TW201800419A - Ｌａｇ－３抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途 - Google Patents
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Abstract
本發明涉及LAG-3抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途。進一步地，本發明涉及包含所述LAG-3抗體CDR區的嵌合抗體、人源化抗體，以及包含LAG-3抗體及其抗原結合片段的藥物組成物，以及其作為抗腫瘤藥物的用途。特別地，本發明涉及一種人源化的LAG-3抗體在製備用於治療免疫細胞參與的疾病的藥物中的用途。
Description
本發明涉及LAG-3(LAG-3)抗體、LAG-3抗體的抗原結合片段、包含所述LAG-3抗體CDR區的嵌合抗體、人源化抗體，以及包含所述LAG-3抗體及其抗原結合片段的藥物組成物，以及其作為抗腫瘤藥物的用途。
淋巴細胞活化基因3(lymphocyteactivationgene-3，也稱LAG-3，CD223)是免疫球蛋白超家族的一員，可負性調節免疫細胞的各項功能和生存週期。已有研究表明，LAG-3在病毒感染、自身免疫疾病以及腫瘤所致的免疫系統功能紊亂中發揮著重要作用，藉由影響LAG-3的功能可以改善這些疾病演進過程中免疫功能失常狀態，從而改善疾病的預後。
LAG-3作為免疫球蛋白超家族的一員，由胞外區、跨膜區和胞質區3個部分組成。成熟的LAG-3分子包括470個胺基酸，相對分子量為70kDa，1990年由Triebel等首次發現(J Exp Med,1990,171(5)：1393-405)。研究發現，LAG-3與CTLA-4、PD-1一樣，是一個負性共刺激分子，其啟動
可負向調控淋巴細胞功能。LAG-3在結構上與CD4密切相關，但卻有著與CD4截然相反的功能，表現在LAG-3與CD4分子具有較高的相似性，可與MHC-II(主要組織相容性複合體)類分子結合但是其與MHC-II類分子的結合更為緊密，從而干預CD4+T淋巴細胞TCR啟動，抑制T淋巴細胞啟動(Curr Opin Immunol,2009,21(2)：179-86；Eur J Immunol,2003,33(4)：970-9)。體外研究顯示，LAG-3可抑制抗原誘導的T淋巴細胞增殖反應，而阻斷了LAG-3之後，T淋巴細胞的活化和增殖，1型輔助性T細胞(type1 T helper cells,Th1)分泌細胞因子的情況均有所改善；Huang等研究表明，活化的CD4+Treg細胞表面LAG-3水平顯著升高，且LAG-3是CD4+Tregs發揮最大免疫抑制作用的必需條件(Immunity,2004,21(4)：503-13)。此外，抗LAG-3抗體還可維持CD4+和CD8+T淋巴細胞穩態，阻斷LAG-3後CD8+T淋巴細胞殺傷腫瘤細胞的能力顯著增強(J Clin Invest,2007,117(11)：3383-92)。一些疾病相關研究也發現，LAG-3在調控疾病發生發展中具有重要作用。Gandhi等證實人類淋巴瘤組織中T淋巴細胞LAG-3的表現水平與T淋巴細胞功能障礙相關，清除LAG-3+T淋巴細胞可顯著增強淋巴細胞的腫瘤清除能力(Blood,2006,108(7)：2280-9)。研究結果顯示LAG-3是免疫細胞表面重要的抑制性分子，並且對T淋巴細胞可產生顯著的負向調控作用。
LAG-3主要表現在T淋巴細胞、B淋巴細胞、NK細胞、Treg細胞以及DC等細胞上(Proc Natl Acad Sci U S A,1997,
94(11)：5744-9.Eur J Immunol,2005,35(7)：2081-8；J Immunol,2009,182(4)：1885-91)。LAG-3是一類免疫抑制性分子，是TCR的共受體組成部分之一，它干預T淋巴細胞TCR啟動，在T淋巴細胞啟動中發揮負性調控功能。在一些疾病中，LAG-3表現均會升高，並且會出現相應的免疫抑制。Gandhi等發現何杰金氏淋巴瘤患者血液和腫瘤組織中，淋巴細胞高度表現LAG-3：腫瘤組織中特異性CD8+T細胞的功能明顯受損，如果去除LAG-3陽性的T細胞，其抗腫瘤功能可以恢復，細胞因子分泌增加。據此推測，LAG-3的表現與特異性T細胞的免疫負調節功能相關，抑制LAG-3分子功能可以增強T細胞的抗腫瘤作用，該分子有可能是一個潛在的腫瘤免疫治療靶點(Blood,2006,108(7)：2280-9)。
目前有多家跨國製藥公司如BMS公司和Novartis公司在研發針對LAG-3的單株抗體，它藉由刺激抗原特異性T細胞反應，增強T細胞的抗腫瘤作用，從而最大限度的提高患者自身對腫瘤的免疫系統反應，達到對腫瘤細胞進行殺傷的目標。目前相關的專利有WO2010019570、WO2014008218、WO9530750、WO2004078928、WO2008132601、WO2014140180或WO2015138920。
本發明提供有著高親和力，高選擇性，高生物活性的LAG-3抗體。
本發明提供一種LAG-3抗體或其抗原結合片段，其包
含任意1個或多個選自以下(i)或(ii)的CDR區或與其具有至少85%(較佳係95%)序列同一性的胺基酸序列：(i)SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示的HCDR區；和SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17所示的LCDR區；或(ii)SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示的HCDR區；和SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20所示的LCDR區。
在本發明另一個較佳的實施方案中，提供根據本發明所述的LAG-3抗體或其抗原結合片段，其中所述的抗體重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，或與其具有至少85%(較佳係95%)序列同一性的胺基酸序列。
在本發明另一個較佳的實施方案中，提供根據本發明所述的LAG-3抗體或其抗原結合片段，其中所述的抗體重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，或與其具有至少85%(較佳係95%)序列同一性的胺基酸序列。
在本發明另一個較佳的實施方案中，提供根據本發明所述的LAG-3抗體或其抗原結合片段，其中所述的抗體輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，或與其
具有至少85%(較佳係95%)序列同一性的胺基酸序列。
在本發明另一個較佳的實施方案中，提供根據本發明所述的LAG-3抗體或其抗原結合片段，其中所述的抗體輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，或與其具有至少85%(較佳係95%)序列同一性的胺基酸序列。
在本發明另一個較佳的實施方案中，提供根據本發明所述的LAG-3抗體或其抗原結合片段為鼠源抗體或其片段。
在本發明另一個較佳的實施方案中，提供根據本發明所述的LAG-3抗體或其抗原結合片段，其中所述的抗體輕鏈可變區進一步包含鼠源κ鏈或鼠源κ鏈變體的輕鏈FR區、或者鼠源λ鏈或鼠源λ鏈變體的輕鏈FR區；其中抗體重鏈可變區進一步包含鼠源IgG1或其變體的重鏈FR區、或IgG2或其變體的重鏈FR區、或IgG3或其變體的重鏈FR區。
在本發明另一個較佳的實施方案中，提供一種鼠源的LAG-3抗體或其抗原結合片段，其中所述的鼠源抗體包含如SEQ ID NO：5所示的重鏈可變區和如SEQ ID NO：6所示的輕鏈可變區。
在本發明另一個較佳的實施方案中，提供一種鼠源的LAG-3抗體或其抗原結合片段，其中所述的鼠源抗體包含如SEQ ID NO：7所示的重鏈可變區和如SEQ ID NO：8所示的輕鏈可變區。
在本發明另一個較佳的實施方案中，提供根據本發明所述的LAG-3抗體或其抗原結合片段，其中抗體輕鏈進一步包含鼠源κ鏈或其變體的輕鏈恆定區、或者鼠源λ鏈或其變體的輕鏈恆定區；其中抗體重鏈可變區進一步包含鼠源IgG1或其變體的重鏈FR區、或IgG2或其變體的重鏈FR區、或IgG3或其變體的重鏈FR區。
在本發明另一個較佳的實施方案中，提供根據本發明所述的LAG-3抗體或其抗原結合片段，其中所述的抗體或其抗原結合片段為嵌合抗體或其抗原結合片段。
在本發明另一個較佳的實施方案中，提供根據本發明所述的LAG-3抗體或其抗原結合片段，其中所述的抗體或其抗原結合片段為人源化抗體或其抗原結合片段。
在本發明另一個較佳的實施方案中，提供根據本發明所述的LAG-3抗體或其抗原結合片段，其中所述的人源化抗體重鏈可變區上的重鏈FR區序列來源於人種系重鏈，IGHV7-4-1*02和hjh6.1的組合序列或其突變序列；其包含人種系重鏈IGHV7-4-1*02的FR1、FR2、FR3區和hjh6.1的FR4區或其突變序列；較佳的，其中所述的人源化抗體重鏈FR區序列有0-10個胺基酸的回復突變，更佳為一個或多個選自E46K,R38K,V93T和Y95F的胺基酸回復突變。
在本發明另一個較佳的實施方案中，提供根據本發明所述的人源化LAG-3抗體或其抗原結合片段，其中所述人源化抗體重鏈可變區序列為SEQ ID NO：21所示的序列，或與其具有至少85%(較佳係95%)序列同一性的胺基酸序
列；較佳係在重鏈可變區有1-10的胺基酸變化；這種胺基酸變化可基於本領域親和力成熟的技術進行改變。
在本發明另一個較佳的實施方案中，提供根據本發明所述的人源化LAG-3抗體或其抗原結合片段，其中所述人源化抗體重鏈可變區包含SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25所示的序列，或與其具有至少85%(較佳係95%)序列同一性的胺基酸序列。
在本發明另一個較佳的實施方案中，提供根據本發明所述的人源化LAG-3抗體或其抗原結合片段，其中所述的人源化抗體重鏈可變區上的重鏈FR區序列來源於人種系重鏈IGHV1-3*01和hjh6.1的組合序列及其突變序列；其包含人種系重鏈IGHV1-3*01的FR1、FR2、FR3區和hjh6.1的FR4區或其突變序列；其中所述的人源化抗體重鏈FR區序列有0-10個胺基酸的回復突變，更佳為一個或多個選自F29L,A97T,M48I,V68A,I70L,R72V和T74K的胺基酸回復突變。
在本發明另一個較佳的實施方案中，提供根據本發明所述的人源化LAG-3抗體或其抗原結合片段，其中所述人源化抗體重鏈可變區序列為SEQ ID NO：29所示的序列，或與其具有至少85%(較佳係95%)序列同一性的胺基酸序列；較佳係在重鏈可變區有1-10的胺基酸變化；這種胺基酸變化可基於本領域親和力成熟的技術進行改變。
在本發明另一個較佳的實施方案中，提供根據本發明所述的人源化LAG-3抗體或其抗原結合片段，其中所述人
源化抗體重鏈可變區序列選自SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：33所示的序列，或與其具有至少85%(較佳係95%)序列同一性的胺基酸序列。
在本發明另一個較佳的實施方案中，提供根據本發明所述的人源化LAG-3抗體或其抗原結合片段，其中所述的人源化抗體輕鏈可變區上的輕鏈FR區序列來源於人種系輕鏈範本IGKV1-39*01和hjk4.1的組合序列及其突變序列；其包含人種系輕鏈IGKV1-39*01的FR1、FR2、FR3區和hjk4.1的FR4區及其突變序列。
