。該圖所用的符號如下：A，在融合瘤中以可控制的方式表現AID(活化誘導胞苷去胺酶)的載體。利用將F2A序列引入進行核糖體跳躍(ribosome skipping)，而使附加HA抗原決定位之AID(HA epitope-tagged AID)會與作為標記的GFP一起表現。在第一個載體中，可藉由加入去氧羥四環素來誘導AID的表現。而在第二個載體中，AID係為組成性的表現，但可藉由CRE轉染而從融合瘤中移除。可用嘌呤黴素篩選出穩定的轉染細胞。WPRE：土撥鼠肝炎病毒轉錄後調控原件(woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element)。cPPT/CTS：中心多嘌呤管道/中心終止序列(central polypurine tract/central termination sequence)。RRE：Rev反應元件(Rev response element)。
融合瘤之表面免疫球蛋白的定性
本發明之一主要特徵在於能夠便利、快速地鑑定出會分泌親和力較高、專一性不同或其特性有所增強之抗體的融合瘤。使用與FITC共軛結合之山羊抗小鼠Ig抗體對活細胞進行染色的方式來檢驗融合瘤表面的Ig表現。當與融合瘤融合伴侶細胞株(FO骨髓瘤)比較時，所有受試的融合瘤(包括那些分泌IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3及IgM抗體者)都有中度至高度的表面Ig表現(第三圖)。使用抗免疫球蛋白F(ab’)2抗體，對表現不同亞型之單株抗體的FO骨髓瘤和融合瘤進行免疫螢光染色，之後在經螢光活化之細胞分選器中分析其表面螢光。其所分泌之單株抗體在一亞型範圍內且具抗原結合特異性的融合瘤會在表面展示出在膜上錨定的抗體(開放曲線)。因為個別融合瘤的表面會分泌並表現相同的抗體，故可測定表面免疫球蛋白來鑑定出會分泌具有期望性質之抗體的融合瘤。
我們進一步確認，融合瘤上的表面免疫球蛋白會展示出合適的抗原結合特異性，如藉由與經螢光標記之抗原結合的結果所示(第四圖)。3.3及1E8融合瘤分別會分泌對抗PEG及β-葡萄糖醛酸苷酶(β-glucuronidase，βG)的抗體，用對表面免疫球蛋白(上方圖面)或用經FITC標記之抗原(下方圖面)對這些融合瘤進行染色。3.3融合瘤會與PEG-FITC結合，而不會與βG-FITC結合；而1E8融合瘤會與βG-FITC結合，而不會與PEG-FITC結合。因此，3.3抗PEG之融合瘤會與經FITC標記之PEG分子結合，而不會去控制經FITC標記之β-葡萄糖醛酸苷酶；而1E8抗β-葡萄糖醛酸苷酶之融合瘤則顯示出相反的特異性。同理，將3.3抗PEG及7G8抗人類β-葡萄糖醛酸苷酶之融合瘤細胞先以經生物素化之聚乙二醇(生物素-PEG) 或人類β-葡萄糖醛酸苷酶(生物素-hβG)標記後，再以與Alexa647共軛結合之鏈黴親和素(strepavidin)進行標記。第五圖顯示3.3細胞可專一地與生物素-PEG結合，而不會與生物素-人類β-葡萄糖醛酸苷酶結合；而7G8細胞會與生物素-人類β-葡萄糖醛酸苷酶結合，而不會與生物素-PEG結合。在FACScalibur流式細胞儀上，先使用經生物素化之PEG或人類β-葡萄糖醛酸苷酶(hβG)抗原、再使用與Alexa647共軛結合之鏈黴親和素來分析3.3抗PEG之融合瘤細胞及7G8抗人類β-葡萄糖醛酸苷酶之融合瘤細胞的表面Ig。我們的結論是，融合瘤會表現功能性表面Ig。
融合瘤細胞中之mAID可停止表現
為生成會以一可控制的方式表現mAID來進行活體外(in vitro)體細胞高頻突變的穩定融合瘤，我們將一帶有loxP(loxP flanked)的組成性表現盒(loxP-CMV-mAID-F2A-eGFP-loxP)(第六圖)轉導到3.3融合瘤細胞(3.3/loxP-mAID)內。該帶有loxP之mAID係包含於一CMV立即早期啟動子(CMV immediate early propmoter)、小鼠活化誘導去胺酶(mAID)基因、一HA抗原決定位、一furin/2A胜肽(F2A)雙順反子表現連結區段(bicistronic expression linker)及一eGFP報告子基因。該mAID盒帶有兩個loxP模體(motif)，位於CMV啟動子之前、以及eGFP之DNA片段之後，用於稍後由Cre重組酶所中介的基因切除。第七圖a至d係為顯示螢光活化細胞分選分析結果：(a)在3.3細胞中，綠色螢光表示AID的表現(y軸)，mCherry紅色螢光表示Cre的表現(x軸)；(b)穩定地表現帶有loxP之mAID的3.3/loxP-mAID細胞；(c)以DNA電穿孔法暫時轉染pLM-mCherry-P2A-Cre質 體的3.3/loxP-mAID細胞；以及針對eGFP陰性細胞進行分選後，暫時轉染pLM-mCherry-P2A-Cre質體的3.3/loxP-mAID細胞。FACs分析顯示3.3/loxP-mAID會表現相當於AID報告子之GFP蛋白的綠色螢光(第七圖b)，而親代3.3細胞則否(第七圖a)。為測試是否可以停止mAID的表現，用DNA電穿孔法將pLM-mCherry-P2A-Cre質體轉入3.3/loxP-mAID細胞中。實施DNA電穿孔法後，約有23%的細胞會表現Cre重組酶，其mCherry表現目視可見(第七圖c)。這些細胞也是eGFP陰性(第七圖c)，顯示AID已從會表現CRE的細胞中排除。在FACSAria細胞分選器上分離這些eGFP陰性的細胞(第七圖d)，以確認mAID基因的Cre依賴性刪除。對由3.3細胞、3.3/loxP-mAID細胞、或分選後經Cre處理之3.3/loxP-mAID細胞製備總溶胞產物，並進行免疫點墨法，發現在3.3/loxP-mAID細胞中有一預期大小26kDa的條帶，但在3.3及經Cre處理之3.3/loxP-mAID細胞中則否(第八圖)。透過免疫點墨法，對由3.3融合瘤細胞、3.3/loxP-mAID融合瘤細胞或經Cre處理之3.3/loxP-mAID融合瘤細胞(分選後得出)所製備的溶胞產物檢測AID上的HA抗原決定位標記、或微管蛋白(細胞載入量的對照組)。這些結果顯示，在3.3融合瘤中，透過Cre重組酶所中介的基因刪除，mAID可穩定地表現出來，也可在一定條件下不表現出來。
對人工受質之SHM的誘導
使用一可由四環素誘導之mAID表現盒(TetOn-mAID)，可讓AID在融合瘤中的表現變為可控制(第九圖)。可自我調控的TetOn-mAID係由一四環素反應元件(TRE)啟動子、一mAID基因、一HA抗原決定位、 一furin/2A胜肽(F2A)雙順反子表現連結區段、一eGFP報告子基因、一IRES片段及rtTA-V14轉活化子(transactivator)所構成。加入去氧羥四環素(dox)會活化rtTA-V14轉活化子，而啟動由TRE啟動子所驅動、且帶有mAID、eGFP及rtTA-V14轉活化子之密碼的基因表現(下圖)。DsRed基因在第519位置之核苷酸帶有提前終止密碼子(premature stop codon)，同時亦包含mAID之熱點模體(hotspot motif)。以TetOn-mAID感染3T3纖維母細胞，並以添加嘌呤黴素之培養基進行篩選。對穩定的3T3細胞加入去氧羥四環素會使eGFP報告子以一劑量依賴性的方式表現(第十圖)，這表示成功地在3T3細胞中調控AID的表現。第十圖提供了以標示濃度之去氧羥四環素誘導3T3/TetOn-mAID纖維母細胞48小時的流式細胞圖表。直接使用免疫點墨法檢視3T3/TetOn-mAID融合瘤細胞中的AID蛋白，發現可透過加入培養基之去氧羥四環素的劑量來控制AID(第十一圖)。以會表現Tet-on可誘導之AID的慢病毒粒子來感染3T3細胞。使融合瘤暴露在標示濃度之去氧羥四環素中，以誘導AID表現。使用免疫點墨法檢測溶胞產物中的AID或微管蛋白(細胞載入量控制組)。為確認mAID活性，我們使用了具有一提前終止密碼子的sDsRed(第九圖)。透過反轉錄病毒感染將sDsRed質體穩定地轉導到3T3纖維母細胞及3T3/TetOn-mAID細胞中。藉由定量DsRed螢光返轉細胞(revertant)來測定mAID之體細胞高頻突變活性。只有具有sDsRed之DNA受質(substrate)之3T3/TetOn-mAID轉染細胞在加入去氧羥四環素開啟體細胞高頻突變後才能偵測到DsRed螢光(第十二圖)。在第十二圖中，將tet-on可誘導之AID及一含有提前終止密碼子之dsRED報告子轉染到3T3纖維母細胞內。該圖係為表現紅色螢光之細胞(表示終止密碼子突變)比例對時間 的圖。我們的結論是，mAID是活化的，數據顯示在提前終止密碼子的突變救回了DsRed螢光。
