ES2802873T3 - Anticuerpos a beta amiloide - Google Patents

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Abstract

Una molécula de anticuerpo para ßA1-42 humano, donde la molécula de anticuerpo comprende un dominio VH y un dominio VL, donde el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 524 y donde el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 533.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos a beta amiloide
Campo de la invención
Esta descripción se refiere a anticuerpos que se unen al péptido 1-42 beta amiloide humano y formas truncadas N-terminales de los mismos, referidos colectivamente como péptidos IJAn-42, donde n va de 1 a 29. Se refiere a anticuerpos que son selectivos en la unión al péptido n-42 beta amiloide sobre el péptido 1-40 beta amiloide. La presente descripción también se refiere al uso de anticuerpos anti-SAn-42 para el tratamiento de condiciones asociadas con amiloidosis, incluyendo la enfermedad de Alzheimer.
Antecedentes
La enfermedad de Alzheimer (EA) se caracteriza por el empeoramiento del deterioro cognitivo, que afecta a la memoria, lo que debilita el funcionamiento social y ocupacional del paciente. La enfermedad degenerativa causa la pérdida de células nerviosas en el cerebro, lo que provoca dificultades cognitivas con el lenguaje y funcionamiento más elevado, tales como el juicio, la planificación, la organización y el razonamiento, lo que puede conducir con el tiempo a cambios de personalidad. Las etapas finales de la enfermedad se caracterizan por una pérdida total del funcionamiento independiente.
Histológicamente, la EA (esporádica y familiar) se define por la presencia de enredos neurofibrilares intracelulares (ENF) y placas extracelulares. Las placas son agregaciones del péptido p amiloide (I3A) derivadas de la escisión aberrante de la proteína precursora amiloidea (PPA), una proteína transmembrana encontrada en las neuronas y astrocitos en el cerebro. Depósitos de I3A se encuentran también en los vasos sanguíneos de pacientes con EA. Las neuronas colinérgicas son especialmente vulnerables en la EA, y la consiguiente disminución de neurotransmisores afecta a otros sistemas neurotransmisores. Otros síntomas de la enfermedad incluyen el estrés oxidativo, la inflamación y apoptosis neuronal (muerte celular programada). En el paciente con EA, la muerte celular neuronal extensiva lleva al deterioro cognitivo y a la eventual muerte del paciente. (Younkin, 1995; Borchelt y col., 1996; Selkoe, 1999).
Los tratamientos actuales sólo son sintomáticos y son vistos como mínimamente efectivos con pequeñas mejoras en los síntomas durante un período limitado de tiempo. Sin embargo, la sobreproducción o cambios en los niveles de I3A se cree que son acontecimientos clave en la patogénesis de la EA esporádica y de inicio precoz. Por esta razón, I3A se ha convertido en un objetivo importante para el desarrollo de fármacos diseñados para reducir su formación (Vassar y col., 1999), o para activar mecanismos que aceleren su remoción del cerebro.
La hipótesis de la cascada amiloide propone que la producción del péptido I3A afecta negativamente a la función de las neuronas, llevando, por lo tanto, a la muerte neuronal y a la demencia en la EA. I3A se produce a partir de la proteína precursora amiloide (PPA) que se escinde secuencialmente por secretasas para generar especies de diferentes longitudes. El componente principal de la placa es la isoforma del aminoácido 42 de I3A1-42 que está implicada en la formación de oligómeros neurotóxicos y la formación de placa en la patogénesis de LA EA. Un número de isoformas de I3A incluyendo I3A1-42, pGlul3A3-42, I3A3-42 y 4-42 predominan en el cerebro con EA, de las cuales I3A1-42 y I3A4-42 son las principales formas en el hipocampo y la corteza de la EA familiar y esporádica (Portelius y col., 2010).
I3A que termina en el residuo 42 es un componente menor de la especie de I3A producidos mediante el procesamiento de la PPA. Otras formas incluyen I3A1-40 y SAn-40 de formas truncadas N-terminales. Sin embargo, I3A que termina en el residuo 42 es más propensa a agregarse y lleva a la deposición en placas amiloides. Además de ser más propensos a agregarse, el péptido I3A1-42 forma polímeros de bajo n solubles (u oligómeros) que han demostrado ser tóxicos para neuronas en cultivo. A diferencia de los depósitos de fibrillas visibles más grandes, oligómeros no son detectables en ensayos de patología típicos. Oligómeros que tienen propiedades similares se han aislado de cerebros con EA y estos están más estrechamente asociados a la progresión de la enfermedad que las placas (Younkin, 1998; Walsh y col., 2005a; Walsh y col., 2005b).
Oligómeros generados experimentalmente aplicados a cortes de cerebro o inyectados in vivo causan falla de potenciación a largo plazo (PLP) del hipocampo, que es una forma de almacenamiento de información sináptica bien conocida como un paradigma para mecanismos de memoria (Lambert y col., 1998; Walsh y col., 2002; Wang y col., 2002). Oligómeros solubles se han implicado en la degeneración física de sinapsis (Mucke y col., 2000). La reversión de fallas de memoria por anticuerpos en modelos de ratón ha confirmado el concepto emergente de que los oligómeros tienen un papel importante a desempeñar en las fallas sinópticas.
La evidencia genética sugiere que el aumento de cantidades de JA1-42 y formas truncadas N-terminales de los mismos (JAn-42) se producen en muchas, si no en todas, las condiciones genéticas que causan la EA familiar (Borchelt y col., 1996; Duff y col., 1996; Scheuner y col., 1996; Citron y col ., 1998), apuntando a la posibilidad de que la formación amiloide puede ser causada ya sea por la generación aumentada de JAn-42 o por la degradación disminuida, o ambas (Glabe, 2000). En particular, la EA familiar, que causa mutaciones genéticas en el gen de la PPA y/o en el gen que codifica la presenilina en el componente complejo de la Y-secretasa, aumentó la producción de JA1-42 con relación a JA1-40. También se ha propuesto que la cantidad absoluta de péptidos producida en el cerebro podría ser menos importante que la proporción de péptidos JA (reflejada en un cambio de la proporción JA1-42 a JA1-40) para la generación de especies de JA tóxicas (De Strooper, 2007; Kuperstein y col., 2010). Además, los modelos animales de la deposición amiloide, tanto en ratones como Drosophila, sugieren que JA1-42 se requiere para la formación de depósitos amiloides (Greeve y col., 2004; Lijima y col., 2004; McGowan y col., 2005).
Los resultados de un estudio de vacunación en 2000 sugirieron posibles nuevas estrategias de tratamiento para la EA. El ratón transgénico PDAPP, que sobreexpresa la PPA humana mutante (en la que el aminoácido en la posición 717 es fenilalanina en lugar de la valina normal), desarrolla progresivamente muchas de las características neuropatológicas de la EA de una manera que depende de la edad y de la región del cerebro. Animales transgénicos se inmunizaron con péptido JA1-42 ya sea antes del inicio de neuropatologías del tipo de la EA (a las 6 semanas de edad) o en una edad más avanzada (11 meses), cuando la deposición de JA y varios de los cambios neuropatológicos posteriores estaban bien establecidos. La inmunización de los animales jóvenes impidió esencialmente el desarrollo de la formación de placa, distrofia neurítica y astrogliosis. El tratamiento de los animales de más edad también redujo notablemente la extensión y progresión de estas neuropatologías semejantes a la EA. Se demostró que la inmunización con JA1-42 dio lugar a la generación de anticuerpos anti-JA y que células monocíticas/microgliales JA-inmunorreactivas aparecen en la región de las placas restantes (Schenk y col., 1999; Schenk y col., 2000). Sin embargo, la estrategia de inmunización activa cuando se aplica a seres humanos resultó en varios casos de meningoencefalitis, muy probablemente debido a una respuesta a células T, y fue suspendida, aunque los resultados iniciales sobre la eficacia fueron prometedores (Orgogozo y col., 2003; Gilman y col., 2005; Pride y col., 2008). Después de esto, se investigaron varias estrategias de vacunación pasiva. La administración periférica de anticuerpos contra pA fue suficiente para reducir la carga de amiloide (Bard y col., 2000). A pesar de los niveles séricos de anticuerpos relativamente modestos obtenidos en estos experimentos, los anticuerpos administrados pasivamente fueron capaces de cruzar la barrera hematoencefálica y entrar en el sistema nervioso central, decorar las placas e inducir la remoción del amiloide preexistente. En una comparación entre un anticuerpo JA1-40-específico, un anticuerpo JA1-42-específico y un anticuerpo dirigido contra residuos 1-16 de pA, todos los anticuerpos mostraron reducir la acumulación de JA en el cerebro de ratones (Levites y col., 2006).
Más recientemente, se ha sugerido que la penetración en el SNC es la ruta más probable para la remoción efectiva de JA para anticuerpos administrados pasivamente (Golde y col., 2009). Sin embargo, además de los anticuerpos ser capaces de atravesar la barrera hematoencefálica, fue propuesta la hipótesis de inmersión como un posible mecanismo de acción.
La hipótesis de inmersión establece que JA se puede eliminar del SNC indirectamente mediante la reducción de la concentración del péptido en el plasma. En los experimentos que describen esto, se usó un anticuerpo que se une al JA en el plasma y por lo tanto secuestra JA del SNC. Esto se logró porque el anticuerpo impide la afluencia de JA desde el plasma al SNC y/o cambia el equilibrio entre el plasma y el SNC debido a una disminución de la concentración de JA libre en el plasma (DeMattos y col., 2001). Agentes de unión a amiloide no relacionados con anticuerpos también han demostrado ser efectivos en la eliminación de JA del SNC través de unión en plasma. Dos agentes de unión a JA, gelsolina y GM1, que secuestran JA del plasma, muestran que reducen o impiden la amiloidosis cerebral (Matsuoka y col., 2003).
Respecto a la seguridad, una característica patogénica en la EA es la angiopatía amiloide cerebral (AAC), donde hay una sustitución de las células musculares lisas vasculares con JA, principalmente JA1-40, en las paredes de las arterias cerebrales (Weller y col., 2003). El tratamiento de los pacientes con EA con anticuerpos pan-AI3 se ha demostrado que conduce a microhemorragias que reflejan la eliminación de JA de la pared del vaso (Wilcock y col., 2009), lo que podría ser perjudicial para los pacientes. Una forma de evitar esto ha sido generar anticuerpos deglicosilados que pueden reducir los mecanismos de remoción que contribuyen a microhemorragias y/o reducir la velocidad a la que JA se remueve de los depósitos vasculares, impidiendo la saturación de las vías de flujo de salida (Wilcock y col., 2006).
Apuntando a la especie de péptido n-42p con un anticuerpo específico AJ42 podría apuntar a la especie que es el compuesto péptido clave en el cerebro con EA y el impulsor de la formación de placa. Un anticuerpo con una especificidad primaria para especies de monómeros n-42 y oligómeros de bajo n no sólo agotan estas especies, sino que también podrían impedir la acumulación de otras especies de oligómeros que demuestran ser tóxicas para las neuronas.
El documento WO 03/015691 describe un procedimiento para efectuar una rápida mejora en la cognición en sujetos que padecen afecciones o enfermedades relacionadas con el péptido pA, incluyendo la enfermedad de Alzheimer, síndrome de Down, angiopatía amiloide cerebral, deterioro cognitivo leve, y similares. El procedimiento comprende administrar anticuerpos anti-JA al sujeto, especialmente anticuerpos que tienen una alta afinidad por formas solubles de JA. X-15240.
El documento WO 09/85200 describe composiciones para el tratamiento de trastornos neurodegenerativos o amiloidogénicos tales como la enfermedad de Alzheimer. Más particularmente, también se proporcionan anticuerpos anti-beta-amiloides, composiciones que contienen tales anticuerpos, ácidos nucleicos, vectores y células huésped correspondientes, y procedimientos de fabricación de tales anticuerpos.
Resumen de la invención
La invención se describe mediante las reivindicaciones adjuntas. Se proporciona una molécula de anticuerpo para JA1-42 humano como se describe en la reivindicación 1. También se proporciona una composición para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer como se describe en la reivindicación 5. Una composición para su uso en la mejora de la cognición o la reducción de la disminución cognitiva en un paciente con la enfermedad de Alzheimer o con síndrome de Down también se da a conocer en la reivindicación 6. Además, características ventajosas son descritas en las reivindicaciones dependientes restantes.
La presente descripción se refiere a anticuerpos completamente humanos que son específicos para JA1-42 y formas truncadas N-terminales de los mismos y se unen a un epítopo entre los aminoácidos 29-42 del péptido pA42. Los anticuerpos según la presente descripción se pueden utilizar para la prevención y/o el tratamiento terapéutico de condiciones asociadas con beta amiloide, tales como la EA, incluyendo el deterioro cognitivo leve (DCL) debido a la EA, y el síndrome de Down.
La presente descripción se refiere al uso de anticuerpos totalmente humanos para suprimir isoformas de péptido pA (n-42) en plasma, cerebro y líquido cefalorraquídeo (LCR) para impedir la acumulación o revertir la deposición de isoformas de pA n-42 en el cerebro y la vasculatura cerebral y mejorar la cognición.
En esta invención se describe la producción de anticuerpos totalmente humanos para los péptidos pA n-42, que reconocen formas monoméricas y oligoméricas de bajo n (hasta e incluyendo pentámero) de pA n-42 y están epítopomapeados a una región que abarca los aminoácidos 17-42 en el péptido pA42, más específicamente a una región que abarca los aminoácidos 29 a 42 en el péptido pA42.
Los anticuerpos según la presente descripción son específicos para especies pA n-42 (donde n es un número entero en el intervalo de 1 a 29) y, por lo tanto, se puede esperar que reduzcan selectivamente el impulsor clave de la progresión de la EA. Los anticuerpos según la presente descripción son efectivos en unirse al AIM2 (no AJ40) en el plasma humano, el cerebro y líquido cefalorraquídeo (LCR) llevando a la remoción aumentada de isoformas pA n-42 del cerebro. Los anticuerpos según la presente descripción también son efectivos en la reducción de la unión de agregados solubles de AJ42 a las neuronas y, por lo tanto, la porción del anticuerpo que entra en el cerebro tendrá un efecto en la salud de las neuronas.
Se describen en esta invención anticuerpos de alta afinidad, potentes, incluyendo un anticuerpo con una KD (Constante de Disociación) de 320 pM para monómero. Tal alta afinidad puede permitir la supresión efectiva de pA n-42 a niveles que permitan la prevención y modificación de la EA.
Los niveles de especies AJ42 y AJ40 solubles pueden ser detectados en el cerebro, LCR y sangre con ensayos estandarizados utilizando anticuerpos dirigidos contra epítopos en el péptido pA. Como se muestra en un PK:PD de rata descrito en esta invención, una supresión dependiente de dosis de AJ42 libre fue observada en el LCR de ratas después de la administración periférica de anticuerpo. También se demostró un aumento dependiente de dosis en AJ42 total en el cerebro de ratas con un efecto despreciable sobre el péptido AJ40.
Por lo tanto, son descritos en esta invención anticuerpos que tienen la capacidad de penetrar en el cerebro (0,1% de la administración periférica total en el LCR) y suprimen específicamente las especies tóxicas clave AJ42 (no AJ40) en el LCR.
La especificidad y el mecanismo de acción de los anticuerpos según la presente descripción pueden permitir tanto el tratamiento profiláctico como el terapéutico de un número de enfermedades relacionadas con una acumulación de amiloide que ocurre dentro de los órganos del cuerpo, incluyendo las diferentes etapas del procedimiento de la enfermedad EA: EA prodrómica, leve y moderada, síndrome de Down, así como la degeneración macular.
Los anticuerpos según la presente descripción pueden tener la capacidad de revertir el deterioro cognitivo, tratar el deterioro cognitivo e impedir el deterioro cognitivo en pacientes con diagnóstico de EA prodrómica, leve a moderada y síndrome de Down.
En consecuencia, un primer aspecto de la presente descripción se refiere a miembros de unión para I3A1-42 humano, especialmente moléculas de anticuerpos.
Los miembros de unión, por ejemplo, moléculas de anticuerpos, según la presente descripción, pueden tener cualquiera o todas de las siguientes propiedades:
- Unirse a I3A1-42 humano monomérico soluble y/o I3A1-42 oligomérico;
- Selectividad al unirse a I3A1-42 sobre I3A1-40. Pueden no mostrar ninguna unión a I3A1-40, o la unión puede ser despreciable. Por ejemplo, las moléculas de anticuerpos según la presente descripción pueden unirse a I3A1-42 monomérico con una constante de disociación (Kd) de 500 pM o menos. Puede que no se unan a I3A1-40, o se pueden unir a I3A1-40 con una KD mayor que 1 mM;
- Unirse a I3A17-42 humano. Por consiguiente, la molécula de anticuerpo puede reconocer un epítopo entre los aminoácidos 17-42 del péptido I3A1-42, más específicamente la molécula de anticuerpo puede reconocer un epítopo entre los aminoácidos 29-42 del péptido I3A1-42;
- Unirse a 3piro-42 (piroglutamato 3) y 11 piro-42 (piroglutamato 11) humano monomérico soluble;
- Unirse a Ap1-43 humano; y
- Reactividad cruzada con I3A1-42 murino.
Un miembro de unión puede comprender un conjunto de HCDR y/o un conjunto de LCDR de una molécula de anticuerpo como se describe en esta invención. Ejemplos de moléculas de anticuerpos según la presente descripción comprenden un dominio VH que contiene un conjunto de HCDR (HCDR1, HCDR2 y HCDR3) y un dominio VL que contiene un conjunto de Lc Dr (LCDR1, LCDR2 y LCDR3), donde las HCDR y LCDR son las HCDR y Lc Dr , respectivamente, de cualquiera de los anticuerpos Abet0380, Abet0007, Abet0144, Abet0319, Abet0321b, Abet0322b, Abet0323b, Abet0328, Abet0329, Abet0332, Abet0342, Abet0343, Abet0344, Abet0368, Abet0369, Abet0370, Abet0371, Abet0372, Abet0373, Abet0374, Abet0377, Abet0378, Abet0379, Abet0381, Abet0382 y Abet0383, o una versión GL de los mismos, cuyas secuencias se muestra en el listado de secuencias adjuntas. La correspondencia entre las moléculas de anticuerpos y los identificadores de secuencias en la lista de secuencias se indica en la Tabla 16.
Una molécula de anticuerpo para I3A1-42 humano puede comprender
(i) un dominio VH que comprende un conjunto de HCDR: HCDR1, HCDR2 y HCDR3, intercaladas con regiones de estructura, donde las secuencias de a minoácidos del conjunto de HCDR son como se muestra en la Tabla 16 para cualquiera de los anticuerpos Abet0380, Abet0007, Abet0144, Abet0319, Abet0321b, Abet0322b, Abet0323b, Abet0328, Abet0329, Abet0332, Abet0342, Abet0343, Abet0344, Abet0368, Abet0369, Abet0370, Abet0371, Abet0372, Abet0373, Abet0374, Abet0377, Abet0378, Abet0379, Abet0381, Abet0382 y Abet0383 o una versión GL de los mismos,
o puede comprender ese conjunto de HCDR con uno o dos mutaciones de aminoácidos; y
(ii) un dominio VL que comprende un conjunto de LCDR: LCDR1, LCDR2 y LCDR3, intercaladas con regiones de estructura, donde las secuencias de aminoácidos del conjunto de LCDR son como se muestra en la Tabla 16 para cualquiera de los anticuerpos Abet0380, Abet0007, Abet0144, Abet0319, Abet0321b, Abet0322b, Abet0323b, Abet0328, Abet0329, Abet0332, Abet0342, Abet0343, Abet0344, Abet0368, Abet0369, Abet0370, Abet0371, Abet0372, Abet0373, Abet0374, Abet0377, Abet0378, Abet0379, Abet0381, Abet0382 y Abet0383, o una versión GL de los mismos,
o puede comprender ese conjunto de LCDR con una o dos mutaciones de aminoácidos.
Una molécula de anticuerpo según la presente descripción puede comprender
(i) un dominio VH que comprende el conjunto GL Abet0380 o Abet0380 de HCDR, donde las secuencias de aminoácidos de las HCDR Abet0380 son
HCDR1 SEQ ID NO: 525,
HCDR2 SEQ ID NO: 526, y
HCDR3 SEQ ID NO: 527,
o puede comprender el conjunto GL Abet0380 o Abet0380 de HCDR con una o dos mutaciones de aminoácidos, y (ii) un dominio VL que comprende el conjunto GL Abet0380 o Abet0380 de LCDR, donde las secuencias de aminoácidos de las LCDR Abet0380 son
LCDR1 SEQ ID NO: 534
LCDR2 SEQ ID NO: 535, y
LCDR3 SEQ ID NO: 536,
o puede comprender el conjunto GL Abet0380 o Abet0380 de LCDR con una o dos mutaciones de aminoácidos. La molécula de anticuerpo puede comprender
(i) un dominio VH que comprende un conjunto de HCDR: HCDR1, HCDR2 y HCDR3, intercaladas con regiones de estructura, donde las secuencias de aminoácidos de las HCDR son
HCDR1 SEQ ID NO: 525,
HCDR2 SEQ ID NO: 526, y
HCDR3 SEQ ID NO: 527,
o puede comprender ese conjunto de HCDR con una o más sustituciones de aminoácidos, donde una o más sustituciones se seleccionan de entre las que se muestran en la Tabla 12 o en la Tabla 14; y
(ii) un dominio VL que comprende un conjunto de LCDR: LCDR1, LCDR2 y LCDR3, intercaladas con regiones de estructura, donde las secuencias de aminoácidos de las LCDR son
LCDR1 SEQ ID NO: 534
LCDR2 SEQ ID NO: 535, y
LCDR3 SEQ ID NO: 536,
o puede comprender ese conjunto de LCDR con una o más sustituciones de aminoácidos, donde una o más sustituciones se seleccionan de entre las que se muestran en la Tabla 13 o en la Tabla 15.
El dominio VH de la molécula de anticuerpo puede comprender una región FW1 en la que los residuos de aminoácidos en las posiciones de Kabat 26-30 se seleccionan de entre los que se muestran en la Tabla 14.
El dominio VH de la molécula de anticuerpo puede comprender regiones de estructura de cadena pesada FW1, FW2, FW3 y FW4, donde las secuencias de aminoácidos de las regiones de estructura de cadena pesada son
FW1 SEQ ID NO: 528
FW2 SEQ ID NO: 529
FW3 SEQ ID NO: 530, y
FW4 SEQ ID NO: 531
o donde FW1 comprende SEQ ID NO: 528 con una o más sustituciones de aminoácidos, donde una o más sustituciones en FW1 se seleccionan de las mostradas en la Tabla 12 o en la Tabla 14.
El dominio VH de la molécula de anticuerpo puede comprender regiones de estructura de cadena ligera FW1, FW2, FW3 y FW4, donde las secuencias de aminoácidos de las regiones de estructura de cadena ligera son
FW1 SEQ ID NO: 537
FW2 SEQ ID NO: 538
FW3 SEQ ID NO: 539, y
FW4 SEQ ID NO: 540.
Una molécula de anticuerpo según la presente descripción puede comprender
(i) una secuencia de aminoácido de dominio VH como se muestra en la Tabla 16 para cualquiera de Abet0380, Abet0343, Abet0369, Abet0377 y Abet0382, o una versión GL de los mismos,
o puede comprender aquella secuencia de aminoácidos con una o dos mutaciones de aminoácidos; y
(ii) una secuencia de aminoácido de dominio VL como se muestra en la Tabla 16 para cualquiera de Abet0380, Abet0343, Abet0369, Abet0377 y Abet0382, o una versión GL de los mismos,
o puede comprender aquella secuencia de aminoácidos con una o dos mutaciones de aminoácidos.
Una molécula de anticuerpo según la presente descripción puede comprender un dominio VH que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 85% idéntica a SEQ ID NO: 524 y un dominio VL que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 85 % idéntica a SEQ ID NO: 533, donde, en el dominio VH:
aminoácido 26 es M, G o S;
aminoácido 27 es G, F o D;
aminoácido 28 es N, T, D o H,
aminoácido 29 es F;
aminoácido 30 es N, S, K o P;
aminoácido 31 es Y, V, R, E o T;
aminoácido 32 es Q, Y, D, S o E;
aminoácido 33 es T, P, I o V;
aminoácido 34 es M;
aminoácido 35 es W;
aminoácido 50 es V;
aminoácido 51 es I;
aminoácido 52 es G;
aminoácido 52a es K, S o A;
aminoácido 53 es T, S, N, D, G o Q;
aminoácido 54 es N, G, T o P;
aminoácido 55 es E, G, N, K o T;
aminoácido 56 es N, T, R o K,
aminoácido 57 es I, T, K< o V,
aminoácido 58 es A, V o T;
aminoácido 59 es Y;
aminoácido 60 es A;
aminoácido 61 es D;
aminoácido 62 es S;
aminoácido 63 es V;
aminoácido 64 es K;
aminoácido 65 es G;
aminoácido 95 es E;
aminoácido 96 es W;
aminoácido 97 es M;
aminoácido 98 es D;
aminoácido 99 es H;
aminoácido 100 es S;
aminoácido 100a es R;
aminoácido 100b es P;
aminoácido 100c es Y;
aminoácido 100d es Y;
aminoácido 100e es Y;
aminoácido 100f es Y;
aminoácido 100g es G;
aminoácido 100h es M;
aminoácido 101 es D;
aminoácido 102 es V;
y donde en el dominio VL:
aminoácido 24 es S;
aminoácido 25 es G;
aminoácido 26 es H;
aminoácido 27 es N;
aminoácido 28 es L o I;
aminoácido 29 es E o G;
aminoácido 30 es D
aminoácido 31 es K;
aminoácido 32 es F o W;
aminoácido 33 es A o V;
aminoácido 34 es S;
aminoácido 50 es R
aminoácido 51 es D
aminoácido 52 es D
aminoácido 53 es K;
aminoácido 54 es R
aminoácido 55 es P;
aminoácido 56 es S;
aminoácido 89 es S o Q;
aminoácido 90 es S o A;
aminoácido 91 es Q
aminoácido 92 es D
aminoácido 93 es T o S;
aminoácido 94 es V o T;
aminoácido 95 es T;
aminoácido 96 es R
aminoácido 97 es V
Una molécula de anticuerpo según la presente descripción puede comprender un dominio VH que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 85% idéntica a SEQ ID NO: 524 y un dominio VL que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 85% idéntica a SEQ ID NO: 533, donde en el dominio VH:
Figure imgf000008_0001
aminoácido 100 es S;
aminoácido 100a es R;
aminoácido 100b es P;
aminoácido 100c es Y;
aminoácido 100d es Y;
aminoácido 100e es Y;
aminoácido 100f es Y;
aminoácido 100g es G;
aminoácido 100h es M o I;
aminoácido 101 es D;
aminoácido 102 es V o A;
y donde en el dominio VL:
aminoácido 24 es S o T;
aminoácido 25 es G o T;
aminoácido 26 es H, R o P;
aminoácido 27 es N o H;
aminoácido 28 es L, I, V, F o T;
aminoácido 29 es E, M, G, S o N;
aminoácido 30 es D, A, S, G o H;
aminoácido 31 es K o S;
aminoácido 32 es F o W;
aminoácido 33 es A, V, M, T o I;
aminoácido 34 es S, T o A;
aminoácido 50 es R;
aminoácido 51 es D;
aminoácido 52 es D;
aminoácido 53 es K;
aminoácido 54 es R;
aminoácido 55 es P;
aminoácido 56 es S;
aminoácido 89 es S, Q o A;
aminoácido 90 es S, A o T;
aminoácido 91 es Q;
aminoácido 92 es D o G;
aminoácido 93 es T, Q, S, N o K;
aminoácido 94 es V, T o F;
aminoácido 95 es T;
aminoácido 96 es R;
aminoácido 97 es V, S o A.
Una molécula de anticuerpo según la presente descripción puede comprender:
(i) un dominio VH que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos del dominio VH que se muestra en la Tabla 16 para cualquiera de Abet0380, Abet0343, Abet0369, Abet0377 y Abet0382, o una versión GL de los mismos; y
(i) un dominio VL que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos del dominio VL que se muestra en la Tabla 16 para cualquiera de Abet0380, Abet0343, Abet0369, Abet0377 y Abet0382, o una versión GL de los mismos.
La molécula de anticuerpo puede comprender un dominio VH y un dominio VL al menos 90 % idénticos con el dominio VH y el dominio VL, respectivamente, de cualquiera de Abet0380, Abet0343, Abet0369, Abet0377 y Abet0382, o una versión GL de los mismos.
El porcentaje indicado de identidad del dominio VH y/o VL puede ser al menos 95 %, al menos 98 % o al menos 99 %. La molécula de anticuerpo puede comprender el dominio VH y el dominio VL de cualquiera de Abet0380, Abet0343, Abet0369, Abet0377 y Abet0382 o una versión GL de los mismos.
Por ejemplo, la molécula de anticuerpo puede comprender la secuencia de aminoácidos del dominio VH Abet0380-GL SEQ ID No : 524 y la secuencia de aminoácidos del dominio VL Abet0380-GL SEQ ID NO: 533.
Una molécula de anticuerpo según la presente descripción puede ser una que compite por la unión a I3A1-42 con: (i) una molécula de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos del dominio VH SEQ ID NO: 524 y una secuencia de aminoácidos del dominio VL SEQ ID NO: 533,
(ii) una molécula de anticuerpo codificada por el ácido nucleico depositado bajo el número de acceso NCIMB 41890, 41891 o 41892.
Una molécula de anticuerpo puede comprender un dominio VH y un dominio VL codificado por:
(i) la secuencia de ácidos nucleicos Abet0380-GL depositada con el número de acceso 41890;
(ii) la secuencia de ácidos nucleicos Abet0144-GL depositada con el número de acceso 41891; o
(ii) la secuencia de ácidos nucleicos Abet0377-GL depositada con el número de acceso 41892.
La molécula de anticuerpo puede comprender un dominio VH y un dominio VL que comprende las HCDR y LCDR, respectivamente, de un anticuerpo depositado mencionado anteriormente. La molécula de anticuerpo puede ser el anticuerpo codificado por el ácido nucleico depositado mencionado anteriormente.
También se describen en esta invención moléculas de ácido nucleico que codifican miembros de unión según la presente descripción, células huésped que contienen el ácido nucleico, y procedimientos de producción de los miembros de unión mediante la expresión del ácido nucleico y la recuperación del miembro de unión.
Otros aspectos de la presente descripción se refieren a composiciones que comprenden una molécula de anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, y uno o más componentes adicionales, tales como un excipiente farmacéuticamente aceptable, y a tales composiciones para uso médico. Composiciones que comprenden miembros de unión según la presente descripción se pueden proporcionar para uso en un procedimiento de tratamiento del cuerpo humano o animal.
Miembros de unión descritos en esta invención pueden usarse en procedimientos de diagnóstico o tratamiento en sujetos humanos o animales, por ejemplo, seres humanos. Miembros de unión de la presente descripción pueden ser utilizados para disminuir los niveles de I3A1-42 en un individuo y/o para reducir la amiloidosis. Miembros de unión pueden ser utilizados para reducir la amiloidosis y para tratar, reducir o impedir afecciones asociadas con amiloidosis. Condiciones y enfermedades que se pueden tratar incluyen la enfermedad de Alzheimer, tales como EA prodrómica, leve o moderada. La EA tratada por la presente descripción puede ser EA familiar o esporádica. La presente descripción se puede usar para impedir, reducir o invertir el deterioro cognitivo leve (DCL) asociado con la EA. La cognición puede mejorarse, y/o el deterioro cognitivo se puede disminuir, en pacientes con EA o pacientes con síndrome de Down. La presente descripción también se puede usar para tratar o impedir la degeneración macular, que está vinculada con beta amiloide (Ding y col. PNAS 108(28):E279-2872011).
Por consiguiente, en un aspecto adicional, la presente descripción proporciona un procedimiento para la reducción de la amiloidosis, el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer, la mejora de la cognición o reducir el deterioro cognitivo en la enfermedad de Alzheimer o el síndrome de Down, y/o el tratamiento de la degeneración macular en un individuo, que comprende administrar un miembro de unión de la presente descripción al individuo.
Estos y otros aspectos de la presente descripción se describen con más detalle a continuación.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra los resultados del ensayo HTRF™ de unión directa entre el Fab Abet0007 purificado y una serie de péptidos beta amiloides. El clon Abet0007 (■) muestra la unión al péptido beta amiloide humano 1-42 (Figura 1A) y el péptido beta amiloide murino 1-42 (Figura 1C), pero no muestra unión al péptido beta amiloide humano 1-40 (Figura 1B) o al péptido beta amiloide humano codificado 1-42 (Figura 1D). El anticuerpo de control positivo (•) y el anticuerpo de control negativo (A ) fueron utilizados para verificar la integridad del ensayo.
La Figura 2 muestra la inhibición de la formación del péptido beta amiloide 1-42 humano biotinilado y el complejo IgG2 Abet0007 por concentraciones crecientes de péptidos competidores. La formación de complejos es inhibida por péptidos beta amiloides humanos 1-42 (•), 11-42 (A), 17-42 (▼) y 1-43 (♦ ). No es inhibida por péptido beta amiloide humano 1-40 (■) o por el péptido de control negativo (o).
La Figura 3 muestra trazas de Resonancia de Plasmones Superficiales (BIAcore) para el péptido beta amiloide humano 1-42 que se une a IgG2 Abet0007 inmovilizado a concentraciones de péptido de 100 nM (traza superior), 50 nM, 25 nM, 12,5 nM, 6,2 nM y 3,1 nM (traza inferior). Cada traza se ajusta a un modelo de Langmuir 1:1.
La Figura 4 muestra imágenes de muestra de la tinción inmunohistoquímica in vitro de Abet0007 IgG2. (A) Un anticuerpo de control positivo muestra fuerte reconocimiento de placa (puntuación = 4) en secciones de cerebro humano con EA (genotipo de ApoE 3/3; Braak etapa 6; 20 pg/ml anticuerpo). (B) El clon principal Abet0007 IgG2 no muestra reconocimiento de placa (puntuación = 0) en una sección de cerebro adyacente (20 pg/ml). (C) El mismo anticuerpo de control positivo muestra fuerte reconocimiento de placa (puntuación = 4) en secciones de cerebro de ratón Tg2576 (ratones de 18 meses de edad; 20 pg/ml anticuerpo). (D) El clon principal Abet0007 IgG2 no muestra reconocimiento de placa (puntuación = 0) en una sección de cerebro de ratón adyacente (20 pg/ml).
La Figura 5 muestra la inhibición de la formación de beta amiloide 1-42 humano y complejo Abet0042 IgG al aumentar las concentraciones de Abet0007 scFv (•) y Abet0144 scFv (A). El clon Abet0144 es significativamente más potente que el clon parental Abet0007 en este ensayo. Un anticuerpo de control negativo (■) se incluye para comparación. La Figura 6 muestra trazas de Resonancia de Plasmones Superficiales (BIAcore) para el scFv Abet0144 purificado que se une al péptido beta amiloide humano 1-42 inmovilizado a concentraciones de scFv de 400 nM (traza superior), 200 nM, 100 nM, 50 nM y 12.5 nM (traza inferior). Cada traza se ajusta a un modelo de Langmuir 1:1.
La Figura 7 muestra trazas de Resonancia de Plasmones Superficiales (BIAcore) para el péptido beta amiloide humano 1-42 que se une al anticuerpo IgG1-TM Abet0144-GL inmovilizado a concentraciones de péptido de 50 nM (traza superior), 25 nM, 12,5 nM, 6,25 nM, 3,13 nM y 1,56 nM (traza inferior). Cada traza se ajusta a un modelo de Langmuir 1:1.