在本發明另一個較佳的實施方案中，提供根據本發明所述的人源化LAG-3抗體或其抗原結合片段，其中所述人源化抗體可變區輕鏈序列為SEQ ID NO：22所示的序列，或與其具有至少85%序列同一性的胺基酸序列；較佳係在輕鏈可變區有1-10的胺基酸變化；這種胺基酸變化可基於本領域親和力成熟的技術進行改變。
在本發明另一個較佳的實施方案中，提供根據本發明所述的人源化LAG-3抗體或其抗原結合片段，其中所述的人源化抗體輕鏈FR區序列有0-10個胺基酸的回復突變，較佳為一個或多個選自D70Q,F71Y,I48V和A43S的胺基酸回復突變。
在本發明另一個較佳的實施方案中，提供根據本發明所述的人源化LAG-3抗體或其抗原結合片段，其中所述人源化抗體輕鏈可變區序列選自SEQ ID NO：22、SEQ ID
NO：26、SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：28所示的序列，或與其具有至少85%(較佳係95%)序列同一性的胺基酸序列。
在本發明另一個較佳的實施方案中，提供根據本發明所述的人源化LAG-3抗體或其抗原結合片段，其中所述人源化抗體可變區輕鏈序列為SEQ ID NO：30所示的序列，或與其具有至少85%序列同一性的胺基酸序列；較佳係在輕鏈可變區有0-10的胺基酸變化；這種胺基酸變化可基於本領域親和力成熟的技術進行改變。
在本發明另一個較佳的實施方案中，提供根據本發明所述的人源化LAG-3抗體或其抗原結合片段，其中所述的人源化抗體輕鏈FR區序列有0-10個胺基酸的回復突變，較佳為一個或多個選自L46R,G66R,S60K,P44F,Y36L,K42G,I21L和T85D的胺基酸回復突變。
在本發明另一個較佳的實施方案中，提供根據本發明所述的人源化LAG-3抗體或其抗原結合片段，其中所述人源化抗體輕鏈可變區序列選自SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：37所示的序列，或與其具有至少85%(較佳係95%)序列同一性的胺基酸序列。
在本發明另一個較佳的實施方案中，提供根據本發明所述的人源化LAG-3抗體或其抗原結合片段，其中所述人源化抗體包含(a)重鏈可變區序列，所述重鏈可變區序列與SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24或SEQ
ID NO：25所示的胺基酸序列具有至少85%(較佳係95%)序列同一性；和(b)輕鏈可變區序列，所述輕鏈可變區序列與SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性。
在本發明另一個較佳的實施方案中，本發明所述的LAG-3抗體或其抗原結合片段，其中所述人源化抗體包含(a)重鏈可變區序列，所述重鏈可變區序列與SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、或SEQ ID NO：33所示的胺基酸序列具有至少85%(較佳係95%)序列同一性；和(b)輕鏈可變區序列，所述輕鏈可變區序列與SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：37所示的胺基酸序列具有至少85%(較佳係95%)序列同一性。
在本發明另一個較佳的實施方案中，提供根據本發明所述的LAG-3抗體或其抗原結合片段，其中所述的抗體包含選自以下的重鏈可變區和輕鏈可變區的組合：1)SEQ ID NO：21的重鏈可變區和SEQ ID NO：22的輕鏈可變區；2)SEQ ID NO：21的重鏈可變區和SEQ ID NO：26的輕鏈可變區；3)SEQ ID NO：21的重鏈可變區和SEQ ID NO：27的輕鏈可變區；4)SEQ ID NO：21的重鏈可變區和SEQ ID NO：28的輕鏈可變區；
5)SEQ ID NO：23的重鏈可變區和SEQ ID NO：22的輕鏈可變區；6)SEQ ID NO：23的重鏈可變區和SEQ ID NO：26的輕鏈可變區；7)SEQ ID NO：23的重鏈可變區和SEQ ID NO：27的輕鏈可變區；8)SEQ ID NO：23的重鏈可變區和SEQ ID NO：28的輕鏈可變區；9)SEQ ID NO：24的重鏈可變區和SEQ ID NO：22的輕鏈可變區；10)SEQ ID NO：24的重鏈可變區和SEQ ID NO：26的輕鏈可變區；11)SEQ ID NO：24的重鏈可變區和SEQ ID NO：27的輕鏈可變區；12)SEQ ID NO：24的重鏈可變區和SEQ ID NO：28的輕鏈可變區；13)SEQ ID NO：25的重鏈可變區和SEQ ID NO：22的輕鏈可變區；14)SEQ ID NO：25的重鏈可變區和SEQ ID NO：26的輕鏈可變區；15)SEQ ID NO：25的重鏈可變區和SEQ ID NO：27的輕鏈可變區；和16)SEQ ID NO：25的重鏈可變區和SEQ ID NO：28的輕鏈可變區。
在本發明另一個較佳的實施方案中，提供根據本發明所述的LAG-3抗體或其抗原結合片段，其中所述的抗體包含選自以下的重鏈可變區和輕鏈可變區的組合：1)SEQ ID NO：29的重鏈可變區和SEQ ID NO：30的輕鏈可變區；2)SEQ ID NO：29的重鏈可變區和SEQ ID NO：34的輕鏈可變區；3)SEQ ID NO：29的重鏈可變區和SEQ ID NO：35的輕鏈可變區；4)SEQ ID NO：29的重鏈可變區和SEQ ID NO：36的輕鏈可變區；5)SEQ ID NO：29的重鏈可變區和SEQ ID NO：37的輕鏈可變區；6)SEQ ID NO：31的重鏈可變區和SEQ ID NO：30的輕鏈可變區；7)SEQ ID NO：31的重鏈可變區和SEQ ID NO：34的輕鏈可變區；8)SEQ ID NO：31的重鏈可變區和SEQ ID NO：35的輕鏈可變區；9)SEQ ID NO：31的重鏈可變區和SEQ ID NO：36的輕鏈可變區；10)SEQ ID NO：31的重鏈可變區和SEQ ID NO：37的輕鏈可變區；11)SEQ ID NO：32的重鏈可變區和SEQ ID NO：30
的輕鏈可變區；12)SEQ ID NO：32的重鏈可變區和SEQ ID NO：34的輕鏈可變區；13)SEQ ID NO：32的重鏈可變區和SEQ ID NO：35的輕鏈可變區；14)SEQ ID NO：32的重鏈可變區和SEQ ID NO：36的輕鏈可變區；15)SEQ ID NO：32的重鏈可變區和SEQ ID NO：37的輕鏈可變區；16)SEQ ID NO：33的重鏈可變區和SEQ ID NO：30的輕鏈可變區；17)SEQ ID NO：33的重鏈可變區和SEQ ID NO：34的輕鏈可變區；18)SEQ ID NO：33的重鏈可變區和SEQ ID NO：35的輕鏈可變區；19)SEQ ID NO：33的重鏈可變區和SEQ ID NO：36的輕鏈可變區；和20)SEQ ID NO：33的重鏈可變區和SEQ ID NO：37的輕鏈可變區。
在本發明另一個較佳的實施方案中，提供根據本發明所述的嵌合或人源化LAG-3抗體或其抗原結合片段，其中所述嵌合抗體或人源化抗體重鏈進一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其變體的重鏈恆定區，較佳係包含人源IgG4或其變體的重鏈恆定區，最佳係如SEQ ID NO：
38所示的重鏈恆定區；所述嵌合抗體或人源化抗體輕鏈進一步包含人源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區，最佳係如SEQ ID NO：39所示的輕鏈恆定區。
本發明進一步提供一種藥物組成物，其含有治療有效量的如上所述的LAG-3抗體或其抗原結合片段，以及一種或多種藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
本發明進一步提供一種分離的單株抗體或其抗原結合片段，能與如上所述的單株抗體或其抗原結合片段競爭結合LAG-3。
本發明進一步提供一種編碼如上所述的LAG-3抗體或其抗原結合片段的分離的核酸。
本發明進一步提供一種含有如上所述的分離的核酸的表現載體。
本發明進一步提供一種用如上所述的表現載體轉化的宿主細胞，所述宿主細胞選自原核細胞和真核細胞，較佳為真核細胞，更佳為哺乳動物細胞。
本發明進一步提供一種用於製備LAG-3抗體及其抗原結合片段的方法，包括在上述的宿主細胞中表現該抗體或其抗原結合片段，並自該宿主細胞中分離該抗體或其抗原結合片段。
本發明進一步提供一種用於抑制受試者中的腫瘤細胞的生長的方法，包括對所述受試者施用治療有效量的如上所述的LAG-3抗體或其抗原結合片段，或包含其的藥物組
成物，或如上所述的核酸，從而在所述受試者中抑制腫瘤生長。
本發明進一步提供一種用本發明所述的LAG-3抗體或其抗原結合片段、或包含其的藥物組成物在受試者中抑制腫瘤細胞生長的用途。
本發明進一步提供一種用本發明所述的LAG-3抗體或其抗原結合片段、或包含其的藥物組成物，或如上所述的核酸在製備用於在受試者中抑制腫瘤細胞生長的藥物中的用途。
本發明進一步提供一種本發明所述的LAG-3抗體或其抗原結合片段、或包含其的藥物組成物、或如上所述的核酸，在製備用於治療免疫細胞參與的疾病或病症的藥物中的用途，其中所述的疾病或病症較佳為癌症；所述的包括，但不限於卵巢癌、黑色素瘤(例如轉移性惡性黑素瘤)、前列腺癌、腸癌(例如，結腸癌和小腸的癌症)、胃癌、食管癌、乳腺癌、肺癌、腎癌(例如，透明細胞癌)、胰腺癌、子宮癌、肝癌、膀胱癌、子宮頸癌、口腔癌、腦癌、睾丸癌、皮膚癌、甲狀腺癌以及血液學惡性腫瘤包括骨髓瘤和慢性/急性白血病。
第1圖：人源化抗LAG-3抗體樣品對SEB刺激啟動的T淋巴細胞增強分泌IL-2細胞因子作用。資料結果顯示，LAG-3人源化候選抗體Hu229-013，Hu303-005能夠不同程度增強啟動的T淋巴細胞分泌細胞因子IL-2，並且有藥物
濃度劑量效應。
第2圖：人源化抗LAG-3抗體對U-87 MG荷瘤小鼠腫瘤體積的影響。結果顯示，給藥14天後，LAG-3抗體Hu229-013 6mpk，Hu303-005 6mpk均有一定的抑瘤效果，抑瘤率分別為27.25%(p<0.05)及34.94%(p<0.01)；與對照組有顯著差異(p<0.001 vs hIGg)。
為了更容易理解本發明，以下具體定義了某些技術和科學術語。除非在本文中另有明確定義，本文使用的所有其它技術和科學術語都具有本發明所屬領域具有通常知識者通常理解的含義。
本發明所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。
術語“LAG-3”是指淋巴細胞活化基因3。術語“LAG-3”包含變體、同等型(isoform)、同源物、直系同源體(ortholog)及旁系同源體(paralog)。術語“人LAG-3”指人序列LAG-3，例如具有Uniprot號：P18627的人LAG-3的完整胺基酸序列。本領域中亦已知LAG-3，例如CD223。人LAG-3序列與Uniprot號：P18627的人LAG-3的不同之處可在於具有例如保守突變或在非保守區中的突變，且LAG-3與Uniprot號：P18627的人LAG-3具有實質上相同的生物功能。舉例而言，人LAG-3的生物功能是在LAG-3的胞外域中具有表位，該表位被本公開的抗體特異性結
合，或人LAG-3的生物功能是結合MHCII類分子。
特定人LAG-3序列在胺基酸序列中通常與Uniprot號：P18627的人LAG-3至少90%相同，且含有在與其他物種(例如鼠類)的LAG-3胺基酸序列相比時鑒別為人胺基酸序列的胺基酸殘基。在某些情形下，人LAG-3在胺基酸序列中可與Uniprot號：P18627的LAG-3至少85%或甚至至少95%、96%、97%、98%或99%相同。在某些實施方案中，人LAG-3序列較Uniprot號：P18627的LAG-3序列顯示不超過10個胺基酸差異。在某些實施方案中，人LAG-3可較Uniprot號：P18627的LAG-3序列顯示不超過5或甚至不超過4、3、2或1個胺基酸差異。可如本文所闡述的測定百分比同一性。