PEG特異性品系的體細胞高頻突變
我們生成了穩定的3.3抗PEG融合瘤細胞(3.3/loxP-AID細胞)，其係藉由將一帶有loxP的組成性表現盒(pCMV-AID-loxP)轉導至3.3融合瘤細胞內，而以一可控制的方式來表現功能性AID。為測試模擬生發中心反應是否能用以分離具有不同結合活性的抗PEG抗體，將3.3/loxP-AID細胞在冰上以100pM之生物素-4臂-PEG10K及Alexa Fluor 647-鏈黴親和素進行染色。用FACSAria細胞分選器來收集展示出最高度螢光的細胞(該群細胞的~1%)，並增殖2週。在後續幾輪分選中，這些細胞係以Alexa Fluor 647-PEG5K或Alexa Fluor 647-BSA-PEG2K進行染色。以與Alexa405共軛結合之山羊抗小鼠Ig抗體(x軸)對細胞進行共同染色，來測量sIg在這些融合瘤上的表現量。在每一輪分選(S0到S5)時，收集顯現出相對較高抗原結合能力的細胞。以相同的方式分析從第五輪分選篩選來的融合瘤選殖體(1E3、2B5及1E10)。我們在冰上進行所有的PEG結合測試，以在低溫分離結合力較強的抗PEG抗體變異體。在連續五輪分選後，將分離的細胞群以Alexa647-PEG5K探針進行染色，並在流式細胞儀上進行分析。第十三圖顯示第五輪分選會使結合至3.3/loxP-AID融合瘤細胞之Alexa Fluor 647-PEG5K的平均螢光強度(MFI)達到233，而對照組親代3.3融合瘤細胞之值則為23.2，這表示在第五輪原位SHM時，這些融合瘤細胞會表現出在低溫時具有較佳PEG親和力的抗體變異體。在第五輪分選後，分離出三個融合瘤選殖 體(1E3、2B5及1E10)。這些融合瘤之免疫球蛋白V基因的序列顯示，三個抗體在重鏈可變骨架區(variable framework region)都有一單一胺基酸的改變，且在輕鏈可變區之CDR2及CDR3都有多個不同的突變(第十四圖)。根據Kabat編碼(Kabat numbering)定出抗體骨架及各個CDR。虛線係表示相同的胺基酸殘基。
抗PEG抗體變異體之熱活性變化
為進一步評估抗PEG抗體變異體(1E10及2B5)之PEG分子結合活性，我們分析了溫度對這些抗體與PEG結合的影響，並與親代3.3抗體進行比較。將梯度濃度之3.3、1E10或2B5抗體於指示溫度加入微孔盤中包覆有CH3-PEG5k-NH2分子的盤孔內。1h後，清洗盤孔，先加入與HRP共軛結合之驢子抗小鼠IgG Fc抗體、再加入ABTS受質，以測量抗體結合。1E10及2B5兩種抗體在4℃時都會以其完全結合活性與固定在盤孔上的CH3-PEG5k-NH2結合，但在較高溫度(24℃及37℃)下，其結合力會明顯降低(第十五圖)。
因此，1E10及2B5抗體與PEG的結合是有溫度依賴性的。為確認此一熱活性變化是否是因為抗體蛋白在較高溫度下損壞而造成，於37℃培養高達5天後，檢驗了從親代3.3或3.3/S5變異體(1E10及2B5)製得之抗PEG抗體的穩定性。第十六圖顯示，於37℃培養5天後，所有的單株抗體都保留了在4℃吸附PEG的完全結合活性。依指示時間於37℃培養抗體。用ELISA檢驗等分試樣(aliquot)對經吸附之CH3-PEG5k-NH2分子的結合狀況。顯示了三重複實驗的平均吸光值(405nm)。誤差線為SD。進一步使 用微分掃描熱分析儀(differential scanning calorimetry)測定抗體的熔融溫度，顯示親代3.3抗體於70.8℃是未摺疊的，而1E3及2B5的熱穩定性較高，其熱轉移溫度分別為73.6℃及74.2℃。這些結果顯示，這些mAID誘導突變係發生在分離出來之單株抗體(1E10及2B5)的免疫球蛋白V基因中，而這些突變和1E10及2B5與PEG的結合有關。
FO細胞及融合瘤中的外源性AID表現
為進一步擴大原位體細胞高頻突變對新生成之融合瘤的效用，我們要問，是否可能將外源性AID基因轉染到FO骨髓瘤細胞內，而使之作為一般的融合伴侶。FO骨髓瘤細胞株不會生產內源性免疫球蛋白，且會與B淋巴母細胞在聚乙二醇存在情況下有效融合。我們認為透過FO-AID細胞及脾細胞融合所生成的融合瘤可經受體細胞高頻突變，而可使用流式細胞儀在多輪篩選並濃縮的方式而輕易地分選出高親和力的選殖體。
我們將含有loxP-CMV-mAID-HA-F2A-eGFP-loxP表現盒的重組慢病毒粒子轉導到FO骨髓瘤細胞內，使小鼠AID在這些細胞中有組成性表現。eGFP亦透過AID基因下游的furin/2A胜肽(F2A)雙順反子序列而作為報告子表現出來。在穩定的FO骨髓瘤細胞轉染體(FO/AID細胞)中可偵測到mAID的組成性表現(第十七圖)。FO(左方填充曲線)及FO/AID骨髓瘤細胞(右方填充曲線)都顯示了GFP報告子的螢光。
為測試AID是否也會在融合FO/AID骨髓瘤細胞與脾細胞所生成之融合瘤中表現，以50μg重組人類β-葡萄糖醛酸苷酶及弗氏完全佐劑對BALB/c小鼠從腹腔內進行免疫。三週後，使用在40μg重組人類β-葡萄糖 醛酸苷酶及弗氏非完全佐劑中重覆進行免疫。在融合前三天，從腹腔內投予在PBS中之30μg重組人類β-葡萄糖醛酸苷酶，作為最後補強(boost)。在融合當天，從經免疫之小鼠身上製備細胞，並與FO/AID細胞融合。使用聚乙二醇來進行融合。在融合後，將細胞種入96孔盤，並培養在帶有15%小牛血清(HyClone,Logan,UT)及1×次黃嘌呤-胺基喋呤-胸腺嘧啶苷(hypoxanthine-aminopterin-thymidine)(HAT,Gibco,Brooklyn,NY)的DMEM培養基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)(Sigma,St Louis,MO,USA)中。利用ELISA，在每盤孔包覆有0.5μg人類β-葡萄糖醛酸苷酶之96孔盤中對生長中之融合瘤的上清液進行篩選1hr，之後清洗盤孔，先加入與HRP共軛結合之驢子抗小鼠IgG Fc抗體、再加入ABTS受質，來測定特異性抗體結合。在FO/AID細胞與以人類β-葡萄糖醛酸苷酶進行免疫之小鼠的脾細胞融合所生成的融合瘤中，約有63%(26/41)顯示為GFP表現陽性(第十八圖)，這表示AID基因以預期的頻率被隱蔽(sequestered)而產生無偏差的基因分離(gene segregation)。從41個融合瘤選殖體中選出之融合瘤的GFP相對表現係如圖中所示。