La Figura 8 muestra trazas de Resonancia de Plasmones Superficiales (BIAcore) para una serie de péptidos beta amiloides a 400 nM que se unen a anticuerpo IgG1-TM Abet0144-GL inmovilizado. Hay una clara unión al péptido beta amiloide humano biotinilado 1-42 (traza superior) y al péptido beta amiloide humano no marcado 1-42 (segunda traza). No hay ninguna unión discernible a péptido beta amiloide humano biotinilado codificado 1-42, péptido beta amiloide humano biotinilado 1-40, péptido beta amiloide humano no marcado 1-40 o insulina biotinilada (líneas planas). La Figura 9 muestra perfiles de especificidad de IgG1-TM Abet0144-GL usando un ensayo de competición epítopo bioquímico en los que se mide la inhibición de la formación de un complejo entre péptido beta amiloide humano biotinilado 1-42 y IgG1-TM Abet0144-GL por medio del aumento de las concentraciones de péptidos competidores. La formación de complejos es inhibida por péptidos beta amiloides humanos 1-42 (•), piro 3-42 (♦ ) y piro 11-42 (o). No se observa ninguna inhibición significativa con péptido beta amiloide humano 1-40 (■), formas truncadas de péptido 1-16 (A) y 12-28 (▼) o con el péptido de control negativo (□).
La Figura 10 muestra imágenes de muestras de la tinción inmunohistoquímica in vitro de IgG1-TM Abet0144-GL. (A) Un anticuerpo de control positivo muestra fuerte reconocimiento de placa (puntuación = 4) en secciones de cerebro humano con EA (genotipo de ApoE 3/3; 20 pg/ml anticuerpo). (B) El clon principal IgG1-TM Abet0144-GL muestra cierto reconocimiento de placa (puntuación = 1,5) en una sección de cerebro adyacente (20 pg/ml). (C) El mismo anticuerpo de control positivo muestra fuerte reconocimiento de placa (puntuación = 4) en secciones de cerebro de ratón Tg2576 (ratones de 18 meses de edad; 20 pg/ml anticuerpo). (D) El clon principal IgG1-TM Abet0144-GL muestra cierto reconocimiento de placa (puntuación = 1) en una sección de cerebro de ratón adyacente (20 pg/ml).
La Figura 11 muestra la inhibición de la formación del péptido beta amiloide humano 1-42 y el complejo IgG1-TM Abet0144-GL por aumento de las concentraciones de scFv competidor purificado (•). Cuatro de los clones scFv más potentes, Abet0369 (Figura 11A), Abet0377 (Figura 11B), Abet0380 (Figura 11C) y Abet0382 (Figura 11D), todos muestran una mejoría significativa en potencia sobre la secuencia scFv Abet0144-GL parental (■).
La Figura 12 muestra trazas de Resonancia de Plasmones Superficiales (BIAcore) para el péptido beta amiloide humano 1-42 que se une al anticuerpo IgG1-TM Abet0380-GL inmovilizado a concentraciones de péptido de 1024 nM (traza superior) a 63 pM (traza inferior). Cada traza se ajusta a un modelo de Langmuir 1:1.
La Figura 13 muestra trazas de Resonancia de Plasmones Superficiales (BIAcore) para una serie de péptidos beta amiloides que se unen a anticuerpo IgG1-TM Abet0380-GL inmovilizado. Hay una clara unión al péptido beta amiloide humano biotinilado 1-42 (traza superior) y al péptido beta amiloide murino no marcado 1-42 (segunda traza). No existe una unión discernible al péptido beta amiloide humano biotinilado 1-40 ni al péptido beta amiloide murino no marcado 1-40 (líneas planas).
La Figura 14 muestra imágenes de muestras de la tinción inmunohistoquímica in vitro de IgG1-TM Abet0380-GL. (A) Un anticuerpo de control positivo muestra fuerte reconocimiento de placa (puntuación = 4) en secciones de cerebro humano con EA (genotipo de ApoE 3/3; Braak etapa 6; 5 pg/ml anticuerpo). (B) El clon principal IgG1-TM Abet0380-GL muestra fuerte reconocimiento de placa (puntuación = 3) en una sección de cerebro adyacente (10 pg/ml). (C) El mismo anticuerpo de control positivo muestra fuerte reconocimiento de placa (puntuación = 4) en secciones de cerebro de ratón Tg2576 (ratones de 22 meses de edad; 20 pg/ml anticuerpo). (B) El clon principal IgG1-TM Abet0380-GL muestra fuerte reconocimiento de placa (puntuación = 4) en una sección de cerebro de ratón adyacente (20 pg/ml). La Figura 15 muestra análisis Western Blot de preparación y detección de agregado de Abeta 42 utilizando el IgGITM Abet0380-GL. (A) Detección IgGITM Abet0380-GL de agregado I3A42 no reticulado por foto (no PICUP). (B) Detección IgGITM Abet0380-GL de agregado I3A42 reticulado por foto (PICUP). Aquí demostramos que IgGITM Abet0380-GL reconoce específicamente especies monoméricas uAl-42 y oligoméricas de bajo n hasta e incluyendo pentámero. La Figura 16 muestra la reducción dependiente de dosis del nivel de péptido beta amiloide libre 1-42 en el LCR (A), el aumento de péptido beta amiloide total 1-42 en el tejido cerebral (B) y los niveles no afectados de péptido beta amiloide total 1-40 en el tejido cerebral (C) por dosis crecientes de anticuerpo IgG1-TM Abet0380-GL en ratas Sprague-Dawley que recibieron dosis repetidas semanales por más de 14 días.
La Figura 17 muestra imágenes de muestra a partir del análisis inmunohistoquímico de unión de IgG1-TM Abet0380-GL a placas beta amiloides in vivo 168 horas después de una dosis periférica a ratones Tg2576 envejecidos. Un anticuerpo de control positivo dado a 30 mg/kg muestra fuerte reconocimiento de placa in vivo (A), mientras que IgG1-TM Abet0380-GL dado a 30(B) o 10(C) mg/kg no muestra ninguna decoración de placa in vivo.
La Figura 18 muestra la especificidad de IgG1-TM Abet0380-GL en experimentos de unión en competencia con un intervalo de diferentes concentraciones (10 uM a 0,17nM) de un panel de péptidos Abeta humanos de longitud completa, truncados y piro (Abeta 1-42, Abeta 1-43, Abeta 1-16, Abeta 12-28, Abeta 17-42, Abeta piro-3-42 o Abeta piro-11 -42). Leyenda:
* - Abeta 1-42
-tr- Abeta 1-43
T Abeta 1-16
♦ Abeta 12-28
Abeta 17-42
ir Abeta Piro-3-42
— Abeta Piro 11-42
0 Vehículo 1 (DMSO)
Vehículo 2 (NH4OH)
El eje x muestra la concentración de péptido Abeta en log M, el eje y muestra % de unión específica. La inhibición de la unión de IgG1-TM Abet0380-GL: Biotina Abeta 1-42 N-terminal fue observada con Abeta 1-42, Abeta 1-43, Abeta 17-42, Abeta Piro-3-42 y Abeta Piro-11 -42 con valores IC50 que van desde 10'8 a 10'9 molar para este grupo. Ninguna inhibición de la unión IgG1-TM Abet0380-GL: Biotina Abeta 1-42 N-terminal fue observada con Abeta 1-16 o Abeta 12-28.
La Figura 19 muestra la capacidad del anticuerpo Abet0144-GL para secuestrar beta amiloide 1-42 en un estudio PK-PD de ratas normales. El eje x muestra el vehículo o concentración de Abet0144-GL (10mg/kg o 40 mg/kg), el eje y muestra la concentración de beta amiloide total 1-42 en LCR en pg/ml. Beta amiloide libre 1-42 en el LCR no fue significativamente alterado por cualquiera de 10 o 40 mg/kg de Abet0144-GL (5 y 18% de incremento, respectivamente, en comparación con vehículo). Beta amiloide total 1-42 en LCR fue significativamente mayor en un 38% a 10 mg/kg, y en un 139% a 40 mg/kg. Beta amiloide total 1-42 en tejido cerebral también se incrementó significativamente, en un 16% y 50% a 10 y 40 mg/kg respectivamente. Los datos de este estudio en ratas normales demuestran que Abet0144-GL no tuvo ningún efecto significativo sobre los niveles de beta amiloide libre 1-42 en LCR, mientras que los niveles de beta amiloide total 1-42 tanto en LCR como en el cerebro aumentaron.
Descripción Detallada
Al unir isoformas del péptido pA 1-42 y truncados N-terminales del mismo (n-42) en plasma, cerebro y líquido cefalorraquídeo (LCR), un miembro de unión según la presente descripción puede impedir la acumulación o revertir la deposición de isoformas de pA n- 42 dentro del cerebro y cerebrovasculatura. Los miembros de unión según la presente descripción se pueden unir y precipitado soluble I3A1-42 en el plasma sanguíneo y/o en el líquido cefalorraquídeo (LCR), reduciendo de este modo la concentración de I3A1-42 en el suero y/o LCR, respectivamente. Esto representa una estrategia terapéutica para la enfermedad de Alzheimer y otras condiciones asociadas con amiloidosis.
Los miembros de unión son específicos para el epítopo diana dentro de I3A17-42, más específicamente dentro de I3A29-42, y se unen a este epítopo diana con alta afinidad en relación con epítopos no diana, por ejemplo epítopos de I3A1-40, alcanzando, de este modo, las principales especies tóxicas relacionadas con la formación de placa amiloide. Por ejemplo, un miembro de unión puede mostrar una afinidad de unión por I3A1-42 que es al menos 10 veces, al menos l0o veces, al menos 1000 veces o al menos 10.000veces mayor que para I3A1-40. Por lo tanto, el miembro de unión es selectiva para unirse a I3A1-42 sobre I3A1-40. Como se señaló anteriormente, el miembro de unión puede unirse a I3A1-42 con una constante de disociación (Kd) de 500 pM o menos. Preferiblemente, no muestra ninguna unión significativa a I3A1-40. La afinidad y la unión se pueden determinar usando Resonancia de Plasmones Superficiales usando péptido pA monomérico, tal como se describe en los Ejemplos.
La unión a I3A también se puede medir en un ensayo homogéneo de fluorescencia resuelta en el tiempo (HTRF™), para determinar si el anticuerpo es capaz de competir por la unión a pA con una molécula del anticuerpo de referencia para el péptido pA, como se describe en los Ejemplos.
Un ensayo de HTRF™ es una tecnología de ensayo homogéneo que utiliza la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia entre un fluoróforo donante y otro aceptor que están en estrecha proximidad. Tales ensayos pueden ser utilizados para medir las interacciones macromoleculares por acoplamiento de forma directa o indirecta de una de las moléculas de interés a un fluoróforo donante, criptato de europio (Eu3+), y acoplamiento de la otra molécula de interés a un fluoróforo aceptor XL665, (una aloficocianina reticulada estable). La excitación de la molécula de criptato (a 337 nm) resulta en la emisión de fluorescencia a 620 nm. La energía de esta emisión se puede transferir a XL665 en estrecha proximidad con el criptato, lo que resulta en la emisión de una fluorescencia específica de larga duración (a 665 nm) del XL665. Las señales específicas tanto del donante (a 620 nm) y del aceptor (a 665 nm) se miden, lo que permite el cálculo de una relación de 665/620 nm que compensa la presencia de compuestos coloreados en el ensayo.
Un miembro de unión según la presente descripción puede competir para unirse a I3A1-42 y, por lo tanto, inhibir la unión del anticuerpo de referencia en un ensayo de competencia HTFR™ con I3A1-42, pero no con I3A1-40. Un miembro de unión puede mostrar al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 % o al menos 90 % de inhibición de Abet0144GL para unirse a I3A1-42 en un ensayo HTRF™.
La potencia de inhibición de la unión se puede expresar como un valor IC50, en nM a menos que se indique lo contrario. En ensayos funcionales, IC50 es la concentración de una molécula de anticuerpo que reduce una respuesta biológica en un 50% de su máximo. En estudios de unión a ligandos, IC50 es la concentración que reduce la unión al receptor en un 50% del nivel de unión específica máxima. IC50 puede calcularse mediante el trazado del % de la respuesta biológica máxima en función del logaritmo de la concentración del miembro de unión, y usando un programa de software, tal como Prism (GraphPad) u Origin (Origin Labs) para adaptarse a una función sigmoidal a los datos para generar valores IC50. Ensayos adecuados para medir o determinar la potencia son bien conocidos en la técnica. Un miembro de unión puede tener un IC50 de 5 nM o menos, por ejemplo, 2 nM o menos, por ejemplo 1 nM o menos, en ensayo de competición epítopo HTRF™ con Abet0144-GL y I3A1-42. Abet0144-GL es una molécula de anticuerpo que tiene dominio VH SEQ ID NO: 20 y dominio VL SEQ ID NO: 29. Puede ser utilizada en el ensayo en el mismo formato que la molécula de anticuerpo a probar, por ejemplo, en scFv o IgG, por ejemplo, formato IgG1. Por lo tanto, moléculas de anticuerpo IgG según la presente descripción pueden competir con IgG Abet0144-GL para unirse a I3A1-42 humano en un ensayo de competición epítopo HTRF. La potencia en un ensayo de este tipo puede ser inferior a 1 nM.
Un miembro de unión según la presente descripción puede mostrar unión específica para I3A1-42 sobre I3A1-40, tal como se determina por un ensayo de competición HTRF™. En un ensayo de este tipo, I3A1-40 puede no mostrar inhibición significativa del miembro de unión se une al péptido I3A1-42, por ejemplo, puede mostrar inhibición de menos de 20 %, por ejemplo menos de 10 % o menos de 5 %, en un ensayo de este tipo, y, preferiblemente, no muestra inhibición significativa en un ensayo de este tipo.
Miembros de unión según la presente descripción reconocen un epítopo dentro de I3A17-42 humano, más específicamente dentro de I3A29-42 humano y también puede reconocer su epítopo diana en I3A de otras especies, por ejemplo, ratón o rata. La potencia de un miembro de unión tal conforme calculada en un ensayo de competencia HTRF™ utilizando I3A1-42 de una primera especie (por ejemplo, humana) puede ser comparada con la potencia del miembro de unión en el mismo ensayo usando I3A1-42 de una segunda especie (por ejemplo, I3A1-42 de ratón), con el fin de evaluar la extensión de la reactividad cruzada del miembro de unión para üA1-42 de las dos especies. La potencia, como se determina por mediciones de IC50, puede estar dentro de 10 veces o dentro de 100 veces. Como se señaló anteriormente, Abet0144GL puede ser utilizado como anticuerpo de referencia en el ensayo de competición HTRF™. Miembros de unión descritos en esta invención puede tener una potencia mayor en un ensayo con I3A1-42 humano que en un ensayo con I3A1-42 no humano.
Un miembro de unión puede comprender una molécula de anticuerpo que tiene una o más CDR, por ejemplo, un conjunto de CDR, dentro de una estructura de anticuerpos (es decir, un dominio de unión a antígeno de anticuerpo). Por ejemplo, una molécula de anticuerpo puede comprender un dominio VH y/o VL de anticuerpo. Dominios VH y VL de moléculas de anticuerpo también se proporcionan como parte de la presente descripción. Como es bien conocido, dominios VH y VL comprenden regiones determinantes de complementariedad ("CDR"), y regiones de estructura, ("FW"). Un dominio VH comprende un conjunto de HCDR y un dominio VL comprende un conjunto de LCDR. Una molécula de anticuerpo puede comprender un dominio VH de anticuerpo que comprende una VH CDR1, CDR2 y CDR3 y/o un dominio VL de anticuerpo que comprende una VL CDR1, CDR2 y c DR3. Dominios VH o VL pueden comprender además una estructura. Una estructura de dominio VH o VL comprende típicamente cuatro regiones de estructura, FW1, FW2, FW3 y FW4, que están intercaladas con CDR en la siguiente estructura: FW1 - CDR1 - FW2 -CDR2 - FW3 - CDR3 - FW4.
Ejemplos de dominios VH y VL de anticuerpos, FW y CDR según aspectos de la presente descripción se enumeran en las Tablas 5 y 6 y la lista de secuencias adjunta que forma parte de la presente descripción. Todas las secuencias de VH y VL, secuencias de CDR, conjuntos de CDR, conjuntos de Hc Dr y conjuntos de LCDR descritas en esta invención, así como combinaciones de estos elementos, representan aspectos de la presente descripción. Como se describe en esta invención, un "conjunto de CDR" comprende CDR1, CDR2 y CDR3. Por lo tanto, un conjunto de HCDR se refiere a HCDR1, HCDR2 y HCDR3, y un conjunto de LCDR se refiere a LCDR1, LCDR2 y LCDR3. A menos que se indique lo contrario, un "conjunto de c Dr" incluye HCDR y LCDR. Típicamente moléculas de anticuerpos de la presente descripción son anticuerpos monoclonales.
En otras realizaciones, un miembro de unión puede comprender un sitio de unión a antígeno dentro de una molécula no-anticuerpo, normalmente proporcionada por una o más CDR, por ejemplo, un conjunto de CDR en un andamio de proteínas no-anticuerpo, como se discute más adelante.
El aislamiento de una molécula de anticuerpo parental designado Abet0007, seguido por mutación dirigida de CDR3 y la selección de un anticuerpo optimizado Abet0144, línea germinal a Abet0144-GL con un conjunto de secuencias de CDR y secuencias de estructura como se muestra en las Tablas 5, 6 y la lista de secuencias, se describe en esta invención. A través de un amplio procedimiento de optimización adicional y la recombinación de varias bibliotecas, como se describe en los Ejemplos, un panel de clones de anticuerpos fue generado a partir Abet0144GL. Estos clones optimizados adicionalmente se designan Abet0380, Abet0319, Abet0321b, Abet0322b, Abet0323b, Abet0328, Abet0329, Abet0332, Abet0342, Abet0343, Abet0369, Abet0370, Abet0371, Abet0372, Abet0373, Abet0374, Abet0377, Abet0378, Abet0379, Abet0381, Abet0382 y Abet0383. Sus secuencias de CDR y secuencias de dominio variable son citadas en las Tablas 5 y 6, y reflejadas en el listado de secuencias. Las secuencias de dominio de línea germinal VH y VL Abet0380GL, Abet0377GL, Abet0343GL, Abet0369GL y Abet0382GL se muestran en la Tabla 8 y la Tabla 9. Por ejemplo, las Tablas 5 y 6 muestran que Abet0380 tiene un conjunto de CDR, en el que HCDR1 es SEQ ID NO: 525 (residuos de Kabat 31-35), HCDR2 es SEQ ID NO: 526 (residuos de Kabat 50-65), HCDR3 es SEQ ID NO: 527 (residuos de Kabat 95-102), LCDR1 es SEQ ID NO: 534 (residuos de Kabat 24-34), LCDR2 es SEQ ID NO: 535 (residuos de Kabat 50-56) y LCDR3 es SEQ ID NO: 536 (residuos de Kabat 89-97). Los otros clones de anticuerpos optimizados se muestran en las Tablas 5 y 6 de una manera similar y también se proporcionan como aspectos de la presente descripción.
Un miembro de unión para I3A1-42 humano según la presente descripción puede comprender una o más CDR como se describe en esta invención, por ejemplo un conjunto de CDR. La CDR o conjunto de CDR puede ser un conjunto Abet0380, Abet0319, Abet0321b, Abet0322b, Abet0323b, Abet0328, Abet0329, Abet0332, Abet0342, Abet0343, Abet0369, Abet0370, Abet0371, Abet0372, Abet0373, Abet0374, Abet0377, Abet0378, Abet0379, Abet0381, Abet0382 y Abet0383 de CDR, o una versión de línea germinal de los mismos, o puede ser una variante de los mismos conforme se describe en esta invención.
En algunas realizaciones;
HCDR1 puede ser de 5 aminoácidos de longitud, consiste en los residuos de Kabat 31-35;
HCDR2 puede ser de 17 aminoácidos de longitud, consiste en los residuos de Kabat 50-65;
HCDR3 puede ser de 16 aminoácidos de longitud, consiste en los residuos de Kabat 95-102;
LCDR1 puede ser de 11 aminoácidos de longitud, consiste en los residuos de Kabat 24-34;
LCDR2 puede ser de 7 aminoácidos de longitud, consiste en los residuos de Kabat 50-56; y/o
LCDR3 puede ser de 9 aminoácidos de longitud, consiste en los residuos de Kabat 89-97.
Miembros de unión pueden comprender una HCDR1, HCDR2 y/o HCDR3 y/o una LCDR1, LCDR2 y/o LCDR3 de cualquiera de los anticuerpos listados en las Tablas 5 y 6, por ejemplo, un conjunto de CDR de cualquiera de los anticuerpos listados en la Tabla 5 o 6. El miembro de unión puede comprender un conjunto de VH CDR de cualquiera de estos anticuerpos. Opcionalmente, también puede comprender un conjunto de VL CDR de uno de estos anticuerpos.
Las CDR de VL pueden ser del mismo anticuerpo o de un anticuerpo diferente como las CDR de VH. Un dominio VH que comprende un conjunto de HCDR de cualquiera de los anticuerpos listados en las Tablas 5, y/o un dominio VL que comprende un conjunto de LCDR de cualquiera de los anticuerpos listados en las Tablas 6, también se proporcionan en esta invención.
Un miembro de unión puede comprender un conjunto de CDR H y/o L de cualquiera de los anticuerpos listados en las Tablas 5 y 6 con una o más mutaciones de aminoácidos, por ejemplo hasta 5, 10 o 15 mutaciones, dentro del conjunto descrito de CDR de H y/o L. Una mutación puede ser una sustitución, deleción o inserción de aminoácidos. Por ejemplo, una molécula de anticuerpo de la presente descripción puede comprender el conjunto de CDR H y/o L de cualquiera de Abet0380, Abet0319, Abet0321b, Abet0322b, Abet0323b, Abet0328, Abet0329, Abet0332, Abet0342, Abet0343, Abet0369, Abet0370, Abet0371, Abet0372, Abet0373, Abet0374, Abet0377, Abet0378, Abet0379, Abet0381, Abet0382 y Abet0383, o una versión de línea germinal de los mismos, con una o dos mutaciones de aminoácidos, p. ej., sustituciones.
Por ejemplo, el miembro de unión puede comprender
un dominio VH que comprende el conjunto Abet0380 o Abet0380GL de HCDR, donde las secuencias de aminoácidos de las HCDR Abet0380 o Abet0380GL son
HCDR1 SEQ ID NO: 525,
HCDR2 SEQ ID NO: 526, y
HCDR3 SEQ ID NO: 527,
o comprende el conjunto Abet0380 de HCDR con una o dos mutaciones de aminoácidos, y
(ii) un dominio VL que comprende el conjunto Abet0380 o Abet0380GL de LCDR, donde las secuencias de aminoácidos de las lCd R Abet0380 o Abet0380GL son
LCDR1 SEQ ID NO: 534
LCDR2 SEQ ID NO: 535, y
LCDR3 SEQ ID NO: 536,
o comprende el conjunto Abet0380 o Abet0380GL de LCDR con una o dos mutaciones de aminoácidos.
Las mutaciones pueden potencialmente hacerse en cualquier residuo dentro del conjunto de CDR. En algunas realizaciones, se pueden hacer sustituciones en las posiciones sustituidos en cualquiera de Abet0380, Abet0319, Abet0321b, Abet0322b, Abet0323b, Abet0328, Abet0329, Abet0332, Abet0342, Abet0343, Abet0369, Abet0370, Abet0371, Abet0372, Abet0373, Abet0374, Abet0377, Abet0378, Abet0379, Abet0381, Abet0382 y Abet0383 comparación con Abet0144GL, o en las posiciones sustituidos en cualquiera de Abet0319, Abet0321b, Abet0322b, Abet0323b, Abet0328, Abet0329, Abet0332, Abet0342, Abet0343, Abet0369, Abet0370, Abet0371, Abet0372, Abet0373, Abet0374, Abet0377, Abet0378, Abet0379, Abet0381, Abet0382 y Abet0383 comparado con Abet0380, o versiones de línea germinal de los mismos, como se muestra en las Tablas 5 y 6.
Por ejemplo, una o más sustituciones pueden estar en uno o más de los siguientes residuos de Kabat:
26, 27, 28, 29 o 30 en VH FW1;
31, 32, 33, 34 o 35 en VH CDR1;
52a, 53, 54, 55, 56, 57, 58 o 62 en VH CDR2;
98, 99, 100h o 102 en VH CDR3;
24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 en VL CDR1;
89, 90, 92, 93, 94 o 97 en VL CDR3.
Ejemplos de posibles sustituciones de aminoácidos en posiciones particulares de residuos de Kabat se muestran en las Tablas 12 y 14 para el dominio VH y en las Tablas 13 y 15 para el dominio VL.
Conforme descrito anteriormente, un miembro de unión puede comprender una molécula de anticuerpo que tiene una o más CDR, por ejemplo, un conjunto de CDR, dentro de una estructura de anticuerpos. Por ejemplo, una o más CDR o un conjunto de CDR de un anticuerpo se pueden injertar en una estructura (por ejemplo, estructura humana) para proporcionar una molécula de anticuerpo. Las regiones de estructura pueden ser de secuencias de segmentos de genes de línea germinal humana. Por lo tanto, la estructura puede ser de línea germinal, en la que uno o más residuos en la estructura se cambian para que coincida con los residuos en la posición equivalente en la estructura de la línea germinal humana más similar. El experto puede seleccionar un segmento de línea germinal que sea más cercano en secuencia con la secuencia de estructura del anticuerpo antes de la línea germinal y probar la afinidad o la actividad de los anticuerpos para confirmar que línea germinal no reduce significativamente la unión o la potencia del antígeno en ensayos descritos en esta invención. Secuencias de segmentos de genes de línea germinal humana son conocidos por los expertos en la técnica y se puede acceder a ellos, por ejemplo, a partir de la compilación VBASE (VBASE, MRC Center of Protein Engineering, Reino Unido, 1997, http//mrc-cpe.cam.ac.uk).
Un miembro de unión como se describe en esta invención puede ser una molécula de anticuerpo humano aislado que tiene un dominio VH que comprende un conjunto de HCDR en una estructura de línea germinal humana, por ejemplo, Vh3-23 DP-47. Por lo tanto, las regiones de estructura de dominio VH FW1, FW2 y/o FW3 pueden comprender regiones de estructura de segmento de gen de la línea germinal humana Vh3-23 DP-47 y/o pueden ser la línea germinal mediante la mutación de residuos de estructura para corresponder con los residuos de la estructura de este segmento de gen de la línea germinal humana. FW4 puede comprender una región de estructura de un segmento j de línea germinal humana.
La secuencia de aminoácidos de VH FW1 puede ser SEQ ID NO: 528. VH FW1 contiene una serie de residuos en las posiciones de Kabat 26-30 que se cree que contribuyen a la unión al antígeno y/o son importantes para la conformación estructural del lazo de CDR1. Las sustituciones pueden ser incluidas en la SEQ ID NO: 528, por ejemplo, para sinergizar con la secuencia seleccionada de HCDR1. Una o más sustituciones pueden ser opcionalmente seleccionadas de entre las que se muestran en la Tabla 12 o en la Tabla 14.
La secuencia de aminoácidos de VH FW2 puede ser SEQ ID NO: 529. La secuencia de aminoácidos de VH FW3 puede ser SEQ ID NO: 530. La secuencia de aminoácidos de VH FW4 puede ser SEQ ID NO: 531.
Normalmente, el miembro de unión también tiene un dominio VL que comprende un conjunto de LCDR, por ejemplo, en una estructura de línea germinal humana, por ejemplo V lambda 23-3 DPL-23. Por lo tanto, las regiones de estructura de dominio VL pueden comprender regiones FW1, FW2 y/o FW3 de segmento de gen de la línea germinal humana V lambda 23-3 DPL-23 y/o pueden ser la línea germinal mediante la mutación de residuos de estructura para corresponder con los residuos de la estructura de este segmento de gen de la línea germinal humana. FW4 puede comprender una región de estructura de un segmento j de línea germinal humana. La secuencia de aminoácidos de VL FW1es SEQ ID NO: 537. La secuencia de aminoácidos de VL FW2 es SEQ ID NO: 538. La secuencia de aminoácidos de VL FW3 es SEQ ID NO: 539. La secuencia de aminoácidos de VL FW4 es SEQ ID NO: 540.
Un dominio VH o VL de línea germinal puede o puede no ser la línea germinal en uno o más residuos de Vernier, pero no lo es normalmente.
Por ejemplo, una molécula de anticuerpo o un dominio VH como se describe en esta invención pueden comprender el siguiente conjunto de regiones de estructura de cadena pesada:
FW1 SEQ ID NO: 528;
FW2 SEQ ID NO: 529;
FW3 SEQ ID NO: 530;
FW4 SEQ ID NO: 531;
o puede comprender el referido conjunto de regiones de estructura de cadena pesada con 1,2, 3, 4, 5, 6 o 7 mutaciones de aminoácidos, por ejemplo, sustituciones.
Una molécula de anticuerpo o un dominio VH como se describe en esta invención pueden comprender el siguiente conjunto de regiones de estructura de cadena ligera:
FW1 SEQ ID NO: 537;
FW2 SEQ ID NO: 538;
FW3 SEQ ID NO: 539;
FW4 SEQ ID NO: 540;
o puede comprender el referido conjunto de regiones de estructura de cadena ligera con 1, 2, 3, 4, 5 o 6 mutaciones de aminoácidos, por ejemplo, sustituciones.
Una molécula de anticuerpo de línea no germinal tiene las mismas CDR, pero diferentes estructuras, en comparación con una molécula de anticuerpo de línea germinal. De las secuencias de anticuerpos que se muestran en esta invención en la lista de secuencias adjunta, las secuencias de Abet0144-GL, Abet0380-GL, Abet0377-GL, Abet0343-GL, Abet0369-GL y Abet0382-GL están a la línea germinal. Anticuerpos de línea germinal de otras moléculas de anticuerpos cuyas secuencias se describen en esta invención pueden producirse por regiones de estructura de línea germinal de sus secuencias de dominio VH y VL, opcionalmente a Vh3-23 DP-47 en el dominio VH y V lambda 23-3 DPL-23 en el dominio VL.
Típicamente, un dominio VH se combina con un dominio VL para proporcionar un sitio de unión a antígeno de anticuerpo, aunque como se discutió anteriormente, un dominio VH o VL solo puede ser usado para unir antígeno. Por ejemplo, el dominio VH Abet0380-GL (SEQ ID NO: 524) puede estar emparejado con el dominio VL Abet0380-GL (ID SEC NO:533), de manera que un sitio de unión a antígeno de anticuerpo es formado comprendiendo ambos dominios VH y VL Abet0380-GL. Realizaciones análogas se proporcionan para los dominios VH y VL de los otros anticuerpos descritos en esta invención. En otras realizaciones, el dominio VH Abet0380-GL está emparejado con un dominio VL distinto del VL Abet0380-GL. La promiscuidad de cadenas ligeras está bien establecida en la técnica. Una vez más, realizaciones análogas son proporcionadas por la presente descripción para los otros dominios VH y VL descritos en esta invención. Por tanto, el dominio VH comprende las CDR VH o la secuencia de dominios VH de línea germinal de cualquiera de Abet0319, Abet0321b, Abet0322b, Abet0323b, Abet0328, Abet0329, Abet0332, Abet0342, Abet0343, Abet0369, Abet0370, Abet0371, Abet0372, Abet0373, Abet0374, Abet0377, Abet0378, Abet0379, Abet0380, Abet0381, Abet0382 y Abet0383 puede ser pareado con un dominio VL que comprende las CDR VL o dominio VL de línea germinal de un anticuerpo diferente, por ejemplo, los dominios VH y VL pueden ser de diferentes anticuerpos seleccionados de Abet0319, Abet0321 b, Abet0322b, Abet0323b, Abet0328, Abet0329, Abet0332, Abet0342, Abet0343, Abet0369, Abet0370, Abet0371, Abet0372, Abet0373, Abet0374, Abet0377, Abet0378, Abet0379, Abet0380, Abet0381, Abet0382 y Abet0383.
Un miembro de unión puede comprender
(i) una secuencia de aminoácidos de dominio VH como se muestra en la Tabla 16 para cualquiera de Abet0380, Abet0343, Abet0369, Abet0377 y Abet0382, o una versión de línea germinal de los mismos,
o puede comprender aquella secuencia de aminoácidos con una o dos mutaciones de aminoácidos; y
(ii) una secuencia de aminoácidos de dominio VL como se muestra en la Tabla 16 para cualquiera de Abet0380, Abet0343, Abet0369, Abet0377 y Abet0382, o una versión de línea germinal de los mismos,
o puede comprender aquella secuencia de aminoácidos con una o dos mutaciones de aminoácidos.
Una molécula de anticuerpo puede comprender:
(i) un dominio VH que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90%, 95% o 98% idéntica a una secuencia de aminoácidos del dominio VH que se muestra en la Tabla 16 para cualquiera de Abet0380, Abet0343, Abet0369, Abet0377 y Abet0382, o una versión de línea germinal de los mismos; y
(ii) un dominio VL que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90%, 95% o 98% idéntica a una secuencia de aminoácidos del dominio VL que se muestra en la Tabla 16 para cualquiera de Abet0380, Abet0343, Abet0369, Abet0377 y Abet0382, o una versión de línea germinal de los mismos.
Esto puede comprender un dominio VH y un dominio VL al menos 90%, 95% o 98% idénticos con el dominio VH y el dominio VL, respectivamente, de cualquiera de Abet0380, Abet0343, Abet0369, Abet0377 y Abet0382, o una versión de línea germinal de los mismos.
Un miembro de unión puede comprender un dominio VH y un dominio VL en el que;
(i) la secuencia de aminoácidos del dominio VH se muestra en SEQ ID NO: 524 y la secuencia de aminoácidos del dominio VL se muestra en SEQ ID NO: 533.
(ii) la secuencia de aminoácidos del dominio VH tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sustituciones de aminoácidos en comparación con SEQ ID NO: 524 y la secuencia de aminoácidos del dominio VL tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sustituciones de aminoácidos en comparación con SEQ ID NO: 533; o
(iii) la secuencia de aminoácidos del dominio VH tiene al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 524 y la secuencia de aminoácidos del dominio VL tiene al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 533.
En algunas realizaciones, una molécula de anticuerpo puede carecer de regiones constantes de anticuerpos, por ejemplo, un scFv.
En otras realizaciones, una molécula de anticuerpo puede comprender una región constante de anticuerpo. Una molécula de anticuerpo puede ser un anticuerpo completo, tal como una IgG, es decir, una IgG1, IgG2, o IgG4, o puede ser un fragmento o derivado de anticuerpo como se describe a continuación. Moléculas de anticuerpo también pueden tener otros formatos, por ejemplo IgG1 con YTE (Dall'Acqua y col. (2002) J. Immunology, 169: 5171-5180; Dall'Acqua y col. (2006) J Biol. Chem. 281 (33):23514-24) y/o mutaciones TM (Oganesyan y col. (2008) Acta Cryst D64:700-4) en la región Fc.
La presente descripción proporciona un miembro de unión de la presente descripción con una región Fc variante, donde la variante comprende un residuo de fenilalanina (F) en la posición 234, un residuo de fenilalanina (F) o un residuo de ácido glutámico (E) en la posición 235 y un residuo de serina (S) en la posición 331, según se numera por el índice EU como se establece en Kabat. Tales combinaciones de mutaciones se denominan en lo adelante como el triple mutante (TM).