本發明所述的“序列同一性”表示當具有適當的替換、插入或缺失等突變的情況下最佳比對和比較時，兩個核酸或兩個胺基酸序列之間的同一性程度。本發明中所述的序列和其具有同一性的序列之間的序列同一性可以至少為85%、90%或95%，較佳係至少為95%。非限制性實施例包括85%，86%，87%，88%，89%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%，100%。
兩條序列之間的同一性百分比是由序列共用的相同位置數目標函數(即%同一性=相同位置數目/位元總數目乘以100)，考慮到缺口數目和每個缺口的長度，其需要被引入用於兩條序列的最佳比對。在兩個序列之間的序列比較和同一性百分比測定可以藉由National Center For
Biotechnology Institute網站上可得的BLASTN/BLASTP演算法的預設設置來進行。本發明所述的“抗體”指免疫球蛋白，是由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈藉由鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結構。免疫球蛋白重鏈恆定區的胺基酸組成和排列順序不同，故其抗原性也不同。據此，可將免疫球蛋白分為五類，或稱為免疫球蛋白的同種型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相應的重鏈分別為μ鏈、δ鏈、γ鏈、α鏈、和ε鏈。同一類Ig根據其鉸鏈區胺基酸組成和重鏈二硫鍵的數目和位置的差別，又可分為不同的亞類，如IgG可分為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。輕鏈藉由恆定區的不同分為κ鏈或λ鏈。五類Ig中每類Ig都可以有κ鏈或λ鏈。
在本發明中，本發明所述的抗體輕鏈可變區可進一步包含輕鏈恆定區，所述的輕鏈恆定區包含人源或鼠源的κ、λ鏈或其變體。
在本發明中，本發明所述的抗體重鏈可進一步包含重鏈恆定區，所述的重鏈恆定區包含人源或鼠源的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體。
抗體重鏈和輕鏈靠近N端的約110個胺基酸的序列變化很大，為可變區(Fv區)；靠近C端的其餘胺基酸序列相對穩定，為恆定區。可變區包括3個高變區(HVR)和4個序列相對保守的骨架區(FR)。3個高變區決定抗體的特異性，又稱為互補性決定區(CDR)。每條輕鏈可變區(LCVR)和重鏈可變區(HCVR)由3個CDR區4個FR區組成，從胺
基端到羧基端依次排列的順序為：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。輕鏈的3個CDR區指LCDR1、LCDR2、和LCDR3；重鏈的3個CDR區指HCDR1、HCDR2和HCDR3。本發明所述的抗體或抗原結合片段的LCVR區和HCVR區的CDR胺基酸殘基在數量和位置符合已知的Kabat編號規則(LCDR1-3，HCDE2-3)，或者符合kabat和chothia的編號規則(HCDR1)。
本發明的抗體包括鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體，較佳係人源化抗體。
術語“鼠源抗體”在本發明中為根據本領域知識和技能製備的抗人LAG-3的單株抗體。製備時用LAG-3抗原注射試驗對象，然後分離表現具有所需序列或功能特性的抗體的雜交瘤。在本發明一個較佳的實施方案中，所述的鼠源LAG-3抗體或其抗原結合片段，可進一步包含鼠源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區，或進一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3或其變體的重鏈恆定區。
術語“嵌合抗體(chimeric antibody)”，是將鼠源性抗體的可變區與人抗體的恆定區融合而成的抗體，可以減輕鼠源性抗體誘發的免疫反應。建立嵌合抗體，要先建立分泌鼠源性特異性單抗的雜交瘤，然後從鼠雜交瘤細胞中株可變區基因，再根據需要株人抗體的恆定區基因，將鼠可變區基因與人恆定區基因連接成嵌合基因後插入表現載體中，最後在真核系統或原核系統中表現嵌合抗體分子。在本發明一個較佳的實施方案中，所述的LAG-3嵌合抗體的
抗體輕鏈進一步包含人源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區。所述的LAG-3嵌合抗體的抗體重鏈進一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體的重鏈恆定區，較佳係包含人源IgG1、IgG2或IgG4重鏈恆定區，或者使用胺基酸突變(如YTE突變)的IgG1、IgG2或IgG4變體。
術語“人源化抗體(humanized antibody)”，也稱為CDR移植抗體(CDR-grafted antibody)，是指將鼠的CDR序列移植到人的抗體可變區框架，即不同類型的人種系抗體構架序列中產生的抗體。可以克服嵌合抗體由於攜帶大量鼠蛋白成分，從而誘導的異源性反應。此類構架序列可以從包括種系抗體基因序列的公共DNA數據庫或公開的參考文獻獲得。如人重鏈和輕鏈可變區基因的種系DNA序列可以在“VBase”人種系序列數據庫(在因特網www.mrccpe.com.ac.uk/vbase可獲得)，以及在Kabat，E.A.等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版中找到。為避免免疫原性下降的同時，引起的活性下降，可對所述的人抗體可變區框架序列進行最少反向突變或回復突變，以保持活性。本發明的人源化抗體也包括進一步由噬菌體展示對CDR進行親和力成熟後的人源化抗體。在本發明一個較佳的實施方案中，所述的LAG-3人源化抗體中鼠的CDR序列選自SEQ ID NO：9-20；人的抗體可變區框架經過設計選擇，其中所述抗體重鏈可變區上的重鏈FR區序列，來源於人種系重鏈IGKV1-39*01和hjk4.1的組合序列；其中所述抗體輕鏈可變區上的輕鏈
FR區序列，來源於人種系重鏈IGHV3-23*04和hjh6.1的組合序列。為避免免疫原性下降的同時，引起的活性下降，可對所述的人抗體可變區可進行最少反向突變，以保持活性。
CDR的移植可由於與抗原接蝕的構架殘基而導致產生的LAG-3抗體或其抗原結合片段對抗原的親和力減弱。此類相互作用可以是體細胞高度突變的結果。因此，可能仍然需要將此類供體構架胺基酸移植至人源化抗體的構架。來自非人LAG-3抗體或其抗原結合片段的參與抗原結合的胺基酸殘基可藉由檢查鼠單株抗體可變區序列和結構來鑑定。CDR供體構架中與種系不同的的各殘基可被認為是相關的。如果不能確定最接近的種系，那麼可將序列與亞型共有序列或具有高相似性百分比的鼠序列的共有序列相比較。稀有構架殘基被認為可能是體細胞高度突變的結果，從而在結合中起著重要作用。
術語抗體的“抗原結合片段”(或簡稱“抗體片段”)是指抗體的保持特異性結合抗原(例如，LAG-3)的能力的一個或多個片段。已顯示可利用全長抗體的片段來進行抗體的抗原結合功能。術語抗體的“抗原結合片段”中包含的結合片段的實例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1結構域組成的單價片段；(ii)F(ab')2片段，包含藉由鉸鏈區上的二硫橋連接的兩個Fab片段的二價片段，(iii)由VH和CH1結構域組成的Fd片段；(iv)由抗體的單臂的VH和VL結構域組成的Fv片段；(v)單結構域或dAb片
段(Ward等人,(1989)Nature341：544-546)，其由VH結構域組成；和(vi)分離的互補決定區(CDR)或(vii)可視需要地藉由合成的接頭連接的兩個或更多個分離的CDR的組合。此外，雖然Fv片段的兩個結構域VL和VH由分開的基因編碼，但可使用重組方法，藉由合成的接頭連接它們，從而使得其能够產生為其中VL和VH區配對形成單價分子的單個蛋白質鏈(稱為單鏈Fv(scFv)；參見，例如，Bird等人(1988)Science 242：423-426和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA 85：5879-5883)。此類單鏈抗體也意欲包括在術語抗體的“抗原結合片段”中。使用本領域具有通常知識者已知的常規技術獲得此類抗體片段，並且以與對於完整抗體的方式相同的方式就功用性筛選片段。可藉由重組DNA技術或藉由酶促或化学斷裂完整免疫球蛋白來產生抗原結合部分。抗體可以是不同同種型的抗體，例如，IgG(例如，IgG1,IgG2,IgG3或IgG4亞型)，IgA1,IgA2,IgD,IgE或IgM抗體。
術語“單鏈抗體”、“單鏈Fv”或“scFv”意指包含藉由接頭連接的抗體重鏈可變結構域(或區域；VH)和抗體輕鏈可變結構域(或區域；VL)的分子。此類scFv分子可具有一般結構：NH2-VL-接頭-VH-COOH或NH2-VH-接頭-VL-COOH。合適的現有技術接頭由重復的GGGGS胺基酸序列或其變體組成，例如使用1-4個重復的變體(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6444-6448)。可用於本發明的其他接頭由Alfthan等人(1995)，Protein
Eng.8：725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immuno 1.31：94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56：3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293：41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。
術語“CDR”是指抗體的可變結構域內主要促成抗原結合的6個高變區之一。所述6個CDR的最常用的定義之一由Kabat E.A.等人，(1991)Sequences of proteins of immunological interest.NIH Publication91-3242)提供。如本文中使用的，CDR的Kabat定義只應用於輕鏈可變結構域的CDR1、CDR2和CDR3(LCDR1、LCDR2、LCDR3或L1、L2、L3)，以及重鏈可變結構域的CDR2和CDR3(HCDR2、HCDR3或H2、H3)。
本文中使用的術語“抗體構架”，是指可變結構域VL或VH的一部分，其用作該可變結構域的抗原結合環(CDR)的支架。從本質上講，其是不具有CDR的可變結構域。
術語“表位”或“抗原決定簇”是指抗原上免疫球蛋白或抗體特異性結合的部位(例如，LAG-3分子上的特定部位)。表位通常以獨特的空間構象包括至少3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15個連續或非連續的胺基酸。參見，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular B iology，第66卷，G.E.Morris，Ed.(1996)。
術語“特異性結合”、“選擇性結合”、“選擇性地結合”和“特異性地結合”是指抗體對預先確定的抗原上的表位的結合。通常，抗體以大約小於10-7M，例如大約小
於10-8M、10-9M或10-10M或更小的親和力(KD)結合。