將會分泌對人類β-葡萄糖醛酸苷酶具有特異性之單株抗體 的個別融合瘤篩選出來，並以嘌呤黴素(5μg/mL)來培養維持。選出四個選殖體(1-3-4、1-3-3、6-10-1及4-1-1)大量培養，以進行進一步的分析和及演化(evolution)。使用FACScalibur流式細胞儀(Becton Dickinson,Mountain View,CA,USA)偵測eGFP報告子表現，以測量融合瘤中mAID的相對表現量。第十九圖顯示了FO(左方填充曲線)及1-3-3(長段虛線)、6-10-1(短段虛線)、4-1-1(實線)、1-3-4(點虛線)融合瘤細胞中的GFP 報告子表現。一如預期，所有用嘌呤黴素篩選出來的融合瘤都會表現GFP(第十九圖)。
為直接測量mAID蛋白的表現，對五種融合瘤(6-3-1、1-3-4、 1-3-3、6-10-1及4-1-1)及親代FO-AID骨髓瘤細胞進行西方墨點法。製備FO、FO-AID及五種抗β-葡萄糖醛酸苷酶融合瘤(以FO/AID作為融合伴侶而製得)的溶胞產物，再以免疫點墨法檢測AID上的HA抗原決定位標記或微管蛋白(細胞載入量的對照組)。五種選出的融合瘤及FO-AID骨髓瘤細胞都顯示出一對應到mAID的特異條帶(第二十圖)。相對地，親代FO骨髓瘤細胞不會表現mAID。這項結果確認了由小鼠脾細胞與FO-AID骨髓瘤細胞融合所生成的融合瘤可表現AID蛋白。
被選出之融合瘤的抗原特異性抗體的表現
使用ELISA來評估那些被選出的融合瘤(1-3-4、1-3-3、6-10-1及4-1-1)所分泌之抗體的結合活性。使用直接ELISA(direct ELISA)來分析四個融合瘤選殖體(1-3-4、1-3-3、6-10-1及4-1-1)的細胞培養基。分別使用7G8抗人類β-葡萄糖醛酸苷酶及1F4抗人類CD13單株抗體作為陽性及陰性對照組。將樣本或對照組序列稀釋，之後以等體積加入微孔盤上包覆有人類β-葡萄糖醛酸苷酶的盤孔中。先加入與HRP共軛結合之驢子抗小鼠IgG Fc抗體、再加入ABTS受質，以測定抗體結合。四種融合瘤都會表現與人類β-葡萄糖醛酸苷酶結合的抗體(第二十一圖)。一如預期，先前建立的7G8抗β-葡萄糖醛酸苷酶抗體會與包覆了β-葡萄糖醛酸苷酶的盤孔結合，而1F4抗CD13抗體則不會與之結合。
抗人類β-葡萄糖醛酸苷酶融合瘤之親和力成熟作用
選出1-3-4融合瘤來檢驗抗原陽性細胞是否能被螢光活化細胞分選程序所分離。將細胞以限制濃度之β-葡萄糖醛酸苷酶-Alexa647染色，其濃度係從1nM開始，之後持續減半，再用FACS Aria細胞分選器進行分選。在五輪分選後，將未經分選之親代1-3-4細胞及分選後的細胞(1-3-4-S5細胞)以200nM之β-葡萄糖醛酸苷酶-Alexa647染色。以200nM與Alexa405共軛結合之山羊抗小鼠Ig抗體進行共同染色，來測定融合瘤上表面免疫球蛋白的表現。之後以流式細胞儀分析這些細胞。在第二十二圖A至D中，這些圖面顯示下列情形：(A)FO-AID細胞；(B)5G11抗人類β-葡萄糖醛酸苷酶融合瘤；(C)未經分選之1-3-4親代融合瘤；以及(D)經5輪分選後的1-3-4細胞(1-3-4-S5)。FO-AID細胞未顯示出抗原結合，也沒有表現表面免疫球蛋白(第二十二圖A)，而陽性對照組5G11融合瘤細胞顯示出抗原結合，也有表面免疫球蛋白表現(第二十二圖B)。與親代1-3-4融合瘤細胞(第二十二圖C)相較之下，經五輪分選的1-3-4融合瘤細胞(1-3-4-S5細胞)顯示出較為明亮的抗原結合訊號(第二十二圖D)，這表示這個策略可用以分離具有較強親和力的單株抗體。
藉由模擬生發中心反應來增加IgM抗PEG抗體的親和力
我們做了實驗來直接測試IgM抗PEG抗體的親和力是否會因為模擬生發中心反應而有所增加。由穩定表現AID基因的AGP4抗PEG融合瘤細胞(由慢病毒轉導pCMV-AID-loxP得出)中，利用螢光活化細胞分 選，篩選出會與限定濃度之PEG-生物素結合的融合瘤細胞。將這些融合瘤細胞培養兩週，使AGP4抗體基因發生體細胞高頻突變。之後將這些融合瘤細胞以10nM生物素-PEG5000及20nM鏈黴親和素-APC(經螢光標記之鏈黴親和素)之混合物進行染色，以選出融合瘤細胞表面的高親和力AGP4抗體；另外並以經羅丹明(rhodamine)標記之抗小鼠mu鏈抗體進行染色，以測量融合瘤細胞表面之AGP4 IgM抗體量。將顯示出高量APC螢光的融合瘤細胞(也就是與更多PEG結合)分選到試管中(第二十三圖)。第二十三圖顯示親代AGP4(左)或AGP4-AID(右)融合瘤細胞與10nM生物素-PEG5000、20nM鏈黴親和素-APC+羅丹明-抗Mo IgM μ鏈結合後的染色結果。收集在圈選區(P6)中的AGP4-AID細胞，並培養增殖其細胞數目，準備進行後續AGP4抗體的體細胞高頻突變。之後將收集下來的融合瘤細胞培養並增殖兩週，以進行AGP4基因的其他體細胞高頻突變。再次對融合瘤細胞進行前文所述的染色，並再次以螢光活化細胞分選來收集高PEG結合物(第二十四圖)。第二十四圖顯示親代AGP4(左)或AGP4-AID(右)融合瘤細胞與10nM生物素-PEG5000、20nM鏈黴親和素-APC+羅丹明-抗Mo IgM μ鏈結合後的染色結果。收集並培養在圈選區(P6)中的AGP4-AID細胞，準備進行後續AGP4抗體的體細胞高頻突變。2週後，使用較少量的抗原(3.3nM PEG-生物素)將細胞染色，以篩選出高PEG結合物(第二十五圖)。第二十五圖顯示AGP4-AID融合瘤細胞(經兩輪篩選後收集得出)與3.3nM生物素-PEG5000、6.6nM鏈黴親和素-APC+羅丹明-抗Mo IgM μ鏈結合後的的染色結果。收集並增殖在圈選區(P6)中的AGP4-AID細胞，準備進行後續AGP4抗體的體細胞高頻突變。收集最高結合物，再以FACs分析，以測定抗體親 和力是否有所增加。這是在限制經螢光標記之抗原的條件下，對原始AGP4融合瘤細胞及在第II輪或第III輪分選後所收集的AGP4-AID融合瘤細胞進行染色而完成的。第二十六圖顯示，與原始AGP4融合瘤細胞相較之下，在第II輪或第III輪後收集的細胞會與明顯較高量的螢光標記PEG結合。在該圖中，親代AGP4(左)、在兩輪(中間圖面)或三輪(右方圖面)篩選後的AGP4-AID融合瘤細胞係在相同的條件下(3.3nM生物素-PEG5000、6.6nM鏈黴親和素-APC+羅丹明-抗小鼠IgM μ鏈)以經螢光標記之抗原染色。應注意，融合瘤細胞上的IgM表現有減少，這表示它經類別轉換後成為IgG。
我們注意到，AGP4融合瘤細胞表面的IgM表現在每一輪篩選都有減少。這表示AGP4抗體可能會經過類別轉換重組(class switch recombination)。第二十七圖顯示下列結果：a，親代AGP4或AGP4-AID融合瘤細胞(經3輪分選後)的IgM(左)或IgG(右)染色結果，以及其與PEG(x軸)結合的染色結果；及b，AGP4或經3輪分選後之AGP4-AID細胞與PEG-Alexa 647結合後的FACs分析(MFI)。利用染色來看親代AGP4融合瘤細胞或經3輪篩選後之AGP4-AID融合瘤細胞的PEG結合，以及融合瘤細胞表面之IgM或IgG抗體的存在。經3輪分選後，發現AGP4-AID細胞中明顯有一群融合瘤細胞會表現出以高親和力與PEG結合之IgG(第二十七圖a，右下圖面)。我們也對經3輪分選後所收集之AGP4-AID融合瘤細胞進行染色，但是使用另一種PEG分子，以確保所篩選出來的AGP4抗體確以高親和力與PEG結合。如第二十七圖b所示，經3輪分選後之AGP4-AID細胞與PEG-Alexa647的結合遠優於親代AGP4融合瘤細胞。更重要的是，在由IgM經類別轉換成為IgG後，融合瘤細胞仍會在其表面表現出足夠的抗體可進行 FACs篩選。我們從這些結果得出的結論是，我們可模擬生發中心反應來增加IgM抗體的親和力，並進行類別轉換重組來生成具有相同抗原結合特異性的IgG抗體。