[0093]Un miembro de unión como se describe en esta invención puede comprender una CDR, dominio VH, dominio Vl , sitio de unión anticuerpo-antígeno o molécula de anticuerpo que están codificados por las secuencias de ácidos nucleicos y/o el vector de cualquiera de:
(i) número de acceso de depósito NCIMB 41889 (Abet0007);
(ii) número de acceso de depósito NCIMB 41890 (Abet0380-GL);
(iii) número de acceso de depósito NCIMB 41891 (Abet0144-GL);
(iv) número de acceso de depósito NCIMB 41892 (Abet0377-GL).
Un miembro de unión como se describe en esta invención puede ser producido o producible a partir del ácido nucleico, vector o línea celular de número de acceso de depósito NCIMB 41889, 41890, 41891 o 41892. Por ejemplo, un miembro de unión puede ser producido por expresión del ácido nucleico o vector de la línea celular de número de acceso de depósito NCIMB 41890. El ácido nucleico o vector se pueden expresar por cualquier sistema de expresión conveniente. Alternativamente, el miembro de unión puede ser expresado por la línea celular de número de acceso de depósito NCIMB 41889, 41890, 41891 o 41892.
Los aspectos de la presente descripción también proporcionan ácido nucleico que codifica los dominios VH y/o VL, que está contenido en la línea celular de número de acceso 41889, 41890, 41891 o 41892; un vector que comprende dicho ácido nucleico, que está contenido en la línea celular de número de acceso 41889, 41890, 41891 o 41892; y las células o línea celular de número de acceso 41889, 41890, 41891 o 41892.
Un miembro de unión según la presente descripción puede comprender un sitio de unión antígeno-anticuerpo o molécula de anticuerpo que compite para unirse a I3A1-42 humano con cualquier molécula de anticuerpo codificado por ácido nucleico depositado bajo el número de acceso 41889, 41890, 41891 o 41892, o con una molécula de anticuerpo que comprende el dominio VH y el dominio VL, secuencias de aminoácidos de Abet007, Abet0380-GL, Abet0144-GL o Abet0377-GL tal como se establece en la lista de secuencias adjunta.
Miembro de unión
El término miembro de unión describe un miembro de un par de moléculas que se unen entre sí. Los miembros de un par de unión pueden ser derivados naturalmente o pueden ser producidos sintéticamente total o parcialmente. Un miembro del par de moléculas tiene un área en su superficie, o una cavidad, que se une y es por lo tanto complementaria a una organización espacial y polar particular del otro miembro del par de moléculas. Ejemplos de tipos de pares de unión son antígeno-anticuerpo, biotina-avidina, receptor hormona-hormona, receptor-ligando, enzima-substrato. La presente descripción se refiere a reacciones de tipo antígeno-anticuerpo.
Un miembro de unión comprende normalmente una molécula que tiene un sitio de unión a antígeno. Por ejemplo, un miembro de unión puede ser una molécula de anticuerpo o una proteína sin anticuerpo que comprende un sitio de unión a antígeno.
Un sitio de unión a antígeno puede proporcionarse por medio de disposición de CDR en andamios de proteínas sin anticuerpos, tales como fibronectina o citocromo B etc. [Haan & Maggos (2004) BioCentury, 12 (5): A1-A6; Koide y col. (1998) Journal of Molecular Biology, 284: 1141-1151; Nygren y col. (1997) Current Opinion in Structural Biology, 7: 463-469i], o mediante aleatorización o mutación de residuos de aminoácidos de un lazo dentro de un andamio de proteínas para conferir especificidad de unión para una diana deseada. Andamios para ingeniería de nuevos sitios de unión se han revisado en detalle por Nygren y col. [supra]. Andamios de proteínas para miméticos de anticuerpos se describen en el documento WO00/34784, en el que los inventores describen proteínas (miméticos de anticuerpos) que incluyen un dominio de fibronectina tipo III que tiene al menos un lazo aleatorizado. Un andamio adecuado en el que injertar una o más CDR, por ejemplo, un conjunto de HCDR o una HCDR3 y/o LCDR3, puede ser proporcionado por cualquier miembro de dominio de la superfamilia del gen de la inmunoglobulina. El andamio puede ser una proteína humana o no humana. Una ventaja de un andamio de proteínas sin anticuerpos es que puede proporcionar un sitio de unión a antígeno en una molécula de soporte que es más pequeña y/o más fácil de fabricar que al menos algunas moléculas de anticuerpo. El pequeño tamaño de un miembro de unión puede conferir propiedades fisiológicas útiles, tales como la capacidad de entrar en las células, penetrar profundamente en los tejidos o alcanzar las dianas dentro de otras estructuras, o para unirse dentro de cavidades de proteínas del antígeno diana. El uso de sitios de unión a antígeno en andamios de proteínas sin anticuerpos es revisado en Weiss, 2004 [Wess, L. In: BioCentury, The Bernstein Report on BioBusiness, 12(42), A1-A7, 2004]. Proteínas que tienen una cadena principal estable y uno o más lazos variables son típicas, en las que la secuencia de aminoácidos del lazo o lazos es específica o aleatoriamente mutada para crear un sitio de unión a antígeno que se une al antígeno diana. Tales proteínas incluyen dominios de unión a IgG de proteína A de S. aureus, transferrina, tetranectina, fibronectina (por ejemplo, dominio de 10a fibronectina tipo III), lipocalinas, así como gamma-cristalina y otros andamios Affilin™ (Scil Proteins). Ejemplos de otras estrategias incluyen "Microcuerpos" sintéticos basado en ciclótidos - pequeñas proteínas que tienen enlaces disulfuro intramoleculares, microproteínas (Versabodies™, Amunix) y proteínas de repetición anquirina (DARPins, Molecular Partners).
Además de las secuencias de anticuerpos y/o un sitio de unión a antígeno, un miembro de unión puede comprender otros aminoácidos, p.ej., formando un péptido o polipéptido, tal como un dominio plegado, o para impartir a la molécula otra característica funcional, además de la capacidad de unirse al antígeno. Miembros de unión pueden llevar un marcador detectable, o pueden conjugarse con una toxina o una fracción o enzima diana (por ejemplo, mediante un enlace peptidil o conector). Por ejemplo, un miembro de unión puede comprender un sitio catalítico (por ejemplo, en un dominio de enzima), así como un sitio de unión a antígeno, donde el sitio de unión se une al antígeno y, por lo tanto, se orienta al sitio catalítico hacia el antígeno. El sitio catalítico puede inhibir la función biológica del antígeno, por ejemplo, por escisión.
Aunque, como se señaló, las CDR pueden ser transportadas por andamios sin anticuerpos, la estructura para transportar una CDR, p.ej., CDR3, o un conjunto de CDR de la presente descripción, generalmente será una secuencia de cadena pesada o ligera de anticuerpos o una porción sustancial de la misma en la que la CDR o conjunto de CDR está ubicado en un lugar correspondiente a la CDR o conjunto de CDR de dominios variables de anticuerpos VH y VL naturales codificados por genes de inmunoglobulina reorganizados. Las estructuras y ubicaciones de dominios variables de inmunoglobulina pueden determinarse por referencia a Kabat, y col., 1987 [Kabat, E.A. y col, Sequences of Proteins of Immunological Interest. 4a Edición. US Department of Health and Human Services. 1987] y actualizaciones de los mismos. Un número de recursos académicos y comerciales en línea están disponibles para consultar esta base de datos. Por ejemplo, ver Martin, A.C.R. Accessing the Kabat Antibody Sequence Database by Computer PROTEINS: Structure, Function and Genetics, 25 (1996), 130-133 y el recurso en línea asociado, actualmente en la dirección web de http://www.bioinf.org.uk/abs/simkab.html.
Por región CDR o CDR, se pretende indicar las regiones hipervariables de las cadenas pesada y ligera de la inmunoglobulina como se define por Kabat y col. 1991 [Kabat, E.A. y col. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Edición. US Department of Health and Human Services, Public Service, NIH, Washington], y ediciones posteriores. Un anticuerpo contiene típicamente 3 CDR de cadena pesada y 3 CDR de la cadena ligera. El término CDR se utiliza aquí con el fin de indicar, según el caso, una o varias de estas regiones, o incluso la totalidad, de estas regiones que contienen la mayoría de los residuos de aminoácidos responsables de la unión por afinidad del anticuerpo para el antígeno o el epítopo que reconoce.
Entre las seis secuencias cortas de CDR, la tercera CDR de la cadena pesada (HCDR3) tiene mayor variabilidad en tamaño (mayor diversidad esencialmente debido a los mecanismos de disposición de los genes que dan lugar a ella). Puede ser tan corto como 2 aminoácidos, aunque el tamaño más largo conocido es 26. La longitud de la CDR también puede variar según la longitud que puede ser acomodada por la estructura particular subyacente. Funcionalmente, HCDR3 juega un papel, en parte, en la determinación de la especificidad del anticuerpo (Segal y col., PNAS, 71:4298-4302, 1974; Amit y col., Science, 233:747-753, 1986; Chothia y col., J. Mol. Biol., 196:901-917, 1987; Chothia y col., Nature, 342:877- 883, 1989; Caton y col., J. Immunol., 144:1965-1968, 199; Sharon y col., PNAS, 87:4814-4817, 1990; Sharon y col., J. Immunol., 144:4863-4869, 1990; y Kabat y col., J. Immunol., 147:1709-1719, 1991).
Molécula de Anticuerpo
Esto describe una inmunoglobulina, ya sea natural o producida total o parcialmente de manera sintética. El término también cubre cualquier polipéptido o proteína que comprenda un sitio de unión a antígeno de anticuerpo. Se debe entender aquí que la presente descripción no se refiere a los anticuerpos en forma natural, es decir que no están en su entorno natural, sino que han sido capaces de ser aislados u obtenidos por purificación a partir de fuentes naturales, u obtenidos por recombinación genética, o por síntesis química, y que pueden a continuación contener aminoácidos no naturales, como se describirá más tarde. Fragmentos de anticuerpos que comprenden un sitio de unión antígenoanticuerpo incluyen, pero no se limitan a, moléculas tales como Fab, Fab', Fab'-SH, scFv, Fv, dAb y Fd. Varias otras moléculas de anticuerpos que incluyen uno o más sitios de unión antígeno-anticuerpo han sido diseñados, incluyendo, por ejemplo Fab2, Fab3, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y minicuerpos. Moléculas de anticuerpos y procedimientos para su construcción y uso se describen en Holliger & Hudson, Nature Biotechnology 23 (9): 1126­ 11362005.
Es posible tomar anticuerpos monoclonales y otros y usar técnicas de tecnología de ADN recombinante para producir otros anticuerpos o moléculas quiméricas que se unen al antígeno diana. Dichas técnicas pueden implicar la introducción de ADN que codifica la región variable de inmunoglobulina, o las CDR, de un anticuerpo a las regiones constantes, o regiones constantes más regiones de estructura, de una inmunoglobulina diferente. Ver, por ejemplo, EP-A-184187, GB 2188638A o EP-A-239400, y una gran cantidad de bibliografía posterior. Un hibridoma u otra célula que produce un anticuerpo pueden estar sujetas a mutación genética u otros cambios, que pueden alterar o no la especificidad de unión de los anticuerpos producidos.
Como los anticuerpos pueden modificarse de varias maneras, el término "molécula de anticuerpo" debe interpretarse como que cubre cualquier miembro o sustancia de unión que tenga un sitio de unión a antígeno de anticuerpo con la especificidad y/o unión a antígeno requeridas. Por lo tanto, este término cubre fragmentos de anticuerpos y derivados, incluyendo cualquier polipéptido que comprenda un sitio de unión a antígeno de anticuerpo, ya sea natural o total o parcialmente sintético. Las moléculas quiméricas que comprenden un sitio de unión antígeno-anticuerpo, o equivalente, fusionado a otro polipéptido (por ejemplo, derivados de otras especies o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpo), por lo tanto están incluidos. La clonación y expresión de anticuerpos quiméricos se describen en EP-A-0120694 y EP-A-0125023, y una gran cantidad de bibliografía posterior.
Otras técnicas disponibles en la técnica de la ingeniería de anticuerpos han hecho posible aislar anticuerpos humanos y humanizados. Por ejemplo, hibridomas humanos pueden prepararse como se describe por Kontermann & Dubel [Kontermann, R & Dubel, S, Antibody Engineering, Springer-Verlag Nueva York, LLC; 2001, ISBN: 3540413545]. Presentación de fagos, otra técnica establecida para la generación de miembros de unión, ha sido descrita en detalle en muchas publicaciones, como Kontermann & Dubel [supra] y WO92/01047 (discutido más adelante), y Patentes de Estados Unidos US5969108, US5565332, US5733743, US5858657, US5871907, US5872215, US5885793, US5962255, US6140471, US6172197, US6225447, US6291650, US6492160, US6521404.
Ratones transgénicos en los que los genes de anticuerpos de ratón son inactivados y reemplazados funcionalmente con genes de anticuerpos humanos, dejando intactos otros componentes del sistema inmune del ratón, se pueden utilizar para aislar anticuerpos humanos [Mendez, M. y col. (1997) Nature Genet, 15 (2): 146-156]. Anticuerpos humanizados pueden producirse usando técnicas conocidas en la técnica tales como las descritos en, por ejemplo, WO91/09967, US5.585.089, EP592106, US565332 y WO93/17105. Además, el documento WO2004/006955 describe procedimientos para la humanización de anticuerpos, en base a la selección de secuencias de estructura de regiones variables de genes de anticuerpos humanos mediante la comparación de tipos de estructuras de CDR canónicas para secuencias de CDR de la región variable de un anticuerpo no humano a tipos de estructuras de CDR canónicas para CDR correspondientes de una biblioteca de secuencias de anticuerpos humanos, por ejemplo segmentos de genes de anticuerpos de línea germinal. Regiones variables de anticuerpos humanos que tienen tipos de estructuras de CDR canónicas similares a las CDR no humanas forman un subconjunto de secuencias de anticuerpos humanos miembros de los cuales se seleccionan secuencias de estructuras humanas. Los miembros del subconjunto pueden clasificarse adicionalmente por la similitud de aminoácidos entre las secuencias de CDR humanas y no humanas. En el procedimiento del documento WO2004/006955, las mejor clasificadas secuencias humanas se seleccionan para proporcionar las secuencias estructura para la construcción de un anticuerpo quimérico que, funcionalmente, sustituya secuencias de CDR humanas con las contrapartes de CDR no humanas utilizando las estructuras humanas miembros del subconjunto seleccionado, proporcionando de este modo un anticuerpo humanizado de alta afinidad y baja inmunogenicidad sin necesidad de comparación de secuencias de estructura entre los anticuerpos no humanos y humanos. También se describen anticuerpos quiméricos hechos según el procedimiento.
Moléculas de anticuerpos sintéticos pueden ser creadas por la expresión a partir de genes generados por medio de oligonucleótidos sintetizados y ensamblados dentro de vectores de expresión adecuados, por ejemplo como se describe por Knappik y col. [Knappik y col. J. Mol. Biol. (2000) 296, 57-86] o Krebs y col. [Krebs y col. Journal of Immunological Methods 254200167-84].
Se ha demostrado que fragmentos de un anticuerpo completo pueden realizar la función de antígenos de unión. Ejemplos de fragmentos de unión son (i) el fragmento Fab que consiste en dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) el fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iii) el fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un solo anticuerpo; (iv) el fragmento dAb [Ward, E.S. y col., Nature 341, 544-546 (1989); McCafferty y col. (1990) Nature, 348, 552-554; Holt y col. (2003) Trends in Biotechnology 21, 484-490], que consiste en un dominio VH o VL; (v) regiones CDR aisladas; (vi) fragmentos F(ab') 2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos (vii) moléculas Fv de cadena única (scFv), donde un dominio VH y un dominio VL están unidos por un conector peptídico que permite que los dos dominios se asocien para formar un sitio de unión a antígeno [Bird y col., Science, 242, 423­ 426, 1988; Huston y col., PNAS USA, 85, 5879-5883, 1988]; (viii) dímeros Fv biespecíficos de cadena sencilla (PCT/US92/09965) y (ix) "diacuerpos", fragmentos multivalentes o multiespecíficos construidos por fusión génica (WO94/13804; Holliger, P. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 906444-6448, 1993). Fv, scFv o moléculas de diacuerpos pueden estabilizarse mediante la incorporación de puentes disulfuro que unen los dominios VH y VL [Reiter, Y. y col., Nature Biotech, 14, 1239-1245, 1996]. También se pueden hacer minicuerpos que comprenden un scFv unido a un dominio CH3 [Hu, S. y col., Cancer Res., 56, 3055-3061, 1996]. Otros ejemplos de fragmentos de unión son Fab', que difiere de los fragmentos Fab por la adición de unos pocos residuos en el extremo carboxilo del dominio CH1 de cadena pesada, incluyendo una o más cisteínas de la región de articulación del anticuerpo, y Fab'-SH, que es un fragmento Fab' en el que el(los) residuo(s) de cisteína de los dominios constantes porta(n) un grupo tiol libre.
Qui y col. [Qui y col., Nat. Biotechnol. 25:921-9292007] describió moléculas de anticuerpos que contienen sólo dos CDR unidas por una región de estructura. CDR3 del dominio VH o VL fue ligada al lazo CDR1 o CDR2 del otro dominio. El vínculo fue a través del extremo C de la CDR1 o CDR2 seleccionada al extremo N de la CDR3, a través de una región FR. Qui y col. seleccionaron la región FR que tiene la menor cantidad de parches hidrófobos. Se encontró que la mejor combinación para el anticuerpo probado era VL CDR1 vinculado por VH FR2 a VH CDR3 (VHCDR1-VHFR2-VLCDR3). A un peso molecular de alrededor de 3 kDa, estas moléculas de anticuerpo ofrecen ventajas en términos de penetración mejorada en el tejido en comparación con inmunoglobulinas completas (aprox. 150 kDa) o scFv (aprox.
28 kDa).
Fragmentos de anticuerpos de la presente descripción se pueden obtener a partir de cualquiera de los anticuerpos enumerados en esta invención, por procedimientos tales como digestión por enzimas, por ejemplo pepsina o papaína y/o por escisión de puentes disulfuro por reducción química. En otra forma, los fragmentos de anticuerpos comprendidos en la presente descripción se pueden obtener mediante técnicas de recombinación genética igualmente bien conocidas por la persona experta en la técnica o bien por síntesis de péptidos por medio de, por ejemplo, sintetizadores automáticos de péptidos, tales como los suministrados por la compañía Applied Biosystems, etc., o por síntesis y expresión de ácidos nucleicos.
Fragmentos de anticuerpos funcionales según la presente descripción incluyen cualquier fragmento funcional cuya vida media se incrementa por una modificación química, especialmente por PEGilación, o por incorporación en un liposoma.
Un dAb (anticuerpo de dominio) es un pequeño fragmento unido a antígeno monomérico de un anticuerpo, a saber, la región variable de una cadena pesada o ligera de anticuerpo. VH dAb se producen naturalmente en camélidos (por ejemplo, camello, llama) y pueden producirse mediante inmunización de un camélido con un antígeno diana, aislando células B específicas de antígeno y clonando directamente genes dAb a partir de células B individuales. dAb son también producibles en cultivo celular. Su pequeño tamaño, buena solubilidad y estabilidad de la temperatura los hacen particularmente útiles y adecuados fisiológicamente para selección y maduración por afinidad. VH dAb de camélidos están siendo desarrollados para uso terapéutico bajo el nombre de "nanocuerpos™". Un miembro de unión de la presente descripción puede ser un dAb que comprende un dominio VH o VL sustancialmente como se establece en esta invención, o un dominio VH o VL que comprende un conjunto de CDR sustancialmente como se establece en esta invención.
Anticuerpos biespecíficos o bifuncionales forman una segunda generación de anticuerpos monoclonales en los que dos regiones variables diferentes se combinan en la misma molécula [Holliger y Bohlen (1999) Cancer and Metastasis Rev. 18: 411-419]. Su uso ha sido demostrado tanto en el campo del diagnóstico como en el campo de la terapia a partir de su capacidad para reclutar nuevas funciones efectoras o para alcanzar varias moléculas en la superficie de células tumorales. Cuando se van a utilizar anticuerpos biespecíficos, estos pueden ser anticuerpos biespecíficos convencionales, que se pueden fabricar de varias maneras. [Holliger, P. and Winter G. Current Opinion Biotechnol 4, 446-449. 1993], por ejemplo, preparados químicamente o a partir de hibridomas híbridos, o pueden ser cualesquiera de los fragmentos de anticuerpos biespecíficos mencionados anteriormente. Estos anticuerpos se pueden obtener por procedimientos químicos [Glennie MJ y col., 1987 J. Immunol. 139, 2367-2375; Repp R. y col., 1995 J. Hemat. 377­ 382] o procedimientos somáticos [Staerz UD y Bevan MJ 1986 PNAS 83; Suresh m R y col., 1986 Methods Enzymol.
121: 210-228] pero igual y preferentemente por técnicas de ingeniería genética que permiten que la heterodimerización sea forzada y así facilitar el procedimiento de purificación del anticuerpo buscado [Merchand y col., 1998 Nature Biotech. 16:677-681]. Ejemplos de anticuerpos biespecíficos incluyen los de la tecnología BiTE™ en la que los dominios de unión de dos anticuerpos con diferente especificidad se pueden utilizar y son directamente conectados a través de péptidos flexibles cortos. Esto combina dos anticuerpos en una cadena corta de un único polipéptido. Diacuerpos y scFv pueden construirse sin una región Fc, usando sólo dominios variables, reduciendo potencialmente los efectos de reacción anti-idiotípica.
Anticuerpos biespecíficos se pueden construir como IgG completo, como Fab'2 biespecífico, como Fab'PEG, como diacuerpos o bien como scFv biespecífico. Además, dos anticuerpos biespecíficos se pueden enlazar usando procedimientos de rutina conocidos en la técnica para formar anticuerpos tetravalentes.
Diacuerpos biespecíficos, a diferencia de anticuerpos completos biespecíficos, también pueden ser particularmente útiles porque pueden construirse fácilmente y expresarse en E. coli. Diacuerpos (y muchos otros polipéptidos, como fragmentos de anticuerpos) de especificidades de unión apropiadas se pueden seleccionar fácilmente usando la presentación de fagos (WO94/13804) de bibliotecas. Si un brazo del diacuerpo se va a mantener constante, por ejemplo, con una especificidad dirigida contra el beta amiloide como se describe en esta invención, a continuación, se puede hacer una biblioteca donde se varía el otro brazo y se selecciona un anticuerpo de especificidad apropiada. Anticuerpos completos biespecíficos se pueden preparar por procedimientos de ingeniería alternativa como se describe en Ridgeway y col., 1996 [Ridgeway, JBB y col., Protein Eng., 9, 616-621, 1996].
Varios procedimientos están disponibles en la técnica para la obtención de anticuerpos. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monoclonales, especialmente de origen humano, murino, origen quimérico o humanizado, que se pueden obtener según los procedimientos estándar bien conocidos para el experto en la materia.
En general, para la preparación de anticuerpos monoclonales o sus fragmentos funcionales, especialmente de origen murino, es posible referirse a las técnicas que se describen en particular en el manual "Anticuerpos" [Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pp 726, 1988.] o a la técnica de preparación a partir de hibridomas descrita por Kohler y Milstein [Kohler & Milstein, Nature, 256:495-497, 1975]. Anticuerpos monoclonales se pueden obtener, por ejemplo, de una célula animal inmunizada con I3A1-42 humano, o uno de sus fragmentos que contienen el epítopo reconocido por dichos anticuerpos monoclonales, por ejemplo, I3A17-42. Fragmentos y péptidos o polipéptidos adecuados que comprenden los mismos se describen en esta invención, y se pueden usar para inmunizar animales para generar anticuerpos contra I3A1-42. Dicho antígeno, o uno de sus fragmentos, puede especialmente ser producido según los procedimientos de trabajo habituales, por recombinación genética a partir de una secuencia de ácidos nucleicos contenida en la secuencia de ADNc que codifica I3A1-42 o fragmento de la misma, mediante síntesis de péptidos a partir de una secuencia de aminoácidos comprendida en la secuencia peptídica del I3A1-42 y/o fragmento del mismo.
Los anticuerpos monoclonales pueden, por ejemplo, purificarse en una columna de afinidad en la que Ap1-42 humano o uno de sus fragmentos que contiene el epítopo reconocido por dichos anticuerpos monoclonales, p.ej., Ap17-42, ha sido previamente inmovilizado. Más particularmente, los anticuerpos monoclonales se pueden purificar por cromatografía sobre proteína A y/o G, seguida o no seguida de cromatografía de intercambio iónico destinada a eliminar los contaminantes proteicos residuales, así como el ADN y el LPS, en sí mismos, seguida o no seguida por cromatografía de exclusión en gel Sepharose para eliminar los agregados potenciales debido a la presencia de dímeros o de otros multímeros. En una realización, el conjunto de estas técnicas se puede utilizar simultánea o sucesivamente.
Sitio de unión a antígeno
Esto describe la parte de una molécula que se une a y es complementaria a todo o parte del antígeno diana. En una molécula de anticuerpo, esto se conoce como el sitio de unión antígeno-anticuerpo, y comprende la parte del anticuerpo que se une a y es complementaria a todo o parte del antígeno diana. Cuando un antígeno es grande, un anticuerpo puede unirse sólo a una parte particular del antígeno, parte que se denomina un epítopo. Un sitio de unión antígeno-anticuerpo puede ser proporcionado por uno o más dominios variables de anticuerpos. Un sitio de unión antígeno-anticuerpo puede comprender una región variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) y una región variable de cadena pesada de anticuerpo (VH).
El documento WO 2006/072620 describe la ingeniería de sitios de unión a antígenos en lazos estructurales (sin CDR) que se extienden entre filamentos beta de dominios de inmunoglobulina. Un sitio de unión a antígeno puede ser diseñado en una región de una molécula de anticuerpo separada de la ubicación natural de las CDR, por ejemplo, en una región de estructura de un dominio VH o VL, o en un dominio constante de anticuerpo, por ejemplo, CH1 y/o CH3. Un sitio de unión a antígeno diseñado en una región estructural puede ser adicional a, o en lugar de, un sitio de unión a antígeno formado por conjuntos de CDR de un dominio VH y VL. Cuando múltiples sitios de unión a antígenos están presentes en una molécula de anticuerpo, pueden unirse al mismo antígeno (antígeno diana), aumentando así la valencia del miembro de unión. Alternativamente, múltiples sitios de unión a antígenos pueden unir diferentes antígenos (el antígeno diana y uno u otros antígenos más), y esto puede ser usado para añadir funciones efectoras, prolongar la vida media o mejorar la entrega in vivo de la molécula de anticuerpo.
Aislado
Esto se refiere al estado en el que los miembros de unión de la presente descripción, o ácido nucleico que codifica tales miembros de unión, estarán generalmente en conformidad con la presente descripción. Por lo tanto, miembros de unión, dominios VH y/o VL, y moléculas de ácido nucleico y vectores que codifican según la presente descripción pueden proporcionarse aislados y/o purificados, p.ej., de su entorno natural, en forma sustancialmente pura u homogénea, o, en el caso de ácido nucleico, libres o sustancialmente libres de ácido nucleico o genes de origen distintos de la secuencia que codifica un polipéptido con la función requerida. Miembros aislados y ácido nucleico aislado estarán libres o sustancialmente libres de material con el que están asociados naturalmente tal como otros polipéptidos o ácidos nucleicos con los que se encuentran en su entorno natural o el entorno en el que se preparan (p. ej., cultivo celular) cuando tal preparación es mediante tecnología de ADN recombinante practicada in vitro o in vivo. Miembros y ácido nucleico pueden formularse con diluyentes o adyuvantes y aún con fines prácticos aislarse; por ejemplo, los miembros normalmente se mezclarán con gelatina u otros vehículos si se usan para recubrir placas de microtitulación para uso en inmunoensayos, o se mezclarán con vehículos farmacéuticamente aceptables o diluyentes cuando se usen en diagnóstico o terapia. Miembros de unión pueden estar glicosilados, de forma natural o mediante sistemas de células eucariotas heterólogas (por ejemplo, células CHO o NS0(ECACC 85110503), o pueden estar (por ejemplo, si se producen por expresión en una célula procariota) no glicosiladas.
Preparaciones heterogéneas que comprenden moléculas de anticuerpos también forman parte de la presente descripción. Por ejemplo, tales preparaciones pueden ser mezclas de anticuerpos con cadenas pesadas de longitud completa y cadenas pesadas que carecen de la lisina C-terminal, con diversos grados de glicosilación y/o con aminoácidos derivados, tales como ciclación de un ácido glutámico N-terminal para formar un residuo de ácido piroglutámico.
Tal como se utiliza en esta invención, la frase "sustancialmente como se establece" se refiere a la(s) característica(s) de las CDR correspondientes del dominio VH o VL de los miembros de unión descritos en esta invención que serán idénticas o muy similares a las regiones especificadas para las cuales la secuencia es expuesta en esta invención. Como se describe en esta invención, la frase "muy similares" con respecto a la(s) región(es) especificada(s) de uno o más dominios variables, se contempla que pueden ser hechas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 sustituciones de aminoácidos en la CDR y/o dominio VH o VL.
Como se señaló anteriormente, un miembro de unión según la presente descripción se une a I3A1-42 humano. Como se describe en esta invención, miembros de unión de la presente descripción pueden ser optimizados para afinidad y/o para potencia de inhibición en un ensayo de competición HTRF™. Generalmente, la optimización de la potencia consiste en la mutación de la secuencia de un miembro de unión seleccionado (normalmente la secuencia del dominio variable de un anticuerpo) para generar una biblioteca de miembros de unión, que, a continuación, son ensayados para determinar la potencia y los miembros de unión más potentes son seleccionados. Los miembros de unión de "potencia optimizada" así seleccionados tienden a tener una mayor potencia que el miembro de unión a partir del cual se generó la biblioteca. Sin embargo, los miembros de unión de alta potencia se pueden obtener también sin optimización, por ejemplo, un miembro de unión de alta potencia se puede obtener directamente de una detección inicial. Ensayos y potencias se describen con más detalle en otra parte en esta invención. El experto puede generar así los miembros de unión que tienen alta potencia.
En otro aspecto, la presente descripción proporciona un procedimiento para obtener uno o más miembros de unión capaces de unirse al antígeno, el procedimiento incluye poner en contacto una biblioteca de miembros de unión según la presente descripción y dicho antígeno, y seleccionar uno o más miembros de unión de la biblioteca capaces de unirse a dicho antígeno.
La biblioteca se puede mostrar en partículas o complejos moleculares, por ejemplo, paquetes genéticos replicables, tales como levadura, partículas bacterianas o bacteriófagas (por ejemplo, t7), virus, células o covalentes, sistemas ribosómicos u otros sistemas de visualización in vitro, cada partícula o complejo molecular que contiene ácido nucleico que codifica el dominio variable VH de anticuerpo mostrado en el mismo, y opcionalmente también un dominio VL mostrado si está presente. La presentación de fagos se describe en WO92/01047 y, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos US5969108, US5565332, US5733743, US5858657, US5871907, US5872215, US5885793, US5962255, US6140471, US6172197, US6225447, US6291650, US6492160 y US6521404, cada una de las cuales se incorpora en esta invención como referencia en su totalidad. Presentación de ribosomas se describe en Hanes J y Plückthun A. (1997) Proc Natl Acad Sci USA. 1997 mayo 13;94(10):4937-42; WO01/75097 y WO2006/072773, cada una de las cuales se incorpora en esta invención como referencia en su totalidad.
Después de la selección de miembros de unión capaces de unirse al antígeno y mostrarse en bacteriófagos u otras partículas de biblioteca o complejos moleculares, se puede tomar ácido nucleico de un bacteriófago u otra partícula o complejo molecular que muestre dicho miembro de unión seleccionado. Dicho ácido nucleico puede usarse en la producción posterior de un miembro de unión o un dominio variable de anticuerpo VH o VL mediante la expresión de ácido nucleico con la secuencia de ácido nucleico tomada de un bacteriófago u otra partícula o complejo molecular que muestre dicho miembro de unión seleccionado.
Un dominio variable VH de anticuerpo con la secuencia de aminoácidos de un dominio variable VH de anticuerpo de dicho miembro de unión seleccionado puede proporcionarse en forma aislada, al igual que un miembro de unión que comprenda dicho dominio VH.
La capacidad de unir I3A1-42 y I3A1-40 humanos se pueden probar adicionalmente, también la capacidad de competir con, por ejemplo, cualquiera de los anticuerpos que se enumeran en esta invención (por ejemplo, en el formato scFv y/o formato IgG, por ejemplo, IgG2 o IgG1) para unirse a I3A1-42 a humano. La capacidad de neutralizar I3A1-42 puede ser probada, como se discute adicionalmente en esta invención.
Un miembro de unión puede unirse a I3A1-42 humano con la afinidad de cualquiera de los anticuerpos listados en las Tablas 5 y 6, por ejemplo, scFv, IgG2, IgG1TM o IgG1, o con una afinidad que sea mejor. Afinidades de unión a anticuerpos se muestran en la Tabla 7. La afinidad de unión y la potencia de neutralización de diferentes miembros de unión se pueden comparar en condiciones apropiadas.
Variantes de los dominios VH y VL y CDR descritas en esta invención, incluyendo aquellas para las que secuencias de aminoácidos se exponen en esta invención, y que pueden emplearse en miembros de unión para I3AÍ-42 se pueden obtener por medio de procedimientos de alteración de secuencia o mutación y detección para miembros de unión a antígeno con las características deseadas. Ejemplos de características deseadas incluyen, pero no se limitan a: aumento de afinidad de unión para el antígeno en relación con anticuerpos conocidos que son específicos para el antígeno, aumento de neutralización de una actividad de antígeno en relación con anticuerpos conocidos que son específicos para el antígeno si la actividad es capacidad competitiva específica conocida con un anticuerpo o ligando conocido para el antígeno a una relación molar específica, capacidad para inmunoprecipitar complejo, capacidad de unirse a un epítopo especificado: un epítopo lineal, por ejemplo, secuencia de péptido identificado usando barrido de unión a péptido como se describe en esta invención, por ejemplo, utilizando péptidos detectados en conformación lineal y/o restringida, o un epítopo conformacional, formado por residuos no continuos; y capacidad para modular una nueva actividad biológica de I3A1-42 humano. Tales procedimientos también se proporcionan en esta invención. Variantes de moléculas de anticuerpo descritas en esta invención puede ser producidas y utilizadas en la presente descripción. Siguiendo el ejemplo de la química computacional en la aplicación de técnicas de análisis de datos multivariados a las relaciones de estructura/propiedad-actividad [ver, por ejemplo, Wold, y col. Multivariate data analysis in chemistry. Chemometrics-Mathematics and Statistics in Chemistry (Ed.: B. Kowalski); D. Reidel Publishing Company, Dordrecht, Holland, 1984 (ISBN 90-277-1846-6] relaciones cuantitativas actividad-propiedad de anticuerpos se pueden derivar usando técnicas matemáticas bien conocidas, como la regresión estadística, reconocimiento y clasificación de patrones [ver por ejemplo Norman y col. Applied Regression Analysis. Wiley-Interscience; 3a edición (abril 1998) ISBN: 0471170828; Kandel, Abraham y col. Computer-Assisted Reasoning in Cluster Analysis. Prentice Hall PTR, (mayo 11, 1995), ISBN: 0133418847; Krzanowski, Wojtek. Principles of Multivariate Analysis: A User's Perspective (Oxford Statistical Science Series, No 22 (Artículo)). Oxford University Press; (diciembre 2000), ISBN: 0198507089; Witten, Ian H. y col Data Mining: Practical Machine Learning Tools and Techniques with Java Implementations. Morgan Kaufmann; (octubre 11, 1999), ISBN: 1558605525; Denison David G. T. (Editor) y col Bayesian Methods for Nonlinear Classification and Regression (Wiley Series in Probability and Statistics). John Wiley & Sons; (Julio 2002), ISBN: 0471490369; Ghose, Arup K. y col. Combinatorial Library Design and Evaluation Principles, Software, Tools, and Applications in Drug Discovery. ISBN: 0-8247-0487-8]. Las propiedades de los anticuerpos se pueden derivar de modelos empíricos y teóricos (por ejemplo, análisis de residuos de contacto probable o propiedad fisicoquímica calculada) de secuencia de anticuerpos, estructuras funcionales y tridimensionales y estas propiedades pueden ser consideradas individualmente y en combinación.