術語“競争結合”是指與本發明的單株抗體識別人LAG-3的胞外區上的相同表位(也稱為抗原決定簇)或相同表位的一部分並與所述抗原結合的抗體。與本發明的單株抗體結合相同表位的抗體是指識別並結合於本發明的單株抗體所識別的人LAG-3的胺基酸序列的抗體。
術語"KD"或“Kd”是指特定抗體-抗原相互作用的解離平衡常數。通常，本發明的抗體以小於大約10-7M，例如小於大約10-8M、10-9M或10-10M或更小的解離平衡常數(KD)結合LAG-3，例如，如使用表面等離子體共振(SPR)技術在BIACORE儀中測定的。
本文中使用的術語“核酸分子”是指DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是單鏈或双鏈的，但較佳是双鏈DNA。當將核酸與另一個核酸序列置於功能關係中時，核酸是“有效連接的”。例如，如果啟動子或增强子影響編碼序列的轉錄，那麼啟動子或增强子有效地連接至所述編碼序列。
術語“載體”是指能够運輸已與其連接的另一個核酸的核酸分子。在一個實施方案中，載體是“質體”，其是指可將另外的DNA區段連接至其中的環狀双鏈DNA環。在另一個實施方案中，載體是病毒載體，其中可將另外的DNA區段連接至病毒基因組中。本文中公開的載體能够在已引入它們的宿主細胞中自主複製(例如，具有細菌的複製起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)或可在引入宿主
細胞後整合入宿主細胞的基因組，從而隨宿主基因組一起複製(例如，非附加型哺乳動物載體)。
現有技術中熟知生產和純化抗體和抗原結合片段的方法，如冷泉港的抗體實驗技術指南，5-8章和15章。例如，鼠可以用人LAG-3或其片段免疫，所得到的抗體能被覆性、純化，並且可以用一般的方法進行胺基酸測序。抗原結合片段同樣可以用一般方法製備。發明所述的抗體或抗原結合片段用基因工程方法在非人源的CDR區加上一個或多個人源FR區。人FR種系序列可以藉由比對IMGT人類抗體可變區種系基因資料庫和MOE軟體，從ImMunoGeneTics(IMGT)的網站http：//imgt.cines.fr得到，或者從免疫球蛋白雜誌，2001ISBN012441351上獲得。
術語“宿主細胞”是指已向其中引入了表現載體的細胞。宿主細胞可包括細菌、微生物、植物或動物細胞。易於轉化的細菌包括腸桿菌科(enterobacteriaceae)的成員，例如大腸桿菌(Escherichia coli)或沙門氏菌(Salmonella)的菌株；芽孢桿菌科(Bacillaceae)例如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)；肺炎球菌(Pneumococcus)；鏈球菌(Streptococcus)和流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)。適當的微生物包括釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和畢赤酵母(Pichia pastoris)。適當的動物宿主細胞株包括CHO(中國倉鼠卵巢細胞株)和NS0細胞。
本發明工程化的抗體或抗原結合片段可用一般方法製備和純化。比如，編碼重鏈和輕鏈的cDNA序列，可以選
殖並重組至GS表現載體。重組的免疫球蛋白表現載體可以穩定地轉染CHO細胞。作為一種更推薦的現有技術，哺乳動物類表現系統會導致抗體的糖基化，特別是在Fc區的高度保守N端位點。藉由表現與人LAG-3特異性結合的抗體得到穩定的選殖株。陽性的選殖株在生物反應器的無血清培養基中擴大培養以生產抗體。分泌了抗體的培養液可以用一般技術純化。比如，用含調整過的緩衝液的A或GSepharose FF管柱進行純化。洗去非特異性結合的組分。再用PH梯度法沖提結合的抗體，用SDS-PAGE檢測抗體片段，收集。抗體可用一般方法進行過濾濃縮。可溶的混合物和多聚體，也可以用一般方法去除，比如分子篩、離子交換。得到的產物需立即冷凍，如-70℃，或者凍乾。
“給予”和“處理”當應用於動物、人、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物流體時，是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組成物與動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體的接觸。“給予”和“處理”可以指例如治療、藥物代謝動力學、診斷、研究和實驗方法。細胞的處理包括試劑與細胞的接觸，以及試劑與流體的接觸，其中所述流體與細胞接觸。“給予”和“處理”還意指藉由試劑、診斷、結合組成物或藉由另一種細胞體外和離體處理例如細胞。“處理”當應用於人、獸醫學或研究受試者時，是指治療處理、預防或預防性措施，研究和診斷應用。
“治療”意指給予患者內用或外用治療劑，例如包含
本發明的任一種結合化合物的組成物，所述患者具有一種或多種疾病症狀，而已知所述治療劑對這些症狀具有治療作用。通常，在受治療患者或群體中以有效緩解一種或多種疾病症狀的量給予治療劑，以誘導這類症狀退化或抑制這類症狀發展到任何臨床右測量的程度。有效緩解任何具體疾病症狀的治療劑的量(也稱作“治療有效量”)可根據多種因素變化，例如患者的疾病狀態、年齡和體重，以及藥物在患者產生需要療效的能力。藉由醫生或其它專業衛生保健人士通常用於評價該症狀的嚴重性或進展狀況的任何臨床檢測方法，可評價疾病症狀是否已被減輕。儘管本發明的實施方案(例如治療方法或製品)在緩解每個目標疾病症狀方面可能無效，但是根據本領域已知的任何統計學檢驗方法如Studentt檢驗、卡方檢驗、依據Mann和Whitney的U檢驗、Kruskal-Wallis檢驗(H檢驗)、Jonckheere-Terpstra核對總和Wilcoxon檢驗確定，其在統計學顯著數目標患者中應當減輕目標疾病症狀。
“保守修飾”或“保守置換或取代”是指具有類似特徵(例如電荷、側鏈大小、疏水性/親水性、主鏈構象和剛性等)的其它胺基酸置換蛋白中的胺基酸，使得可頻繁進行改變而不改變蛋白的生物學活性。本領域具有通常知識者知曉，一般而言，多肽的非必需區域中的單個胺基酸置換基本上不改變生物學活性(參見例如Watson等(1987)Molecular Biology of the Gene,The Benjamin/Cummings Pub.Co.,第224頁，(第4版))。另外，結構或功能類似的胺基
酸的置換不大可能破壞生物學活性。
“有效量”包含足以改善或預防醫學疾病的症狀或病症的量。有效量還意指足以允許或促進診斷的量。用於特定患者或獸醫學受試者的有效量可依據以下因素而變化：例如，待治療的病症、患者的總體健康情況、給藥的方法途徑和劑量以及副作用嚴重性。有效量可以是避免顯著副作用或毒性作用的最大劑量或給藥方案。
“外源性”指根據情況在生物、細胞或人體外產生的物質。“內源性”指根據情況在細胞、生物或人體內產生的物質。
“同源性”是指兩個多核苷酸序列之間或兩個多肽之間的序列相似性。當兩個比較序列中的位置均被相同鹼基或胺基酸單體亞基佔據時，例如如果兩個DNA分子的每一個位置都被腺嘌呤佔據時，那麼所述分子在該位置是同源的。兩個序列之間的同源性百分率是兩個序列共有的匹配或同源位置數除以比較的位置數×100的函數。例如，在序列最佳比對時，如果兩個序列中的10個位置有6個匹配或同源，那麼兩個序列為60%同源；如果兩個序列中的100個位置有95個匹配或同源，那麼兩個序列為95%同源。一般而言，當比對兩個序列而得到最大的同源性百分率時進行比較。
本文使用的表述“細胞”、“細胞株”和“細胞培養物”可互換使用，並且所有這類名稱都包括後代。因此，單詞“轉化體”和“轉化細胞”包括原代受試細胞和由其
衍生的培養物，而不考慮轉移數目。還應當理解的是，由於故意或非有意的突變，所有後代在DNA含量方面不可能精確相同。包括具有與最初轉化細胞中篩選的相同的功能或生物學活性的突變後代。在意指不同名稱的情況下，其由上下文清楚可見。
本文使用的“聚合酶鏈式反應”或“PCR”是指其中微量的特定部分的核酸、RNA和/或DNA如在例如美國專利號4,683,195中所述擴增的程式或技術。一般來說，需要獲得來自目標地區域末端或之外的序列資訊，使得可以設計寡核苷酸引子；這些引子在序列方面與待擴增範本的對應鏈相同或相似。2個引子的5’末端核苷酸可以與待擴增材料的末端一致。PCR可用於擴增特定的RNA序列、來自總基因組DNA的特定DNA序列和由總細胞RNA轉錄的cDNA、噬菌體或質體序列等。一般參見Mullis等(1987)Cold Spring Harbor Symp.Ouant.Biol.51：263；Erlich編輯，(1989)PCR TECHNOLOGY(Stockton Press,N.Y.)。本文使用的PCR被視為用於擴增核酸測試樣品的核酸聚合酶反應法的一個實例，但不是唯一的實例，所述方法包括使用作為引子的已知核酸和核酸聚合酶，以擴增或產生核酸的特定部分。
“視需要”或“視需要地”意味著隨後所描述地事件或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生的場合。例如，“視需要包含1-3個抗體重鏈可變區”意味著特定序列的抗體重鏈可變區可以但不必須存在。
“藥物組成物”表示含有一種或多種本文所述化合物或其生理學上/可藥用的鹽或前驅藥物與其他化學組分的混合物，所述其他組分例如生理學/可藥用的載體和賦形劑。藥物組成物的目標是促進對生物體的給藥，利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。
以下結合實施例進一步描述本發明，但這些實施例並非限制著本發明的範圍。本發明實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照一般條件，如冷泉港的抗體技術實驗手冊，分子選殖手冊；或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。未註明具體來源的試劑，為市場購買的一般試劑。
1、蛋白設計及表現
以UniProt Lymphocyte activation gene 3 protein(人LAG-3，Uniprot號：P18627)作為本發明LAG-3的範本，設計本發明涉及的抗原及檢測用蛋白的胺基酸序列，可選的在LAG-3蛋白基礎上融合不同的標籤，分別選殖到pHr載體上(自產)或pTT5載體上(Biovector，Cat#：102762)或pTargeT載體上(promega,A1410)，在293細胞瞬轉表現或CHO-S穩定表現純化，獲得編碼本發明抗原及檢測用蛋白。以下LAG-3抗原未特殊說明的均指人LAG-3。
帶Flag標籤的LAG-3胞外區：LAG-3-Flag，用於免疫小鼠
SEQ ID NO：1
注釋：劃橫線部分為信號肽，斜體部分為Flag-tag標籤。
注釋：信號肽+胞外區+
+胞內區
注釋：劃橫線部分為信號肽，雙劃線部分為linker，斜體部分為Fc。
注釋：劃橫線部分為信號肽，雙劃線部分為linker，斜體部分為rnFc。
1)帶Flag標籤的LAG-3-Flag重組蛋白的純化步驟：將樣品高速離心去除雜質，並濃縮至適當體積。利用0.5×PBS平衡flag親和管柱，沖洗2-5倍管柱體積。將除雜後的細胞表現上清樣品上管柱。用0.5×PBS沖洗管柱，至A280讀數降至基線。用PBS沖洗管柱，沖洗雜蛋白，並收集。用100mM甘胺酸，pH 3.0.沖提目標蛋白，並收集，以備後續體外啟動和進一步純化。
2)雜交瘤，重組抗體，Fc融合蛋白的純化將細胞表現上清樣品高速離心去除雜質，雜交瘤表現上清用Protein G管柱，重組抗體、Fc融合蛋白表現上清用Protein A管柱進行純化。用PBS沖洗管柱，至A280讀數降至基線。用100mM乙酸pH3.0沖提目標蛋白，用1M Tris-HCl,pH8.0中和。沖提樣品適當濃縮後利用PBS平衡好的凝膠層析Superdex200(GE)進一步純化，去聚體的峰收集好後分裝備用。