我們希望進一步確認，從IgM變成IgG的類別轉換重組是發生在AGP4-AID細胞中。因此我們透過FACs，基於其與PEG結合及在其表面表現IgG的能力來進行分選，選出個別的AGP4-AID細胞(經3輪分選後)。分選出來的個別細胞直接送到96孔培養盤，使之生長大約10天。使用同型ELISA(isotype ELISA)來測定盤孔中分泌出來的AGP4抗體，以決定抗體的重鏈類別。在測試後，發現10個選殖體都是IgG3(第二十八圖)，這確認了AGP4的IgM確實經類別轉換後成為IgG。第二十八圖顯示，在3輪體細胞高頻突變及分選後，收集到10個明顯展示出表面IgG之融合瘤選殖體的單一細胞，並使之增殖。用ELISA測試在融合瘤細胞之培養上清液中的AGP4抗體的類別。10個AGP4融合瘤選殖體都會分泌IgG3抗體，顯示AGP4成功地將IgM經類別轉換後成為IgG。所有AGP4之IgG抗體都保有與PEG結合的能力(第二十九圖)，這確認了它們確是來自AGP4。在第二十九圖中，用ELISA測試了經過類別轉換的AGP4之IgG與96孔盤上所包覆之PEG之間的結合。所有AGP4之IgG抗體都保有抗原(PEG)結合活性，且沒有抗體會與對照抗原(β-葡萄糖醛酸苷酶)結合，這表示特異性被保留下來了。我們的結論是，在試管中模擬生發中心反應是一種可增加單株抗體之親和力及轉換抗體類別的便利方法。
利用1nM生物素-PEG及2nM鏈黴親和素-APC與經羅丹明標記之抗小鼠IgG的混合物對細胞進行染色，以進一步使AGP4之IgG的親和 力成熟(第三十圖)。第三十圖顯示親代AGP4(左)或AGP4-AID(右)融合瘤細胞以1nM生物素-PEG5000、2nM鏈黴親和素-APC+羅丹明-抗Mo IgG結合後的染色結果。收集並增殖圈選區(P6)中會表現表面IgG並與高量經螢光標記之PEG結合的AGP4-AID細胞，以進行後續AGP4之IgG抗體的體細胞高頻突變。因此，IgG的親和力成熟作用是有可能的。我們也測試了另一個IgM抗體是否能經受類別轉換而變成IgG。在3D8融合瘤細胞(會分泌可與B16黑色素瘤細胞上所表現之一表面抗原結合的IgM抗體)中穩定地表現AID基因。2週後，以經螢光標記之抗小鼠IgG抗體對3D8融合瘤細胞進行染色，並用FACs將陽性細胞個別分選出來。在增殖這些細胞後，對其培養基中的抗體進行測試，發現三個選殖體都會分泌IgG(第三十一圖，左方圖面)。這些IgG抗體都保有與B16黑色素瘤細胞結合的能力(第三十一圖，右方圖面)。在第三十一圖中，以表現AID基因之慢病毒感染3D8融合瘤細胞。 在培養數週後，依照FACs測定結果，分選出會表現膜IgG之融合瘤細胞的單一細胞，將之種入96孔盤。用ELISA來測定培養基中得自三個個別選殖體的抗體類別，發現是IgG(左方圖面)。用FACs來測試得自三個融合瘤選殖體且經過類別轉換的3D8之IgG與B16黑色素瘤細胞結合的能力(右方圖面)。 如與黑色素瘤細胞結合的結果所示，所有的3D8之IgG抗體都保有抗原結合活性。在結合對照組，AGP4抗體則不會與黑色素瘤細胞結合。我們的結論是，我們的方法可迅速簡單地將IgM經類別轉換後成為IgG。
為得出內建表現原位體細胞高頻突變及類別轉換重組之能 力的新融合瘤細胞，我們製備了能以一可控制的方式穩定地表現AID的FO骨髓瘤細胞(第三十二圖a)。FO骨髓瘤細胞常用作融合伴侶來製造融合瘤 細胞。使FO-AID細胞與得自以一蛋白抗原進行免疫之小鼠的脾細胞進行融合，發現在所得融合瘤細胞中，約有50%會表現GFP，這表示這些融合瘤細胞成功地表現出AID(第三十二圖b)。可在培養基中加入嘌呤黴素來篩選出會表現AID的融合瘤細胞。對數個融合瘤細胞進行有限稀釋選殖(limiting dilution cloning)，之後以免疫點墨法來證明這些新形成的融合瘤細胞確會表現AID蛋白(第三十二圖c)。第三十二圖顯示：a，親代FO或FO-AID骨髓瘤細胞的GFP染色，這表示AID有表現；b，以FACs分析由小鼠脾細胞與FO-AID細胞融合得出的融合瘤細胞中之GFP表現；以及c，以免疫點墨法測定FO、FO-AID及個別融合瘤選殖體中的AID表現，其係使用溶胞產物及抗AID之抗體或抗微管蛋白之抗體(細胞載入量的對照組)來進行。這些結果顯示，我們可生成內建實行特異性單株抗體之親和力成熟作用及其類別轉換的能力的新融合瘤細胞。
模擬生發中心反應得出人類抗體
在融合瘤細胞中模擬生發中心反應可生產高親和力人類單株抗體，這對許多疾病的治療都十分重要。目前生成人類單株抗體的方法包括使用噬菌體展示庫(phage display libraries)、或者從患者之B細胞或從經免疫之基因轉殖抗體小鼠生成生產抗體的融合瘤細胞。噬菌體展示是一種能生成人類抗體的有效方法，但有一些缺點，包括需要構築大cDNA庫(cDNA libraries)、需要進行其他工程、免疫原性，以及它們容易變得不穩定和聚集的性質(這會在抗體的調配及儲存中造成一些問題)26,54,55。人類抗體也可直接使從人類患者分離出來的B細胞不死化(immortalization)或 使之融合而得出。確實，在發現加入TLR9促效劑CpG可使B細胞不死化的效率從1-2%提升至30-100%之後，已有許多方式可用來改善人類B細胞之EBV不死化的效率56,57。雖然不死化確實有效，但抗體生產量偏低。使用標準融合瘤技術將透過EBV不死化之B細胞與小鼠-人類異源骨髓瘤細胞融合可達到較高的選殖效率、穩定性及抗體生產量58。然而，最近的人類融合瘤技術大多限於製造對抗接種抗原之抗體，此時抗原陽性之B細胞出現的頻率夠高，可分離出生產特異性抗體之融合瘤細胞58-60。
生技公司和科學實驗室目前正廣泛地評估人類單株抗體的生產，而人類免疫小鼠(human immune mice)顯然是一條有希望的路徑。可將CD34+造血幹細胞(從臍帶血清分離得出)注射到NOD/SCID/IL-2Rγnull(NSG)小鼠體內，來得到人類免疫小鼠。以肝內注射方式將CD34+人類臍帶細胞注入條件新生NSG小鼠(conditioned newborn NSG mice)，20週後，周邊血液中的重組人類CD45+細胞高達40%，在骨髓為60%，在脾臟為69%，在肝臟為95%61,62。在肝臟與脾臟中，成熟的B細胞十分重要，而在肝臟、脾臟與骨髓中可偵測到人類單核球、巨噬細胞、樹狀細胞及NK細胞61。人類免疫小鼠也發展出高度多樣化的的T細胞資料庫，並產生強大的T細胞抗原特異性CD4+及CD8+ T細胞反應62,63。在造血作用、感染病、自體免疫及癌症免疫學的研究上，這些小鼠的重要性與日俱增64。更重要的是，人類化的小鼠可對所投予的抗原(包括人類蛋白)產生體液免疫反應65-67，而可分離出人類單株抗體68。
要廣泛使用人類免疫小鼠來生成人類單株抗體，最大的阻礙是這些小鼠之IgM抗體反應的親和力通常偏低64,68,69。一般認為，負責分泌 「自然IgM抗體」的類B1之B細胞(B1-like B cell)70會在重組人類免疫小鼠的造血環境中優先發育71。目前已提出數個可增加人類免疫小鼠之IgG反應的方法，包括投予B細胞細胞激素72、在MHC基因轉殖NSG小鼠身上植入第二型MHC配對相符的人類幹細胞73、以及T細胞授受性轉移(adoptive transfer)74。然而，即便是採用這些做法，IgG反應仍未達最佳情形64。
我們可突破近來使用人類免疫小鼠生產人類單株抗體的限制。將表現AID之骨髓瘤細胞與得自先前免疫過的人類免疫小鼠且經EBV不死化之脾臟B細胞融合，所得之人類抗體融合瘤細胞有能力開啟AID表現，而依「命令」誘導抗體可變區基因之體細胞高頻突變及類別轉換重組。如我們的結果顯示，融合瘤細胞中的AID表現會模擬生發中心反應，而促進抗體親和力成熟作用及重鏈類別轉換。這有助於突破目前在人類免疫小鼠生產人類單株抗體的瓶頸。