Un sitio de unión antígeno-anticuerpo compuesto de un dominio VH y un dominio VL está típicamente formado por seis lazos de polipéptidos: tres del dominio variable de cadena ligera (VL) y tres del dominio variable de cadena pesada (VH). El análisis de anticuerpos de estructura atómica conocida ha dilucidado las relaciones entre la secuencia y la estructura tridimensional de sitios de combinación de anticuerpos [Chothia C. y col. Journal Molecular Biology (1992) 227, 799-817; Al-Lazikani, y col. Journal Molecular Biology (1997) 273(4), 927-948]. Estas relaciones implican que, excepto para la tercera región (lazo) en dominios VH, los lazos del sitio de unión tienen un pequeño número de conformaciones de cadena principal: estructuras canónicas. Se ha demostrado que la estructura canónica formada en un lazo particular es determinada por su tamaño y la presencia de ciertos residuos en lugares clave, tanto en el lazo como en regiones de estructura.
Este estudio de relación secuencia-estructura se puede utilizar para la predicción de esos residuos en un anticuerpo de secuencia conocida, pero de una estructura tridimensional desconocida, que son importantes en el mantenimiento de la estructura tridimensional de sus lazos de CDR y, por lo tanto, mantener la especificidad de unión. Estas predicciones se pueden respaldar mediante la comparación de las predicciones a los resultados de experimentos de optimización principales. En una estrategia estructural, un modelo puede ser creado de la molécula de anticuerpo [Chothia, y col. Sciences, 223,755-758 (1986)] utilizando cualquier paquete libremente disponible o comercial, tal como WAM [Whitelegg, NRU & Rees, A.R. (2000). Prot. Eng., 12, 815-824]. Un paquete de visualización de proteínas y software de análisis, tal como Insight II (Accelrys, Inc.) o de Deep View [Guex, N. y Peitsch, MC Electrophoresis (1997) 18, 2714-2723] puede a continuación ser utilizado para evaluar posibles sustituciones en cada posición en la CDR. Esta información puede a continuación ser utilizada para hacer sustituciones que puedan tener un efecto mínimo o beneficioso sobre la actividad.
Las técnicas requeridas para hacer sustituciones dentro de secuencias de aminoácidos de CDR, dominios de anticuerpos VH o VL y miembros de unión generalmente están disponibles en la técnica. Secuencias de variantes pueden ser hechas, con sustituciones que puede o pueden no ser predicho que tengan un efecto mínimo o beneficioso sobre la actividad, y se probaron para la capacidad de unirse a I3A1-42 y/o para cualquier otra propiedad deseada. Variantes de secuencias de aminoácidos de dominio variable de cualquiera de los dominios VH y VL cuyas secuencias se describen específicamente en esta invención pueden ser empleadas de conformidad con la presente descripción, como se discutió.
Como se describió anteriormente, aspectos de la presente descripción proporcionan un miembro de unión, tal como una molécula de anticuerpo, que comprende un dominio VH que tiene al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con un dominio VH de cualquiera de los anticuerpos enumerados en esta invención, para los que se muestran las secuencias de dominio VH en la lista de secuencias adjunta a continuación; y/o que comprende un dominio VL que tiene al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con un dominio VL de cualquiera de los anticuerpos listados en la Tabla 11, para los que se muestran las secuencias de dominio VL en la lista de secuencias adjunta.
Aspectos de la presente descripción proporcionan un miembro de unión, tal como una molécula de anticuerpo, que comprende un dominio VH que tiene un conjunto de VH CDR que tienen al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con el conjunto de VH CDR de cualquiera de los anticuerpos enumerados en esta invención, para los cuales las secuencias de VH CDR se muestran en esta invención; y/o que comprenden un dominio VL que tiene un conjunto de VL CDR que tienen al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con el conjunto de VL CDR de cualquiera de los anticuerpos enumerados en esta invención, para los cuales las secuencias de Vl CDR se muestran en esta invención.
Los algoritmos que se pueden utilizar para calcular % de identidad de dos secuencias de aminoácido incluyen, por ejemplo, BLAST [Altschul y col. (1990) J. Mol. Biol. 215: 405-410], FASTA [Pearson & Lipman (1988) PNAS USA 85: 2444-2448], o el algoritmo de Smith-Waterman [Smith y Waterman (1981) J. Mol Biol. 147: 195-197] por ejemplo, empleando parámetros por defecto.
Dominios variables particulares pueden incluir una o más mutaciones de secuencias de aminoácidos (sustitución, deleción, y/o inserción de un residuo de aminoácido), y menos de aproximadamente 1514, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 o 2.
Mutaciones pueden realizarse en una o más regiones de estructura y/o una o más CDR. Las mutaciones normalmente no dan lugar a pérdida de la función, por lo que un miembro de unión que comprende una secuencia de aminoácidos así alterada puede retener una capacidad de unirse a I3A1-42 humano. Puede conservar la misma capacidad de unión y/o neutralización como un miembro de unión en el que no se hace la alteración, por ejemplo, como se mide en un ensayo descrito en esta invención. El miembro de unión que comprende una secuencia de aminoácidos así alterada puede tener una capacidad mejorada para unirse a I3A1-42 humano.
La mutación puede comprender la sustitución de uno o más residuos de aminoácidos con un aminoácido que no ocurre naturalmente o no es estándar, modificando uno o más residuos de aminoácidos en una forma que no ocurre naturalmente o no es estándar, insertando un aminoácido que no ocurre naturalmente o no es estándar en la secuencia. Ejemplos de números y ubicaciones de alteraciones en secuencias de la presente descripción se describen en esta invención en otras partes. Aminoácidos que ocurren naturalmente incluyen los 20 aminoácidos "estándar" L, identificados como G, A, V, L, I, M, P, F, W, S, T, N, Q, Y, C, K, R, H, D, E por sus códigos estándar de letras únicas. Aminoácidos no estándar incluyen cualquier otro residuo que puede ser incorporado en una cadena principal del polipéptido o resultan de la modificación de un residuo de aminoácido existente. Aminoácidos no estándar pueden ser de origen natural o pueden producirse no naturalmente. Varios de aminoácidos de origen natural no estándar son conocidos en la técnica, tales como 4-hidroxiprolina, 5-hidroxilisina, 3-metilhistidina, N-acetilserina, etc. [Voet & Voet, Biochemistry, 2a edición, (Wiley) 1995]. Aquellos residuos de aminoácidos que son derivados en su posición N-alfa sólo se encuentran en el N-extremo de una secuencia de aminoácidos. Normalmente, en la presente descripción un aminoácido es un L-aminoácido, pero puede ser un D-aminoácido. Por lo tanto, la alteración puede comprender modificar un L-aminoácido en, o sustituirlo por, un D-aminoácido. También se conocen formas metiladas, acetiladas y/o fosforiladas de aminoácidos, y los aminoácidos de la presente descripción pueden estar sujetos a dicha modificación.
Secuencias de aminoácidos en dominios de anticuerpos y miembros de unión de la presente descripción pueden comprender aminoácidos no naturales o no estándar descritos anteriormente. Aminoácidos no estándar (por ejemplo, D-aminoácidos) pueden ser incorporados en una secuencia de aminoácidos durante la síntesis, o por modificación o sustitución de los aminoácidos estándar "originales" después de la síntesis de la secuencia de aminoácidos.
El uso de aminoácidos no estándar y/o no naturales aumenta la diversidad estructural y funcional, y, por lo tanto, puede aumentar el potencial para lograr la deseada unión y neutralización de propiedades en un miembro de unión de la presente descripción. Adicionalmente, D-aminoácidos y análogos han demostrado tener diferentes perfiles farmacocinéticos en comparación con L-aminoácidos estándar, debido a la degradación in vivo de polipéptidos que tienen L-aminoácidos después de la administración a un animal, por ejemplo, un ser humano, lo que significa que D-aminoácidos son ventajosos para algunas aplicaciones in vivo.
Nuevas regiones VH o VL que llevan secuencias derivadas de CDR de la presente descripción pueden generarse usando mutagénesis aleatoria de uno o más genes VH y/o VL seleccionados para generar mutaciones dentro de todo el dominio variable. Tal técnica es descrita por Gram y col. [Gram y col., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89:3576-3580], que usó PCR (Reacción de Cadena de Polimerasa) propensa a errores. En algunas realizaciones una o dos sustituciones de aminoácidos se realizan dentro de todo un dominio variable o conjunto de CDR.
Otro procedimiento que puede usarse es dirigir la mutagénesis a regiones CDR de genes VH o VL. Tales técnicas son descritas por Barbas y col. [Barbas y col., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91:3809-3813] y Schier y col. [Schier y col., 1996, J. Mol. Biol. 263:551-567].
Todas las técnicas descritas anteriormente son conocidas como tales en la técnica y la persona experta será capaz de usar tales técnicas para proporcionar miembros de unión de la presente descripción usando metodología de rutina en la técnica.
Un aspecto adicional de la presente descripción proporciona un procedimiento para obtener un sitio de unión a antígeno de anticuerpo para pA1-42 humano, el procedimiento comprende proporcionar por medio de sustitución, deleción o inserción de uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de un dominio VH establecido en esta invención, un dominio VH que es una variante de secuencia de aminoácidos del dominio VH, combinando opcionalmente el dominio VH así provisto con uno o más dominios VL, y probar el dominio VH o la combinación o combinaciones de VH/VL para identificar un miembro de unión o un sitio de unión antígeno-anticuerpo para Ap1-42 y opcionalmente con una o más propiedades deseadas. Dicho dominio VL puede tener una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente como se establece en esta invención. Un procedimiento análogo se puede emplear, en el cual una o más variantes de secuencia de un dominio VL descritas en esta invención se combinan con uno o más dominios VH.
Como se señaló anteriormente, una secuencia de aminoácidos de CDR sustancialmente como se establece en esta invención se puede incorporar como una CDR en un dominio variable de anticuerpo humano o una porción sustancial del mismo. Las secuencias HCDR3 sustancialmente como se establecen en esta invención representan realizaciones de la presente descripción y cada una de éstas se puede incorporar como una HCDR3 en un dominio variable de cadena pesada humana o una porción sustancial de la misma.
Dominios variables empleados en la presente descripción pueden obtenerse o derivarse de cualquier línea germinal o dominio variable humano reordenado, o pueden ser un dominio variable sintético basado en consenso o secuencias reales de dominios variables humanos conocidos. Un dominio variable se puede derivar de un anticuerpo no humano. Una secuencia de CDR de la presente descripción (por ejemplo, CDR3) puede introducirse en un repertorio de dominios variables que carecen de una CDR (por ejemplo, CDR3), usando tecnología de ADN recombinante. Por ejemplo, Marks y col. [Marks y col Bio/Technology, 1992, 10:779-783] describe procedimientos para producir repertorios de dominios variables de anticuerpos en los que se usan cebadores de consenso dirigidos a o adyacentes al extremo 5' del área de dominio variable junto con cebadores de consenso a la tercera región de estructura de genes VH humanos para proporcionar un repertorio de dominios variables VH que carecen de CDR3. Marks y col. describen además cómo este repertorio se puede combinar con una CDR3 de un anticuerpo particular. Usando técnicas análogas, las secuencias derivadas de CDR3 de la presente descripción pueden mezclarse con repertorios de dominios VH o VL que carecen de CDR3, y los dominios VH o VL completos mezclados combinados con un dominio VL o VH análogo para proporcionar miembros de unión de la presente descripción. El repertorio puede a continuación ser mostrado en un sistema huésped adecuado, tal como el sistema de presentación de fagos de WO92/01047, o cualquiera de una gran cantidad de bibliografía posterior, incluyendo Kay, Winter & McCafferty [Kay, BK, Winter, J., y McCafferty, J. (1996) Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, San Diego: Academic Press], para que miembros de unión adecuados puedan ser seleccionados. Un repertorio puede consistir de cualquier número a partir de 104 miembros individuales hacia arriba, por ejemplo al menos 105, al menos 106, al menos 107, al menos 108, al menos 109 o al menos 1010 miembros o más. Otros sistemas huésped adecuados incluyen, pero no se limitan a, presentación de levadura, presentación bacteriana, presentación de T7, presentación viral, presentación celular, presentación de ribosomas y presentación covalente.
Se proporciona un procedimiento para preparar un miembro de unión para I3A1-42 humano, cuyo procedimiento comprende:
(a) proporcionar un repertorio inicial de ácidos nucleicos que codifican un dominio VH que incluye una CDR3 para ser reemplazada o carece de una región codificadora de CDR3;
(b) combinar dicho repertorio con un ácido nucleico donador que codifica una secuencia de aminoácidos sustancialmente como se establece en esta invención para una VH CDR3, por ejemplo, una VH CDR3 que se muestra en la Tabla 11, de modo que dicho ácido nucleico donador se inserta en la región CDR3 en el repertorio, de modo a proporcionar un repertorio de productos de ácidos nucleicos que codifican un dominio VH;
(c) expresar los ácidos nucleicos de dicho repertorio de productos;
(d) seleccionar un miembro de unión para I3A1-42 humano; y
(e) recuperar dicho miembro de unión o ácido nucleico que lo codifica.
De nuevo, se puede emplear un procedimiento análogo en el que una VL CDR3 de la presente descripción se combina con un repertorio de ácidos nucleicos que codifica un dominio VL que incluye una CDR3 para ser reemplazada o carece de una región codificadora de c DR3.
Del mismo modo, una o más, o las tres CDR pueden injertarse en un repertorio de dominios VH o VL que a continuación son examinados para detectar un miembro de unión o los miembros de unión para I3A1-42 humano.
Por ejemplo, una HCDR1, HCDR2 y/o HCDR3, por ejemplo, se puede emplear un conjunto de HCDR, desde uno o más de los anticuerpos listados en la Tabla 5 o en la Tabla 6, y/o pueden ser empeladas una LCDR1, LCDR2 y/o LCDR3, por ejemplo, un conjunto de LCDR, de uno o más de los anticuerpos enumerados en esta invención.
Del mismo modo, se pueden emplear otros dominios VH y VL, conjuntos de CDR y conjuntos de HCDR y/o conjuntos de LCDR descritos en esta invención.
Una porción sustancial de un dominio variable de inmunoglobulina puede comprender al menos las tres regiones CDR, junto con sus regiones de estructura intermedias. La porción también puede incluir al menos aproximadamente el 50% de una o ambas de las regiones marco primera y cuarta, el 50% siendo el 50% del C-terminal de la primera región de estructura y el 50% del N-terminal de la cuarta región de estructura. Los residuos adicionales en el extremo N-terminal o C-terminal de la parte sustancial del dominio variable puede ser aquellos no asociados normalmente con regiones de dominio variable naturales. Por ejemplo, la construcción de miembros de unión de la presente descripción realizada mediante técnicas de ADN recombinante puede dar como resultado la introducción de residuos N- o C-terminales codificados por los conectores introducidos para facilitar la clonación u otras etapas de manipulación. Otras etapas de manipulación incluyen la introducción de conectores para unir dominios variables de la presente descripción a secuencias de proteínas adicionales que incluyen regiones constantes de anticuerpos, otros dominios variables (por ejemplo en la producción de diacuerpos) o marcadores detectables/funcionales como se describe con más detalle en otra parte de esta invención.
Aunque en algunos aspectos de la presente descripción, los miembros de unión comprenden un par de dominios VH y VL, los dominios de unión individuales en base a cualquiera de las secuencias de dominio VH o VL forman aspectos adicionales de la presente descripción. Se sabe que los dominios de inmunoglobulina individuales, especialmente los dominios VH, son capaces de unirse a antígenos diana de una manera específica. Por ejemplo, ver la discusión de dAb anterior.
En el caso de cualquiera de los dominios de unión individuales, estos dominios pueden usarse para detectar dominios complementarios capaces de formar un miembro de unión de dos dominios capaz de unirse a Ap1-42. Esto puede lograrse mediante procedimientos de detección de presentación de fagos utilizando la denominada estrategia combinatoria dual jerárquica como se describe en el documento WO92/01047, en el que se utiliza una colonia individual que contiene un clon de cadena H o L para infectar una biblioteca completa de clones que codifican la otra cadena (L o H) y el miembro de unión de dos cadenas resultante se selecciona según técnicas de presentación de fagos, tales como las descritas en esa referencia. Esta técnica es también descrita en Marks y col., Bio/Technology, 1992, 10:779-783.
Miembros de unión de la presente descripción pueden comprender además regiones constantes de anticuerpos o partes de las mismas, por ejemplo, regiones constantes de anticuerpos humanos o partes de las mismas. Por ejemplo, un dominio VL puede estar unido en su extremo C-terminal a dominios constantes de cadena ligera de anticuerpos que incluyen cadenas Ck o CA humanas. De manera similar, un miembro de unión basado en un dominio VH puede estar unido en su extremo C-terminal a toda o parte (por ejemplo, un dominio CH1) de una cadena pesada de inmunoglobulina derivada de cualquier isotipo de anticuerpo, por ejemplo, IgG, IgA, IgE e IgM y cualquiera de las subclases de isotipos, particularmente IgG2, IgG1 e IgG4. IgG2 puede ser ventajoso en algunas realizaciones debido a su falta de funciones efectoras. En otras realizaciones, IgG1 puede ser ventajoso debido a su función efectora y facilidad de fabricación. Cualquier variante sintética u otras variantes de región constante que tenga estas propiedades y estabilice regiones variables también pueden ser útiles en la presente descripción.
Miembros de unión pueden marcarse con un marcador detectable o funcional. Por lo tanto, un miembro de unión o molécula de anticuerpo pueden estar presentes en forma de un inmunoconjugado de modo que se obtenga una señal detectable y/o cuantificable. Un inmunoconjugado puede comprender una molécula de anticuerpo de la presente descripción conjugada con marcador detectable o funcional. Un marcador detectable que se refiere el presente documento puede ser cualquier marcador que produce o puede ser inducido a producir una señal, incluyendo, pero no limitado a, agentes fluorescentes, quimioluminiscentes (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante), marcadores de colores (por ejemplo, látex [azul] u oro coloidal [rojo]), radiomarcadores, enzimas, fotosensibilizadores y marcadores magnéticos. La cantidad de marcador unido a una superficie, por ejemplo, una superficie de un orificio capilar, puede, por lo tanto, ser detectada y/o medida mediante la detección de fluorescencia o luminiscencia, color, radioactividad, actividad enzimática, absorbancia de luz o cambios en el campo magnético. Marcadores detectables se pueden unir a miembros de unión utilizando química convencional. Preferiblemente, un marcador detectable es un marcador detectable por interrogación óptica, por ejemplo, con una cámara digital o un escáner de base plana. Los marcadores que se pueden detectar mediante interrogación óptica incluyen marcadores fluorescentes, quimioluminiscentes y de colores. El mecanismo por el cual una señal se puede generar para detección óptica incluye (pero no se limita necesariamente a): absorción de luz, dispersión de luz, difracción de luz, reflexión de luz, fluorescencia o luminiscencia. Marcadores adecuados incluyen, a modo de ilustración y no de limitación,
- enzimas, tales como fosfatasa alcalina, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa ("G6PDH"), alfa-D-galactosidasa, glucosa oxidasa, amilasa glucosa, anhidrasa carbónica, acetilcolinesterasa, lisozima, malato deshidrogenasa y peroxidasa, por ejemplo, peroxidasa de rábano picante;
- colorantes;
- marcadores fluorescentes o fluorescentes, tales como fluoresceína y sus derivados, fluorocromo, compuestos de rodamina y derivados, GFP (GFP para "Proteína Fluorescente Verde"), dansilo, umbeliferona, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldehido, y fluorescamina; fluoróforos tales como criptatos de lantánidos y quelatos, por ejemplo, europio etc. (Perkin Elmer y Cis Biointernational),
- marcadores quimioluminiscentes o quimioluminiscentes, tales como isoluminol, luminol y los dioxetanos;
- marcadores bio-luminiscentes, tales como luciferasa y luciferina;
- sensibilizadores;
- coenzimas;
- sustratos de enzimas;
- radiomarcadores, incluyendo pero no limitados a, bromo77, carbono14, cobalto57, flúor8, galio67, galio68, hidrógeno3 (Tritio), indio111, indio113m, yodo123m, yodo125, yodo126, yodo131, yodo133, mercurio107, mercurio203, fósforo32, renio99m, renio101, renio105, rutenio95, rutenio97, rutenio103, rutenio105, escandio47, selenio75, azufre35, tecnecio99, tecnecio99m, telurio121m, telurio122m, telurio125m, tulio165, tulio167, tulio168, itrio199 y otros radiomarcadores mencionados en esta invención;
- partículas, tales como partículas de látex o de carbono; sol de metal; cristalita; liposomas; células, etc., que pueden marcarse además con un colorante, catalizador u otro grupo detectable;
- moléculas tales como biotina, digoxigenina o 5-bromodeoxiuridina;
- fracciones de toxinas, tales como por ejemplo, una fracción de toxina seleccionada de un grupo de Pseudomonas exotoxina (PE o un fragmento citotóxico o mutante del mismo), Difteria toxina o un fragmento citotóxico o mutante de la misma, un Botulinum toxina A, B, C, D, E o F, ricina o un fragmento citotóxico de la misma, por ejemplo ricina A, abrina o un fragmento citotóxico de la misma, saporina o un fragmento citotóxico de la misma, toxina antiviral de fitolaca o un fragmento citotóxico de la misma y briodina 1 o un fragmento citotóxico de la misma.
Ejemplos de enzimas y coenzimas adecuadas se describen en US4275149 y US4318980. Fluorescentes y quimioluminiscentes adecuados se describen también en US4275149. Marcadores incluyen además fracciones químicas, tales como biotina que pueden detectarse mediante la unión a una fracción detectable análogo específico, por ejemplo, avidina o estreptavidina marcada. Marcadores detectables pueden estar unidos a anticuerpos de la presente descripción usando química convencional conocida en la técnica.
Los inmunoconjugados o sus fragmentos funcionales se pueden preparar por procedimientos conocidos por la persona experta en la técnica. Ellos pueden ser acoplados a enzimas o a marcadores fluorescentes directamente o por intermedio de un grupo espaciador o de un grupo de unión, tal como un polialdehído, como glutaraldehído, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido dietileno-triaminepentaacético (DPTA), o en presencia de agentes de acoplamiento, tales como los mencionados anteriormente para los conjugados terapéuticos. Los conjugados que contienen marcadores de tipo fluoresceína se pueden preparar mediante reacción con un isotiocianato.
Los procedimientos conocidos en la técnica para el acoplamiento de radioisótopos terapéuticos a los anticuerpos, ya sea directamente o a través de un agente quelante, tales como EDTA, DTPA mencionados anteriormente también se pueden usar para los radioelementos que se pueden utilizar en el diagnóstico. Asimismo, es posible llevar a cabo la marcación con sodio125 por el procedimiento de la cloramina T [Hunter W.M. & Greenwood F.C. (1962) Nature 194:495] o bien con tecnecio99m por la técnica de US4424200 o unido a través de DTPA como se describe en US4479930. Hay numerosos procedimientos por los cuales el marcador puede producir una señal detectable por medios externos, por ejemplo, por examen visual, radiación electromagnética, calor y reactivos químicos. El marcador también se puede unir a otro miembro de unión que se une al anticuerpo de la presente descripción, o a un soporte.
El marcador puede producir directamente una señal y, por lo tanto, componentes adicionales no se requieren para producir una señal. Numerosas moléculas orgánicas, por ejemplo agentes de fluorescencia, son capaces de absorber luz ultravioleta y visible, donde la absorción de la luz transfiere energía a estas moléculas y las eleva a un estado de energía excitado. Esta energía absorbida se disipa a continuación por emisión de luz a una segunda longitud de onda. Esta emisión de segunda longitud de onda también puede transferir energía a una molécula aceptora marcada, y la energía resultante disipada de la molécula aceptora por emisión de luz, por ejemplo, transferencia de energía de resonancia por fluorescencia (FRET). Otros marcadores que producen directamente una señal incluyen isótopos radioactivos y colorantes.
Alternativamente, el marcador puede necesitar otros componentes para producir una señal, y el sistema que produce la señal incluiría a continuación todos los componentes requeridos para producir una señal medible, que puede incluir sustratos, coenzimas, potenciadores, enzimas adicionales, sustancias que reaccionan con productos enzimáticos, catalizadores, activadores, cofactores, inhibidores, eliminadores, iones metálicos, y una sustancia de unión específica requerida para la unión de sustancias generadoras de señal. Una discusión detallada de sistemas de producción de señales adecuados se puede encontrar en US5185243.
Un aspecto de la presente descripción proporciona un procedimiento que comprende causar o permitir la unión de un miembro de unión como se proporciona en esta invención a I3A1-42 humano. Como se señaló, dicha unión puede tener lugar in vivo, por ejemplo, después de la administración de un miembro de unión, o ácido nucleico que codifica un miembro de unión, o puede tener lugar in vitro, por ejemplo en ELISA, Western blot, inmunocitoquímica, inmunoprecipitación, cromatografía de afinidad y ensayos bioquímicos o basados en células.
La presente descripción también contempla la medición de niveles de antígeno directamente, por ejemplo, en plasma o LCR, mediante el empleo de un miembro de unión según la presente descripción, por ejemplo, en un sistema biosensor. Por ejemplo, un procedimiento de detección y/o medición de la unión a IÍA1-42 humano puede comprender, (i) exponer dicho miembro de unión a I3A1-42 y (ii) detectar la unión de dicho miembro de unión a I3A1-42, donde la unión es detectada utilizando cualquier procedimiento o marcador detectable descritos en esta invención. El I3A1-42 puede ser I3A1-42 monomérico u oligomérico, preferiblemente I3A1-42 monomérico. Esto, y cualquier otro procedimiento de detección de unión descritos en esta invención, puede ser interpretado directamente por la persona que realiza el procedimiento, por ejemplo, observando visualmente un marcador detectable. Alternativamente, este procedimiento, o cualquier otro procedimiento de detección de unión descritos en esta invención, pueden producir un informe en la forma de una autorradiografía, una fotografía, una impresión de ordenador, un informe de citometría de flujo, un gráfico, un diagrama, un tubo de ensayo o un recipiente o pocillo que contiene el resultado, o cualquier otra representación visual o física de un resultado del procedimiento.
La cantidad de unión del miembro de unión a I3A1-42 puede ser determinada. La cuantificación puede estar relacionada a la cantidad del antígeno en una muestra de prueba, que puede tener interés diagnóstico. La detección de la unión a I3A1-42 y/o la cuantificación de la misma puede ser útil, por ejemplo, en el examen de pacientes para enfermedades o trastornos que se refiere en esta invención y/o cualquier otra enfermedad o trastorno que impliquen niveles y/o actividad aberrantes de I3A1-42.
Un procedimiento de diagnóstico puede comprender (i) obtener una muestra de tejido o fluido de un sujeto, por ejemplo, un paciente que se sospecha o se cree que tener una condición o enfermedad mencionada en esta invención, (ii) exponer dicha muestra de tejido o fluido a uno o más miembros de unión de la presente descripción; y (iii) detectar I3A1-42 ligado en comparación con una muestra control, donde un aumento en la cantidad de unión de I3A1-42 en comparación con el control puede indicar un nivel aberrante de I3A1-42. Las muestras de tejido o fluido a ser probadas incluyen sangre, suero, plasma, LCR, orina, material de biopsia, tumores, o cualquier tejido que se sospecha que contiene niveles aberrantes de I3A1-42. Los sujetos que den positivo para niveles o actividad aberrantes de I3A1-42 también pueden beneficiarse de los procedimientos de tratamiento descritos más adelante en esta invención.
Los expertos en la técnica son capaces de elegir un modo adecuado de determinar la unión del miembro de unión a un antígeno según su preferencia y conocimiento general, a la luz de los procedimientos descritos en esta invención. Las reactividades de los miembros de unión en una muestra pueden determinarse por cualquier medio apropiado. Radioinmunoensayo (RIA) es una posibilidad. El antígeno marcado radiactivo se mezcla con el antígeno no marcado (la muestra de prueba) y se deja unir al miembro de unión. El antígeno unido se separa físicamente del antígeno no unido y se determina la cantidad de antígeno radioactivo unido al miembro de unión. Cuanto más antígeno haya en la muestra de prueba, menos antígeno radioactivo se unirá al miembro de unión. También se puede usar un ensayo de unión competitivo con antígeno no radioactivo, usando antígeno o un análogo unido a una molécula indicadora. La molécula indicadora puede ser un fluorocromo, fósforo o colorante láser con características de absorción o de emisión aisladas espectralmente. Fluorocromos adecuados incluyen fluoresceína, rodamina, ficoeritrina y rojo de Texas, y quelatos o criptatos de lantánidos. Colorantes cromogénicos adecuados incluyen diaminobenzidina.
Otros indicadores incluyen partículas coloidales macromoleculares o material particulado, como perlas de látex coloreadas, magnéticas o paramagnéticas, y agentes biológicamente o químicamente activos que pueden hacer que, directa o indirectamente, se observen señales detectables, se detecten electrónicamente o se graben de otra manera. Estas moléculas pueden ser enzimas, que catalizan reacciones que se desarrollan o cambian de color o causan cambios en las propiedades eléctricas, por ejemplo. Estas pueden ser molecularmente excitables, de forma que las transiciones electrónicas entre estados de energía resulten en absorciones o emisiones espectrales características. Pueden incluir entidades químicas utilizadas en conjunción con biosensores. Se pueden emplear sistemas de detección de biotina / avidina o biotina / estreptavidina y fosfatasa alcalina.
Las señales generadas por los conjugados de miembro de unión individual-indicador pueden usarse para obtener datos absolutos o relativos cuantificables de la unión del miembro de unión relevante en muestras (normal y prueba). Un kit que comprende un miembro de unión tal como se describe en esta invención también se proporciona como un aspecto de la presente descripción. En el kit, el miembro de unión puede estar marcado para permitir su reactividad en una muestra que se determinará, por ejemplo, como se describe adicionalmente más adelante. Además, el miembro de unión puede o puede no estar unido a un soporte sólido. Componentes de un kit son generalmente estériles y en viales sellados u otros recipientes. Los kits pueden ser empleados en análisis de diagnóstico o de otros procedimientos para los que miembros de unión son útiles. Un kit puede ser para uso en un procedimiento descrito anteriormente. Un kit puede contener instrucciones para el uso de los componentes en un procedimiento, por ejemplo, un procedimiento según la presente descripción. Materiales auxiliares para ayudar en o para permitir la realización de un procedimiento de un tipo pueden ser incluidos dentro de un kit de la presente descripción. Los materiales auxiliares incluyen un segundo miembro de unión diferente que se une al primer miembro de unión y está conjugado a un marcador detectable (por ejemplo, un marcador fluorescente, isótopo radiactivo o enzima). Kits basados en anticuerpos también pueden comprender perlas para llevar a cabo una inmunoprecipitación. Cada componente de los kits está generalmente en su propio recipiente adecuado. Por lo tanto, estos kits comprenden generalmente distintos contenedores adecuados para cada miembro de unión. Además, los kits pueden comprender instrucciones para realizar el ensayo y procedimientos para la interpretación y análisis de los datos resultantes de la realización del ensayo.
La presente descripción también proporciona el uso de un miembro de unión como el anterior para medir los niveles de antígeno en un ensayo de competición, es decir, un procedimiento para medir el nivel de antígeno en una muestra empleando un miembro de unión como se proporciona en la presente descripción en un ensayo de competencia. Este puede ser el caso en el que no es necesaria la separación física de antígeno unido y no unido. Vincular una molécula indicadora al miembro de unión para que ocurra un cambio físico u óptico en la unión es una posibilidad. La molécula indicadora puede generar directa o indirectamente señales detectables, que pueden ser cuantificables. La unión de las moléculas indicadoras puede ser directa o indirectamente, covalentemente, por ejemplo, a través de un enlace peptídico o no covalente. La unión mediante un enlace de péptido puede ser como resultado de la expresión recombinante de anticuerpo que codifica la fusión de genes y la molécula indicadora.
La competencia entre miembros de unión se puede analizar fácilmente in vitro, por ejemplo, utilizando ELISA y/o mediante un ensayo de competencia bioquímica, como el marcado de una molécula indicadora específica a un miembro de unión que se puede detectar en presencia de uno o más miembros de unión no marcados, para permitir la identificación de miembros de unión que se unen al mismo epítopo o un epítopo superpuesto. Tales procedimientos son conocidos fácilmente por un experto normal en la técnica, y se describen en más detalle en esta invención.
La presente descripción se extiende a un miembro de unión que compite por la unión a I3A1-42 humano con cualquier miembro de unión definido en esta invención, por ejemplo, cualquiera de los anticuerpos listados en las Tablas 5 y 6, por ejemplo, en triple mutación de IgG2, IgG1 o IgG1 ("TM"; Oganesyan y col. (2008) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. formato 64 (Pt 6):700-4). La competencia entre miembros de unión se puede analizar fácilmente in vitro, por ejemplo, marcando una molécula indicadora específica a un miembro de unión que se puede detectar en presencia de uno o más miembros de unión no marcados, para permitir la identificación de miembros de unión que se unen al mismo epítopo o un epítopo superpuesto. La competencia puede ser determinada, por ejemplo, utilizando ELISA en que I3A1-42 se inmoviliza a una placa y se añade un primer miembro de unión marcado o etiquetado, junto con uno u otros miembros de unión no marcados o no etiquetados que se unen a la placa. La presencia de un miembro de unión sin marcador que compite con el miembro de unión marcado se observa por una disminución en la señal emitida por el miembro de unión marcado.
Los ensayos de competición también se pueden usar en el mapeo de epítopo. En un caso, el mapeo de epítopos se puede usar para identificar el epítopo unido por un miembro de unión que opcionalmente puede tener características optimizadas, neutralizantes y/o moduladoras. Tal epítopo puede ser lineal o conformacional. Un epítopo conformacional puede comprender al menos dos fragmentos diferentes de I3A, donde dichos fragmentos se colocan en proximidad entre sí cuando el péptido I3A se pliega en su estructura terciaria o cuaternaria para formar un epítopo conformacional que es reconocido por un inhibidor de I3A, tal como un miembro de unión a I3A. En pruebas de competencia se puede emplear un fragmento peptídico del antígeno, especialmente un péptido que incluye o consiste esencialmente en un epítopo de interés. Puede ser usado un péptido que tiene la secuencia de epítopo más uno o más aminoácidos en cualquier extremo. Miembros de unión según la presente descripción pueden ser tales que su unión al antígeno sea inhibida por un péptido con o que incluya la secuencia dada.