1．免疫
抗人LAG-3單株抗體藉由免疫小鼠產生。實驗用SJL白小鼠，雌性，6週齡(北京維通利華實驗動物技術有限
公司，動物生產許可證號：SCXK(京)2012-0001)。飼養環境：SPF級。小鼠購進後，實驗室環境飼養1週，12/12小時光/暗週期調節，溫度20-25℃；濕度40-60%。將已適應環境的小鼠按以下方案免疫。免疫抗原為帶Flag標籤的人LAG-3胞外區(SEQ ID NO：1)。
免疫方案A：用TiterMax® Gold Adjuvant(Sigma Cat No.T2684)與Thermo Imject® Alum(Thermo Cat No.77161)交叉免疫。抗原與佐劑(TiterMax® Gold Adjuvant)比例為1：1，抗原與佐劑(Thermo Imject® Alum)比例為3：1，50μg/隻/次(首免)，25μg/隻/次(加強免疫)。抗原乳化後進行接種，時間為第0、7、14、21、28、35、42天。第0天皮下(SC)多點注射50μg/隻的乳化後抗原。第7天腹膜內(IP)注射25μg/隻。第14、28、35、42天根據背部結塊和腹部腫脹情況，選擇背部或腹膜內注射抗原。於第21，35，49天取血，用ELISA方法確定小鼠血清中的抗體滴度。在7免以後，選擇血清中抗體滴度高並且滴度趨於平臺的小鼠進行脾細胞融合。在進行脾細胞融合前3天加強免疫，腹膜內(IP)注射50μg/隻的生理鹽水配製的抗原溶液。
免疫方案B：用QuickAntibody-Mouse5W(KX0210041)對小鼠進行免疫。抗原與佐劑比例為1：1，25μg/隻/次(首免/加強免疫)。抗原與佐劑迅速充分混勻後接種，時間為第0、21、35天。第0天小鼠後小腿肌肉(IM)注射25μg/隻的抗原。第21，35天按同樣方式注射25μg/隻(根據滴度決定第3免是否進行)。於第28，42天取血，用ELISA
方法確定小鼠血清中的抗體滴度。選擇血清中抗體滴度高並且滴度趨於平臺的小鼠進行脾細胞融合。在進行脾細胞融合前3天加強免疫，腹膜內(IP)注射50μg/隻的生理鹽水配製的抗原溶液。
2．脾細胞融合
採用優化的PEG介導的融合步驟將脾淋巴細胞與骨髓瘤細胞Sp2/0細胞(ATCC® CRL-8287TM)進行融合得到雜交瘤細胞。融合好的雜交瘤細胞以0.5-1×106/ml的密度用完全培養基(含20% FBS、1×HAT、1×OPI的DMEM培養基)重新懸浮，100μl/孔種於96孔板中，37℃，5% CO2培育3-4天後，補充HAT完全培養基100μl/孔，繼續培養3-4天至形成針尖般選殖株。去除上清，加入200μl/well的HT完全培養基(含20%FBS、1×HT和1×OPI的RPMI-1640培養基)，37℃，5% CO2培養3天後進行ELISA檢測。
3．雜交瘤細胞篩選
根據雜交瘤細胞生長密度，用結合ELISA方法進行雜交瘤培養上清檢測(見測試例1)。並將結合ELISA檢測的陽性孔細胞上清進行細胞阻斷實驗(見測試例3)。結合和阻斷均為陽性的孔細胞及時進行擴增凍存保種和二到三次亞選殖直至獲得單細胞選殖株。
每次亞選殖細胞均需進行LAG-3結合ELISA、細胞阻斷實驗檢測(見測試例1和測試例3)。藉由以上實驗篩選得到雜交瘤選殖株，用無血清細胞培養法進一步製備抗體，按純化實例純化抗體，供在檢測例中使用。
4．雜交瘤陽性選殖株序列測定
從陽性雜交瘤中選殖株序列過程如下。收集對數生長期雜交瘤細胞，用Trizol(Invitrogen,Cat No.15596-018)按照試劑盒說明書步驟提取RNA，用PrimeScriptTM Reverse Transcriptase試劑盒反轉錄(Takara,Cat No.2680A)。將反轉錄得到的cDNA採用mouse Ig-Primer Set(Novagen,TB326 Rev.B 0503)進行PCR擴增後送測序公司測序。得到的雜交瘤選殖株mAb229和mAb303的重鏈、輕鏈的DNA序列對應的胺基酸序列SEQ ID NO：5、6和SEQ ID NO：7、8所示：mAb229-VH
SEQ ID NO：5
mAb229-VL
SEQ ID NO：6
mAb303-VH
EINSLTSEDSAVYYCTRDDGYYDYYFDVWGTGTTVTVSS SEQ ID NO：7
mAb303-VL
SEQ ID NO：8
對得到的陽性選殖株進行結合人LAG-3的ELISA實驗(測試例1，結果見表2中蛋白水平結合活性EC50值)、結合人LAG-3過表現CHO-s細胞的ELISA實驗(測試例2，結果見表2中細胞水平結合活性EC50值)和阻斷LAG-3抗原與Daudi細胞結合實驗(測試例3，結果見表2中阻斷活性
EC50值)，並檢測其與人LAG-3蛋白的親和力(見測試例4，結果見表3)。
表2資料顯示LAG-3抗體mAb229和mAb303與人LAG-3蛋白均有很好的結合活性。LAG-3抗體mAb229和mAb303與過表現人LAG-3全長蛋白的CHO-S細胞均有很好的結合活性。LAG-3抗體mAb229和mAb303均可顯著阻斷人LAG-3抗原與Daudi細胞的結合。
表3資料表明，本發明LAG-3抗體mAb229和mAb303對人LAG-3蛋白有較強的結合活性和親和力。
藉由比對IMGT人類抗體重輕鏈可變區種系基因資料庫和MOE軟體，分別挑選與mAb229同源性高的重鏈和輕鏈可變區種系基因作為範本，將鼠源抗體的CDR分別移植到相應的人源範本中，形成次序為
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的可變區序列。其中胺基酸殘基由Kabat編號系統確定並注釋。
鼠源抗體mAb229的人源化輕鏈範本為IGKV1-39*01和hjk4.1，人源化重鏈範本為IGHV7-4-1*02和hjh6.1，人源化可變區序列如下：Hu229VH-CDR graft
SEQ ID NO：21
Hu229VL-CDR graft
SEQ ID NO：22
註：順序為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，序列中斜體為FR序列，底線為CDR序列。
mAb229人源化具體序列如下：Hu229VH.1(同Hu229VH-CDR graft)
SS SEQ ID NO：21
Hu229VH.1A
SEQ ID NO：23
Hu229VH.1B
SEQ ID NO：24
Hu229VH.1C
SEQ ID NO：25
Hu229VL.1(同Hu229VL-CDR graft)
SEQ ID NO：22
Hu229VL.1A
SEQ ID NO：26
Hu229VL.1B
SEQ ID NO：27
Hu229VL.1C
SEQ ID NO：28
藉由比對IMGT人類抗體重輕鏈可變區種系基因資料庫和MOE軟體，分別挑選與mAb303同源性高的重鏈和輕鏈可變區種系基因作為範本，將鼠源抗體的CDR分別移植到相應的人源範本中，形成次序為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的可變區序列。其中胺基酸殘基由Kabat編號系統確定並註釋。
鼠源抗體mAb303的人源化輕鏈範本為IGKV1-39*01和hjk4.1，人源化重鏈範本為IGHV1-3*01和hjh6.1，人源化可變區序列如下：Hu303VH-CDR graft
SEQ ID NO：29
Hu303VL-CDR graft
SEQ ID NO：30
註：順序為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，序列中斜體為FR序列，底線為CDR序列。
各突變序列組合如下：
mAb303人源化具體序列如下：Hu303_VH.1(同Hu303VH-CDR graft)
SEQ ID NO：29
Hu303_VH.1A
SEQ ID NO：31
Hu303_VH.1B
SEQ ID NO：32
Hu303_VH.1C
SEQ ID NO：33
Hu303_VL.1(同Hu303VL-CDR graft)
SEQ ID NO：30
Hu303_VL.1A
SEQ ID NO：34
Hu303_VL.1B
SEQ ID NO：35
Hu303_VL.1C
SEQ ID NO：36
Hu303_VL.1D
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTLTCRASQDIGSRLNWLQQKPGG
AFKRLIYATSTLDSGVPKRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFADYYCLQLASSPPTFGGGTKVEIK SEQ ID NO：37
抗體選用人重鏈IgG4/輕鏈kappa的恆定區與各可變區組合，在Fc段做了S228P突變來增加IgG4抗體的穩定性，也可選用本領域其它已知的突變來增加其性能。
重鏈恆定區：
SEQ ID NO：38
輕鏈恆定區：
SEQ ID NO：39
1.重組抗體的分子選殖株
雜交瘤篩選所獲得的陽性抗體分子經過測序後，得到可變區編碼基因序列。以測序所得序列設計首尾引子，以
測序基因為範本，經過PCR搭建各抗體VH/VK基因片段，再與表現載體pHr(帶信號肽及hIgG4/hkappa恆定區基因(CH1-FC/CL)片段)進行同源重組，構建重組抗體全長表現質體VH-CH1-FC-pHr/VL-CL-pHr。
2.人源化抗體的分子選殖株
人源設計之後的抗體序列，經過密碼子優化後產生人密碼子偏好的編碼基因序列，設計引子PCR搭建各抗體VH/VK基因片段，再與表現載體pHr(帶信號肽及hIgG4/hkappa恆定區基因(CH1-FC/CL)片段)進行同源重組,構建人源化抗體全長表現質體VH-CH1-FC-pHr/VL-CL-pHr。
3.重組以及人源化抗體的表現與純化
分別表現抗體輕重鏈的質體以1：1.2的比例轉染HEK293E細胞，6天後收集表現上清，高速離心去除雜質，用Protein A管柱進行純化。用PBS沖洗管柱，至A280讀數降至基線。用pH3.0-pH3.5的酸性沖提液沖提目標蛋白，用1M Tris-HCl,pH8.0-9.0中和。沖提樣品適當濃縮後，利用PBS平衡好的凝膠層析Superdex200(GE)進一步純化，以去除聚體，收集單體峰，分裝備用。
以下用生化測試方法驗證本發明抗體性能及有益效果。
抗LAG-3抗體的結合力藉由抗體與human LAG-3蛋白
的ELISA實驗來檢測。用帶Fc或mFc標籤的LAG-3融合蛋白藉由與包被在酶標板中的抗Fc或mFc抗體結合從而固定到96孔酶標板中，抗體加入後信號的強弱被用於判斷抗體和LAG-3的結合活性，具體實驗方法如下。
用pH7.4的PBS(Sigma，Cat No.P4417-100TAB)緩衝液將羊抗人Fc抗體(Jackson Immuno Research，Cat No.109-005-008)或羊抗鼠Fc抗體(Sigma，Cat No.M3534-1ML)稀釋至2μg/ml濃度，以50μl/孔的體積加入96孔酶標板中，於37℃培育箱中放置2小時。棄去液體後，加入用PBS稀釋的5%脫脂牛奶(光明脫脂奶粉)封閉液200μl/孔，37℃培育箱培育2.5小時或4℃放置過夜(16-18小時)進行封閉。封閉結束後，棄去封閉液，並用PBST緩衝液(PH7.4 PBS含0.05% tweeen-20)洗板5次後，加入50μl/孔用樣品稀釋液(PH7.4 PBS含1%BSA)稀釋至1ug/ml的LAG-3-Fc融合蛋白(內部生產，SEQ ID NO：3)或LAG-3-mFc融合蛋白(內部生產，SEQ ID NO：4)，置37℃培育箱培育1小時或4℃放置過夜。培育結束後，棄去酶標板中的反應液，用PBST洗板6次後，加入50μl/孔用樣品稀釋液稀釋的不同濃度待測抗體(雜交瘤純化抗體或人源化抗體)，放於37℃培育箱培育1小時。培育結束後用PBST洗板5次，加入100μl/孔用樣品稀釋液稀釋的HRP標記的羊抗鼠二抗(Jackson Immuno Research，Cat No.115-035-003)或羊抗人二抗(Jackson Immuno Research，Cat No.109-035-003)，37℃培育1小時。用PBST洗板6次後，加入50μl/孔TMB顯色底物