材料與方法
細胞株及試劑
BALB/3T3小鼠纖維母細胞(CCL-163)、CC49(抗TAG-72之IgG1 mAb，HB-9459)、L6(抗人類L6抗原之IgG2a mAb，HB-8677)、BC3(抗人類CD3 ε鏈之IgG2b mAb，HB-10166)及PEG-1-6(抗流感病毒之IgG3 mAb，CCL-189)融合瘤細胞係購自美國菌種保存中心(ATCC,Manassas，VA)。融合瘤細胞株AGP4(抗聚乙二醇之IgM mAb)、3.3及6-3(均為抗聚乙二醇之IgG1 mAb)、7G8(抗人類β-葡萄糖醛酸苷酶之IgG1 mAb)及3D8(抗B16F0黑色素瘤之IgM mAb)則是由本實驗室開發出來，已見於先前技 術16,39。人類293FT細胞係得自賴明宗博士(台灣，中研院，分子生物研究所)。所有細胞都在添加了2.98g/L HEPES、2g/L NaHCO3、10%胎牛血清(Hyclone,Logan,UT)、100U/mL青黴素及100μg/mL鏈黴素的DMEM培養基中，於37℃及含有5% CO2之加溼大氣中進行培養。甲氧基-PEG750-NH2、甲氧基-PEG1K-NH2、甲氧基-PEG2K-NH2、甲氧基-PEG3K-NH2、羥基-PEG5K-NH2、甲氧基-PEG10K-NH2、甲氧基-PEG20K-NH2(分子量分別是750、1000、2000、3000、5000、10000及20000Da)、4臂聚(氧乙烯)10K-NH2及18-冠-6係購自Sigma-Aldrich。
DNA質體構築
載體pAS4w.1.Ppuro、pAS3w.Ppuro、pAS3w.Pneo、pLKO.AS2.eGFP、pMD.G(VSV-G信封型質體(envelope plasmid))及pCMV△R8.91(包裹型質體(packaging plasmid))係得自國家干擾性核醣核酸核心設施(台灣，中研院，分子生物研究所/基因體研究中心)。為生成一可停止的AID表現系統，我們設計了一帶有loxP的loxP-CMV-AID-HA-F2A-eGFP-loxP表現盒(pCMV-AID-loxP)。使用RT-PCR，從BALB/c小鼠分離出來的脾細胞中將一以HA標記之(HA-tagged)小鼠活化誘導去胺酶(AID-HA)DNA片段選殖出來。為監看AID-HA的表現，使用以furin-2A(F2A)為主的雙順反子表現策略，來連接一位於mAID-HA基因下游的加強綠色螢光蛋白(eGFP基因)。把這個含有部分HA標記及eGFP基因的HA-F2A-eGFP片段從pLNCX-抗PEG-eB7載體中放大40。利用PCR，從pLKO.AS2.eGFP選殖出eGFP片段。之後利用組合式PCR(assembly PCR)， 從AID-HA及F2A-eGFP片段創造出AID-HA-F2A-eGFP基因，將之插入pAS3w.Ppuro質體。為引入loxP位置，分別將降溫黏合(annealed)後的寡核苷酸插入位於CMV啟動子上游的Spe I位置、以及位於eGFP下游的Pme I位置。我們也構築了一可誘導AID表現之載體。利用PCR，從pRetroX-Tet-On Advanced(Clontech,Mountain View,CA)中放大rtTA-M2片段，之後使用多點突變(multisite-directed mutagenesis)的方式進行突變41，得出rtTA-V14基因42。利用組合式PCR生成IRES-rtTA-V14片段。將經Nhe I-Pme I酶切後的mAID-HA-F2A-eGFP片段及IRES-rtTA-V14片段插入pAS4w.1.Ppuro中，產出pAS4w.1.Ppuro-AID-F2A-eGFP-IRES-rtTA-V14質體，以pTetOn-AID表示。將從pDsRed2(Clontech Laboratories,Inc.,Mountain View,CA,USA)放大的DsRed2 DNA片段插入pAS3w.Pneo，得出pAS3w.Pneo-DsRed。使用QuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene,Santa Clara,CA)而藉由定點突變(site directed mutagenesis)將琥珀終止密碼子(amber stop codon)引入pAS3w.Pneo-DsRed的第519核苷酸位置，得出p-sDsRed2。
PEG及β-葡萄糖醛酸苷酶的生物素化
將4臂-PEG10K-NH2、甲氧基-PEG5K-NH2及甲氧基-PEG2K-NH2分子(Laysan Bio,Arab,AL)溶解於DMSO成為2mg/mL溶液，之後分別與一6倍(用於4臂-PEG10K-NH2)或2倍(用於甲氧基-PEG5K-NH2及甲氧基-PEG2K-NH2)莫耳過剩(molar excess)的EZ-link NHS-LC-生物素(Pierce,Rockford,IL)或Alexa Fluor® 647琥珀醯亞胺酯(Invitrogen,Grand Island,NY)(溶於DMSO)於室溫混合2h，而分別產出經生物素化之4臂 -PEG10K或與Alexa Fluor 647共軛結合之甲氧基-PEG5K及甲氧基-PEG2K。將這些化合物稀釋於5倍體積的ddH2O中，再對ddH2O進行透析，以移除自由態的EZ-link NHS-LC-生物素或Alexa Fluor 647。同樣地，將人類β-葡萄糖醛酸苷酶溶解於PBS(pH 8.0)而成為2mg/mL溶液，之後與20倍莫耳過剩的EZ-link NHS-LC-生物素於室溫混合2h，以產生經生物素化之β-葡萄糖醛酸苷酶。加入十分之一體積的1M甘胺酸溶液來停止反應。將經生物素化之β-葡萄糖醛酸苷酶對PBS進行透析，以移除自由態的EZ-link NHS-LC-生物素，過濾滅菌後於-80℃儲存。
融合瘤細胞上與膜結合之免疫球蛋白的分析
為測量小鼠免疫球蛋白(B細胞受體，BCR)在融合瘤細胞表面的表現，使用在含有0.05% BSA之PBS中的2μg/mL山羊抗小鼠Ig(ICN Pharmaceuticals,Inc,CA,USA)或山羊抗E.coli抗體(Abcam,MA,USA)(陰性對照組)溶液於4℃對細胞染色1小時。細胞以冷PBS清洗三次，再以2μg/mL與FITC共軛結合之兔子F(ab)’2抗山羊抗體(ICN Pharmaceuticals,Inc,CA,USA)進行染色。另外並以在HBSS，2% FBS中的經生物素化之4臂-PEG10K(生物素-PEG，0.5nM)或經生物素化之β-葡萄糖醛酸苷酶(生物素-βG，5μg/mL)溶液對3.3及7G8融合瘤細胞於4℃染色30分鐘，再以與Alexa Fluor 647共軛結合之鏈黴親和素(2μg/mL)(Jackson ImmunoResearch Laboratories,West Grove,PA)於4℃染色30分鐘。以冷PBS清洗兩次，移除未結合的探針。在BDTM LSR II流式細胞儀(Becton Dickinson,Mountain View,CA,USA)上測量104個存活細胞的表面螢光，並以Flowjo(Tree Star Inc.,San Carlos,CA,USA)進行分析。
以慢病毒將AID基因轉導至融合瘤內