En otros aspectos, la presente descripción proporciona un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica un miembro de unión, dominio VH y/o dominio VL según la presente descripción, y procedimientos para preparar un miembro de unión, un dominio VH y/o un dominio VL de la presente descripción, que comprende expresar dicho ácido nucleico en condiciones para provocar la producción de dicho miembro de unión, dominio VH y/o dominio VL, y recuperarlo. Ejemplos de codificación de secuencias de ácido nucleico se exponen en las Tablas y listas de secuencias adjuntas. Secuencias de ácidos nucleicos según la presente descripción pueden comprender ADN o ARN y pueden ser total o parcialmente sintéticos. La referencia a una secuencia de nucleótidos como se establece en esta invención abarca una molécula de ADN con la secuencia especificada, y abarca una molécula de ARN con la secuencia especificada en la que U está sustituido por T, a menos que el contexto requiera lo contrario.
La presente descripción también proporciona construcciones en forma de plásmidos, vectores, tal como un plásmido o vector de fago, casetes de transcripción o expresión que comprenden al menos un polinucleótido como anteriormente, por ejemplo, unido operativamente a un elemento regulador.
Un aspecto adicional proporciona una célula huésped que contiene o es transformada con los ácidos nucleicos y/o vectores de la presente descripción. La presente descripción también proporciona una línea celular huésped recombinante que comprende una o más construcciones como anteriormente. Una secuencia de ácido nucleico que codifica cualquier CDR o conjunto de CDR o dominio VH o dominio VL o sitio de unión antígeno-anticuerpo o molécula de anticuerpo, por ejemplo scFv o IgG (por ejemplo, IgG2, IgG1 o IgGITM) de conformidad, forma un aspecto de la presente descripción, junto con un procedimiento de producción del producto codificado, procedimiento que comprende la expresión a partir de la codificación de secuencias de ácido nucleico de los mismos. La expresión puede conseguirse convenientemente mediante el cultivo de células huésped recombinantes que contienen el ácido nucleico en condiciones apropiadas. Después de la producción por expresión, un dominio VH o VL, o un miembro de unión puede aislarse y/o purificarse usando cualquier técnica adecuada, y a continuación usarse según sea apropiado. Por consiguiente, otro aspecto de la presente descripción es un procedimiento de producción de un dominio variable VH de anticuerpo, incluyendo el procedimiento de causar la expresión a partir de la codificación de secuencias de ácido nucleico. Dicho procedimiento puede comprender el cultivo de células huésped en condiciones para la producción de dicho dominio variable VH de anticuerpo.
Se proporcionan procedimientos análogos para la producción de dominios variables VL y miembros de unión que comprenden un dominio VH y/o VL como aspectos adicionales de la presente descripción.
Un procedimiento de producción puede comprender una etapa de aislamiento y/o purificación del producto. Un procedimiento de producción puede comprender la formulación del producto en una composición que incluye al menos un componente adicional, como un excipiente farmacéuticamente aceptable.
Sistemas para clonación y expresión de un polipéptido en una variedad de células huésped diferentes son bien conocidos. Células huésped adecuadas incluyen bacterias, células de mamíferos, células de plantas, hongos filamentosos, sistemas de levadura y baculovirus y plantas y animales transgénicos. La expresión de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos en células procariotas está bien establecida en la técnica. Para una revisión, ver por ejemplo Plückthun [Plückthun, A. Bio/Technology 9: 545-551 (1991)]. Un huésped bacterial común es E. coli.
La expresión en células eucariotas en cultivo también está disponible para los expertos en la técnica como una opción para la producción de un miembro de unión [Chadd HE y Chamow Sm (2001) Current Opinion in Biotechnology 12: 188-194; Andersen CC y Krummen L (2002) Current Opinion in Biotechnology 13: 117; Larrick JW y Thomas DW (2001) Current Opinion in Biotechnology 12:411-418].
Las líneas celulares de mamíferos disponibles en la técnica para la expresión de un polipéptido heterólogo incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, células de riñón de hámster bebé, células de melanoma de ratón NS0, células de mieloma de rata YB2/0, células de riñón embrionario humano, células de retina embrionaria humana y muchas otras.
Los vectores adecuados pueden elegirse o construirse, conteniendo secuencias reguladoras apropiadas, incluyendo secuencias promotoras, secuencias terminadoras, secuencias de poliadenilación, secuencias potenciadoras, genes marcadores y otras secuencias según sea apropiado. Los vectores pueden ser plásmidos, por ejemplo, fagémidos, o virales, por ejemplo, 'fagos', según corresponda [Sambrook and Russell, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 3a edición, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press]. Muchas técnicas y protocolos conocidos para la manipulación de ácidos nucleicos, por ejemplo en la preparación de construcciones de ácidos nucleicos, mutagénesis, secuenciación, introducción de ADN en células y expresión génica, y análisis de proteínas, se describen en detalle en Ausubel y col. [Ausubel y col. eds., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 4a edición1999].
Un aspecto adicional de la presente descripción proporciona una célula huésped que contiene ácido nucleico como se describe en esta invención. Dicha célula huésped puede ser una célula in vitro y puede estar en cultivo. Dicha célula huésped puede ser una célula in vivo. La presencia in vivo de la célula huésped puede permitir expresión intracelular de los miembros de unión de la presente descripción como "intracuerpos" o anticuerpos intracelulares. Los intracuerpos pueden usarse para terapia génica.
Otro aspecto proporciona un procedimiento que comprende introducir ácido nucleico de la presente descripción en una célula huésped. La introducción puede emplear cualquier técnica disponible. Para las células eucariotas, las técnicas adecuadas pueden incluir transfección con fosfato de calcio, DEAE-Dextrano, electroporación, transfección y transducción mediada por liposomas usando retrovirus u otro virus, por ejemplo, Vaccinia, o para células de insectos, Baculovirus. La introducción de ácido nucleico en la célula huésped, en particular en una célula eucariota, puede utilizar un sistema viral o un sistema basado en plásmido. El sistema de plásmido puede mantenerse episomal o se puede incorporar en la célula huésped o en un cromosoma artificial. La incorporación puede ser o bien mediante integración aleatoria o específica de una o más copias en loci única o múltiple. En células bacterianas, las técnicas adecuadas pueden incluir transformación con cloruro de calcio, electroporación y transfección con bacteriófagos. La introducción puede seguirse causando o permitiendo la expresión del ácido nucleico, por ejemplo, cultivando células huésped en condiciones para la expresión del gen. La purificación del producto expresado puede lograrse por procedimientos conocidos para un experto en la materia.
El ácido nucleico de la presente descripción puede estar integrado en el genoma (por ejemplo, cromosoma) de la célula huésped. La integración puede promoverse mediante la inclusión de secuencias que promueven la recombinación con el genoma, según técnicas estándar.
La presente descripción también proporciona un procedimiento que comprende el uso de una construcción como se indicó anteriormente en un sistema de expresión para expresar un miembro de unión o polipéptido como anteriormente. Los miembros de unión según la presente descripción se pueden usar en un tratamiento (que puede incluir tratamiento profiláctico) de una enfermedad o trastorno en el cuerpo humano o animal (por ejemplo, en un paciente humano), que comprende administrar el miembro de unión al paciente. Condiciones tratables según la presente descripción se describen en otra parte en esta invención, incluyendo el tratamiento preventivo y reducción de la gravedad de la afección, o uno o más de sus síntomas, o retrasar o reducir el riesgo de aparición.
En consecuencia, la presente descripción proporciona un procedimiento para tratar o reducir la gravedad de al menos un síntoma de cualquiera de las condiciones mencionadas en esta invención, que comprende administrar a un paciente en necesidad del mismo una cantidad efectiva de uno o más miembros de unión de la presente descripción sola o en un régimen terapéutico combinada con otro medicamento apropiado conocido en la técnica o descrito en esta invención de tal manera que la gravedad de al menos un síntoma de cualquiera de los trastornos anteriores se reduzca. El término "dosis efectiva" se define como una cantidad suficiente para curar o al menos detener parcialmente la enfermedad y sus complicaciones en un paciente que ya padece la enfermedad.
La presente descripción se dirige inter alia para tratamiento de la enfermedad de Alzheimer y otras enfermedades amiloidogénicas mediante la administración del anticuerpo terapéutico de la presente descripción a un paciente bajo condiciones que generan una respuesta terapéutica beneficiosa en un paciente (por ejemplo, una reducción de I3A1-42 en LCR, una reducción de la carga de placas, inhibición de la formación de placas, reducción de la distrofia neurítica, mejora y/o reversión de la función cognitiva, reducción o prevención del deterioro cognitivo) en el paciente, por ejemplo, para la prevención o tratamiento de una enfermedad amiloidogénica.
Tal como se usa en esta invención, "tratamiento" se define como la aplicación o administración de un agente terapéutico a un paciente que tiene una enfermedad o afección asociada con la amiloidosis; o un síntoma de, o una predisposición hacia dicha enfermedad o condición asociada con amiloidosis, con el propósito de curar, sanar, aliviar, mitigar, alterar, remediar, mejorar o afectar la enfermedad, la condición, los síntomas de la misma o la predisposición a la misma.
La presente descripción proporciona procedimientos para impedir o tratar una enfermedad asociada con depósitos amiloides de pA en el cerebro de un paciente. Tales enfermedades incluyen la enfermedad de Alzheimer, síndrome de Down y el deterioro cognitivo. El deterioro cognitivo puede producirse con o sin otras características de una enfermedad amiloidogénica. La presente descripción proporciona procedimientos de tratamiento de la degeneración macular, una afección que está vinculada con I3A. Los procedimientos de la presente descripción pueden implicar la administración de una dosis efectiva a un paciente de un anticuerpo que se une específicamente al I3A1-42 y formas N-terminales truncadas del mismo. Tales procedimientos son particularmente útiles para impedir o tratar la enfermedad de Alzheimer en pacientes humanos.
Los anticuerpos de la presente descripción pueden usarse en regímenes terapéuticos para impedir o mejorar la neuropatología y, en algunos pacientes, el deterioro cognitivo asociado con la enfermedad de Alzheimer.
Los pacientes susceptibles de tratamiento incluyen pacientes que muestran síntomas y también individuos con riesgo de enfermedad, pero que no muestran síntomas. Para la enfermedad de Alzheimer, potencialmente cualquier persona está en riesgo si la misma vive por un tiempo suficientemente largo. Los anticuerpos de la presente descripción se pueden administrar profilácticamente a un sujeto sin ninguna evaluación del riesgo del paciente objeto. Los pacientes susceptibles de tratamiento incluyen individuos que tienen un riesgo genético conocido de la enfermedad de Alzheimer, por ejemplo las personas que tienen parientes de sangre con esta enfermedad y aquellos cuyo riesgo se determina por análisis de marcadores genéticos o bioquímicos. Los marcadores genéticos de predisposición hacia la enfermedad de Alzheimer incluyen mutaciones en el gen PPA, particularmente mutaciones en la posición 717 y las posiciones 670 y 671, a las que se hace referencia como mutaciones de Hardy y mutaciones suecas, respectivamente. Otros marcadores de riesgo son mutaciones en los genes de la presenilina, PS1 y PS2, y ApoE4, historia familiar de EA, hipercolesterolemia o aterosclerosis. Los individuos que sufren de la enfermedad de Alzheimer se pueden diagnosticar por la demencia característica asociada con la enfermedad, así como por la presencia de factores de riesgo descritos anteriormente. Una serie de pruebas de diagnóstico están disponibles para ayudar en la identificación de la enfermedad de Alzheimer en un individuo. Estas incluyen la medición de los niveles de LCR tau y I3A1-42. Tau elevado y la disminución de los niveles de I3A1-42 pueden significar la presencia de EA. Las personas que sufren de la enfermedad de Alzheimer también pueden diagnosticarse mediante criterios NINCDS-ADRDA o DSM-IV-TR.
En pacientes asintomáticos, el tratamiento puede comenzar a cualquier edad (por ejemplo, 10, 20, 30). Generalmente, el tratamiento se inicia en la vida posterior, por ejemplo, cuando un paciente llega a sus 40, 50, 60 o 70 años de edad. El tratamiento puede implicar múltiples dosis durante un período de tiempo, que puede ser durante toda la vida restante del paciente. La necesidad de la administración de dosis repetidas puede monitorizarse mediante la medición de los niveles de anticuerpos en el tiempo.
Para la profilaxis, composiciones farmacéuticas o medicamentos se administran a un paciente susceptible a, o de otra manera en riesgo de, enfermedad de Alzheimer en una cantidad suficiente para eliminar o reducir el riesgo, disminuir la gravedad, o retrasar el comienzo de la enfermedad, incluyendo el deterioro bioquímico, histológico, cognitivo y/o síntomas conductuales de la enfermedad, sus complicaciones y fenotipos patológicos intermedios que se presentan durante el desarrollo de la enfermedad. Para aplicaciones terapéuticas, se administran composiciones o medicamentos a un paciente que se sospecha de, o que ya sufre de tal enfermedad en una en una cantidad suficiente para curar o al menos detener parcialmente, los síntomas de la enfermedad (deterioro histológico, cognitivo, bioquímico y/o conductual), incluyendo sus complicaciones y fenotipos patológicos intermedios en el desarrollo de la enfermedad.
La presente descripción proporciona un procedimiento para tratar a un individuo que comprende administrar a un individuo que lo necesita una cantidad efectiva de uno o más miembros de unión de la presente descripción solo o en un régimen terapéutico combinado con otro medicamento apropiado conocido en la técnica o descrito en esta invención. Un procedimiento de tratamiento puede comprender administrar una cantidad efectiva de un miembro de unión que se describe en esta invención a un paciente en necesidad del mismo, donde los niveles de I3A1-42 están disminuidos en el plasma sanguíneo y/o LCR.
Un procedimiento de tratamiento puede comprender (i) identificar a un paciente que tiene una afección asociada con la amiloidosis como se ha mencionado en esta invención, y (ii) administrar una cantidad efectiva de un miembro de unión descrito en esta invención al paciente, donde los niveles de I3A1-42 están disminuidos en el plasma sanguíneo y/o LCR, y la amiloidosis está reducida. Una cantidad efectiva es una cantidad que disminuye el nivel de I3A1-42 así como disminuye o reduce la gravedad de al menos un síntoma de la enfermedad o trastorno particular a tratar, pero no necesariamente cura la enfermedad o trastorno.
La presente descripción también proporciona un procedimiento de antagonizar al menos un efecto de I3A1-42 que comprende poner en contacto con, o la administración de una cantidad efectiva de uno o más miembros de unión de la presente descripción de tal manera que al menos un efecto de I3A1-42 sea antagonizado.
En consecuencia, aspectos adicionales de la presente descripción proporcionan procedimientos de tratamiento que comprenden la administración de un miembro de unión según lo previsto, composiciones farmacéuticas que comprenden tal miembro de unión, y el uso de tal miembro de unión en la fabricación de un medicamento para administración, por ejemplo, en un procedimiento de fabricación de un medicamento o composición farmacéutica que comprende formular el miembro de unión con un excipiente farmacéuticamente aceptable. Un excipiente farmacéuticamente aceptable puede ser un compuesto o una combinación de compuestos que entran en una composición farmacéutica sin provocar reacciones secundarias y que permite, por ejemplo, la facilitación de la administración del miembro de unión, un aumento de su vida útil y/o en su eficacia en el cuerpo, un aumento de su solubilidad en solución o bien una mejora en su conservación. Estos vehículos farmacéuticamente aceptables son bien conocidos y serán adaptados por el experto en la materia como una función de la naturaleza y del modo de administración del (de los) compuesto(s) activo(s) elegido(s).
Los miembros de unión como se describen en esta invención generalmente se administrarán en forma de una composición farmacéutica, que puede comprender al menos un componente, además del miembro de unión. Por lo tanto, las composiciones farmacéuticas según la presente descripción, y para su uso según la presente descripción, pueden comprender, además de un miembro de unión, un excipiente, vehículo, tampón, estabilizador u otros materiales farmacéuticamente aceptables bien conocidos por los expertos en la materia. Dichos materiales no deben ser tóxicos y no deben interferir con la eficacia del ingrediente activo. La naturaleza precisa del vehículo u otro material pueden depender de la vía de administración.
Para formulaciones inyectables, por ejemplo, para inyección intravenosa o subcutánea, el ingrediente activo estará en la forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable que es libre de pirógeno y tiene un pH, isotonicidad y estabilidad adecuados. Miembros de unión como se describe en esta invención puede ser formulados en forma líquida, semisólida o formas sólidas dependiendo de las propiedades físico-químicas de la molécula y de la ruta de entrega. Las formulaciones pueden incluir excipientes, o combinaciones de excipientes, por ejemplo: azúcares, aminoácidos y tensioactivos. Las formulaciones líquidas pueden incluir una amplia gama de concentraciones de anticuerpos y pH. Las formulaciones sólidas se pueden producir por liofilización, secado por pulverización, o secado por tecnología de fluidos supercríticos, por ejemplo. El tratamiento puede administrarse por inyección (por ejemplo, por vía subcutánea, o intravenosa. El tratamiento se puede administrar por infusión por pulsos, particularmente con dosis decrecientes del miembro de unión. La ruta de administración puede determinarse por las características fisicoquímicas del tratamiento, por consideraciones especiales para la enfermedad o por el requisito de optimizar la eficacia o minimizar los efectos secundarios. Una ruta particular de administración es intravenosa. Otra ruta de administración de composiciones farmacéuticas de la presente descripción es por vía subcutánea. La inyección subcutánea utilizando un dispositivo sin aguja también es ventajosa.
Una composición puede administrarse sola o en combinación con otros tratamientos, ya sea simultánea o secuencialmente, dependiendo de la afección a tratar.
Un miembro de unión se puede utilizar como parte de una terapia de combinación junto con un componente medicinal adicional. Los tratamientos de combinación pueden usarse para proporcionar efectos sinérgicos significativos, particularmente la combinación de un miembro de unión con uno o más de otros fármacos. Un miembro de unión puede administrarse al mismo tiempo o secuencialmente o como una preparación combinada con otro agente o agentes terapéuticos, para el tratamiento de una o más de las condiciones mencionadas en esta invención.
Un miembro de unión y uno o más de los componentes medicinales adicionales anteriores se pueden utilizar en la fabricación de un medicamento. El medicamento puede ser para administración por separado o combinado a un individuo, y en consecuencia puede comprender el miembro de unión y el componente adicional como una preparación combinada o como preparaciones separadas. Preparaciones separadas se pueden utilizar para facilitar la administración independiente y secuencial o simultánea, y permitir la administración de los componentes por diferentes vías, por ejemplo la administración oral y parenteral.
Las composiciones proporcionadas pueden administrarse a mamíferos. La administración es normalmente en una "cantidad terapéuticamente efectiva", es decir, suficiente para mostrar beneficio a un paciente. Dicho beneficio puede ser al menos la mejora de al menos un síntoma. La cantidad real administrada y la velocidad y el tiempo de administración dependerán de la naturaleza y la gravedad de lo que se esté tratando, el mamífero en particular que se esté tratando, la condición clínica del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de entrega de la composición, el tipo de miembro de unión, el procedimiento de administración, la programación de administración y otros factores conocidos por los médicos. Prescripción de tratamiento, por ejemplo, las decisiones sobre la dosificación, etc., son responsabilidad de los médicos generales y otros médicos y pueden depender de la gravedad de los síntomas y/o de la progresión de una enfermedad que se esté tratando. Una cantidad terapéuticamente efectiva o dosis adecuada de un miembro de unión de la presente descripción pueden determinarse comparando su actividad in vitro y su la actividad in vivo en un modelo animal. Se conocen procedimientos para la extrapolación de dosis efectivas en animales de prueba a seres humanos. La dosis precisa dependerá de varios factores, incluyendo si el anticuerpo es para diagnóstico, prevención o tratamiento, el tamaño y la ubicación del área a tratar, la naturaleza precisa del anticuerpo (por ejemplo, anticuerpo completo, fragmento o diacuerpo) y la naturaleza de cualquier marcador detectable u otra molécula unida al anticuerpo. Una dosis típica anticuerpo estará en el intervalo de 100 mg a 1 g para aplicaciones sistémicas. Se puede administrar una dosis inicial de carga más alta, seguida de una o más dosis más bajas. Típicamente, el anticuerpo será un anticuerpo completo, por ejemplo, el IgG1 o isotipo IgG1-TM. Los tratamientos se pueden repetir diariamente, dos veces a la semana, de forma semanal o mensual, a discreción del médico. Los tratamientos pueden ser cada dos a cuatro semanas para la administración subcutánea y cada cuatro a ocho semanas para administración intravenosa. El tratamiento puede ser periódico, y el período entre administraciones es de aproximadamente dos semanas o más, por ejemplo, aproximadamente tres semanas o más, aproximadamente cuatro semanas o más, o aproximadamente una vez al mes.
Varios aspectos y realizaciones adicionales de la presente descripción serán evidentes para los expertos en la técnica en vista de la presente descripción.
Todos los documentos, incluyendo antecedentes de bases de datos y números de acceso, patentes, solicitudes de patentes y publicaciones, citadas en esta memoria descriptiva se incorporan en esta invención por referencia en su totalidad para todos los propósitos.
"y/o" donde se usa en esta invención debe tomarse como una descripción específica de cada una de las dos características o componentes especificados con o sin el otro. Por ejemplo, "A y/o B" debe ser tomada como una descripción específica de cada uno de (i) A, (ii) B y (iii) A y B, al igual que si cada uno se estableciese de forma individual en esta invención.
Ciertos aspectos y realizaciones de la presente descripción se ilustrarán ahora a modo de ejemplo y con referencia a las figuras y tablas que acompañan.
Ejemplos
Las siguientes secuencias se han depositado en NCIMB, Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, AB21 9YA. Escocia, Reino Unido:
E. coli TOP10 células Abet0007 = NCIMB 41889
E. coli TOP10 células Abet0380-GL = NCIMB 41890
E. coli TOP10 células Abet0144-GL = NCIMB 41891
E. coli TOP10 células Abet0377-GL = NCIMB 41892
Fecha de depósito = 02 de noviembre de 2011
Ejemplo 1. Beta Anti-Amiloide 1-42 generación y selección principal de anticuerpos específicos
1.1 Formulación de péptidos beta amiloides
Péptido beta amiloide humano botinilado 1-42 (rPeptide, EE. UU.; cat: A1117 o Bachem AG, Suiza; cat: H-5642) se volvió a suspender a 1 mg/ml en 1% solución de hidróxido de amonio (v/v) y se almacenó en alícuotas a -80°C hasta que fuese necesario. Se siguió un procedimiento idéntico para el péptido beta amiloide humano no marcado 1-42 (Anaspec, EE. UU.; cat: 64129), péptido beta amiloide humano no marcado 1-40 (rPeptide, EE. UU.; cat: A1155), péptido beta amiloide humano biotinilado 1-40 (rPeptide, EE. UU.; cat: A111 o Bachem AG, Suiza; cat: H-5914), péptido beta amiloide murino biotinilado 1-42 (Anaspec, EE. UU.; cat: 61718-01) y péptido beta amiloide murino biotinilado 1-40 (Anaspec, EE. UU.;cat: 61717).
1.2 Selecciones
La biblioteca de presentación de fagos Fab310-Lambda (Dyax, EE. UU.) clonada en un vector fagémido basado en el fago filamentoso M13 fue utilizada para selecciones (Hoet y col., 2005). Anticuerpos Fab específicos beta anti-Amiloide 1-42 fueron aislados de las bibliotecas de presentación de fagos usando una serie de ciclos de selección en beta amiloide humano sintético biotinilado 1-42 (rPeptide, EE. UU.), esencialmente como se describió previamente (Hawkins y col., 1992; Vaughan y col., 1996). En resumen, para la primera ronda de selecciones en fase de solución, se añadió beta amiloide biotinilado 1-42 en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS, pH 7,4) a las partículas de fago purificadas que se habían preincubado durante 1 hora en Marvel-PBS (3% w/v) conteniendo un exceso de 100 veces de péptido beta amiloide humano no marcado 1-40 (Anaspec, EE. UU.). Las partículas de fago que se unieron al péptido beta amiloide biotinilado 1-42 fueron capturadas utilizando perlas paramagnéticas acopladas con Estreptavidina (Invitrogen Life Technologies, Reino Unido) y fagos débilmente unidos fueron eliminados mediante una serie de ciclos de lavado usando PBS-Tween (0,1% v/v). Partículas de fago unidas se eluyeron de las perlas, infectadas en bacterias TG1 E. coli y se rescataron para la siguiente ronda de selección (Vaughan y col., 1996). Dos rondas posteriores de selección se llevaron a cabo como se describió anteriormente, pero con una concentración reducida de antígeno beta amiloide biotinilado 1-42.
1.3 Identificación de clones específicos de beta amiloide 1-42 utilizando un ensayo de unión directa en fragmentos Fab no purificados
Para producir fragmentos Fab solubles de cadena simple (sFab) la fijación genelll fue eliminada del casete de presentación Fab310-Lambda mediante técnicas de escisión y ligación estándar. Brevemente, los vectores fagémidos se aislaron del resultado de la 3 ronda utilizando kits de purificación de ADN estándar (QIAgen, Reino Unido) y la secuencia de fijación genelll se eliminó a partir del vector usando digestión con restricción MLUI (Hoet y col., 2005). Vectores religados se transformaron de nuevo en células TG1 y las colonias individuales se recogieron para análisis. sFab sin purificar a partir de preparaciones periplásmicas se examinaron en ensayo de unión homogéneo de fluorescencia resuelta en el tiempo (HTRF™, CisBio International, Francia) usando un lector de placas Envision (PerkinElmer, EE. UU.). En este ensayo, la unión de sFab sin purificar a péptido beta amiloide humano 1-42 se evaluó midiendo la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) entre sFab marcado con histidina y el péptido biotinilado usando criptato de estreptavidina y reactivos de detección anti-6his-XL665 (CisBio International, Francia; cat: 610SAKLB y 61HISXLB respectivamente). Resultados de selección se examinaron como extractos periplásmicos bacterianos no purificados que contienen sFab, preparado en tampón MOPS 50 mM pH 7,4, EDTA 0,5 mM y sacarosa 0,5 M. Diez microlitros de muestras sFab no purificadas se añadieron a una placa de ensayo de 384 pocilios Costar® (Corning, EE. UU.; cat: 3676). Esto fue seguido por la adición de 5 pl de 20 nM de beta amiloide sintético humano 1-42 y 5 pl de una solución combinada de 6 nM de criptato de estreptavidina y 20 nM de anti-his-XL665. Pocillos de unión no específicos (controles negativos) se definieron para cada placa mediante el uso de sFab sin purificar de control negativo en lugar de la muestra sFab de prueba. Clones de sFab de reactividad cruzada se identificaron usando un ensayo concurrente con péptido beta amiloide humano 1-40. Todas las diluciones se realizaron en 50 mM MOPS pH 7,4 (Sigma, Reino Unido; cat: M9381) conteniendo 0,4 M KF (BDH Chemicals, EE. UU.; cat: 103444T), 0,1% de albúmina de suero libre bovino sin ácidos grasos (Sigma, Reino Unido; cat: A6003) y 0,1% de Tween 20 (v/v) (Sigma, Reino Unido; cat: P2287) (tampón de ensayo). Las placas de ensayo se incubaron durante 4 horas a temperatura ambiente antes de la lectura de fluorescencia resuelta en el tiempo en un lector de placas Envision (PerkinElmer, EE. UU.), utilizando una longitud de onda de excitación de 320 nm y midiendo la emisión a 620 nm y 665 nm (100 destellos).
Los datos se analizaron mediante el cálculo de % de valores Delta F para cada muestra. % Delta F fue determinado según la ecuación 1.
Ecuación 1:
% Delta F = (muestra proporción 665 nm/620 nm) - (control negativo proporción 665 nm/620 nm) X 100
(control negativo proporción 665 nm/ 620 nm)
1.4 Ensayo de unión directa de fragmentos sFab purificados
Extractos de periplasma de sFab sin purificar que mostraron unión específica al péptido beta amiloide humano 1-42 mediante el ensayo HTRF™ se sometieron a secuenciación de ADN (Osbourn y col., 1996; Vaughan y col., 1996). El sFab con secuencias de proteínas únicas se expresaron en E. coli y se purificó por cromatografía de afinidad (esencialmente como se describe (Bannister y col., 2006)). El perfil de unión de beta amiloide de cada sFab purificado se determinó mediante prueba de una serie de diluciones de sFab purificado en el ensayo HTRF™ descrito en la sección 1.3, sustituyendo la preparación periplásmica de sFab no purificado con el sFab purificado. El sFab purificado fue probado al mismo tiempo para la unión a péptido beta amiloide humano biotinilado 1-42, péptido beta amiloide murino biotinilado 1-42 y péptido beta amiloide humano biotinilado 1-40. Además, sFab fue probado para unión a péptido beta amiloide humano codificado 1-42 (Anaspec, síntesis personalizada) en un experimento HTRF™ separado con el fin de control para cualquier unión a péptido no específico. Los datos se analizaron mediante el cálculo de los valores % Delta F como se describe en la sección 1.3.
Ejemplos de resultados para Abet0007 sFab purificado se muestran en la Figura 1. Estos resultados demuestran que Abet0007 se une específicamente al péptido beta amiloide humano 1-42 sobre el péptido beta amiloide humano 1-40 y el péptido beta amiloide humano codificado 1-42. Además, Abet0007 sFab tiene reactividad cruzada con péptido beta amiloide murino 1-42.
1.5 Cambio de formato de anticuerpos específicos Fabs beta amiloide 1-42 al formato IgG2
Trece clones específicos beta amiloides 1-42 fueron convertidos de Fab a IgG2 por subclonación de los dominios de la cadena pesada variable (Vh ) y la cadena ligera variable (Vl ) en vectores que expresan las cadenas completas, pesada y ligera, de anticuerpo humano, respectivamente. Los dominios Vh eran codones optimizados internamente, antes de subclonación, ya que los dominios Vh de la biblioteca Dyax FAB310 son semisintéticos y fallaron en expresarse en cantidades suficientes dentro de las células de mamíferos descritas en esta invención. Un VH emparejado internamente a la línea germinal, que se sabe que se expresa bien como IgG humano de longitud total en células de mamífero, se usó como un modelo para alterar el uso de codones de ADN de los dominios VH Dyax al tiempo que se conservaba la secuencia de aminoácidos original. Las cadenas pesadas variables optimizadas del codón fueron clonadas en un vector de expresión de mamífero (UEP 9,2) que contiene los dominios constantes de cadena pesada humana y elementos reguladores para expresar la cadena pesada IgG2 completa en células de mamífero. Del mismo modo, el dominio de cadena ligera variable se clonó en un vector de expresión de mamífero (pEU4,4) para la expresión de los dominios constantes de cadena ligera lambda humana y elementos reguladores para expresar la cadena ligera de IgG completa en células de mamífero. Los vectores para la expresión de cadenas pesadas y cadenas ligeras fueron descritos originalmente en Persic y col. (Persic y col., 1997). Para obtener clones como IgG2, los vectores de expresión de IgG de cadena pesada y ligera se transfectaron transitoriamente en células de mamífero HEK293-EBNA (Invitrogen, Reino Unido; cat: R620-07) o CEP6-CHO (producido internamente) en que el anticuerpo es expresado y secretado en el medio. Medios cosechados se filtraron antes de la purificación. Los IgG se purificaron usando cromatografía de Proteína A (Biosepra™, Pall, EE. UU. o MabSelect SuRe, GE Healthcare, Reino Unido). Los sobrenadantes del cultivo se cargaron en una columna apropiada de Proteína A preequilibrada en 50 mM Tris pH 8,0, NaCI 250 mM. IgG unido fue eludido de la columna usando Citrato de sodio 0,1 M pH 3,0 y el eludido se neutralizó mediante la adición de tampón Tris 1 M (pH 10,0). Los IgG fueron a intercambio con tampón en PBS de Dulbecco usando columnas de intercambio con tampón NAP-10 (GE Healthcare, Reino Unido; cat: 17-0854­ 02). Los IgG purificados se pasaron a través de un filtro de 0,2 micrómetros y la concentración de IgG se determinó por absorbancia a 280 nm usando un coeficiente de extinción basado en la secuencia de aminoácido del IgG. Los IgG purificados se analizaron para agregación o degradación utilizando técnicas SEC-HPLC y SDS-PAGE.
1.6 Determinación de especificidad de anticuerpos principales en un ensayo HTRF™ de competición con péptido beta amiloide
Como se describió anteriormente, los fragmentos sFab purificados que se unieron específicamente al péptido beta amiloide 1-42 se convirtieron a IgG recombinante. Para probar la especificidad de estos IgG para unirse a otros péptidos beta amiloides humanos, se desarrolló un ensayo de competición. En este ensayo péptidos beta amiloides humanos 1-42 (rPeptide, EE. UU., cat: A1165), 1-40 (rPeptide, EE. UU., cat: A1155), 11-42 (rPeptide, EE. UU., cat: A1063), 17-42 (rPeptide, EE. UU., cat: A1058) y 1-43 (Anaspec, EE. UU.; cat: 25356) no marcados se incubaron con el IgG principal y péptido amiloide humano biotinilado 1-42 (rPeptide, EE. UU., cat: A1117). En resumen, una serie de diluciones de cada péptido de prueba se combinó con 0,3 nM de IgG de prueba y 5 nM de péptido beta amiloide humano biotinilado 1-42. La competición de cada péptido se evaluó mediante la detección de la pérdida de la unión del IgG principal al péptido biotinilado 1-42 midiendo la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) entre el IgG y el beta amiloide biotinilado 1-42 usando reactivos de detección criptato de estreptavidina (CisBio Internacional, Francia; cat: 610SAKLB) y Fc IgG XL665 antihumano (CisBio International, Francia; cat: 61HFCXLB). Criptato de estreptavidina y Fc IgG XL665 antihumano se combinaron a 7 nM y 5 nM respectivamente en tampón de ensayo conteniendo 50 mM de MOPS pH 7,4 (Sigma, Reino Unido; cat: M9381), 0,4 M de KF (BDH Chemicals, EE. UU.; cat: 103444T), 0,1% de albúmina de suero bovino libre de ácido graso (Sigma, Reino Unido; cat: A6003) y 0,1% de Tween 20 (v/v) (Sigma, Reino Unido; cat: P2287). Se añadieron 5 pl de esta solución a la placa de ensayo (Costar® 384 pocillos negros poco profundos, Corning Life Sciences; cat: 3676). Péptidos beta amiloides se diluyeron en serie en tampón de ensayo usando una placa de fondo en U Greiner de 96 pocillos (Greiner BioOne, Alemania; cat: 650201). 5 pl de cada dilución de péptido se transfirieron por duplicado a la placa de ensayo usando un robot de manipulación de líquidos MiniTrak™ (PerkinElmer, EE. UU.). El IgG de prueba se diluyó a 1,2 nM en tampón de ensayo y 5 pl se añadieron a la placa de ensayo. Una solución 20 nM de péptido beta amiloide humano biotinilado 1-42 se preparó en tampón de ensayo y se añadieron 5 pl de esta solución a las placas de ensayo. Pocillos de unión no específicos (controles negativos) se definieron para cada placa mediante la sustitución del IgG de prueba con 5 pl de tampón de ensayo. Las placas de ensayo se incubaron durante 4 horas a temperatura ambiente, antes de la lectura de fluorescencia resuelta en el tiempo, a longitudes de onda de emisión de 620 nm y 665 nm, usando un lector de placas EnVision (PerkinElmer, EE. UU.).