(KPL，Cat No.52-00-03)，於室溫培育5-15min，加入50μl/孔1M H2SO4終止反應，用NOVOStar酶標儀在波長450nm處讀取吸收值，計算LAG-3抗體對人LAG-3的結合EC50值。結果如表8所示，資料表明，本發明篩選得到的人源化抗體與人LAG-3蛋白均有較高的結合活性。
抗LAG-3抗體的結合力藉由抗體與過表現LAG-3蛋白的CHO-S細胞的結合實驗來檢測。藉由電轉染的方法將LAG-3全長質體(內部生產，SEQ ID NO：2)轉染進CHO-S細胞中後加壓篩選兩週後，檢測LAG-3的表現量。將過表現細胞固定於96孔板底後，抗體加入後信號的強弱被用於判斷抗體和LAG-3過表現CHO-S細胞的結合活性，具體實驗方法如下。
將細胞以4×105/ml密度，100μl/孔接種於96孔板中過夜培養。棄上清，用PBS洗三遍後，加入100μl/孔4% PFA室溫固定半小時，PBS洗三遍。棄去液體後，加入用PBS稀釋的5%脫脂牛奶(光明脫脂奶粉)封閉液200μl/孔，37℃培育箱培育2.5小時進行封閉。封閉結束後，棄去封閉液，並用PBST緩衝液(PH7.4 PBS含0.05% tweeen-20)洗板5次後，加入50μl/孔用樣品稀釋液稀釋的不同濃度待測抗體(雜交瘤純化抗體或人源化抗體)，放於37℃培育箱培育1小時。培育結束後用PBST洗板5次，加入100μl/孔用樣品稀釋液稀釋的HRP標記的羊抗鼠二抗(Jackson Immuno Research，Cat No.115-035-003)或羊抗人二抗(Jackson Immuno Research，Cat No.109-035-003)，37℃培育1小時。用PBST洗板6次後，加入50μl/孔TMB顯色底物(KPL，Cat No.52-00-03)，於室溫培育5-15min，加入50μl/孔1M H2SO4終止反應，用NOVOStar酶標儀在波長
450nm處讀取吸收值，計算LAG-3抗體對LAG-3過表現CHO-S細胞的結合EC50值。
Daudi細胞(人白血病細胞，購自中科院細胞庫)以3×105/孔的數量接種於96孔培養板中，1000轉離心後棄上清，加入4%PFA室溫固定30分鐘。棄去固定液後用PBS緩衝液洗4遍，加入用PBS稀釋的5%脫脂牛奶(光明脫脂奶粉)封閉液200μl/孔，37℃培育箱培育2.5小時進行封閉。封閉結束後，棄去封閉液，並用PBST緩衝液(PH7.4 PBS含0.05% tweeen-20)洗板5次後，加入50μl/孔用樣品稀釋液(PH7.4 PBS含1%BSA)稀釋的已預混合培育1小時的終濃度為0.4μg/ml的生物素(生物素標記試劑盒，東仁化學，Cat No.LK03)標記的LAG-3-Fc融合蛋白(內部生產，SEQ ID NO：3)和梯度濃度的待測抗體的混合液，置37℃培育箱培育1小時。培育結束後，棄去酶標板中的反應液，用PBST洗板5次後，加入50μl/孔用樣品稀釋液稀釋HRP標記的鏈黴親和素(Sigma，Cat No.S2438)，37℃培育1小時。用PBST洗板5次後，加入50μl/孔TMB顯色底物(KPL，Cat No.52-00-03)，於室溫培育5-15min，加入50μl/孔1M H2SO4終止反應，用NOVOStar酶標儀在波長450nm處讀取吸收值，計算LAG-3抗體對抗原與daudi細胞結合的阻斷作用。結果如表9所示，資料表明，本發明篩選得到的人源化抗體均可顯著阻斷人LAG-3抗原與Daudi細胞的結合。
1、按照鼠抗捕獲試劑盒(Cat.# BR-1008-38，GE)說明書中所述的方法將鼠抗捕獲抗體共價偶聯於CM5生物傳感晶片(Cat.# BR-1000-12，GE)上，從而親和捕獲待測抗體，然後於晶片表面流經LAG-3-Flag(內部生產，SEQ ID NO：1)抗原，利用Biacore儀器即時檢測反應信號從而獲得結合和解離曲線，藉由擬合得到親和力數值，見上表2。在實驗中每個循環解離完成後，用鼠抗捕獲試劑盒裡配置的再生溶液將生物晶片洗淨再生。結果表明，LAG-3抗體mAb229和mAb303對人LAG-3蛋白有較強的結合活性和親和力。
2、按照人抗捕獲試劑盒(Cat.# BR-1008-39，GE)說明書中所述的方法將人抗捕獲抗體共價偶聯於CM5生物傳感晶片(Cat.# BR-1000-12，GE)上，從而親和捕獲待測抗體，然後於晶片表面流經LAG-3-Flag(內部生產，SEQ ID NO：1)抗原，利用Biacore儀器即時檢測反應信號從而獲得結合和解離曲線，藉由擬合得到親和力數值，見下表10。在實驗中每個循環解離完成後，用人抗捕獲試劑盒裡配置的再生溶液將生物晶片洗淨再生。結果表明，本發明篩選得到的人源化抗體對人LAG-3蛋白有較強的結合活性和親和力。
為了研究LAG-3抗體對T淋巴細胞啟動，收集和純化人外周血單核細胞(PBMC)，採用超抗原金黃色葡萄球菌腸毒素B(SEB)體外刺激72小時，檢測IL-2細胞因子的分泌水平。實驗過程簡單描述如下：新鮮分離純化的PBMC，接種至96孔細胞培養板，細胞密度約為1×105/孔，加入100ng/mL SEB超抗原刺激，同時加入梯度稀釋的抗體樣品(用培養基稀釋)或培養基作為空白對照。37℃，5% CO2培養箱培養72h後，收集細胞
培養上清。採用ELISA(BD,CAT# 550611)方法檢測細胞培養上清內IL-2分泌水平。具體操作參考試劑說明書。結果如第1圖所示，LAG-3人源化候選抗體Hu229-013，Hu303-005能夠不同程度增強啟動的T淋巴細胞分泌細胞因子IL-2,並且有藥物濃度劑量效應。
本實驗用於人源化抗LAG-3抗體對U-87 MG荷瘤小鼠腫瘤體積的影響。
將人腦膠質瘤U-87 MG細胞(3.5×106個)100μl接種於NOD-SCID(購自常州卡文斯實驗動物有限公司)小鼠右肋部皮下，待10-14 d腫瘤長至約40mm3後，去除體重、腫瘤過大和過小的，按腫瘤體積將小鼠隨機分為對照組Isotype matched hIgG，LAG-3人源化候選抗體Hu229-013組，Hu303-005組共3組(分組及劑量見表1)，每組8隻(D0)。將經CD3抗體刺激的PBMC以5×105cells/60μl量注射到腫瘤組織中，並開始腹腔注射抗體，一週三次，共給藥6次。每週測2次瘤體積，記錄資料。腫瘤體積(V)計算公式為：腫瘤體積(TV)=1/2×L長×L短 2
各組動物腫瘤體積均用平均值±標準差(Mean±SEM)表示，並用Graphpad Prism 5軟體作圖，使用two way ANOVA統計分析，並計算抑瘤率，公式為：腫瘤增殖率(T/C %)=(T-T0/C-C0)×100%
抑瘤率%TGI=1-T/C %
實驗結果如表11及第2圖所示，給藥14天後，LAG-3抗體Hu229-013 6mpk，Hu303-005 6mpk均有一定的抑瘤效果，抑瘤率分別為27.25%(p<0.05)及34.94%(p<0.01)；與對照組有顯著差異(p<0.001 vs hIGg)。
ICR小鼠18隻，雄性，體重18-22g，購自西普爾-必凱實驗動物有限公司。飼養期間自由攝取飼料和水，實驗室環境適應性飼養不小於3天，12/12小時光/暗週期調節，溫度16-26℃，相對濕度40-70%。實驗開始前一天，對ICR小鼠進行編號，隨機分組，每組各3隻。實驗當天，兩組小鼠分別靜脈注射人源化候選抗體(Hu229-013)，給藥劑量為3mg/kg和10mg/kg；兩組每隻小鼠分別靜脈注射人源化候選抗體(Hu303-005)，給藥劑量為3mg/kg和10mg/kg。靜
脈注射體積為20ml/kg。
給藥後採血時間點為15min,8h,1 d,2 d,4 d,7 d,10 d,14 d,21 d,28 d,35 d。每次約取全血0.1ml，不加抗凝劑，取血後在4℃放置30min，1000g離心15min，取上清置於EP管中，-80℃保存。
用ELISA方法檢測血清中的血藥濃度，用Winnolin軟體來計算受試藥物的T1/2及其主要參數。所得主要藥動學參數見表12：
LAG-3人源化抗體Hu229-013和Hu303-005在小鼠體內的暴露量相近，且2個抗體在3,10mg/kg劑量下的暴露量、達峰濃度與劑量增長基本呈線性關係，具有線性動力學特徵。
本測試例用於檢測抗LAG-3人源化抗體Hu229-013和Hu303-005的穩定性。
利用DSC(Differential scanning calorimetry，差示掃描量熱法)檢測不同抗體的熱穩定性，比較了不同的緩衝體系不同pH條件下的穩定性情況，不同pH對應的示例性緩衝體系如PBS(pH7.4)，10mM His/135mM NaCl(pH6.0)，10mM Acetate/135mMNaCl(pH5.2)。
將樣品置換到對應緩衝液中，控制樣品濃度在1mg/ml左右，利用MicroCal* VP-Capillary DSC(Malvern)進行檢測。檢測前，將各個樣品及空白緩衝液用真空脫氣器脫氣1-2min。樣品板每個孔加入400μl樣品或空白緩衝液(儀器上樣量為300μl)。最後兩對孔板分別加入14% Decon 90和ddH2O，以備清洗用，樣品板加樣完畢後，套上塑膠軟蓋板。掃描溫度從25℃開始到100℃結束，掃描速率60℃/h。具體結果如表13所示，在幾個測試體系中Hu229-013和Hu303-005均表現了較好的熱穩定性。
藉由SEC-HPLC監測樣品純度考察-定濃度條件下週期性穩定性，示例性的條件比如將樣品濃度控制在約50mg/ml，在PBS(pH7.4)體系中比較不同抗體在比如-80℃反復凍融5次及4℃和40℃保存-個月的穩定性情況。利用Xbridge protein BEH SEC 200A(Waters)HPLC管柱檢測。檢測結果如表14所示，兩個抗體均表現出較好的穩定性。
脫醯胺修飾是抗體中可能影響後期穩定性的-種常見的化學修飾，尤其是CDR區域的部分胺基酸高度脫醯胺修飾-般選擇儘量避免或者突變降低。取500μg待測抗體溶於500μl pH 7.4的PBS中，40℃水浴；分別於0、3、7天取樣，用於酶解實驗。將100μg不同時間點取樣的樣品溶於100μl 0.2M His-HCl，8M Gμa-HCl，pH 6.0溶液中，加3μl 0.1g/mL DTT，50℃水浴1小時，後用0.02M His-HCl，pH 6.0的溶液超濾兩次，加入3μL 0.25mg/mL的trypsin，37℃水浴酶解過夜。Agilent 6530 Q-TOF進行LC-MS檢測脫醯胺修飾情況，結果如表15：
質譜檢測結果顯示幾個抗體都沒有明顯高比例的脫醯胺修飾位點，提示其後期化學穩定性較好。
<110> 江蘇恆瑞醫藥股份有限公司、上海恆瑞醫藥有限公司
<120> LAG-3抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途
<130> 2016
<160> 39
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 442
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LAG-3-Flag
<400> 1
<210> 2
<211> 525
<212> PRT
<213> 人種
<400> 2
<210> 3