使用45μL TransIT-LT1轉染試劑(Mirus Bio,Madison,WI)，將7.5μg之pCMV-AID-loxP、6.75μg之pCMV△R8.91及0.75μg之pMD.G共轉染到在10cm培養皿中生長的293FT細胞(長到90%滿)中，以包裝重組慢病毒粒子。48h後，收取慢病毒粒子並進行超速離心(Beckman SW 41 Ti Ultracentrifuge Swing Bucket Rotor，50,000×g，1.5h，4℃)。使慢病毒粒子懸浮在含有5μg/mL聚凝胺(polybrene)之培養基中，並以0.45μm濾器加以過濾。在病毒感染前一天將3.3融合瘤細胞種入6孔盤(1×105個細胞/盤孔)中。將含有慢病毒的培養基加入至細胞，之後離心1.5h(500×g，32℃)。這些細胞在含有嘌呤黴素(5μg/mL)之完全培養基中進行篩選，以生成穩定的3.3/loxP-AID、AGP4/loxP-AID或3D8/loxP-AID(pCMV-AID-loxP)細胞。
外源性mAID在細胞中的條件式基因表現(conditional expression)
在BDTM LSR II流式細胞儀(Becton Dickinson,Mountain View,CA,USA)上測量AID在細胞中的相對表現量，其係藉由在有或無去氧羥四環素的環境下偵測3.3/loxP-AID及3T3/TetOn-AID細胞中的eGFP報告子來進行。為檢視AID的表現是否會被終止，使用BTX電穿孔器(275伏特，脈衝長度為15msec)，以在電穿孔溶液(Mirus Bio LLC,WI,USA)中的5μg之pLM-CMV-mCherry-P2A-Cre DNA溶液對3.3/loxP-AID融合瘤細胞 (2.5×106個細胞)進行轉染。將這些細胞培養6孔盤中48小時，之後在BDTM LSR II流式細胞儀上分析eGFP及mCherry螢光。在FACSAria細胞分選器上分離出轉染了pLM-CMV-mCherry-P2A-Cre且eGFP表現為陰性的3.3/loxP-mAID細胞。為直接測量細胞中的AID蛋白量，將5×106個3.3或3.3/loxP-AID融合瘤細胞於4℃在0.5mL之RIPA緩衝液(1% NP-40、150mM NaCl、0.5%去氧膽酸鈉、0.1% SDS、50mM Tris，pH 8.0)中溶解1小時。從澄清後的溶胞產物中取出50μg總蛋白，在12.5%還原性SDS-PAGE進行電泳，轉移到硝化纖維素紙上，之後以經生物素化之山羊抗HA(Vector Laboratories,Inc,CA,USA)或兔子抗微管蛋白α抗體(NeoMarkers Inc,CA,USA)染色，再分別以鏈黴親和素-HRP及山羊抗兔子Ig-HRP(Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc,PA,USA)染色。以ECL偵測套組(Pierce,Rockford,IL)使電泳條帶目視可見，再以LAS-3000 Mini Fujifilm影像系統(FujiFilm,Tokyo,Japan)進行分析。
體細胞高頻突變測試
以sDsRed2慢病毒感染3T3或3T3/TetOn-mAID細胞，以生成3T3/sDsRed2或3T3/TetOn-mAID×sDsRed2細胞。這些細胞係在有或沒有500ng/mL去氧羥四環素的情況下進行培養。在設定時間收取細胞，處理後進行流式細胞儀分析，以測量DsRed訊號，DsRed訊號係表示提前終止密碼子有突變而使全長DsRed蛋白表現。計算DsRed2陽性細胞的比例，其係以回復突變體(revertant)之數目/106個細胞來表示。
藉由FACS分離抗PEG抗體變異體
為分離抗PEG抗體變異體，以在HBSS及2%FBS中的經生物素化之4臂-PEG10K(100pM，1×106個細胞/mL)溶液對3×107個3.3/loxP-AID細胞於4℃染色30分鐘，之後與5mL與Alexa Fluor 647共軛結合之鏈黴親和素(2μg/mL)及與PE共軛結合之山羊抗小鼠IgG Fc抗體(2μg/mL)於4℃共同培養30分鐘，以測量與膜結合之免疫球蛋白量。以冷PBS清洗兩次，移除未結合的探針。在FACSAria細胞分選器上收集顯示高Alexa Fluor 647螢光的細胞(所有細胞的1%)，培養2週後再次進行細胞分選。在後續幾輪分選中，來自4臂-PEG10K、線形PEG5K及線形PEG2K之PEG探針的PEG鏈長度會漸次縮短。在5輪分選後，將單個3.3/mAID細胞收入96孔盤，並以短暫轉染pLM-CMV-mCherry-P2A-Cre的方式終止AID表現。
抗體的生產與純化
將在15mL培養基(DMEM，5% FBS)中2.5×107個篩選出來的3.3/loxP-AID變異體融合瘤細胞(1E3及2B5)種到CELLine CL 1000雙槽生物反應器(INTEGRA Biosciences AG,Hudson,NH)中。每7天收集一次含有抗體之培養基，之後用蛋白A Sepharose 4 Fast Flow色層分析(GE Healthcare,Piscataway,NJ)加以純化。將所收集的抗體對PBS進行透析，並過濾滅菌。以BCA蛋白測試法(Thermo Scientific Pierce,Rockford,IL)來測定抗體濃度。
抗體2B5的定點突變
利用RT-PCR，從2B5融合瘤的cDNA中選殖出重組的2B5抗體基因。2B5的輕鏈及重鏈DNA是透過在pLNCX-抗PEG-eB7中的furin-2A雙順反子表現胜肽連結區段組成物而連結在一起。將經EcoR I-Pme I酶切之2B5 IgG片段插入pAS3w.Ppuro而創造出pAS3w.Ppuro-2B5。於50μL在1×Phusion緩衝液中含有20ng之pAS3w.Ppuro-2B5模板DNA質體、15pmole之各個引子、20nmole之dNTPs、2U之Phusion高產能DNA聚合酶(Thermo Scientific)之混合物中進行V23A和K54N的定點突變。所用熱循環步驟係為：於95℃開始變性0.5分鐘；於95℃作用0.5分鐘、55℃作用1分鐘及於68℃作用11分鐘，如此進行18個循環。在冷卻到≦37℃後，直接加入2U的Dpn I限制酶(NEB,Beverly,MA)，於37℃進行放大反應1.5h。使用熱休克方法，以4μL經Dpn I酶切後的樣本對DH5α勝任細胞進行轉型。藉由前文所述的慢病毒轉導及嘌呤黴素(10μg/mL)篩選方法產生會穩定地分泌2B5/V23A(2B5△V)及2B5/K54N(2B5△K)抗體的3T3細胞。每7-10天從CELLine adhere 1000生物反應器收集2B5/V23A及2B5/K54N重組抗體的培養基，並以蛋白A Sepharose 4 Fast Flow色層分析法純化這些抗體。
抗體ELISA