Los datos se analizaron mediante el cálculo de valores % Delta F para cada muestra. % Delta F fue determinado según la ecuación 1. Valores de % Delta F fueron usados posteriormente para calcular % de unión específica como se describe en la ecuación 2.
Ecuación 2:
% unión específica = o/o De|ta F de muestra x 100
% Delta F de control total de unión
Ejemplos de resultados para Abet0007 IgG son mostrados en la Figura 2. Estos resultados demuestran que IgG Abet0007 se une al péptido beta amiloide humano 1-42, pero no al péptido beta amiloide humano 1-40. Este anticuerpo también se une a los péptidos truncados 11-42 y 17-42 y al péptido beta amiloide humano 1-43.
1.7 Determinación de afinidades de unión de anticuerpos principales a beta amiloide humano 1-42 usando Resonancia de Plasmones Superficiales
Fue utilizado el instrumento biosensor BIAcore T-100 (GE Healthcare, Reino Unido) para evaluar los parámetros cinéticos de la interacción entre cada anticuerpo principal y péptido beta amiloide humano 1-42 producido sintéticamente. Estos experimentos se realizaron esencialmente como se describe por Karlsson y col. (Karlsson y col., 1991).
El biosensor utiliza los efectos ópticos de la Resonancia de Plasmones Superficiales (SPR) para estudiar los cambios en la concentración superficial que resultan de la interacción de una molécula de analito que se hace fluir a través de una molécula de ligando que está inmovilizado sobre la capa de dextrano de un chip biosensor. Típicamente, una concentración definida de la especie de analito se hace pasar sobre el ligando acoplado y se detecta cualquier unión como un aumento en la señal de SPR local (fase de asociación). Esto es seguido por un período de flujo de tampón, durante el cual la disociación de las especies de analito del ligando inmovilizado superficial puede ser observada como una disminución en la señal (fase de disociación). El analito restante puede a continuación ser retirado del ligando vinculado al chip y el procedimiento se repite a varias concentraciones diferentes de analito. El experimento está diseñado de manera que ni la capacidad de unión absoluta ni el perfil cinético del ligando acoplado cambian de manera significativa durante todo el experimento y pueden ser monitoreados usando una serie de controles empleados durante todo el experimento. Una solución salina tamponada HEPES patenteada que contiene EDTA (HBS-EP+, GE Healthcare, Reino Unido) se utiliza típicamente como tampón diluyente para las muestras de analitos y como tampón de flujo durante la fase de disociación. Los datos experimentales se registran con el tiempo como 'Unidades de Resonancia' (UR), que son unidades arbitrarias que corresponden directamente a la señal de SPR. Las UR son directamente proporcionales a los cambios en el índice de refracción en la superficie del chip, que a su vez es una medida aproximada de la masa de analito ligado. El paquete de software BIAevaluation patenteado se puede utilizar a continuación para procesar los datos y ajustar los modelos de unión a los conjuntos de datos. Las constantes de tasas de asociación (ka, M-1 s-1) y de disociación (kd, s-1) obtenidas permiten el cálculo de las constantes de afinidad de disociación (KD, M).
La afinidad de unión entre cada IgG de prueba y péptido beta amiloide humano 1-42 se estimó usando ensayos en los que el anticuerpo se acopló de forma covalente por enlace amina a una superficie de chip CM5 patenteado a una densidad superficial final de aproximadamente 2.000 UR. La superficie del chip era regenerada entre ciclos por una única inyección de 40 segundos de 10 mM de Glicina pH 2,0 para eliminar el ligando vinculado al anticuerpo. La regeneración no dio lugar a una pérdida significativa de la actividad de unión del péptido.
Una serie de diluciones de péptido beta amiloide humano 1-42 sintético (1,6 - 100 nM) se pasaron secuencialmente sobre la superficie del anticuerpo por una cantidad suficiente de tiempo para observar sensogramas que podrían ser ajustados a un modelo de unión apropiado con confianza. Los datos de la célula de flujo de referencia en blanco se restaron de cada conjunto de datos de IgG y un blanco tampón de concentración cero fue restado como doble referencia del conjunto de datos principales para reducir el impacto de cualquier artefacto tampón o efectos de unión no específicos. A continuación, un modelo de unión apropiado se ajustó simultáneamente a los datos de cada titulación de analito usando el software BIAevaluation.
La validez de los datos se evaluó usando el valor de Chi2 calculado, con un valor aceptable estando abajo 2 UR2. El éxito general del ajuste se estimó utilizando los residuos, con una desviación de menos de 2 UR siendo aceptable. Ejemplos de resultados para Abet0007 IgG2 se muestran en la Figura 3. La constante de tasa de asociación media (ka), la constante de tasa de disociación (kd) y la constante de disociación (KD) son 1,6 x 105 M_1 s-1, 7,4 x 10‘2 s_1 y 473 nM respectivamente. Estos parámetros se derivaron de un ajuste de Langmuir 1:1 a los datos.
1.8 Caracterización funcional de anticuerpos principales por agotamiento de péptidos beta amiloides a partir de plasma humano
Los anticuerpos principales se probaron en un ensayo de agotamiento de plasma para investigar su capacidad de inmunoprecipitar péptido beta amiloide humano 1-42 a partir de plasma sanguíneo humano. Este ensayo fue utilizado para proporcionar evidencia de la eficacia funcional para cada anticuerpo. Brevemente, muestras de plasma humano se incubaron con cada IgG de prueba durante 3 horas después de lo cual se eliminaron los anticuerpos y cualesquiera ligandos vinculados. El contenido de péptido beta amiloide 1-42 de las muestras de plasma humano fue ensayado usando técnicas estándar antes y después de la inmunoprecipitación, y estos valores se utilizaron para determinar la eficacia del anticuerpo. Las muestras de plasma también se analizaron para cualquier agotamiento en péptido amiloide 1-40 para evaluar la especificidad de los anticuerpos principales.
Cada anticuerpo de prueba fue, separadamente, enlazado covalentemente a perlas magnéticas de Ácido Carboxílico Dynabeads® M-270 (Invitrogen Life Technologies, Reino Unido; cat: 143-05D) según las instrucciones del fabricante. Para cada IgG de prueba,100 pl de Dynabeads se lavaron dos veces con 100 pl de MES 25 mM, pH 5 (Sigma, Reino Unido; cat: M5287) usando un imán para separar las perlas de la suspensión. Inmediatamente antes de su uso, EDC (Pierce, Thermo Scientific, EE. UU.; cat: 22981) se disolvió en MES frío 25 mM, pH 5 a una concentración final de 50 mg/ml. Una solución de 50 mg/ml de NHS (Pierce, Thermo Scientific; cat: 24.500) se preparó de manera similar en MES 25 mM, pH 5. 50 pl de solución de NHS y 50 pl de solución de EDC se añadieron a las Dynabeads lavadas, que se mezclaron bien y se incubaron con rotación lenta inclinada a temperatura ambiente durante 30 minutos. Un imán se utilizó para sedimentar las perlas y se eliminó el sobrenadante. Las perlas se lavaron dos veces con 100 pl de MES 25 mM, pH 5. Cada IgG de prueba se diluyó a 0,6 mg/ml en un volumen total de 100 pl de MES 25 mM, pH 5. Las perlas lavadas se resuspendieron en la solución de ligando y se incubaron durante al menos 30 minutos a temperatura ambiente con rotación lenta inclinada. Las perlas se sedimentaron posteriormente usando un imán y se lavaron una vez con 100 pl de 50 mM tampón Tris, pH 7,4 (Sigma, Reino Unido). Las perlas se resuspendieron en 100 pl de Marvel-PBS (3% w/v) y se incubaron durante la noche a 4°C. Las perlas se lavaron dos veces con PBS de Dulbecco (100 pl) y se resuspendieron en PBS (100 pl).
Muestras de ETA-plasma se aislaron de donantes anónimos de la Clínica de Salud AstraZeneca en Sodertalje, Suecia. Se recogieron aproximadamente 100 ml de sangre de cada donante, y esto se agrupó en dos tubos de 50 ml. Se añadió EDTA a una concentración final de 5 mM para evitar la coagulación, y los tubos se centrifugaron a 4.000 x g durante 10 minutos a 4°C. Se recogió el sobrenadante (plasma), se tomaron alícuotas en tubos de 1 ml, y se almacenaron a -80°C hasta su utilización. Las muestras se ensayaron para contenido de péptido beta amiloide 1-42 y de péptido beta amiloide 1-40 tal como se describe a continuación.
Cada conjunto de perlas recubiertas de anticuerpos se incubó por separado con una alícuota de 1 ml de ETA-plasma durante 3 horas a 4°C con rotación lenta inclinada, y las perlas se sedimentaron después usando un imán. El sobrenadante se retiró cuidadosamente de las perlas y se analizó tanto para el péptido beta amiloide 1-42 como para el péptido beta amiloide 1-40 como se describe a continuación.
El análisis del contenido de péptido beta amiloide 1-40 de las muestras de plasma se realizó usando el kit ELISA para I3A 40 Humano de Invitrogen (Reino Unido; cat: KHB3482) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, un estándar beta amiloide humano 1-40 fue utilizado para crear una serie de diluciones de 1 ng/ml hasta 7,81 pg/ml. Las diluciones se hicieron utilizando Tampón de Dilución Estándar conteniendo 1 comprimido de inhibidor de proteasa (Roche, Reino Unido; cat: 11697498001) por 50 ml de diluyente. 50 pl de cada dilución se añadió a continuación a un pocillo de microtitulación diferente precubierto con un anticuerpo monoclonal patenteado específico para el N-extremo del péptido beta amiloide. Muestras de ETA-plasma fueron centrifugadas durante 10 minutos a 4°C y 2.000 x g y 50 pl de cada sobrenadante de la muestra se añadieron a un pocillo separado en la misma placa de microtitulación como las estándar. 50 pl de Anticuerpo de Detección Hu &A patenteado, que reconoce específicamente el C-extremo del péptido beta amiloide 1-40, se añadieron a continuación a cada pocillo de microtitulación. La placa se cubrió con un sello de placa y se incubó durante 3 horas a temperatura ambiente con agitación. La placa se lavó cuatro veces con 400 pl de tampón de lavado, permitiendo que la placa se remojase durante 15-30 segundos durante cada lavado. La placa después se invirtió y se secó. 100 pl de conjugado IgG h Rp Anti-Conejo patenteado se añadieron a cada pocillo, la placa se cubrió con un sello de placa, y las muestras se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. De nuevo, la placa se lavó cuatro veces con 400 pl de tampón de lavado, permitiendo que la placa se remojase durante 15-30 segundos durante cada lavado. A continuación, la placa se invirtió y se secó. Se añadieron 100 pl de Cromógeno Estabilizado patenteado a cada pocillo, y la placa se incubó en la oscuridad durante 20 minutos a temperatura ambiente. Esto fue seguido por la adición de 100 pl de Solución de Parada patenteada a cada pocillo. La absorbancia de cada pocillo se leyó a 450 nm dentro de 2 horas de la adición de la solución de parada. Una curva estándar fue producida a partir de la serie de diluciones de beta amiloide humano 1-40, y esto se utilizó para determinar la concentración de beta amiloide humano 1-40 en las muestras de ETA-plasma de prueba.
El análisis del contenido de péptido beta amiloide 1-42 de las muestras de plasma se realizó utilizando el kit INNOTEST® p-Amyloid(1-42) de Innogenetics (Bélgica; cat: 80177) esencialmente según las instrucciones del fabricante. Brevemente, un estándar beta amiloide humano 1-42 se utilizó para crear una serie de diluciones de 1 ng/ml hasta 7,81 pg/ml. 100 pl de cada dilución se añadió, a continuación, a un pocillo de microtitulación diferente precubierto con un anticuerpo monoclonal patenteado específico para el C-extremo del péptido beta amiloide humano 1-42. Muestras de ETA-plasma se centrifugaron durante 10 minutos a 4°C y 2000 x g y 100 pl de sobrenadante de cada muestra se añadieron a un pocillo separado en la misma placa de microtitulación como los estándares. La placa se cubrió con un sello de placa y se incubó durante 3 horas a temperatura ambiente con agitación. La placa se lavó cinco veces con 400 pl de tampón de lavado y a continuación se invirtió y se secó. 100 pl de conjugado patenteado 1 (C1HS), que reconoce el N-extremo del péptido beta amiloide, se añadieron a cada pocillo. La placa se cubrió con un sello de placa y las muestras se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. De nuevo, la placa se lavó cinco veces con 400 pl de tampón de lavado, y después se invirtió y se secó. 100 pl del conjugado 2 (C2), un conjugado estreptavidina-HRP que se une al anticuerpo C1HS biotinilado, se añadió a continuación a cada pocillo. La placa se cubrió con un sello de placa y se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente. La placa se lavó cinco veces con 400 pl de tampón de lavado, y después se invirtió y se secó. 100 pl de solución de sustrato patenteada se añadieron a cada pocillo, la placa se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente y, a continuación, 100 pl de solución de parada fueron añadidos a cada pocillo. La absorbancia de cada pocillo se leyó a 450 nm dentro de 15 minutos de la adición de la solución de parada. Una curva estándar fue producida a partir de la serie de diluciones de beta amiloide humano 1-42, y esto se utilizó para determinar la concentración de beta amiloide humano 1-42 en las muestras de ETA-plasma de prueba.
En un experimento, el anticuerpo Abet0007 IgG2 redujo los niveles del péptido beta amiloide humano 1-42 en plasma de 80,47 pg ml-1 a 60,56 pg ml-1 (una reducción del 25%). En un segundo experimento, los niveles se redujeron de 197,43 pg ml-1 a 154,45 pg ml-1 (una reducción del 22%).
1.9 Identificación de clones principales con baja afinidad por beta amiloide nativo usando inmunohistoquímica in vitro Los anticuerpos principales fueron probados por su capacidad de unirse al beta amiloide, con el objetivo de identificar clones principales con baja afinidad por las formas nativas del péptido beta amiloide. Brevemente, los anticuerpos principales fueron seleccionados en secciones de cerebro humano con enfermedad de Alzheimer y secciones de cerebro de ratón Tg2576 para identificar anticuerpos beta antiamiloide 1-42 que se unen a amiloide nativo in vitro. Los ratones Tg2576 son ratones transgénicos que sobreexpresan el gen para la Proteína Precursora de Amiloide (PPA) humana. Este gen lleva dos mutaciones puntuales en el sitio de escisión de gamma-secretasa (Lys670Asn y Met671Leu) que conduce a la formación de placas beta amiloides en la corteza y el hipocampo de los ratones, a partir de una edad de aproximadamente 9 meses.
Tejido cerebral humano fue aislado de la corteza frontal (circunvolución frontal inferior) de dos individuos con enfermedad de Alzheimer grave (genotipo ApoE 3/3, etapa Braak 6 y genotipo ApoE 4/3, etapa Braak 5, respectivamente). Como control, tejido equivalente fue aislado de un individuo sin demencia (genotipo ApoE 3/3, etapa Braak 1). Los tres tejidos fueron suministrados por el Banco de Cerebros de los Países Bajos (NBB). La calidad de las secciones se verificó por tinción con haematoxilina/eosina antes del uso. Tejido de cerebro de ratón se aisló de ratones Tg2576 a una edad de 15 meses (2 ratones), 18 meses (6 ratones), y 22 meses (2 ratones).
Secciones del cerebro embebidas en parafina, 4-6 pm de anchura, se prepararon para inmunohistoquímica retirando primero la matriz de soporte de parafina. Las secciones se lavaron con xileno (5 minutos x2), etanol absoluto (3 minutos x2), etanol al 95% (3 minutos x2), etanol al 70% (3 minutos x 2), ácido fórmico al 90% (Sigma Aldrich, Reino Unido; cat: 06440; 10 minutos), agua del grifo (20 minutos x3) y PBS (5 minutos X2). Las secciones fueron hervidas en solución Diva Decloaker (Biocare Medical, EE. UU.; cat: DV2004 G1) en un horno de microondas durante 20 minutos a 100°C. Las muestras se enfriaron a continuación a 40°C en un baño de agua y después se lavaron con agua destilada (5 minutos) y PBS (5 minutos x3).
Los anticuerpos IgG2 de plomo se ensayaron a concentraciones de 2, 5 y 20 mg ml-1. La unión de estos IgG se detectó usando un anticuerpo secundario antihumano de conejo (Dako, Dinamarca; cat: A0482) a una dilución de 1 en 400, seguido de anticuerpo conjugado HRP anti-conejo OmniMap (Ventana Medical Systems, EE. UU., cat: 760-4311). La señal se detectó usando el kit de ChromoMap DAB (Ventana Medical Systems, EE. UU.; cat: 760-159). Estas etapas de tinción se llevaron a cabo usando un sistema de preparación de portaobjetos automático de BenchMark (Ventana Medical Systems, EE. UU.) según protocolos estándar.
El puntaje de la tinción se llevó a cabo de una manera ciega por al menos dos personas diferentes bajo aumento óptico 20-40x. La placa de unión in vitro fue designada usando una escala de 0 (placas sin tinción) hasta 4 (tinción intensa de las placas).
Abet0007 IgG2 no mostró tinción de placas en ninguno de los cerebros humanos con Enfermedad de Alzheimer o cerebros de ratón Tg2576 (puntaje = 0). En contraste, un anticuerpo de control positivo produjo un puntaje de 4 en secciones adyacentes en las mismas condiciones. Imágenes representativas se presentan en la Figura 4.
Ejemplo 2. Optimización de anticuerpo de Abet0007 a través de mutación dirigida de las Regiones Determinantes de Complementariedad 3 (CDR3)
2.1 Conversión del clon parental Abet0007 al formato scFv
El clon parental fue convertido de formato IgG2 a formato de fragmento variable de cadena única (scFv) en preparación para optimización de afinidad. Los dominios variable pesado (Vh ) y variable ligero (Vl ) con codón optimizado fueron amplificados por separado de sus respectivos vectores IgG con la adición de sitios de clonación específicos y una región conectora flexible. A continuación, fue realizada PCR de recombinación para generar una construcción de scFv completa, que se clonó en el vector fagémido pCantab10.5, esencialmente como se describe en Vaughan y col. (Vaughan y col., 1996). El vector pCantab10.5 es una versión modificada del vector pCantab6 que contiene sitios de restricción adicionales para facilitar la adición de marcadores que no sean el estándar His y marcadores myc.
2.2 Optimización de Abet0007 por mutagénesis dirigida
El anticuerpo principal (Abet0007) fue optimizado para mejorar la afinidad a péptido beta amiloide humano 1-42 utilizando una estrategia de mutagénesis dirigida con selecciones de presentación de fagos basadas en afinidad. Grandes bibliotecas de scFv-fagos derivadas de Abet0007 fueron creadas por mutagénesis dirigida a oligonucleótidos de las regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada variable (Vh ) y cadena ligera variable (Vl ) 3 (CDR3) usando técnicas de biología molecular estándar como se describe por Clackson y Lowman ((2004) A Practical Approach, Oxford University Press).
Las bibliotecas se sometieron a selecciones de presentación de fagos basadas en afinidad para enriquecer para variantes con mayor afinidad por péptido beta amiloide humano 1-42. Las selecciones se realizaron esencialmente como se describió anteriormente (Hawkins y col., 1992; Schier y col., 1996; Thompson y col., 1996). Brevemente, partículas de fago de scFv se incubaron con péptido beta amiloide humano biotinilado 1-42 (rPeptide, EE. UU.; cat: A1117) en solución. ScFv-fagos que se unieron al antígeno fueron a continuación capturados en perlas paramagnéticas revestidas de estreptavidina (Dynabeads® M280, Invitrogen Life Sciences, Reino Unido) siguiendo las recomendaciones del fabricante. Las partículas de scFv-fagos seleccionadas fueron a continuación rescatadas como se ha descrito previamente (Osbourn y col., 1996), y el procedimiento de selección se repitió en presencia de concentraciones decrecientes de antígeno beta amiloide humano biotinilado 1-42 (200 nM a 2 nM sobre 3 rondas).
2.3 Identificación de clones mejorados usando un ensayo de unión directa
Mil setecientos sesenta scFv fueron seleccionados al azar de las rondas de selección 2 y 3 de la estrategia de mutagénesis dirigida descrita en la sección 2.2. Estos clones fueron seleccionados utilizando un ensayo de unión directa esencialmente como se describe en la sección 1.3. Brevemente, scFv no purificado de preparaciones periplásmicas se ensayaron para el aumento de la unión a péptido beta amiloide humano biotinilado 1-42 y se detectaron usando tecnología HTRF™ con criptato de estreptavidina y reactivos de detección anti-6his-XL665. scFv sin purificar de preparaciones periplásmicas fueron preparados en 50 mM de tampón MOPS pH 7,4 incluyendo 0,5 mM de EDTA y 0,5 M de sacarosa y se diluyeron posteriormente a 1% en tampón de ensayo que contiene 50 mM de MOPS pH 7,4 (Sigma, Reino Unido; cat: M9381), 0,4 M de fluoruro de potasio (BDH Chemicals, EE. UU.; cat: 103444T), 0,1% de albúmina de suero bovino libre de ácido graso (Sigma, Reino Unido; cat: A6003 ) y 0,1% de Tween 20 (v/v) (Sigma, Reino Unido; cat: P2287) usando una placa de fondo en V de 384 pocillos Greiner (Greiner BioOne, Alemania; cat: 781280). 5 pl de muestra de scFv diluida fueron transferidos a la placa de ensayo (Costar® 384 pocillos poco profundos negros, Corning Life Sciences; cat: 3676) usando un robot de manipulación de líquidos MiniTrak™ (PerkinElmer, EE. UU.). A continuación, se añadieron 5 pl de tampón de ensayo a cada pocillo. Una solución 20 nM de péptido beta amiloide humano biotinilado 1-42 (rPeptide, USA; cat: A1117) se preparó en tampón de ensayo y se añadieron 5 pl de esta solución a las placas de ensayo. Criptato de estreptavidina (Cisbio International, Francia; cat: 610SAKLB) y reactivos de detección anti-His6-XL665 (Cisbio International, Francia; cat: 61HISXLB) se combinaron en tampón de ensayo para dar concentraciones de 7 nM de criptato de estreptavidina y 60 nM de anti-His6-XL665 y, a continuación, 5 pl de este cóctel de detección se añadieron a todos los pocillos de las placas de ensayo. Pocillos de unión no específicos (controles negativos) se definieron para cada placa mediante la sustitución de la muestra csFv con 5 pl de tampón de ensayo. Placas de ensayo se incubaron durante 2,5 horas a temperatura ambiente, antes de la lectura de fluorescencia resuelta en el tiempo, a longitudes de onda de emisión de 620 nm y 665 nm, usando un lector de placas EnVision (PerkinElmer, EE. UU.). El análisis de datos se realizó como se ha descrito anteriormente (Sección 1.3) y los valores % Delta F se utilizaron para comparar las señales de ensayo en pocillos adyacentes. Un "acierto" se definió como una muestra de scFv que generó un % Delta F mayor que la señal observada para Abet0007 scFv. 2.4 Confirmación de clones mejorados usando un ensayo de competición de epítopo
Los clones que mostraron una unión a péptido beta amiloide humano 1-42 más alta que el clon parental Abet0007 se sometieron a secuenciación de ADN (Osbourn y col., 1996; Vaughan y col., 1996). El scFv con secuencias de proteínas únicas se expresó en E. coli y se purificó por cromatografía de afinidad seguida de intercambio de tampón. Las afinidades de unión de estos scFv se probaron después en un ensayo de competición de epítopos contra un anticuerpo de referencia llamado Abet0042, que tiene una afinidad similar por péptido beta amiloide humano 1-42 como Abet0007. En este ensayo de competición, la unión de Abet0042 IgG a péptido beta amiloide humano biotinilado 1-42 se compitió contra las muestras de scFv de prueba. La unión de Abet0042 IgG a péptido beta amiloide humano biotinilado 1-42 se detecta usando la tecnología HTRF™ como se describió anteriormente (sección 1.6). Brevemente, se añaden una serie de diluciones de scFv purificado a una mezcla de Abet0042 IgG, péptido beta amiloide biotinilado 1-42, criptato de estreptavidina y Fc IgG XL665 antihumano. La fluorescencia resuelta en el tiempo fue leída después de dos horas de incubación a temperatura ambiente.
scFv purificados se diluyeron en serie en tampón de ensayo que contenía 50 mM de tampón MOPS pH 7,4 (Sigma, Reino Unido; cat: M9381), 0,4 M de fluoruro de potasio (BdH Chemicals, Estados Unidos; cat: 103444T), 0,1% de albúmina de suero bovino libre de ácidos grasos (Sigma , Reino Unido; cat: A6003) y 0,1% de Tween 20 (Sigma, Reino Unido; cat: P2287) usando una placa de fondo en U Greiner de 96 pocillos (Greiner BioOne, Alemania; cat: 650201).
5 pl de cada dilución de scFv se transfirieron por duplicado a la placa de ensayo (Costar® 384 pocillos poco profundos negros, Corning Life Sciences; cat: 3676) usando un robot de manipulación de líquidos MiniTrak™ (PerkinElmer, EE.
UU.). Una solución 20 nM de péptido beta amiloide biotinilado 1-42 (rPeptide, EE. UU.; cat: A1117) se preparó en tampón de ensayo y se añadieron 5 pl de la solución de péptido biotinilado a las placas de ensayo, para dar una concentración final de 5 nM de péptido en el volumen de ensayo final de 20 pl. Las placas de ensayo se sellaron y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Criptato de estreptavidina y Fc IgG XL665 antihumano se combinaron a 7 nM y 20 nM, respectivamente, en tampón de ensayo y se añadieron 5 pl de esta solución a la placa de ensayo. Abet0042 IgG se diluyó a 2,4 nM en tampón de ensayo y 5 pl se añadieron a la placa de ensayo para generar una concentración de IgG final de 0,6 nM. Pocillos de unión no específicos (controles negativos) se definieron para cada placa mediante la sustitución de Abet0042 IgG con 5 pl de tampón de ensayo. Placas de ensayo se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente, antes de la lectura de fluorescencia resuelta en el tiempo, a longitudes de onda de emisión de 620 nm y 665 nm, usando un lector de placas EnVision (PerkinElmer, EE. UU.). Los datos se analizaron mediante el cálculo del valor % Delta F y el % de unión para cada muestra específica. El % Delta F se determinó según la Ecuación 1 y el % de unión específica se calculó usando la Ecuación 2. Los valores de IC50 se determinaron usando Prism (GraphPad Software, EE. UU.) mediante ajuste de curva utilizando una ecuación logística de cuatro parámetros, como se describe en la ecuación 3.
Ecuación 3:
Y = Abajo Arriba-Abajo
1 10A((LogEC5o - X)* Pendiente)
Donde Y es la unión específica y X es el logaritmo de la concentración.
Ejemplos de resultados se muestran en la Figura 5. El Abet0007 original, principal, tiene un IC50 de 159 nM mientras que el clon más mejorado, Abet0144, tiene un valor de IC50 de 5,5 nM.
2.5 Perfiles cinéticos de clones con afinidad mejorada en formato scFv purificado por Resonancia de Plasmones Superficiales
La Resonancia de Plasmones Superficiales se utilizó para analizar los clones de scFv purificados que habían mostrado mejora significativa en la afinidad de unión por péptidos beta amiloide humanos 1-42 sobre la secuencia parental, Abet0007, en el ensayo de competición de epítopos HTRF™ (sección 2.4). Brevemente, fue utilizado el instrumento biosensor BIAcore T-100 (GE Healthcare, Reino Unido) para evaluar los parámetros cinéticos de la interacción entre cada scFv purificado y cada péptido beta amiloide humano 1-42 producido sintéticamente. Estos experimentos se realizaron esencialmente como se describe por Karlsson y col. (Karlsson y col., 1991). Para más detalles, ver sección 1.7.
La afinidad de unión entre cada scFv de prueba y beta amiloide humano 1-42 se estimó usando ensayos en los que péptido beta amiloide humano sintético biotinilado 1-42 (rPeptide, EE. UU.; cat: A1117) era unido de manera no covalente a través de una interacción biotina/estreptavidina a un chip sensor SA patenteado a una densidad superficial final de aproximadamente 700 UR. La superficie del chip era regenerada entre ciclos por una única inyección de 20 segundos de 10 mM de Glicina pH 2,0 para eliminar el vínculo del scFv al péptido. La regeneración no dio lugar a una pérdida significativa de la capacidad de unión del péptido.
Una serie de diluciones de cada scFv purificado (12,5 - 400 nM) se pasaron secuencialmente sobre la superficie del péptido por una cantidad suficiente de tiempo para observar sensogramas que podrían ser ajustados a un modelo de unión apropiado con confianza. Un blanco de tampón de concentración cero fue restado del conjunto de datos principal para reducir el impacto de cualquier artefacto de tampón o efectos de unión no específicos. A continuación, un modelo de unión apropiado se ajustó simultáneamente a los datos de cada titulación de analito usando el software BIAevaluation.
La validez de los datos se evaluó usando el valor de Chi2 calculado, con un valor aceptable estando bajo 4 UR2. El éxito general del ajuste se estimó utilizando los residuos, con una desviación de menos de 20 UR siendo aceptable. Ejemplos de resultados para Abet0144 scFv son mostrados en la Figura 6. La constante de tasa de asociación (ka), la constante de tasa de disociación (kd) y la constante de disociación (KD) son 2,01 x 105 M'1 s-1, 6,66 x 10'3 s_1 y 33,2 nM respectivamente. Estos parámetros se derivaron de un ajuste de Langmuir 1:1 a los datos.
2.6 Cambio de formato de afinidad mejorada scFv a IgG1-TM humano
El formato del anticuerpo IgG1-TM es un isotipo de IgG1 humano que contiene tres sustituciones de aminoácidos simples (Triple Mutante: TM) dentro de la articulación inferior y dominio constante CH2 (Oganesyan y col., 2008). Cuando se introduce en la articulación inferior y dominio Ch 2 de moléculas IgG1 humanas, la triple mutación L234F/L235E/P331S ('TM') provoca una profunda disminución de su unión a CD64, CD32A, CD16 y C1q humano. Estas mutaciones TM se utilizan para crear un isotipo humano con función efectora muy baja. ScFv se reformatearon a IgG1-TM subclonando los dominios de cadena pesada variable (Vh ) y de cadena ligera variable (Vl ) en vectores que expresan cadenas pesadas y ligeras completas de anticuerpos humanos, respectivamente. Las cadenas pesadas variables fueron clonadas en un vector de expresión de mamífero (pEU 1,4) que contiene los dominios constantes de cadena pesada humana y elementos reguladores para expresar la cadena pesada IgG1-TM completa en células de mamífero. Del mismo modo, el dominio de cadena ligera variable se clonó en un vector de expresión de mamífero (pEU4,4) para la expresión de los dominios constantes de cadena ligera lambda humana y elementos reguladores para expresar la cadena ligera de IgG completa en células de mamífero. Anticuerpos IgG se expresaron y se purificaron esencialmente como se describe en la Sección 1.5.
2.7 Líneas Germinales
Las secuencias de aminoácidos de dominios Vh y Vl de los anticuerpos específicos del péptido beta amiloide de afinidad optimizada 1-42 se alinearon con las conocidas secuencias de la línea germinal humana en la base de datos VBASE (Tomlinson y col., 1992), y la línea germinal más cercana fue identificada por la similitud de secuencia. Para los dominios Vh del linaje de anticuerpos optimizados esto fue Vh3-23 (DP-47) y para los dominios Vl fue VA3-3r (DPL-23).
El procedimiento de línea germinal consistió en revertir los residuos de la estructura en dominios Vh y Vl a la secuencia de la línea germinal más cercana para corresponder idénticamente a anticuerpos humanos. Para Abet0144, no hay residuos requeridos cambiando en el dominio Vh (Tabla 1), pero un total de 5 cambios se hicieron en la estructura del dominio Vl . Estos cambios ocurrieron en las posiciones de Kabat 1, 2, 3, 40 y 81 (Tabla 2). Los residuos de Vernier (Foote y col., 1992), no fueron la línea germinal, aparte de residuo 2 en la secuencia de cadena ligera que fue la línea germinal al mismo tiempo que los residuos colaterales 1 y 3. La línea germinal de estos residuos de aminoácidos se llevó a cabo usando técnicas de mutagénesis estándar dirigidas al sitio, con cebadores mutagénicos apropiados como se describe por Clackson y Lowman (Clackson y col., 2004).
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Tabla 1: Un alineamiento de secuencia de los clones Abet0144 y Abet0144-GL a la línea germi­ nal VH3-23 (DP47). Los residuos que son diferentes de la línea germinal están destacados. Los residuos de Vemler son Indicados con círculos (•). No se hicieron cambios en el dominio Vh para la línea germinal del clon Abet0144.
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Tabla 2: Un alineamiento de secuencia de los clones ABET0144 y ABET0144-GL a la línea germinal
VA3-3R (DPL-23). Los residuos que son diferentes de la línea germinal están destacados Los
residuos de Vernier son indicados con círculos (•). Se hicieron cinco cambios en el dominio VL para la línea germinal del clon Abet0144. El residuo de Vernier 2 fue revertido a la línea germinal al mismo tiempo que los residuos 1 y 3 Revertir este residuo no tuvo impacto en la potencia del anticuerpo.
2.8 Determinación de la cinética de unión de IgGs de afinidad optimizada usando Resonancia de Plasmones Superficiales
La Resonancia de Plasmones Superficiales se utilizó para analizar la cinética de unión de IgGs de afinidad optimizada (sección 2.6) y sus homólogos de línea germinal (sección 2.7). Brevemente, fue utilizado el instrumento biosensor BIAcore T-100 (GE Healthcare, Reino Unido) para evaluar los parámetros cinéticos de la interacción entre cada IgG de prueba y cada péptido beta amiloide humano 1-42 producido sintéticamente. Estos experimentos se realizaron esencialmente como se describe por Karlsson y col., (Karlsson y col., 1991). Para más detalles, ver sección 1.7.
La afinidad de unión entre cada IgG de prueba y beta amiloide humano 1-42 se estimó usando ensayos en los que el anticuerpo se acopló de forma covalente por enlace amina a una superficie de chip CM3 patenteado a una densidad superficial final de aproximadamente 2.000 UR. La superficie del chip era regenerada entre ciclos por una única inyección de 40 segundos de 10 mM de Glicina pH 2,0 para eliminar el ligando vinculado al anticuerpo. La regeneración no dio lugar a una pérdida significativa de la capacidad de unión del péptido.
Una serie de diluciones de péptido beta amiloide humano 1-42 sintético (1,6 - 50 nM) se pasaron secuencialmente sobre la superficie del anticuerpo por una cantidad suficiente de tiempo para observar sensogramas que podrían ser ajustados a un modelo de unión apropiado con confianza. Los datos de la célula de flujo de referencia en blanco se restaron de cada conjunto de datos de IgG y un blanco tampón de concentración cero fue restado como doble referencia del conjunto de datos principales para reducir el impacto de cualquier artefacto tampón o efectos de unión no específicos. A continuación, un modelo de unión apropiado se ajustó simultáneamente a los datos de cada titulación de analito usando el software BIAevaluation.
La validez de los datos se evaluó usando el valor de Chi2 calculado, con un valor aceptable estando abajo 2 UR2. El éxito general del ajuste se estimó utilizando los residuos, con una desviación de menos de 2 UR siendo aceptable. Ejemplos de resultados para Abet0144-GL (línea germinal) IgG1-TM son mostrados en la Figura 7. La constante de tasa de asociación (ka), la constante de tasa de disociación (kd) y la constante de disociación (KD) son 2,08 x 105 M' 1 s-1, 1,97 x 10‘3 s_1 y 9,50 nM respectivamente. Estos parámetros se derivaron de un ajuste de Langmuir 1:1 a los datos.