<211> 675
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LAG-3胞外區和hIgG1 Fc的融合蛋白
<400> 3
<210> 4
<211> 677
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LAG-3胞外區和mIgG2a Fc的融合蛋白
<400> 4
<210> 5
<211> 124
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 5
<210> 6
<211> 107
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 6
<210> 7
<211> 120
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 7
<210> 8
<211> 107
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 8
<210> 9
<211> 5
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 9
<210> 10
<211> 17
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 10
<210> 11
<211> 15
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 11
<210> 12
<211> 5
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 12
<210> 13
<211> 17
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 13
<210> 14
<211> 11
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 14
<210> 15
<211> 11
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 15
<210> 16
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 16
<210> 17
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 17
<210> 18
<211> 11
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 18
<210> 19
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 19
<210> 20
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 20
<210> 21
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Hu229VH.1
<400> 21
<210> 22
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Hu229VL.1
<400> 22
<210> 23
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Hu229VH.1A
<400> 23
<210> 24
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Hu229VH.1B
<400> 24
<210> 25
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Hu229VH.1C
<400> 25
<210> 26
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Hu229VL.1A
<400> 26
<210> 27
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Hu229VL.1B
<400> 27
<210> 28
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Hu229VL.1C
<400> 28
<210> 29
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Hu303_VH.1
<400> 29
<210> 30
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Hu303_VL.1
<400> 30
<210> 31
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Hu303_VH.1A
<400> 31
<210> 32
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Hu303_VH.1B
<400> 32
<210> 33
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Hu303_VH.1C
<400> 33
<210> 34
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Hu303_VL.1A
<400> 34
<210> 35
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Hu303_VL.1B
<400> 35
<210> 36
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Hu303_VL.1C
<400> 36
<210> 37
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Hu303_VL.1D
<400> 37
<210> 38
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重鏈恆定區，S228P突變。
<400> 38
<210> 39
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> kappa輕鏈恆定區
<400> 39
Claims (38)
- 一種LAG-3抗體或其抗原結合片段，其包含任意1個或多個選自以下(i)或(ii)的CDR區序列或與其具有至少85%序列同一性的胺基酸序列：(i)SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示的HCDR區；和SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17所示的LCDR區；或(ii)SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示的HCDR區；和SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20所示的LCDR區。
- 如申請專利範圍第1項所述的LAG-3抗體或其抗原結合片段，其中該抗體重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，或與其具有至少85%序列同一性的胺基酸序列；或包含分別如SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，或與其具有至少85%序列同一性的胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第1項所述的LAG-3抗體或其抗原結合片段，其中該抗體輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，或與其具有至少85%序列 同一性的胺基酸序列；或包含分別如SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，或與其具有至少85%序列同一性的胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第1項所述的LAG-3抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段為鼠源抗體或其片段。
- 如申請專利範圍第1項所述的LAG-3抗體或其抗原結合片段，其中該抗體輕鏈可變區進一步包含鼠源κ鏈或鼠源κ鏈變體的輕鏈FR區、或者鼠源λ鏈或鼠源λ鏈變體的輕鏈FR區；其中抗體重鏈可變區進一步包含鼠源IgG1或其變體的重鏈FR區、或IgG2或其變體的重鏈FR區、或IgG3或其變體的重鏈FR區。
- 如申請專利範圍第4項所述的LAG-3抗體或其抗原結合片段，其中該鼠源抗體包含如SEQ ID NO：5所示的重鏈可變區和如SEQ ID NO：6所示的輕鏈可變區，或包含如SEQ ID NO：7所示的重鏈可變區和如SEQ ID NO：8所示的輕鏈可變區。
- 如申請專利範圍第1項所述的LAG-3抗體或其抗原結合片段，其中抗體輕鏈進一步包含鼠源κ鏈或其變體的輕鏈恆定區、或者鼠源λ鏈或其變體的輕鏈恆定區；其中抗體重鏈進一步包含鼠源IgG1或其變體的重鏈恆定區、或IgG2或其變體的重鏈恆定區、或IgG3或其變體的重鏈恆定區。
- 如申請專利範圍第1項所述的LAG-3抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段為嵌合抗體或其抗原結合片段。
- 如申請專利範圍第1項所述的LAG-3抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段為人源化抗體或其抗原結合片段。
- 如申請專利範圍第9項所述的LAG-3抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體重鏈可變區上的重鏈FR區序列來源於人種系重鏈IGHV7-4-1*02和hjh6.1的組合序列或其突變序列；或者，該人源化抗體重鏈可變區上的重鏈FR區序列來源於人種系重鏈IGHV1-3*01和hjh6.1的組合序列或其突變序列。
- 如申請專利範圍第10項所述的LAG-3抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體重鏈可變區上的重鏈FR區序列包含人種系重鏈IGHV7-4-1*02的FR1、FR2、FR3區和hjh6.1的FR4區或其突變序列；或者，該人源化抗體重鏈可變區上的重鏈FR區序列包含人種系重鏈IGHV1-3*01的FR1、FR2、FR3區和hjh6.1的FR4區或其突變序列。
- 如申請專利範圍第10項所述的LAG-3抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體重鏈可變區序列為SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：29所示的序列，或與其具有至少85%序列同一性的胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第12項所述的LAG-3抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體重鏈可變區有1至10的胺基酸變化。