以溶解於50μL/盤孔之0.1M NaHCO3/Na2CO3(用HCl調整為pH 8.0)緩衝液中之0.5μg/盤孔的甲氧基-PEG750-NH2、甲氧基-PEG1K-NH2甲氧基-PEG2K-NH2、甲氧基-PEG3K-NH2羥基-PEG5K-NH2、甲氧基-PEG10K-NH2、甲氧基-PEG20K-NH2及四臂聚(氧乙烯)10K-NH2溶液於37℃包覆 Maxisorp 96孔微孔盤(Nalge-Nunc International,Roskilde,Denmark)3h，之後以200μL/盤孔的稀釋緩衝液(溶於PBS的5%脫脂牛奶)於4℃封阻(block)隔夜。抗體於37℃預培養高達5天，以確定其熱穩定性。將在50μL之2%脫脂牛奶中的梯度濃度抗體於4℃、RT或37℃加入盤中作用1h。分別於4℃、RT或37℃以PBS清洗孔盤三次。於4℃、RT或37℃加入在50μL稀釋緩衝液中與HRP共軛結合之驢子抗小鼠IgG Fc(2μg/mL)作用1h。如前文所述清洗孔盤。為進行競爭性ELISA測試，將maxisorp 96孔微孔盤以如前文所述之0.5μg/盤孔的胺基-PEG3K-NH2、胺基-PEG10K-NH2或人類β-葡萄糖醛酸苷酶進行包覆。將起始濃度為120mM的18-冠-6做三倍序列稀釋，並與20μg/mL的3.3、2B5或7G8抗體做1：1(v/v)混合(故抗體的最終濃度為10μg/mL)。於4℃將混合物加入盤中作用1h。於4℃以PBS清洗孔盤三次，之後和與HRP共軛結合之驢子抗小鼠IgG Fc(2μg/mL)於4℃共同培養1h。於室溫加入150μL/盤孔的ABTS溶液(0.4mg/mL之2,2‘-次偶氮基雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)、0.003% H2O2及100mM磷酸-檸檬酸，pH 4.0)作用30分鐘，以測量結合之過氧化酶的活性。用微孔盤讀取儀(Molecular Device,Menlo Park,CA)來測量盤孔的吸光值(405nm)。
抗體的熱穩定性分析
將抗體對PBS進行透析，除氣(degas)後，以0.5mg/mL的濃度加入微分掃描熱分析儀(Nano DSC III)(TAInstruments,New Castle,DE,USA)的樣本槽中。將除氣後的PBS注射到參考測試槽(reference chamber)內。各個抗體-緩衝液組合在3atm的固定壓力下以每分鐘1℃的速度進行線 性加熱，從10℃升溫至110℃，期間監看其微分功率(differential power)。使用與抗體樣本相同的程序來收集緩衝液-緩衝液(除氣後的PBS)的掃描樣本，以用於基準值的扣除(baseline subtraction)。
藉由表面電漿子共振進行抗體的冠醚特異性結合分析
於所定義之溫度，在Biacore T-200(GE Healthcare,Piscataway,NJ)上測量抗體對18-冠-6化合物的結合活性。使用透過EDC/NHS反應進行胺耦合的標準程序，將2-胺基甲基-18-冠-6固定在CM5晶片上。以恆定流量為10μL/分鐘的速度將2-胺基甲基-18-冠-6(10mM，溶於50mM硼酸鈉緩衝液，pH 8.5)注射到經EDC/NHS活化之CM5晶片，共進行30分鐘。注射乙醇胺，使剩餘的琥珀醯亞胺酯被去活化。總共固定279.4個共振單位(RU)。在溶於HEPES緩衝鹽水中之1μM抗體的恆定流量為50μL/min的情況下，於4℃、25℃及37℃進行抗體結合分析。
藉由抗PEG抗體進行PEG化之奈米粒子的親和力純化
在抗PEG抗體樹脂管柱上，藉由親和力色層分析法來純化PEG-Qdot 655奈米粒子。簡言之，使用ZebaTM Spin Desalting Columns(Thermo Scientific Pierce,Rockford,IL)，以耦合緩衝液(0.1M乙酸鈉，0.15M氯化鈉，pH 5.5)對5mg抗PEG抗體進行脫鹽，使之最終體積為1mL。在抗體溶液中加入2.1mg偏過碘酸鈉(Thermo Scientific Pierce,Rockford,IL)，使之最終濃度為10mM，混合物於室溫黑暗中培養30分鐘。在將該氧化抗體與含有0.1M苯胺之1mL UltraLink® Hydrazide Resin(Thermo Scientific Pierce,Rockford,IL)於室溫培養4小時之前，利用ZebaTM Spin Desalting Columns移除抗體溶液中的偏過碘酸鈉。以PBS清洗耦合在樹脂管柱上的抗PEG抗體3次(2mL/次)。於4℃在抗PEG樹脂管柱載入500微升的PEG-Qdot 655溶液(32nM)，之後以冷PBS清洗。再用100mM檸檬酸緩衝液(pH=3)或熱PBS(37℃)將有結合的PEG-Qdot 655奈米粒子沖提出來。
免疫球蛋白分類(isotyping)ELISA
使用小鼠MonoAb-ID之ELISA套組(Zymed Laboratories)，依供應商指示來測定抗體的型別(class)及亞型別(subclasses)。
經類別轉換之3D8抗體變異體的FACS分析
於4℃以3D8抗體變異體之培養上清液對B16F1細胞進行染色30分鐘。細胞以冷PBS清洗三次，並以2μg/mL與PE共軛結合之山羊Ig抗小鼠IgG Fc抗體(Jackson ImmunoResearch Laboratories,West Grove,PA)進行染色。以冷PBS清洗兩次，移除未結合的探針。在BDTM LSR II流式細胞儀(Becton Dickinson,Mountain View,CA,USA)上測量104個存活細胞的表面螢光，並以Flowjo(Tree Star Inc.,San Carlos,CA,USA)進行分析。
生產FO-AID細胞
以重組慢病毒感染FO骨髓瘤細胞(ATCC PTA-11450)，而可在CMV啟動子控制之下使AID進行組成性表現(使用pCMV-AID-loxP)。AID基因帶有loxP位置，而可進行經Cre中介的切除，在期望的時間點停止 體細胞高頻突變。藉由在添加嘌呤黴素之培養基中培養而分離出穩定的細胞。對eGFP陽性細胞進行螢光活化細胞分選，確保所有的細胞都會表現AID。對溶胞產物進行免疫點墨法來確認AID蛋白的表現係。
其他方法
HMMA2.5細胞是一種由小鼠骨髓瘤細胞株P3X63Ag8.653與得自IgA骨髓瘤患者之骨髓單核細胞所形成的異源融合瘤(heterohybridoma)74。以在CMV啟動子或Tet-on可誘導之載體的控制下表現出活化誘導胞苷去胺酶基因的重組慢病毒粒子穩定地感染這些細胞。在以嘌呤黴素進行篩選後，藉由螢光活化細胞分選來收集表現eGFP的細胞(代表AID有表現)。對HMMA2.5-AID細胞進行處理，以確保它們沒有黴漿菌污染，之後將多數細胞儲存在液態氮中。
依照之前公開的方法來建立人類免疫小鼠62,75。簡言之，臍帶血先去除紅血球，再進行Percoll梯度離心。利用磁珠分離CD34+細胞。對新生的(24-48小時大)NOD-scid IL2rγnull(NSG)小鼠施以100cGy輻射，之後透過肝內注射，直接穿透皮膚注入1×105個CD34+造血幹細胞。藉由螢光活化細胞分選，使用對抗特異性人類分化標記之螢光標記抗體對在經移植之小鼠體內的人類細胞群進行週期性分析。
利用s.c.注射抗原及弗氏完全佐劑，對重組人類免疫小鼠進行免疫作用。之後每三週對這些小鼠補強(boost)一次，但在弗氏非完全佐劑中的抗原量會逐漸減少。在每次進行免疫後一週採集血液樣本，並用ELISA測試其特異性抗體效價。使小鼠造血細胞與包覆有大鼠抗小鼠CD45 抗體30-F11的磁珠結合，將之從脾細胞中移出。使用TLR促效劑CpG 2006及前述持續感染及轉型而會生產Epstein Barr病毒之B95-8細胞的培養基來刺激人類脾細胞，進行轉型56。藉電融合或PEG方法，將HMMA2.5-AID及經EBV轉型之人類B細胞融合在一起，並以完全RPMI-1640培養基(添加20%經熱去活化之FBS、2mM L-麩醯胺酸、1mM丙酮酸鈉、2.5μg/ml兩性黴素、50μg/ml健大黴素、60μg/ml泰黴素溶液、1×HAT(100μM次黃嘌呤、0.4μM胺基喋呤、16μM胸腺嘧啶苷)、5μg/ml嘌呤黴素及0.5μM哇巴因(ouabain))進行培養。哇巴因係用以排除未融合的經EBV轉型之B細胞，嘌呤黴素可排除不表現AID的融合瘤細胞，而HAT係用以排除未融合的骨髓瘤細胞。在培養一週後，慢慢地改變培養基，使之包含HT(100μM次黃嘌呤、16μM胸腺嘧啶苷)，而非HAT。可藉由ELISA測量培養基中的特異性抗體來鑑定出陽性融合瘤。