2.9 Especificidad de perfiles de afinidad IgGs optimizados utilizando Resonancia de Plasmones Superficiales La Resonancia de Plasmones Superficiales se utilizó para verificar la especificidad de IgGs de afinidad optimizada para el péptido beta amiloide humano 1-42. Brevemente, fue utilizado el instrumento biosensor BIAcore T-100 (GE Healthcare, Reino Unido) para evaluar los parámetros cinéticos de la interacción entre cada IgG de prueba y un intervalo de pequeños péptidos incluyendo beta amiloide humano 1-42 y beta amiloide humano 1-40 producidos sintéticamente. Estos experimentos se realizaron esencialmente como se describe por Karlsson y col., (Karlsson y col., 1991). Para más detalles, ver sección 1.7.
La afinidad de unión entre cada IgG de prueba y cada péptido se estimó usando ensayos en los que el anticuerpo se acopló de forma covalente por enlace amina a una superficie de chip CM3 patenteado a una densidad superficial final de aproximadamente 2.000 UR. La superficie del chip era regenerada entre ciclos por una única inyección de 40 segundos de 10 mM de Glicina pH 2,0 para eliminar el ligando vinculado al anticuerpo. La regeneración no dio lugar a una pérdida significativa de la capacidad de unión del péptido.
Cada péptido de prueba a 400 nM se pasó secuencialmente sobre la superficie del anticuerpo durante una cantidad de tiempo suficiente para observar sensorgramas que no mostraban unión o que podían ajustarse a un modelo de unión apropiado con confianza. Los datos de la célula de flujo de referencia en blanco se restaron de cada conjunto de datos de IgG y un blanco tampón de concentración cero fue restado como doble referencia del conjunto de datos principales para reducir el impacto de cualquier artefacto tampón o efectos de unión no específicos.
Ejemplo de resultados para Abet0144-GL (línea germinal) IgG1-TM se muestran en la Figura 8. Dos péptidos (beta amiloide humano biotinilado 1-42, (rPeptide, EE. UU., cat: A1117) y beta amiloide humano no marcado 1-42 (rPeptide, EE. UU.; cat: A1165)) mostró una fuerte unión al anticuerpo, mientras que tres péptidos (beta amiloide humano biotinilado codificado 1-42 (Anaspec, EE. UU., síntesis personalizada), beta amiloide humano biotinilado 1-40 (rPeptide, EE. UU., cat: A1111) y beta amiloide humano no marcado 1-40 (Anaspec, EE. UU.; cat: 24236)) no mostró unión al anticuerpo.
2.10 Especificidad de perfiles de Abet0144-GL IgG1-TM en formato de ensayo de competición de epítopos bioquímicos Para probar la especificidad de Abet0144-GL IgG1-TM para unirse a otros péptidos beta amiloides humanos, se desarrolló un ensayo de competición. En este ensayo una concentración fija (1,5 nM) de péptido beta amiloide humano biotinilado 1-42 (rPeptide, e E. UU.; cat: A1117) se incubó con un intervalo de diferentes concentraciones de péptidos beta amiloides humanos no marcados incluyendo 1-42, 1-40, 1-16, 12-28, piro 3-42, piro 11-42 y codificados 1-42 (Anaspec cat: 20276, 24236, 24226, 24230, 29907, 29903 y 25383, respectivamente) en presencia de una concentración fija (0,28 nM) de Abet0144-GL IgG1-TM. La competición de péptidos se evaluó mediante la detección de la inhibición de la unión de Abet0144-GL IgG1-TM al péptido beta amiloide humano biotinilado 1-42 usando transferencia de energía de resonancia de fluorescencia resuelta en el tiempo (TR-FRET). Esto implicó el uso de reactivos de detección TR-FRET de Fc IgG antihumano marcado con criptato de Europio (CisBio International, Francia; cat: 61HFCKLB) y estreptavidina marcada con XL665 (CisBio International, Francia; cat: 611SAXLB).
Los experimentos se establecieron en placas Costar de 384 pocillos para microtitulación poco profundas. 5 ul/pocillo de beta amiloide humano biotinilado 1-42 (6 nM) se añadió a todos los pocillos de la placa de ensayo (excepto para los pocillos de control negativo de ensayo de unión) con el fin de dar una concentración de ensayo final de 1,5 nM. 5 ul de tampón de ensayo solamente se añadió a los pocillos de control negativo de ensayo de unión. Un duplicado de 11 puntos titulación en serie 1:3 se preparó de cada péptido de prueba a partir de una concentración superior de 40uM con el fin de dar una concentración de péptido de ensayo final superior de 10 uM. 5 ul por pocillo de cada péptido de prueba de dilución en serie se transfirió a continuación a la placa de ensayo de 384 pocillos. 5 ul de tampón de ensayo solamente se añadió a los pocillos de control total y negativo de ensayo de unión. Abet0144-GL IgG1-TM se diluyó para dar una solución de trabajo en 1,12nM. 5 ul por pocillo de esta solución se añadió a todos los pocillos de la placa de ensayo de 384 pocillos con el fin de dar lugar a un ensayo final Abet0144-GL-IgG1-TM con concentración de 0,28nM. Finalmente, una solución combinada fue preparada con Fc antihumano marcado con criptato de europio (2,4 nM) y estreptavidina marcada con XL665 (60 nM). 5 ul por pocillo de esta solución se añadió a todos los pocillos de la placa de 384 pocillos de ensayo de tal manera que las concentraciones finales de Fc antihumano marcado con criptato de europio y estreptavidina marcada con XL665 fueron 0,6 nM y 15 nM, respectivamente. Nótese que el volumen de ensayo final fue de 20 ul y que cada componente de ensayo individual fue añadido como una adición de 5 ul a cuatro veces la concentración de ensayo final requerida. Todos los reactivos se diluyeron en un tampón de ensayo que contenía 50 mM de MOPS, pH 7,4 (Sigma, Reino Unido; cat: M9381), 0,4 M de KF (BDH Chemicals, EE. u U.; cat: 103444T), 0,1% de albúmina de suero bovino libre de ácidos grasos (Sigma, Reino Unido); cat: A6003) y 0,1% de Tween 20 (v/v) (Sigma, Reino Unido; cat: P2287).
Las placas de ensayo se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente, antes de la lectura de fluorescencia resuelta en el tiempo, a longitudes de onda de emisión de 620 nm y 665 nm, usando un lector de placas EnVision (PerkinElmer, EE. UU.). Los datos se analizaron calculando los valores de % Delta F para cada muestra. % Delta F fue determinado según la ecuación 1.
Ecuación 1:
% Delta F = (muestra proporción 665 nm/620 nm) - (control negativo proporción 665 nm/620 nm) X 100
(control negativo proporción 665 nm/ 620 nm)
Los valores de % Delta F se usaron para calcular el % de unión específica como se describe en la ecuación 2.
Ecuación 2:
% unión específica = % De|ta F de muestra x 100
% Delta F de control total de unión
Ejemplo de resultados para Abet0144-GL IgG1-TM se muestran en la Figura 9. Estos resultados demuestran que Abet0144-GL IgG1-TM se une a péptidos beta amiloide humanos 1-42, piro 3-42 y piro 11-42, pero no se une al péptido beta amiloide humano 1-40 o a las formas truncadas de péptidos 1-16 y 12-28.
2.11 Caracterización funcional de anticuerpos principales por agotamiento de péptidos beta amiloides a partir de plasma humano
Los anticuerpos principales se probaron en un ensayo de agotamiento de plasma para investigar su capacidad de inmunoprecipitar péptido beta amiloide humano 1-42 a partir de plasma sanguíneo humano. Este ensayo fue utilizado para proporcionar evidencia de la eficacia funcional para cada anticuerpo. Los ensayos se realizaron exactamente como se describe en la Sección 1.8.
En un experimento, el anticuerpo Abet0144-GL IgG1-TM redujo los niveles del péptido beta amiloide humano 1-42 en plasma de 13,54 pg ml-1 a 9,86 pg ml-1 (una reducción del 27%). En un segundo experimento, los niveles se redujeron de 40,06 pg ml-1 a 34,65 pg ml-1 (una reducción del 14%).
2.12 Identificación de clones no probados con unión nativa por beta amiloide usando inmunohistoquímica in vitro Se analizó la capacidad de IgG optimizados por afinidad para unirse a beta amiloide, con el objetivo de identificar clones principales que reconocen el péptido beta amiloide nativo. Brevemente, los anticuerpos principales fueron seleccionados en secciones de cerebro humano con enfermedad de Alzheimer y secciones de cerebro de ratón Tg2576 para identificar anticuerpos beta antiamiloide 1-42 que se unen a amiloide nativo in vitro. Los experimentos se realizaron esencialmente como se describe en la Sección 1.9.
En estos experimentos, tejido cerebral humano se aisló de la corteza frontal y el hipocampo de dos individuos con enfermedad de Alzheimer grave (mujer, ApoE 4/3, 86 años; mujer, ApoE 3/3, 67 años). Se aisló tejido cerebral de ratón de ratones Tg2576 a una edad de 18 meses (6 ratones). Anticuerpos fueron probados a concentraciones de 2, 5 y 20 ug ml-1.
En un experimento, el anticuerpo Abet0144-GL IgG1-TM no tiñó placas difusas (DP) o placas con angiopatía amiloide cerebral (AAC) (puntaje = 0). Había, sin embargo, teñido las placas centrales (CP) con un puntaje de 1 en secciones de cerebro de Tg2576, y un puntaje de 1,5 en secciones de cerebro humano con EA. En contraste, un anticuerpo de control positivo produjo un puntaje de 3-4 en todas las placas (CP, DP, AAC) en secciones adyacentes en las mismas condiciones. Imágenes representativas se muestran en la figura 10.
Ejemplo 3. Optimización de anticuerpo de Abet0144-GL a través de mutación de las seis CDR que incluyen residuos de Vernier colaterales
3.1 Conversión de clon parental Abet0144-GL a formato scFv compatible con Presentación de Ribosomas El clon parental fue convertido de formato IgG1-TM a formato de fragmento variable de cadena única (scFv) en preparación para optimización de afinidad. Los dominios variable pesado (Vh) y variable ligero (Vl) con codón optimizado fueron amplificados por separado de sus respectivos vectores IgG con la adición de sitios de clonación específicos y una región conectora flexible. A continuación, PCR de recombinación se realizó para generar una construcción de scFv completa, que se clonó en un vector pUC modificado (pUC-RD) que contiene las características estructurales necesarias para la presentación en ribosomas. Estas características incluyen un lazo del tronco de 5' y 3' para evitar la degradación del transcrito de ARNm por exonucleasas, una secuencia de Shine-Dalgarno para promover la unión del ribosoma a la transcripción de ARNm, y un espaciador genelll que permite que la molécula scFv trasladada se pliegue sin dejar de estar unida al ribosoma (Groves y col., 2005).
3.2 Optimización de Abet0144-GL por mutagénesis dirigida
El anticuerpo principal (Abet0144-GL) fue optimizado para mejorar la afinidad a péptido beta amiloide humano 1-42 utilizando una estrategia de mutagénesis dirigida con selecciones de presentación de ribosomas basadas en afinidad. Grandes bibliotecas de ribosomas scFv derivadas de Abet0144-GL se crearon mediante mutagénesis dirigida por oligonucleótidos de las seis regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada variable (VH) y ligera variable (Vl) (CDR) utilizando técnicas estándar de biología molecular como se describe por Clackson y Lowman (Clackson y col., 2004). Las secuencias mutadas de cada CDR fueron optimizadas por afinidad como una biblioteca separada. Los cinco residuos Vernier anteriores a VhCDR1 (residuos de Kabat 26-30) también se asignaron al azar usando mutagénesis dirigida y estas secuencias se combinaron y se maduraron con la biblioteca VhCDR1 restante. Todas las bibliotecas se sometieron a selecciones de presentación de ribosomas basadas en afinidad para enriquecer para variantes con mayor afinidad por péptido beta amiloide humano 1-42. Las selecciones se realizaron esencialmente como se describió previamente (Hanes y col., 2000).
En resumen, las seis bibliotecas de mutagénesis dirigidas del clon principal de Abet0144-GL, uno que cubre cada CDR, se transcribieron por separado en ARNm. Usando un procedimiento de traslación estancada, fueron formados complejos terciarios ARNm-ribosoma-scFv (Hanes y col., 1997). Estos complejos se sometieron a cuatro rondas de selección incubados en presencia de concentraciones decrecientes de péptido beta amiloide humano 1-42 sintético biotinilado (Bachem, Alemania; cat: H-5642) (100 nM a 10 nM) para seleccionar variantes con mayor afinidad por péptido beta amiloide humano 1-42. Esos complejos que se unen al antígeno fueron a continuación capturados en perlas paramagnéticas revestidas con estreptavidina (Dynabeads™, Invitrogen, Reino Unido; cat: 112-05D) y complejos no específicos de ribosomas fueron lavados. ARNm se aisló posteriormente a partir de los complejos ribosómicos vinculados, transcritos de manera inversa a ADNc y a continuación amplificados por PCR. Este ADN se utilizó para la siguiente ronda de selección.
Después de cuatro rondas de maduración de la afinidad, cada resultado de selección fue clonado para fines de selección. ScFv aislados mediante presentación en ribosomas se clonaron en el vector fagémido pCANTAB6 por digestión de endonucleasa con restricción NotI/NcoI de la construcción de presentación en ribosomas (New England Biolabs, EE. UU., cat: R0189L, R0193L) seguido de ligación en NoI/NcoI digerido pCANTAB6 utilizando T4 ADN ligasa (New England Biolabs, EE. UU., cat: M0202L) esencialmente como se describe por McCafferty y col. (McCafferty y col., 1994).
3.3 Identificación de clones mejorados usando un ensayo de competición de epítopos
Dos mil veinticuatro scFv elegidos al azar de entre rondas de selección 3 y 4 de la estrategia de mutagénesis dirigida que se describen en la sección 3.2 se expresaron en bacterias para producir scFv periplásmico no purificado. Los scFv capaces de unirse al péptido beta amiloide sintético humano 1-42 a través del mismo epítopo que Abet0144-GL IgG1-t M fueron dilucidados en un ensayo de formato de competición, usando la plataforma HTRF™. Específicamente, se midió la transferencia de energía de resonancia por fluorescencia (FRET) entre criptato de estreptavidina (asociada con péptido beta amiloide biotinilado 1-42) y Fc XL665 antihumano (asociada con Abet0144-GL IgG1-TM) en presencia de una concentración única de cada scFv de prueba periplásmico no purificado. La ocupación exitosa del epítopo Abet0144-GL IgG1-TM en el péptido por scFv resultó en una reducción en FRET, conforme medido en un lector de placas de fluorescencia.
Una señal de unión 'Total' se determinó mediante el análisis de unión de Abet0144-GL IgG1-TM a péptido beta amiloide humano sintético 1-42 en ausencia de péptido competidor. Las señales de 'Muestra' se derivaron del análisis de la unión de Abet0144-GL IgG1-TM al péptido beta amiloide humano sintético 1-42 en presencia de una muestra de scFv de prueba. Por último, una señal de 'Criptato en Blanco' fue determinada mediante análisis de la fluorescencia mediada por el cóctel reactivo de detección solo.
scFv periplásmicos sin purificar fueron suministrados en el tampón de muestra que consiste en MOPS 50 mM, pH 7,4, 0,5 mM de EDTA, y 0,5 M de sacarosa. Para el perfilado, muestras de scFv se diluyeron en una placa de fondo en V de 384 pocilios a 50% de la concentración reserva original en tampón de ensayo, que consiste en 50 mM de MOPS, pH 7,4, 0,4 M de fluoruro de potasio, 0,1% de albúmina de suero bovino sin ácidos grasos y 0,1% de Tween 20 (v/v).
5 pl de cada scFv nuevamente diluido se transfirió a los pocillos 'Muestra' de una placa de ensayo de 384 pocillos sin unión, de fondo sólido, poco profunda, negra, usando un robot de manipulación de líquidos. Se añadieron los reactivos restantes (preparados en tampón de ensayo) a la placa de ensayo mediante una pipeta multicanal en el siguiente orden: 5 pl de tampón de muestra (a pocillos 'Total' y 'Blanco de Criptato'), 10 pl de tampón de ensayo (a pocillos 'Blanco de Criptato'), 5 pl 2 nM de Abet0144-GL IgG1-TM (a pocillos 'Muestra' y 'Total'), 5 pl 5 nM de péptido beta amiloide humano biotinilado 1-42 (a pocillos 'Muestra' y 'Total'), y 5 pl de cóctel de detección, que consta de 6 nM de criptato de estreptavidina y 60 nM de anti-His6-XL665 (A todos los pocillos). Las placas de ensayo se sellaron y luego se incubaron durante 3 horas a temperatura ambiente en la oscuridad, antes de medir la fluorescencia resuelta en el tiempo a longitudes de onda de emisión de 620 y 665 nm en un lector de placa de fluorescencia.
Los datos se analizaron calculando los valores de % Delta F para cada muestra. % Delta F fue determinado según la ecuación 4.
Ecuación 4
% Delta F = (muestra proporción 665 nm/620 nm) - (Criptato en Blanco proporción 665 nm/620 nm) x 100 (Criptato en Blanco proporción 665 nm/620 nm)
Los valores Delta F se usaron posteriormente para calcular los valores de unión normalizados como se describe en la ecuación 5.
Ecuación 5:
Datos normalizados (% Total) = % Delta F de muestra x 100
% Delta F de control total de unión
scFv periplásmicos sin purificar que demuestran una inhibición significativa de Abet0144-GL IgG1-TM unido a péptido beta amiloide 1-42 se sometió a secuenciación de ADN (Osbourn y col., 1996; Vaughan y col., 1996). Los scFv con secuencias de proteínas únicas se expresaron en E. coli y se purificaron por cromatografía de afinidad seguida de intercambio de tampón.
La potencia de cada scFv purificado se determinó mediante la prueba de una serie de diluciones de scFv (típicamente 4 pM - 1200 nM) en el ensayo de competición de epítopos descrito anteriormente. Los datos se analizaron de nuevo mediante el cálculo del % Delta F y % Total de valores de unión para cada muestra. Además, un valor de % de inhibición para cada concentración de scFv purificado también se calculó como se describe en la Ecuación 6:
Ecuación 6:
% Inhibición = 100- %Total de Unión
La concentración de la muestra de ScFv se ploteó contra el % de inhibición utilizando software de gráficos científico, y cualesquiera respuestas dependientes de la concentración fueron ajustadas con curvas de regresión no lineal. Se obtuvieron valores de IC50 de estos análisis con pendientes de Hill limitadas a un valor de -1. El clon más potente de esta ronda de selecciones, Abet0286, tenía un IC50 de 1,8 nM y vino de la biblioteca de mutagénesis marcada VlCDR1. Fuentes de Reactivos/Equipos: MOPS (Sigma, Reino Unido; cat: M9381), fluoruro de potasio (BDH chemicals, EE. UU.; cat: A6003), albúmina de suero bovino libre de ácidos grasos (Sigma, Reino Unido; cat: A6003), Tween 20 (Sigma, Reino Unido; cat: P2287), Abet0144-GL IgG1-TM (producido internamente), péptido beta amiloide humano biotinilado 1-42 (rPeptide, EE. UU.; cat: A1117), criptato de estreptavidina (Cisbio, Francia; cat: 610SAKLB), anti-His6-XL665 (Cisbio, Francia; cat: 61HISXLB), placas de ensayo de 384 pocillos (Corning, Costar Life Sciences; cat: 3676), placas de dilución de 384 pocillos (Greiner BioOne, Alemania; cat: 781280), robot de manipulación de líquidos (MiniTrak™, Perkin Elmer, EE. UU.), lector de placas de fluorescencia (Envision™, Perkin Elmer, EE. UU.), tecnología HTRF (Cisbio International, Francia), software de gráficos/estadística (Prism, GraphPad EE. UU.).
3.4 Recombinación de resultados de selección exitosos para producir bibliotecas "binarias", y su optimización de afinidad posterior
El ensayo de competición de epítopos descrito en la Sección 3.3 se utilizó para juzgar si una determinada biblioteca de scFv-ribosomas había sido madurada por afinidad durante las primeras cuatro rondas de selección. Dos de las bibliotecas, las bibliotecas de mutagénesis dirigida Vh CDR3 y Vl CDR2, no habían mostrado ninguna mejora con respecto al clon Abet0144-GL parental y no progresaron más.
Las cuatro bibliotecas de mutagénesis dirigidas restantes, (que cubren las Vh CDR1, Vh CDR2, Vl CDR1 y Vl CDR3), había mostrado afinidad mejoras y se recombinaron a pares para producir seis bibliotecas de recombinación "binarias" en las que se mutaron dos de las seis CDR. Por ejemplo, la biblioteca de afinidad madurada que cubre la Vh CDR1 se recombinó al azar con la biblioteca de afinidad madurada Vh CDR2 para generar una biblioteca Vh 1:Vh 2. Las bibliotecas restantes se produjeron como: Vh 1 :Vl 1, Vh 1 :Vl 3, Vh 2:Vl 1, Vh 2:Vl 3 and Vl 1 :Vl 3. Un subconjunto de cada biblioteca de recombinación se clonó como se ha descrito anteriormente (Sección 3.2) y fue enviado para secuenciación para verificar la integridad de cada biblioteca.
Se continuaron seguidamente selecciones como se describió anteriormente (sección 3.2) en presencia de concentraciones decrecientes de péptido beta amiloide sintético humano biotinilado 1-42 (5 nM y 2 nM para las rondas 5 y 6 respectivamente). Como antes, cada resultado de selección fue clonado con fines de detección (sección 3.2). Mil novecientos treinta y seis scFv, seleccionados al azar de las rondas de selección 5 y 6, se rastrearon en un ensayo de competición de epítopos como se describe en la sección 3.3. Debido al aumento de la potencia de estos clones, los scFv no purificados se diluyeron primero a 25% antes de la adición a las placas de ensayo. Como anteriormente, los clones que mostraban propiedades inhibidoras significativas fueron enviados a secuenciación de ADN, y los clones únicos se produjeron y se analizaron como scFv purificado (sección 3.3). El clon más potente de estas selecciones, Abet0303, tenía una potencia de 0,84 nM y vino de la biblioteca de recombinación Vh 1:Vh 2.
3.5 Recombinación de resultados de selección binaria para producir bibliotecas "ternarias", y su optimización de afinidad posterior
El ensayo de competición de epítopos descrito en la Sección 3.3 se utilizó para juzgar si cada biblioteca binaria había sido madurada por afinidad durante las dos rondas anteriores de selección (5 y 6). Todas las bibliotecas habían mostrado mejoras de afinidad, y, por lo tanto, fueron consideradas para una mayor maduración de la afinidad.
Las seis bibliotecas binarias (sección 3.4) se recombinaron con los resultados exitosos de la 4 ronda (sección 3.2) a pares para formar cuatro bibliotecas de recombinación "ternarias" en las que se mutaron tres de las seis CDR. Por ejemplo, la biblioteca binaria Vh 2:Vl 3 (resultado de la ronda 6) se recombina con la biblioteca de mutagénesis dirigida Vh CDR1 (resultado de la ronda 4) para generar una biblioteca Vh 1:Vh 2:Vl 3. Construcciones similares también han sido creadas por la combinación de la biblioteca binaria Vh 1:Vh 2 (resultado de la ronda 6) con la biblioteca de mutagénesis dirigida Vl CDR3 (resultado de la ronda 4). Estas dos bibliotecas individuales se combinaron para crear la biblioteca ternaria Vh 1:Vh 2:Vl 3.
Se tuvo cuidado de no destruir la sinergia entre CDR que habían sido cooptimizadas. Por ejemplo, la biblioteca binaria Vh 1 :Vl 3 no se recombina con la biblioteca de mutagénesis dirigida Vh CDR2 ya que esta manipulación habría destruido la sinergia entre las secuencias cooptimizadas Vh CDR1 y Vl CDR3. En la Tabla 3 se proporciona una lista completa de todas las bibliotecas ternarias y sus derivaciones. Un subconjunto de cada biblioteca de recombinación se clonó como se ha descrito anteriormente (Sección 3.2) y fue enviado para secuenciación para verificar la integridad de cada biblioteca.
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Tabla 3: Una descripción de las cuatro bibliotecas ternarias que se maduraron durante las rondas 7 y 8 de la segunda campaña de Optimización Principal. Cada biblioteca compuesta por dos bibliotecas constituyentes, generada a partir de una recombinación por parejas al azar de una biblioteca binaria resultado de la ronda 6 y una biblioteca de mutagénesis dirigida resultado de la ronda 4.
Se continuaron seguidamente selecciones como se describió anteriormente (sección 3.2) en presencia de concentraciones decrecientes de péptido beta amiloide sintético humano biotinilado 1-42 (500 pM y 200 pM para las rondas 7 y 8 respectivamente). Como antes, cada resultado de selección fue clonado con fines de detección (sección 3.2).
Mil cuatrocientos ocho scFv, seleccionados al azar de las rondas de selección 7 y 8, se rastrearon en un ensayo de competición de epítopos como se describe en la sección 3.3. Como con la detección "binaria", los scFv no purificados se diluyeron primero a 25% antes de la adición a las placas de ensayo. Como anteriormente, los clones que mostraban propiedades inhibidoras significativas fueron enviados a secuenciación de ADN, y los clones únicos se produjeron y se analizaron como scFv purificado (sección 3.3). El clon más potente de estas selecciones, Abet0343, tenía una potencia de 0,48 nM y vino de la biblioteca de recombinación Vh 1:Vh 2:Vl 3.
3.6 Recombinación de resultados de selección ternaria para producir bibliotecas "cuaternarias", y su optimización de afinidad posterior
El ensayo de competición de epítopos descrito en la Sección 3.3 se utilizó para juzgar si cada biblioteca ternaria había sido madurada por afinidad durante las dos rondas anteriores de selección (7 y 8). Todas las bibliotecas habían mostrado mejoras de afinidad, y, por lo tanto, fueron consideradas para una mayor maduración de la afinidad.
La biblioteca ternaria Vh 1:Vh 2:Vl 1 (resultado de la ronda 8) se recombina con la biblioteca de mutagénesis dirigida Vl CDR3 (resultado de la ronda 4) y la biblioteca ternaria Vh 2:Vl 1:Vl 3 (resultado de la ronda 8) se recombina con la biblioteca de mutagénesis dirigida Vh CDR1 (resultado de la ronda 4). Por separado, la biblioteca binaria Vh 1:Vh 2 (resultado de la ronda 6) se recombina con la biblioteca binaria Vl 1 :Vl 3 (resultado de la ronda 6). Estas tres bibliotecas individuales se combinaron para crear una única biblioteca "cuaternaria", Vh 1 :Vh 2:Vl 1 :Vl 3, en la que se mutaron cuatro de las seis CDR.
Se tuvo cuidado de no destruir la sinergia entre CDR que habían sido cooptimizadas. Por ejemplo, la biblioteca ternaria Vh 1:Vl 2:Vl 3 no se recombina con la biblioteca de mutagénesis dirigida Vl CDRI ya que esta manipulación habría destruido la sinergia entre las secuencias cooptimizadas Vh CDR1/Vh CDR2 y Vl CDR3. Un subconjunto de cada biblioteca de recombinación se clonó como se ha descrito anteriormente (Sección 3.2) y fue enviado para secuenciación para verificar la integridad de cada biblioteca.
Se continuaron seguidamente selecciones como se describió anteriormente (sección 3.2) en presencia de concentraciones decrecientes de péptido beta amiloide sintético humano biotinilado 1-42 (50 pM a l0 pM para las rondas 9 y 11 respectivamente). Como antes, cada resultado de selección fue clonado con fines de detección (sección 3.2).
Mil seiscientos setenta y dos scFv, seleccionados al azar de las rondas de selección 9 y 11, se rastrearon en un ensayo de competición de epítopos como se describe en la sección 3.3. Debido al aumento de la potencia de estos clones, los scFv no purificados se diluyeron primero a 3,13% antes de la adición a las placas de ensayo. Como anteriormente, los clones que mostraban propiedades inhibidoras significativas fueron enviados a secuenciación de ADN, y los clones únicos se produjeron y se analizaron como scFv purificado (sección 3.3). El clon más potente de estas selecciones, Abet0377, tenía una potencia de 0,32 nM (n=2 datos). Curvas de inhibición de muestra se muestran en la Figura 11, y los datos para 24 de los clones de potencia más alta se muestran en la Tabla 4. Las correspondientes secuencias de proteínas se enumeran en las Tablas 5 y 6.
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Tabla 4: Ejemplo de datos de potencia para clones de scFv optimizados cuando se evalúa en el ensayo de competición de epítopos HTRF™ Abet0144-GL. Cuando se realizó el ensayo más de una vez, se proporciona el intervalo absoluto de valores IC50.
Tabla 5 (ver más abajo): Alineación de secuencia de los dominios VH de los clones de línea no germinal optimizados descritos en esta invención. Cambios respecto a la secuencia parental (Abet0144-GL) se destacan. Los residuos se designan según el sistema de numeración de Kabat.
Tabla 6 (ver más abajo): En esta invención se describe la alineación de secuencias de los dominios VL de los clones optimizados de línea no germinal. Cambios respecto a la secuencia parental (Abet0144-GL) se destacan. Los residuos se designan según el sistema de numeración de Kabat. Nótese que Abet0378 tiene un codón de parada ámbar "B" presente en la secuencia VL en la posición 91, que fue introducido como un cambio de glutamina durante la optimización. El anticuerpo se produce como un fragmento de scFv en la cepa E. coli TG1 utiliza para la expresión en la que el codón de parada ámbar se lee como glutamina.
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3.7 Perfiles cinéticos de clones con afinidad mejorada en formato scFv purificado por Resonancia de Plasmones Superficiales
La Resonancia de Plasmones Superficiales se utilizó para analizar los clones de scFv purificados que habían mostrado mejora significativa en la afinidad de unión por péptidos beta amiloide humanos 1-42 sobre la secuencia parental, Abet0144-GL, en el ensayo de competición de epítopos HTRF™ (secciones 3.3-3.6). Brevemente, fue utilizado el Sistema de Matriz de Interacción de Proteínas ProteOn(BioRad, USA) para evaluar los parámetros cinéticos de la interacción entre cada scFv purificado y cada péptido beta amiloide humano 1-42 producido sintéticamente. Estos experimentos se realizaron esencialmente como se describe por Karlsson y col., (Karlsson y col., 1991). Para más detalles, ver sección 1.7.
La afinidad de unión entre cada scFv de prueba y beta amiloide humano 1-42 humano se estimó usando ensayos en los que el péptido beta amiloide sintético humano biotinilado 1-42 (rPeptide, EE. UU.; cat: A1117) se unió de forma no covalente a través de una interacción biotina/estreptavidina a un chip de estreptavidina patenteado (NTA 176-5021) a cinco densidades superficiales diferentes. La superficie del chip era regenerada entre ciclos por una única inyección de 60 segundos de 10 mM de Glicina pH 2,0 para eliminar el vínculo del scFv al péptido. La regeneración no dio lugar a una pérdida significativa de la capacidad de unión del scFv.
Cada scFv a 100 - 200 nM se pasó secuencialmente sobre la superficie del péptido por una cantidad suficiente de tiempo para observar sensogramas que podrían ser ajustados a un modelo de unión apropiado con confianza. Un blanco de scFv irrelevante fue restado del conjunto de datos principal para reducir el impacto de cualquier artefacto de tampón o efectos de unión no específicos. A continuación, un modelo de unión apropiado se ajustó a los datos. Para Abet0380 scFv, la constante de tasa de asociación (ka), la constante de tasa de disociación (kd) y la constante de disociación (KD) son 1,93 x 105 M'1 s-1, 2,85 x 10'5 s_1 y 148 pM respectivamente. Estos parámetros se derivaron de un ajuste de Langmuir 1:1 a los datos.
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Tabla 7: Ejemplo de datos cinéticos para clones de scFv optimizados de unión a péptido beta amiloide humano sintético biotinilado 1-42, como se determina por Resonancia de Plasmones Superficiales.
3.8 Cambio de formato de afinidad mejorada scFv a IgG1-TM humano
El formato de anticuerpo IgG1-TM se discute en la sección 2.6. ScFv se reformatearon a IgG1-TM subclonando los dominios de cadena pesada variable (Vh ) y de cadena ligera variable (Vl ) en vectores que expresan cadenas pesadas y ligeras completas de anticuerpos humanos, respectivamente. Las cadenas pesadas variables fueron clonadas en un vector de expresión de mamífero (pEU 1,4) que contiene los dominios constantes de cadena pesada humana y elementos reguladores para expresar la cadena pesada IgG1-TM completa en células de mamífero. Del mismo modo, el dominio de cadena ligera variable se clonó en un vector de expresión de mamífero (pEU4,4) para la expresión de los dominios constantes de cadena ligera lambda humana y elementos reguladores para expresar la cadena ligera de IgG completa en células de mamífero.
Para obtener anticuerpos como IgG, los vectores de expresión de IgG de cadena pesada y ligera se transfectaron transitoriamente en células de mamífero HEK293-EBNA (Invitrogen, Reino Unido; cat: R620-07) en que IgG fueron expresados y secretados en el medio. Las cosechas se agruparon y filtraron antes de la purificación. La IgG se purificó usando cromatografía de Proteína A. Los sobrenadantes del cultivo se cargaron en una columna apropiada de Proteína A (BioSepra - Pall, USA) y se lavaron con 50 mM Tris-HCI pH 8,0, 250 mM NaCl. IgG unido fue eludido de la columna usando Citrato de sodio 0,1 M (pH 3,0) y neutralizado mediante la adición de Tris-HCl (pH 9,0). El material eluído se intercambió con tampón en PBS usando columnas de intercambio de tampón NAP-10 (GE Healthcare, Reino Unido; cat: 17-0854-02) y los IgG purificados se pasaron a través de un filtro de 0,2 pm. La concentración de IgG se determinó espectrofotométricamente usando un coeficiente de extinción basado en la secuencia de aminoácidos del IgG. Los IgG purificados se analizaron para agregación o degradación utilizando SEC-HPLC y SDS-PAGE.
3.9 Líneas Germinales
Cinco de los IgG más potentes fueron seleccionados para línea germinal, basado en una caracterización experimental de su scFv correspondiente. scFv purificado de clones Abet0343, Abet0369, Abet0377, Abet0380 y Abet0382 todos exhibieron valores de IC50 de menos de 750 pM, como se determinó por ensayo de competición de epítopos (Tabla 4), y todos tenían una constante de disociación experimental de menos de 250 pM, como se determinó por Resonancia de Plasmones Superficiales, Tabla 7.
El procedimiento de línea germinal consistió en revertir los residuos de la estructura en dominios Vh y Vl a la secuencia de la línea germinal más cercana para corresponder idénticamente a anticuerpos humanos. Para los dominios Vh del linaje de anticuerpos optimizados esto fue Vh3-23 (DP-47) y para los dominios Vl fue VA3-3r (DPL-23). Para Abet0380, el residuo 1 requirió cambiar en el dominio Vh en la posición Kabat 43 (Tabla 8) y el residuo 1 requirió cambiar en el dominio Vl en la posición Kabat 81 (Tabla 9). Las cuatro secuencias restantes requieren entre dos y cinco cambios (Tablas 8 y 9). Los residuos de Vernier (Foote y col., 1992), no derivaron en líneas germinales, aparte del residuo 2 en la secuencia de cadena ligera de Abet0343, que derivó en línea germinal al mismo tiempo que los residuos colaterales 1 y 3. Las líneas germinales de estos residuos de aminoácidos se llevaron a cabo utilizando técnicas estándar de mutagénesis dirigida al sitio con los cebadores mutagénicos apropiados según lo descrito por Clackson y Lowman. (Clackson y col., 2004).