- 如申請專利範圍第10項所述的LAG-3抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體重鏈FR區序列有0至10個胺基酸的回復突變。
- 如申請專利範圍第14項所述的LAG-3抗體或其抗原結合片段，其中，在人種系重鏈IGHV7-4-1*02和hjh6.1的組合序列的重鏈FR區上，該回復突變為一個或多個選自E46K,R38K,V93T和Y95F的胺基酸回復突變；或者，在人種系重鏈IGHV1-3*01和hjh6.1的組合序列的重鏈FR區上，該回復突變為一個或多個選自F29L,A97T,M48I,V68A,I70L,R72V和T74K的胺基酸回復突變。
- 如申請專利範圍第10項所述的LAG-3抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體重鏈可變區序列係選自SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25所示的序列，或與其具有至少85%序列同一性的胺基酸序列；或選自SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、或SEQ ID NO：33所示的序列，或與其具有至少85%序列同一性的胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第9項所述的LAG-3抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體輕鏈可變區上的輕鏈FR區序列來源於人種系輕鏈範本IGKV1-39*01和hjk4.1的 組合序列或其突變序列；其包含人種系輕鏈IGKV1-39*01的FR1、FR2、FR3區和hjk4.1的FR4區或其突變序列。
- 如申請專利範圍第17項所述的LAG-3抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體輕鏈可變區序列為SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：30所示的序列，或與其具有至少85%序列同一性的胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第17項所述的LAG-3抗體或其抗原結合片段，其中該變體在輕鏈可變區有1至10的胺基酸變化。
- 如申請專利範圍第17項所述的LAG-3抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體輕鏈FR區序列有0至10個胺基酸的回復突變。
- 如申請專利範圍第20項所述的LAG-3抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體輕鏈FR區序列有一個或多個選自D70Q,F71Y,I48V和A43S的胺基酸回復突變，或一個或多個選自L46R,G66R,S60K,P44F,Y36L,K42G,I21L和T85D的胺基酸回復突變。
- 如申請專利範圍第17項所述的LAG-3抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體輕鏈可變區序列選自SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：28所示的序列，或與其具有至少85%序列同一性的胺基酸序列；或選自SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36或SEQ ID NO： 37所示的序列，或與其具有至少85%序列同一性的胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第9項所述的LAG-3抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體包含(a)重鏈可變區，該重鏈可變區的序列選自SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25所示的序列，或與其具有至少85%序列同一性的胺基酸序列；或選自SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、或SEQ ID NO：33所示的序列，或與其具有至少85%序列同一性的胺基酸序列；和/或(b)輕鏈可變區，該輕鏈可變區的序列選自SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：28所示的序列，或與其具有至少85%序列同一性的胺基酸序列；或選自SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：37所示的序列，或與其具有至少85%序列同一性的胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第9項所述的LAG-3抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含選自以下的重鏈可變區和輕鏈可變區的組合：1)SEQ ID NO：21的重鏈可變區和SEQ ID NO：22的輕鏈可變區；2)SEQ ID NO：21的重鏈可變區和SEQ ID NO： 26的輕鏈可變區；3)SEQ ID NO：21的重鏈可變區和SEQ ID NO：27的輕鏈可變區；4)SEQ ID NO：21的重鏈可變區和SEQ ID NO：28的輕鏈可變區；5)SEQ ID NO：23的重鏈可變區和SEQ ID NO：22的輕鏈可變區；6)SEQ ID NO：23的重鏈可變區和SEQ ID NO：26的輕鏈可變區；7)SEQ ID NO：23的重鏈可變區和SEQ ID NO：27的輕鏈可變區；8)SEQ ID NO：23的重鏈可變區和SEQ ID NO：28的輕鏈可變區；9)SEQ ID NO：24的重鏈可變區和SEQ ID NO：22的輕鏈可變區；10)SEQ ID NO：24的重鏈可變區和SEQ ID NO：26的輕鏈可變區；11)SEQ ID NO：24的重鏈可變區和SEQ ID NO：27的輕鏈可變區；12)SEQ ID NO：24的重鏈可變區和SEQ ID NO：28的輕鏈可變區；13)SEQ ID NO：25的重鏈可變區和SEQ ID NO：22的輕鏈可變區；14)SEQ ID NO：25的重鏈可變區和SEQ ID NO： 26的輕鏈可變區；15)SEQ ID NO：25的重鏈可變區和SEQ ID NO：27的輕鏈可變區；16)SEQ ID NO：25的重鏈可變區和SEQ ID NO：28的輕鏈可變區；17)SEQ ID NO：29的重鏈可變區和SEQ ID NO：30的輕鏈可變區；18)SEQ ID NO：29的重鏈可變區和SEQ ID NO：34的輕鏈可變區；19)SEQ ID NO：29的重鏈可變區和SEQ ID NO：35的輕鏈可變區；20)SEQ ID NO：29的重鏈可變區和SEQ ID NO：36的輕鏈可變區；21)SEQ ID NO：29的重鏈可變區和SEQ ID NO：37的輕鏈可變區；22)SEQ ID NO：31的重鏈可變區和SEQ ID NO：30的輕鏈可變區；23)SEQ ID NO：31的重鏈可變區和SEQ ID NO：34的輕鏈可變區；24)SEQ ID NO：31的重鏈可變區和SEQ ID NO：35的輕鏈可變區；25)SEQ ID NO：31的重鏈可變區和SEQ ID NO：36的輕鏈可變區；26)SEQ ID NO：31的重鏈可變區和SEQ ID NO： 37的輕鏈可變區；27)SEQ ID NO：32的重鏈可變區和SEQ ID NO：30的輕鏈可變區；28)SEQ ID NO：32的重鏈可變區和SEQ ID NO：34的輕鏈可變區；29)SEQ ID NO：32的重鏈可變區和SEQ ID NO：35的輕鏈可變區；30)SEQ ID NO：32的重鏈可變區和SEQ ID NO：36的輕鏈可變區；31)SEQ ID NO：32的重鏈可變區和SEQ ID NO：37的輕鏈可變區；32)SEQ ID NO：33的重鏈可變區和SEQ ID NO：30的輕鏈可變區；33)SEQ ID NO：33的重鏈可變區和SEQ ID NO：34的輕鏈可變區；34)SEQ ID NO：33的重鏈可變區和SEQ ID NO：35的輕鏈可變區；35)SEQ ID NO：33的重鏈可變區和SEQ ID NO：36的輕鏈可變區；和36)SEQ ID NO：33的重鏈可變區和SEQ ID NO：37的輕鏈可變區。
- 如申請專利範圍第7至18項中任一項所述的LAG-3抗體或其抗原結合片段，其中該嵌合抗體或人源化抗體重鏈進一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其 變體的重鏈恆定區；該嵌合抗體或人源化抗體輕鏈進一步包含人源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區。
- 如申請專利範圍第25項所述的LAG-3抗體或其抗原結合片段，其中該嵌合抗體或人源化抗體重鏈進一步包含人源IgG4或其變體的重鏈恆定區。
- 如申請專利範圍第25項所述的LAG-3抗體或其抗原結合片段，其中該嵌合抗體或人源化抗體重鏈進一步包含如SEQ ID NO：38所示的重鏈恆定區；該嵌合抗體或人源化抗體輕鏈進一步包含如SEQ ID NO：39所示的輕鏈恆定區。
- 一種分離的單株抗體或其抗原結合片段，其中與申請專利範圍第1至27項中任一項所述的單株抗體或其抗原結合片段競爭結合LAG-3。
- 一種藥物組成物，其含有治療有效量的如申請專利範圍第1至28項中任一項所述的LAG-3抗體或其抗原結合片段，以及一種或多種藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
- 一種分離的核酸，其編碼申請專利範圍第1至28項中任一項所述的LAG-3抗體或其抗原結合片段。
- 一種表現載體，其含有如申請專利範圍第30項所述的核酸。
- 一種用如申請專利範圍第31項所述的表現載體轉化的宿主細胞，該宿主細胞係選自原核細胞和真核細胞。
- 一種用如申請專利範圍第32項所述的表現載體轉化的宿主細胞，該宿主細胞係選自真核細胞。
- 一種用如申請專利範圍第32項所述的表現載體轉化的宿主細胞，該宿主細胞係選自哺乳動物細胞。
- 一種用於製備LAG-3抗體及其抗原結合片段的方法，包括在申請專利範圍第32項的宿主細胞中表現該抗體或其抗原結合片段，並自該宿主細胞中分離該抗體或其抗原結合片段。
- 一種用於抑制受試者中的腫瘤細胞的生長的方法，包括對該受試者施用治療有效量的申請專利範圍第1至28項中任一項所述的LAG-3抗體或其抗原結合片段或申請專利範圍第29項所述的藥物組成物或申請專利範圍第30項所述的核酸，從而在該受試者中抑制腫瘤生長。
- 一種如申請專利範圍第1至28項中任一項所述的LAG-3抗體或其抗原結合片段、如申請專利範圍第29項所述的藥物組成物或申請專利範圍第30項所述的核酸的用途，其係製備用於治療與致病性T細胞的參與相關的疾病或病症的藥物。
- 如申請專利範圍第37項所述的製備用於治療與致病性T細胞的參與相關的疾病或病症的藥物的用途，其中該疾病或病症為癌症；該癌症的包括，但不限於卵巢癌、黑色素瘤、前列腺癌、腸癌、胃癌、食管癌、乳腺癌、肺癌、腎癌、胰腺癌、子宮癌、肝癌、膀胱癌、子宮 頸癌、口腔癌、腦癌、睾丸癌、皮膚癌、甲狀腺癌以及血液學惡性腫瘤包括骨髓瘤和慢性和急性白血病。
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