舉例來說，為了篩選抗神經纖毛蛋白-1(neuropilin-1， NRP-1)之人類單株抗體，將人類融合瘤細胞以經生物素化之NRP-1的b1b2結構域(domain)進行染色，再和與Alexa647共軛結合之鏈黴親和素及與PE共軛結合之山羊抗人類Ig(A+G+M)抗體共同培養，以測量與膜結合之免疫球蛋白量。在FACSAria細胞分選器上收集展示出Alexa647螢光的細胞。為鑑別會進行NRP-1之功能性中和作用的融合瘤細胞，用與Alexa488共軛結合之VEGF-A165和NRP-1的b1b2結構域進行結合競爭。在FACSAria細胞分選器上收集會展示出高度Alexa647螢光(代表該融合瘤細胞會表現抗NRP-1抗體，故可與經生物素化之NRP-1及與Alexa647共軛結合之鏈黴親和素結合)、且無Alexa488螢光(代表該融合瘤細胞與Alexa488共軛結合之 VEGF-A165結合的位置被抗NRP-1抗體封阻了)的細胞。為分析NRP-1抗體的封阻功能，將經葡聚糖包覆之Cytodex 3微載體球珠(Amersham)與HUVECs在有VEGF-A165存在的情況下共同培養，再將抗體加入各盤孔中。 八天後，在倒立顯微鏡拍攝球珠影像。計算血管的芽長(sprout length)及數目，以鑑別出具有最大抗血管新生作用活性的單株抗體。在後續幾輪分選中，與Alexa488共軛結合之VEGF-A165的蛋白濃度會漸次增加。在最終細胞篩選中，將單一抗NRP-1融合瘤細胞收集到96-孔盤中，並藉由短暫轉染表現了Cre重組酶之pLM-CMV-mCherry-P2A-Cre DNA質體來終止AID的表現。
先前技術
現已開發了數個用來篩選高親和力抗體的抗體展示庫(antibody display libraries)，包括噬菌體44、酵母菌8及核糖體45展示庫。這些技術只能展示非經糖化之抗體片段，而無法用於有適度糖化之全長IgG。此外，也需要進行實質展示庫的開發與分子選殖。
目前已用人類供體建立了一個人類抗體展示庫。這個展示庫會在哺乳類細胞上表現。這個方法有其限制，只能發現患者對抗非人類抗原的抗體，如類Qβ病毒顆粒(Qβ virus like paricle，VLP)，這是一種病毒抗原模型46。
活化誘導胞苷去胺酶(AID)的表現係足以在融合瘤及纖維母細胞中誘導體細胞高頻突變及類別轉換重組38,47-49。但這些文獻並沒有想要進行高親和力抗體的篩選。
目前顯示，在融合瘤中穩定地轉染活化誘導胞苷去胺酶 (AID)會增加類別轉換的頻率，而有助於分離出表現各種同型(isotype)單株抗體的次選殖體(subclone)，但這項技術並未用於分離高親和力抗體37。
在AID過度表現之Ramos細胞(人類Burkitt氏淋巴瘤細胞株) 中穩定地表現一單體紅色螢光蛋白基因，透過AID中介的SHM，這個基因可演化出一種具有較佳之光穩定性且可發出遠紅光(如649nm)的紅色螢光蛋白。因此，SHM提供了一個可演化出具有期望性質之非抗體蛋白的策略。 藉由將期望的抗體基因轉染至Ramos細胞，可將這個系統應用於抗體親和力成熟作用。然而，目標基因的轉染、反覆分離(約23輪)及蛋白表現都是相當耗時的50。
AID過度表現的B細胞株(人類Ramos細胞及雞DT-40細胞) 會在表面展示IgM，而可在AID依賴性SHM之後，使用FACS分離出可辨識位於B細胞膜之螢光標記抗原的抗原特異性B細胞。雖然Ramos細胞會生產人類抗體，但其反覆演化(iterative evolution)和篩選程序的效率不佳(約19輪，2週/輪)51。
將Bcl-6(B細胞淋巴瘤-6)及Bcl-xL的基因引入周邊血液記 憶性B細胞中。將這些細胞與CD40配位體(CD40L)及介白素-21(IL-21)蛋白一同培養，會產生高度增殖性、細胞表面B細胞受體(BCR)為陽性、且會分泌免疫球蛋白的B細胞，這種細胞具有生發中心B細胞的特徵，包括活化誘導胞苷去胺酶(AID)的表現在內。然而，這個方法有其限制，由於需要在B細胞分離之前對患者進行免疫，只能用於非人類抗原的抗體52。
在人類293細胞中，於AID表現的情況下進行哺乳類細胞表 面人類抗體展示的技術已應用於抗體親和力成熟作用。這項技術係透過AID依賴性SHM(即將一AID基因引入293細胞中)而成功地增加抗體的親和力。然而，抗體庫的建構、AID基因的引入、分離後抗體基因的再轉染、以及抗體表現步驟都非常昂貴、技術上有其難度、且十分耗時53。
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Claims (10)

  1. 一種在可生產單株抗體之既有融合瘤細胞中使親和力成熟及抗體類別轉換重組的方法，該方法係包含下列步驟：(a)使用一可控制型活化誘導胞苷去胺酶(activation-induced cytidine deaminase)表現系統，在前述既有融合瘤細胞中表現活化誘導胞苷去胺酶但不選殖抗體基因；(b)測定自然出現在前述既有融合瘤細胞表面上之抗體的表現量及抗原結合能力；(c)透過前述自然出現在前述既有融合瘤細胞表面上之抗體，藉由螢光活化細胞分選的方式，從會優先與經螢光標記之抗原結合的融合瘤細胞中選出會分泌高親和力抗體的融合瘤細胞；以及(d)重複進行前述步驟(a)至(c)，直到所分離出的融合瘤會分泌親和力夠高的抗體後，通過對所述細胞轉染CRE重組酶或通過移除去氧羥四環素來終止所述步驟(a)。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中前述抗體係經過類別轉換重組，由IgM轉換為選自由IgG、IgA及IgE所組成之群組的類別。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中前述融合瘤細胞係為會分泌完全人源性抗體之融合瘤細胞。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中前述類別轉換重組係發生在會分泌完全人源性抗體之融合瘤細胞中。
  5. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中前述類別轉換重組係發生在會分泌完全人源性抗體之融合瘤細胞中。
  6. 一種生成可生產單株抗體之新融合瘤細胞的方法，其中前述融合瘤細胞係經受可調式抗體親和力成熟作用及抗體類別轉換重組，該方法係包含下列步驟：(a)使用一可控制型活化誘導胞苷去胺酶表現系統，在骨髓瘤融合瘤融合伴侶細胞中表現活化誘導胞苷去胺酶但不選殖抗體基因；(b)在前述表現活化誘導胞苷去胺酶之骨髓瘤細胞與得自經抗原免疫之動物的B細胞之間生成融合瘤細胞；(c)透過自然出現在前述融合瘤細胞表面上之抗體，藉由螢光活化細胞分選的方式，從會優先與經螢光標記之抗原結合的新融合瘤細胞中選出會分泌高親和力抗體的融合瘤細胞；以及(d)重複進行前述步驟(a)至(c)，直到所分離出的融合瘤會分泌親和力夠高的抗體後，通過對所述細胞轉染CRE重組酶或通過移除去氧羥四環素來終止所述步驟(a)。
  7. 如申請專利範圍第6項所述之方法，其中前述抗體係經過類別轉換重組，由IgM轉換為選自由IgG、IgA及IgE所組成之群組的類別。
  8. 如申請專利範圍第6項所述之方法，其中前述融合瘤細胞會分泌完全人源性抗體。
  9. 如申請專利範圍第6項所述之方法，其中前述類別轉換重組係發生在會分泌完全人源性抗體之融合瘤細胞中。
  10. 如申請專利範圍第7項所述之方法，其中前述類別轉換重組係發生在會分泌完全人源性抗體之融合瘤細胞中。
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