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3.10 Determinación de la cinética de unión de IgGs de afinidad optimizada usando Resonancia de Plasmones Superficiales
La Resonancia de Plasmones Superficiales se utilizó para analizar la cinética de unión de IgGs de afinidad optimizada (sección 3.8) y sus homólogos de línea germinal (sección 3.9). Brevemente, fue utilizado el instrumento biosensor BIAcore T-100 (GE Healthcare, Reino Unido) para evaluar los parámetros cinéticos de la interacción entre cada IgG de prueba y cada péptido beta amiloide humano 1-42 producido sintéticamente. Estos experimentos se realizaron esencialmente como se describe por Karlsson y col., (Karlsson y col., 1991). Para más detalles, ver sección 1.7. La afinidad de unión entre cada IgG de prueba y el beta amiloide humano 1-42 se estimó mediante ensayos en los que cada anticuerpo fue capturado de forma no covalente por una superficie de proteína G que estaba unida por amina a un chip CM5 patenteado. La superficie del chip era regenerada entre ciclos por inyecciones pareadas de 40 segundos de 10 mM de Glicina pH 2,0 para eliminar el ligando y el anticuerpo vinculado. A continuación, el anticuerpo de ensayo se volvió a aplicar para cada inyección de péptidos.
Una serie de diluciones de péptido beta amiloide humano 1-42 sintético (0,063 - 1024 nM) se pasaron secuencialmente sobre la superficie del anticuerpo por una cantidad suficiente de tiempo para observar sensogramas que podrían ser ajustados a un modelo de unión apropiado con confianza. Datos de celda de flujo de referencia en blanco se restaron de cada conjunto de datos de IgG y un blanco de tampón de concentración cero solo de anticuerpo se restó por doble referencia del conjunto de datos principal. A continuación, un modelo de unión apropiado se ajustó simultáneamente a los datos de cada titulación de analito usando el software BIAevaluation.
La validez de los datos se evaluó usando el valor de Chi2 calculado, con un valor aceptable estando bajo 2 UR2. El éxito general del ajuste se estimó utilizando los residuos, con una desviación de menos de 2 UR siendo aceptable. Ejemplo de resultados para Abet0380-GL (línea germinal) IgG1-TM se muestra en la Figura 12. La constante de tasa de asociación (ka), la constante de tasa de disociación (kd) y la constante de disociación (KD) son 9,52 x 105 M'1 s-1, 3,07 x 10‘4 s_1 y 322 nM respectivamente. Estos parámetros se derivaron de un ajuste de Langmuir 1:1 a los datos.
3.11 Especificidad de perfiles de IgG optimizados por afinidad utilizando Resonancia de Plasmones Superficiales La Resonancia de Plasmones Superficiales se utilizó para verificar la especificidad de IgGs optimizados por afinidad para el péptido beta amiloide humano 1-42. Brevemente, fue utilizado el instrumento biosensor BIAcore2000 (GE Healthcare, Reino Unido) para evaluar los parámetros cinéticos de la interacción entre cada IgG de prueba y un intervalo de pequeños péptidos incluyendo beta amiloide humano 1-42 y beta amiloide humano 1-40 producidos sintéticamente. Estos experimentos se realizaron esencialmente como se describe por Karlsson y col., (Karlsson y col., 1991). Para más detalles, ver sección 1.7.
La interacción entre cada IgG de prueba y cada péptido se estimó mediante ensayos en los que el anticuerpo era capturado de forma no covalente por una superficie de proteína G que estaba unida por amina a un chip CM5 patenteado. Se observó la interacción entre el anticuerpo y el péptido utilizando una estrategia de ciclo único de 5 aplicaciones. La superficie del chip era regenerada entre ciclos por inyecciones pareadas de 40 segundos de 10 mM de Glicina pH 2,0 para eliminar el ligando y el anticuerpo vinculado. A continuación, el anticuerpo de ensayo se volvió a aplicar para cada ciclo de inyección de péptidos.
Cada péptido de prueba (entre 64 nM y 1024 nM) se pasó secuencialmente sobre la superficie del anticuerpo durante una cantidad de tiempo suficiente para observar sensorgramas que no mostraban unión o que podían ajustarse a un modelo de unión apropiado con confianza. Datos de celda de flujo de referencia en blanco se restaron de cada conjunto de datos de IgG y un blanco de tampón de concentración cero solo de anticuerpo se restó por doble referencia del conjunto de datos principal.
Ejemplo de resultados para Abet0380-GL (línea germinal) IgG1-TM se muestra en la Figura 13. Dos péptidos (beta amiloide humano biotinilado 1-42, (rPeptide, EE. UU.; cat: A1117) y beta amiloide murino no marcado 1-42 (rPeptide, EE. UU.; cat: A1008) mostraron una fuerte unión al anticuerpo, mientras que dos péptidos beta amiloides biotinilados humanos 1-40 (rPeptide, EE. UU.; cat: A1111) y beta amiloide murino no marcado 1-40 (rPeptide, EE. UU.; cat: A1007) no mostraron unión al anticuerpo.
3.12 afinidad de los IgG más potentes para beta amiloide nativo usando inmunohistoquímica in vitro
Los IgG más potentes fueron probados por su capacidad de unirse a beta amiloide, con el objetivo de estimar la afinidad de esos clones por formas nativas del péptido beta amiloide. Brevemente, los anticuerpos principales fueron seleccionados en secciones de cerebro humano con enfermedad de Alzheimer y secciones de cerebro de ratón Tg2576 para identificar anticuerpos beta antiamiloide 1-42 que se unen a placas amiloides in vitro. Los experimentos se realizaron esencialmente como se describe en la Sección 1.9.
En estos experimentos, tejido cerebral humano se aisló de la corteza frontal de dos individuos con enfermedad de Alzheimer grave (genotipo ApoE 3/3, etapa Braak 6 y genotipo ApoE 4/3, etapa Braak 5). Como control, tejido equivalente fue aislado de un individuo sin demencia (genotipo ApoE 3/3, etapa Braak 1). Tejido de cerebro de ratón se aisló de ratones Tg2576 a una edad de 15 meses (2 ratones) y 22 meses (2 ratones). Anticuerpos fueron probados a concentraciones de 2, 5, 10 y 20 ug ml-1.
En un experimento, el anticuerpo Abet0380-GL IgG1-TM tiñó placas centrales (CP) con un puntaje de 4 en secciones de cerebro de Tg2576, y un puntaje de 3 en secciones de cerebro humano con EA. También tiñó placas difusas (DP) y placas de angiopatía amiloide cerebral (AAC), pero en menor medida. En contraste, un anticuerpo de control positivo produjo un puntaje de 3-4 en todas las placas (CP, DP, AAC) en secciones adyacentes en las mismas condiciones. Imágenes representativas se muestran en la figura 14.
3.13 Demostración del perfil de reconocimiento de Abet0380-GL IgG1-TM A 42 por Western Blot
Para combinar los oligómeros AI342 antes de SDS-PAGE, PICUP (combinación foto-inducida de péptidos) se hizo lo siguiente. Una solución 1 mM de Ru(bpy) fue creada por la adición de 2 pl de reserva (a 10 mM) a 18 pl de 1xPBS. Además, una solución 20 mM de persulfato de amonio (APS) se creó mediante la adición de 2 pl de reserva (a 200 mM) a 18 pl de 1xPBS. La reserva no utilizada fue de inmediato congelada instantáneamente en hielo seco y devuelta al congelador a -80°C. En el cuarto oscuro, se añadió 5 ul de Ru (bpy) a 80ul de agregado (puro 10 uM muestra), seguido de 5 pl de APS. Las muestras se irradiaron con una lámpara en el cuarto oscuro por 10seg. Se añadió inmediatamente 30uls de tampón de muestra (4x) LDS.
A continuación, se realizó SDS-PAGE en agregado entrecruzado (PICUP) y no entrecruzado I3A1-42. Las soluciones se incubaron en un bloque caliente a 70°C durante 10 minutos. Mientras tanto, un marcador fue creado mediante la combinación de 5 pl de Magic Mark XP Western Protein Standard, 5 pl de Novex Sharp Pre-stained Protein Standard. Después de diez minutos de incubación, las muestras más el marcador se cargaron en un NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gels (1,0 mm, 15 pocillos, 15 pl por pocillo) con tampón activo MES. Los geles se corrieron a 200 V durante 35 minutos.
A continuación, el gel se transfirió a una membrana de PVDF usando una máquina de iBlot de Invitrogen, durante 7 minutos a 20V (programa P3).
Una vez que el blotting es completado, la pila de gel fue desmontada y a continuación la membrana PVDF se bloqueó en 50 ml de MPBST al 4% (4% Marvel en PBST) durante una hora a temperatura ambiente con rotación suave. Los blots se cortaron a continuación con un escalpelo para sondear con anticuerpos individuales. Esta fue una incubación de 1 hora con la solución de anticuerpo primario (2ug/ml en 10 ml de MPBST al 3%).
A continuación, la membrana se lavó 5x con PBST, 5 minutos cada uno, y a continuación se incubó en solución de anticuerpo secundario (1 pl Fc específica antihumana - conjugada a h Rp en 10 ml de PBST) durante 1 hora a temperatura ambiente. La membrana se lavó 3 veces con PBST y 2 veces con PBS, 5 minutos cada uno.
Durante los lavados finales, el sustrato quimioluminiscente de SuperSignal West Dura (Thermo Scientific; 34.075) se dejó calentar a temperatura ambiente. 600ul de cada una de las 2 soluciones fueron combinados. El PBS se decantó de la membrana de PVDF, y a continuación una pipeta se utilizó para cubrir la membrana con los reactivos Dura mezclados. La reacción se dejó proceder durante ~ 5 minutos (tiempo durante el cual el Sistema de Imágenes VerscDoc fue ajustado) y a continuación una imagen fue tomada con exposición de 30 s (con mejora usando el filtro de transformación). Una imagen representativa se muestra en Figura 15.
Ejemplo 4. Los estudios que demuestran una respuesta funcional específica del anticuerpo Abet0380-GL IgG1-TM in vivo
4.1 Caracterización funcional de Abet0380-GL IgG1-TM por reducción de péptido beta amiloide 1-42 libre in vivo Ratas albinas Harlan Sprague-Dawley de ocho semanas del sexo masculino (n = 8-12) recibieron una dosis única de anticuerpo Abet0380-GL IgG1-TM por inyección intravenosa con un vehículo de dosificación de histidina 25 mM, 7% de sacarosa, 0,02% de tensioactivo P80, pH 6,0 a 5 ml/kg. Las soluciones de dosificación se hicieron justo antes de la dosificación. Los animales fueron anestesiados en el tiempo indicado y el líquido cefalorraquídeo (LCR) se aspiró de la cisterna magna. Muestras de LCR fueron centrifugadas durante 10 minutos a aproximadamente 3000 x g a 4°C dentro de 20 minutos de toma de las muestras para eliminar las células o residuos. Las muestras se congelaron a continuación en hielo seco y se almacenaron a -70°C para su posterior análisis.
Los animales se sacrificaron por decapitación, se diseccionó el tejido cerebral y péptidos beta amiloides fueron extraídos del tejido cerebral en dietilamina (DEA; Fluka, Sigma, Reino Unido; cat: 31729). Brevemente, el tejido cerebral congelado se homogeneizó en 0,2% de DEA y NaCl 50 mM (Merck, EE. UU.; cat: 1.06404.1000). Homogeneizados de cerebro se ultracentrifugaron a 133.000 x g, durante 1 hora. Sobrenadantes recuperados se neutralizaron a pH 8,0 con Tris-HCI 2 M (TRIZMA®-clorhidrato; Sigma, Reino Unido; cat: 93363) y almacenados a -70°C hasta el análisis. Experimentaciones con animales se realizaron de conformidad con las directrices y regulaciones pertinentes proporcionadas por la Junta Sueca de Agricultura. El permiso ético fue proporcionado por una junta de ética especializada en la experimentación con animales: la Junta Ética de Experimentación Animal de Estocolmo Sodra.
La medición de péptido beta amiloide libre 1-42 en LCR de rata se realizó utilizando inmunoprecipitación para eliminar el péptido beta amiloide 1-42 ligado a Abet0380-GL, seguido por análisis mediante un kit comercial ELISA obtenido de Invitrogen. Brevemente, una solución de perlas de proteína A (Proteína A Dynabeads®; Invitrogen, Reino Unido; cat: 100-02D) se añadió a una placa sin faldón de 96 pocillos (0,2 ml de polipropileno; VWR International, Reino Unido; cat: 10732-4828) y se lavó dos veces con TBST (TBS 50 mM; Sigma, Reino Unido; cat: T6664 más 0,1% de Tween 20) usando un imán (Dynamag™ 96 lateral; Invitrogen, Reino Unido; cat: 123.31D) para separar las perlas de la solución. Se añadieron muestras descongeladas LCR de rata (40 pl) a cada pocillo y se incubaron a 40°C con rotación inclinada durante 1 hora. Las perlas se sedimentaron después usando el imán y 30 pl de muestras de LCR inmunoprecipitadas se transfirieron a una placa de 96 pocillos del kit ELISA (beta amiloide de ratón (1-42) kit colorimétrico ELISA; Invitrogen, Reino Unido; cat: KMB3441) con 70 pl del Tampón Diluyente Estándar ya añadido (suplementado con inhibidor de proteasa; Roche, Reino Unido; cat: 11836153001). Se añadieron muestras estándar de calibración a la placa por duplicado y la placa se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación. La placa se lavó 4 veces con 400 pl de tampón de lavado, se añadieron 100 pl de la solución de anticuerpo de detección a cada pocillo y la placa se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación. La placa se lavó 4 veces con 400 pl de tampón de lavado, se añadieron 100 pl de la solución de trabajo de anticuerpo secundario a cada pocillo y la placa se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitación. Finalmente, la placa se lavó 4 veces con 400 pl de tampón de lavado, se añadieron 100 pl de Chromogen estabilizado a cada pocillo y la placa se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Para detener la reacción, se añadieron 100 pl de Solución de Parada a cada pocillo y la placa se leyó dentro de 2 horas a una absorbancia de 450 nm.p Muestras individuales de LCR se analizaron y se realizó análisis de datos usando Prism 4 (GraphPad, EE. UU.) con ANOVA de una vía en datos transformados en registro sin ajuste para comparaciones múltiples.
Se realizó la medición de péptido beta amiloide 1-42 total (libre y unido a Abet0380-GL) en homogeneizados de cerebro de rata usando modificaciones del kit colorimétrico ELISA (Invitrogen, Reino Unido; cat: KMB3441) para beta amiloide de ratón (1-42). El anticuerpo de detección del kit fue sustituido por un exceso de anticuerpo Abet0380-GL IgG1-TM y el anticuerpo secundario por un anticuerpo IgG HRP-conjugado antihumano (Jackson ImmunoResearch, Reino Unido; cat: 109-035-098). Brevemente, homogeneizados de cerebro descongelados de 50 pl se diluyeron 1:2 en Diluyente de Muestra (suplementado con inhibidor de proteasa; Roche, Reino Unido; cat: 11836153001) y muestras estándar se añadieron por duplicado a la placa ELISA de 96 pocillos. Un exceso de anticuerpo Abet0380-GL IgG1-TM (50 pl, 4 pg/ml) se añadió a cada pocillo y a continuación la placa se incubó durante 3 horas a temperatura ambiente. La placa se lavó 4 veces con 400 pl de tampón de lavado, se añadieron 100 pl de la solución de trabajo de anticuerpo secundario a cada pocillo y la placa se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente. Finalmente, la placa se lavó 4 veces con 400 pl de tampón de lavado, se añadieron 100 pl de Chromogen estabilizado a cada pocillo y la placa se incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Para detener la reacción, se añadieron 100 pl de Solución de Parada a cada pocillo y la placa se leyó dentro de 2 horas a una absorbancia de 450 nm.p Se realizó análisis de datos usando Prism 4 (GraphPad, EE. UU.) con ANOVA de una vía en datos transformados en registro sin ajuste para comparaciones múltiples.
Se realizó la medición de péptido beta amiloide 1-40 total en homogeneizados de cerebro de rata usando el kit colorimétrico ELISA para beta amiloide de ratón (1-40) (Invitrogen, Reino Unido; cat: KMB3481). Brevemente, homogeneizados de cerebro descongelados de 50 pl y muestras estándar, diluidos en Diluyente de Muestra (suplementado con inhibidor de proteasa; Roche, Reino Unido; cat: 11836153001) se añadieron por duplicado a la placa ELISA de 96 pocillos. Se añadieron 50 pl de solución de anticuerpo de detección a cada pocillo y la placa se incubó durante 3 horas a temperatura ambiente. La placa se lavó 4 veces con 400 pl de tampón de lavado, se añadieron 100 pl de la solución de trabajo de anticuerpo secundario a cada pocillo y la placa se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente. Finalmente, la placa se lavó 4 veces con 400 pl de tampón de lavado, se añadieron 100 pl de Chromogen estabilizado a cada pocillo y la placa se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Para detener la reacción, se añadieron 100 pl de Solución de Parada a cada pocillo y la placa se leyó dentro de 2 horas a una absorbancia de 450 nm.p Se realizó análisis de datos usando Prism 4 (GraphPad, EE. u U.) con ANOVA de una vía en datos transformados en registro sin ajuste para comparaciones múltiples.
4.2 Caracterización funcional de Abet0380-GL IgG1-TM por reducción de péptido beta amiloide 1-42 libre in vivo Una única dosis de anticuerpo Abet0380-GL IgG1-TM a 20 mg/kg redujo el nivel de LCR de péptido beta amiloide libre 1-42 en ratas al límite de cuantificación a las 72 o 168 horas después de la dosis en el ensayo descrito en la Sección 4.1 (datos no mostrados). Para investigar más el efecto del anticuerpo Abet0380-GL IgG1-TM in vivo, le fueron administradas a ratas dosis semanales de 0,25, 0,5, 1, 5 o 10 mg/kg durante 14 días. Los animales se sacrificaron 168 horas después de la segunda dosis para medir los niveles de péptido beta amiloide libre 1-42 en LCR, así como péptidos beta amiloides totales 1-42 o 1-40 en el tejido cerebral.
Una disminución dependiente de la dosis de beta amiloide libre 1-42 fue demostrada en LCR (Figura 16A). Las dos dosis más altas de 5 y 10 mg/kg redujeron el péptido beta amiloide 1-42 al límite de cuantificación en el ensayo utilizado, mientras que las dosis de 0,5 y 1 mg/kg redujeron significativamente el péptido beta amiloide 1-42 en 47% y 61% respectivamente en comparación con el control del vehículo. La dosis más baja, 0,25 mg/kg, dio una reducción del 14% de péptido beta amiloide libre 1-42 en el LCR, pero no alcanzó significación estadística. Debido al secuestro del péptido beta amiloide 1-42 por el anticuerpo Abet0380-GL IgG1-TM, un aumento dependiente de dosis de péptido beta amiloide total 1-42 fue demostrada en el tejido cerebral (Figura 16B). Sin embargo, el nivel de péptido beta amiloide total 1-40 en el tejido cerebral no fue afectado (Figura 16C), lo que demuestra la especificidad de Abet0380-GL IgG1-TM para el péptido beta amiloide 1-42. En resumen, los resultados anteriores de los estudios en ratas mostraron que el anticuerpo Abet0380-GL IgG1-TM redujo el nivel del péptido beta amiloide 1-42 libre en FCE con un ED50 entre 0,5 y 1 mg/kg.
4.3 Caracterización funcional de Abet0380-GL IgG1TM - demostración de no unión a placas in vivo - no unión de Abet0380-GL IgG1-TM a placas beta amiloides in vivo 168 horas después de una dosis periférica a ratones Tg2576 envejecidos
Abet0380-GL IgG1-TM fue probado para su capacidad de unirse a placas beta amiloides en ratones Tg2576 envejecidos después de una dosis periférica única. Experimentaciones con animales se realizaron de conformidad con las directrices y regulaciones pertinentes proporcionadas por la Junta Sueca de Agricultura. El permiso ético fue proporcionado por una junta de ética especializada en la experimentación con animales: la Junta Ética de Experimentación Animal de Estocolmo Sodra.
Ratones Tg2576 del sexo femenino de diecisiete meses de edad (n=5) recibieron una dosis única de vehículo, un anticuerpo de control positivo a 30 mg/kg o el anticuerpo Abet0380-GL IgG1-TM a 10 o 30 mg/kg por inyección intravenosa con un vehículo de dosificación de histidina 25 mM, 7% de sacarosa, 0,02% de tensioactivo p80, pH 6,0 a 5 mL/kg. A las 168 horas después de la dosis, los animales se anestesiaron profundamente y se perfundieron con PBS a temperatura ambiente seguido de 4% de paraformaldehído (PFA) frío (4°C) tamponado con fosfato. Los animales fueron a continuación sacrificados por decapitación y se diseccionaron los cerebros e inmersiones fijadas en PFA a 4°C durante 72 horas. El fijador se intercambió a PBS que contenía azida de sodio al 0,1% y los tejidos se almacenaron a 4°C hasta su procesamiento ulterior.
Fue realizada inmunohistoquímica en secciones cerebrales para evaluar el grado de unión de Abet0380-GL IgG1-TM a las placas beta-amiloide in vivo. Brevemente, secciones de cerebro embebidas en parafina se prepararon para inmunohistoquímica, como se describe en la sección 1.9. La detección de Abet0380-GL IgG1-TM o el anticuerpo de control positivo depositado dentro parénquima cerebral se llevó a cabo usando un anticuerpo secundario conejo-antiratón IgG1 e IgG2-específico de Epitomics. La tinción se realizó en el robot Ventana, utilizando el sistema de detección de OmniMap (Ventana Medical Systems, EE. UU.). Para un rápido aumento ex vivo, secciones de tejido consecutivas se tiñeron in vitro con el Abet0380-GL IgG1-TM o anticuerpo de control positivo inyectados en exceso. Anticuerpos y cromogenes secundarios fueron los mismos que anteriormente.
El puntaje de la tinción se realizó de forma ciega con un aumento óptico de 10x. Se observó la distribución de las placas decoradas. La intensidad de la marcación de la placa se puntuó según una escala de intensidad relativa de 0 (sin tinción de las placas) hasta 4 (decoración intensa de las placas).
Abet0380-GL IgG1-TM no decoró las placas de beta-amiloide o angiopatía amiloide cerebral (AAC) in vivo a las 168 horas después de una dosis periférica de 10 o 30 mg/kg. El anticuerpo de control positivo demostró decoración de placa de intensa a baja in vivo. Un patrón de distribución parcial y focal fue evidente, con placas centrales, placas difusas y AAC en todos los animales. Imágenes representativas se muestran en la figura 17. El aumento rápido ex vivo de tejido cerebral de los mismos animales con Abet0380-GL IgG1-TM y el anticuerpo de control positivo confirmaron la capacidad previamente demostrada de los anticuerpos inyectados ex vivo de unirse a las placas (no mostrado).
Ejemplo 5. Secuencias Anti-&A1-42
Ejemplos de secuencias de moléculas de anticuerpos se enumeran en el listado de secuencias adjunto, incluyendo ejemplos de anticuerpos, dominios VH, dominios VL, secuencias de CDR individuales, conjuntos de HCDR, conjuntos de LCDR y regiones de estructura.
Se compararon secuencias de los 24 clones optimizados enumerados en la Tabla 7. Las tablas 10 y 11 muestran % de identidad de secuencia entre los dominios VH y VL, respectivamente.
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Tabla 12: Ejemplos de residuos en cada posición dentro de las VH CDR y Residuos de Vernier
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Tabla 13: Ejemplos de residuos en cada posición dentro de las VL CDR
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Tabla 14: Sustituciones observadas en VH CDR y FW1 en 24 clones optimizados
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Tabla 15: Suscripciones observadas en VL CDR en 24 clones optimizados Tabla 16: Correspondencia entre las secuencias de anticuerpos mencionadas en esta invención y las secuencias del Listado de secuencias al final de este documento.
Abet0007 VH ADN Abet0007 VH PRT Abet0007 CDR1 PRT Abet0007 CDR2PRT Abet0007 CDR3PRT Abet0007 FW1 PRT Abet0007 FW2 PRT Abet0007 FW3 PRT Abet0007 FW4 PRT
0 Abet0007 VL ADN
1 Abet0007 VL PRT
2 Abet0007 CDR1 PRT
3 Abet0007 CDR2PRT
4 Abet0007 CDR3PRT
5 Abet0007 FW1 PRT
6 Abet0007 FW2 PRT
7 Abet0007 FW3PRT
8 Abet0007 FW4 PRT
9 Abeto 144-GL VH ADN
0 Abeto 144-GL VH PRT
1 AbetO 144-GL CDR1 PRT
2 Abeto 144-GL CDR2PRT
3 AbetO 144-GL CDR3PRT
4 Abeto 144-GL FW1 PRT
5 AbetO 144-GL FW2 PRT
6 AbetO 144-GL FW3 PRT
7 AbetO 144-GL FW4 PRT
8 AbetO 144-GL VL ADN
9 AbetO 144-GL VL PRT
0 AbetO 144-GL CDR1 PRT
1 AbetO 144-GL CDR2PRT
2 AbetO 144-GL CDR3PRT
3 AbetO 144-GL FW1 PRT
4 AbetO 144-GL FW2 PRT
5 AbetO 144-GL FW3 PRT
6 AbetO 144-GL FW4 PRT
7 Abet0319 VH ADN
8 Abet0319 VH PRT
9 Abet0319 CDR1 PRT
0 Abet0319 CDR2PRT
1 Abet0319 CDR3PRT
2 Abet03l9 FW1 PRT Abet0319 FW2 PRT Abet0319 FW3 PRT Abet0319 FW4 PRT Abet0319 VL ADN Abet0319 VL PRT Abet0319 CDR1 PRT Abet0319 CDR2PRT Abet0319 CDR3PRT Abet0319 FW1 PRT Abet0319 FW2 PRT Abet0319 FW3 PRT Abet0319 FW4PRT Abet0321b VH ADN Abet0321b VH PRT Abet0321b CDR1 PRT Abet0321b CDR2PRT AbetO 321b CDR3PRT Abet0321b FW1 PRT Abeto 321b FW2 PRT Abet0321b FW3 PRT Abet0321b FW4 PRT AbetO 321b VL ADN Abet0321b VL PRT Abet0321b CDR1 PRT Abet0321b CDR2PRT AbetO 321b CDR3PRT AbetO 321b FW1 PRT Abet0321b FW2 PRT AbetO 321b FW3 PRT Abet0321b FW4 PRT Abet0322b VH ADN Abet0322b VH PRT Abet0322b CDR1 PRT Abet0322b CDR2PRT Abet0322b CDR3PRT Abet0322b FW1 PRT Abet0322b FW2 PRT Abet0322b FW3 PRT Abet0322b FW4 PRT Abet0322b VL ADN Abet0322b VL PRT Abet0322b CDR1 PRT Abet0322b CDR2PRT Abet0322b CDR3PRT Abet0322b . . FW1 PRT .
Abct0322b FW2 PRT Abet0322b FW3 PRT Abet0322b FW4PRT Abet0323b VH ADN Abet0323b VH PRT Abet0323b CDR1 PRT Abet0323b CDR2PRT Abet0323b CDR3PRT Abet0323b FW1 PRT Abet0323b FW2 PRT Abet0323b FW3 PRT Abet0323b FW4PRT Abet0323b VL ADN Abet0323b VL PRT Abet0323b CDR1 PRT Abet0323b CDR2PRT Abet0323b CDR3PRT Abet0323b FW1 PRT Abet0323b FW2 PRT Abet0323b FW3 PRT Abet0323b FW4 PRT Abet0328 VH ADN Abet0328 VH PRT Abet0328 CDR1 PRT Abet0328 CDR2PRT Abet0328 CDR3PRT Abet0328 FW1 PRT Abet0328 FW2 PRT Abet0328 FW3PRT Abct0328 FW4PRT Abet0328 VL ADN Abet0328 VL PRT Abet0328 CDR1 PRT Abet0328 CDR2PRT Abet0328 CDR3PRT Abet0328 FW1 PRT Abet0328 FW2 PRT Abet0328 FW3 PRT Abet0328 FW4 PRT Abet0329 VH ADN Abet0329 VH PRT Abet0329 CDR1 PRT Abet0329 CDR2PRT Abet0329 CDR3PRT Abet0329 FW1 PRT
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AbetO 342 FW2 PRT AbetO 342 FW3 PRT AbetO 342 FW4 PRT Abet0343 VH ADN Abet0343 VH PRT Abet0343 CDR1 PRT AbetO 343 CDR2PRT Abet0343 CDR3PRT Abet0343 FW1 PRT Abet0343 FW2 PRT Abet0343 FW3 PRT Abet0343 FW4PRT Abet0343 VL ADN AbetO 343 VL PRT Abet0343 CDR1 PRT Abet0343 CDR2PRT Abet0343 CDR3PRT Abet0343 FW1 PRT Abet0343 FW2 PRT Abet0343 FW3 PRT Abet0343 FW4PRT Abet0344 VH ADN AbetO 344 VH PRT AbetO 344 CDR1 PRT AbetO 344 CDR2PRT AbetO 344 CDR3PRT AbetO 344 FW1 PRT AbetO 344 FW2 PRT AbetO 344 FW3 PRT AbetO 344 FW4 PRT AbetO 344 VL ADN AbetO 344 VL PRT AbetO 344 CDR1 PRT AbetO 344 CDR2PRT AbetO 344 CDR3PRT AbetO 344 FW1 PRT AbetO 344 FW2 PRT AbetO 344 FW3 PRT Abet0344 FW4PRT Abet0368 VH ADN Abet0368 VH PRT Abet0368 CDR1 PRT Abet0368 CDR2PRT Abet0368 CDR3PRT Abet0368 FW1 PRT
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Abet0373 FW2 PRT Abet0373 FW3 PRT Abet0373 FW4PRT Abet0373 VL ADN Abet0373 VL PRT Abet0373 CDR1 PRT Abet0373 CDR2PRT Abet0373 CDR3PRT Abet0373 FW1 PRT Abet0373 FW2 PRT Abet0373 FW3 PRT Abet0373 FW4 PRT Abet0374 VH ADN Abet0374 VH PRT Abet0374 CDR1 PRT Abet0374 CDR2PRT Abet0374 CDR3PRT Abet0374 FW1 PRT Abet0374 FW2 PRT Abet0374 FW3 PRT Abet0374 FW4 PRT Abet0374 VL ADN Abet0374 VL PRT Abet0374 CDR1 PRT Abct0374 CDR2PRT Abet0374 CDR3PRT Abet0374 FW1 PRT Abet0374 FW2 PRT Abet0374 FW3 PRT Abet0374 FW4PRT Abet0377 VH ADN Abet0377 VH PRT Abet0377 CDR1 PRT Abet0377 CDR2 PRT Abet0377 CDR3PRT Abet0377 FW1 PRT Abet0377 FW2 PRT Abet0377 FW3 PRT Abet0377 FW4 PRT Abet0377 VL ADN Abet0377 VL PRT Abet0377 CDR1 PRT Abet0377 CDR2PRT Abet0377 CDR3PRT Abet0377 FW1 PRT Abet0377 FW2 PRT Abet0377 FW3 PRT Abet0377 FW4PRT Abet0378 VH ADN Abet0378 VH PRT Abet0378 CDR1 PRT AbctO 378 CDR2PRT Abet0378 CDR3PRT Abet0378 FW1 PRT Abet0378 FW2 PRT Abet0378 FW3 PRT AbetO 378 FW4PRT Abet0378 VL ADN Abet0378 VL PRT AbetO 378 CDR1 PRT Abet0378 CDR2PRT Abet0378 CDR3PRT Abet0378 FW1 PRT AbetO 378 FW2 PRT Abet0378 FW3 PRT Abet0378 FW4PRT Abet0379 VH ADN Abet0379 VH PRT Abet0379 CDR1 PRT AbetO 379 CDR2PRT Abet0379 CDR3PRT AbetO 379 FW1 PRT AbetO 379 FW2 PRT AbetO 379 FW3 PRT AbetO 379 FW4PRT AbetO 379 VL ADN AbetO 379 VL PRT AbetO 379 CDR1 PRT AbetO 379 CDR2PRT AbetO 379 CDR3PRT AbetO 379 FW1 PRT AbetO 379 FW2 PRT AbetO 379 FW3 PRT AbetO 379 FW4PRT Abet0380 VH ADN Abet0380 VH PRT Abet0380 CDR1 PRT AbetO 380 CDR2PRT Abet0380 ' CDR3PRT Abet0380 FW1 PRT
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Abet0382 FW2 PRT Abet0382 FW3 PRT Abet0382 FW4PRT Abet0383 VH ADN Abet0383 VH PRT Abet0383 CDR1 PRT Abet0383 CDR2PRT Abet0383 CDR3PRT Abet0383 FW1 PRT Abet0383 FW2 PRT Abet0383 FW3 PRT Abet0383 FW4 PRT Abet0383 VL ADN Abet0383 VL PRT Abet0383 CDR1 PRT Abet0383 CDR2PRT Abet0383 CDR3PRT Abet0383 FW1 PRT Abet0383 FW2 PRT Abet0383 FW3 PRT Abet0383 FW4 PRT Abet0343-GL VH ADN Abet0343-GL VH PRT Abet0343-GL CDR1 PRT Abet0343-GL CDR2PRT Abet0343-GL CDR3PRT Abet0343-GL FW1 PRT Abet0343-GL FW2 PRT Abet0343-GL FW3 PRT Abet0343-GL FW4PRT Abet0343-GL VL ADN Abet0343-GL VL PRT Abet0343-GL CDR1 PRT Abet0343-GL CDR2PRT Abet0343-GL CDR3PRT Abet0343-GL FW1 PRT Abet0343-GL FW2 PRT Abet0343-GL FW3 PRT Abet0343-GL FW4PRT Abet0369-GL VH ADN Abet0369-GL VH PRT Abet0369-GL CDR1 PRT Abet0369-GL CDR2PRT Abet0369-GL CDR3PRT Abet0369-GL FW1 PRT Abet0369-GL FW2 PRT Abet0369-GL FW3 PRT Abet0369-GL FW4 PRT Abet0369-GL VL ADN Abet0369-GL VL PRT Abet0369-GL CDR1 PRT Abet0369-GL CDR2PRT Abet0369-GL CDR3PRT Abet0369-GL FW1 PRT Abet0369-GL FW2 PRT Abet0369-GL FW3 PRT Abet0369-GL FW4 PRT Abot0377-GL VH ADN Abet0377-GL VH PRT Abet0377-GL CDR1 PRT Abet0377-GL CDR2PRT Abet0377-GL CDR3PRT Abet0377-GL FW1 PRT Abet0377-GL FW2 PRT Abet0377-GL FW3 PRT Abet0377-GL FW4PRT Abet0377-GL VL ADN Abet0377-GL VL PRT Abet0377-GL CDR1 PRT Abet0377-GL CDR2PRT Abet0377-GL CDR3PRT Abet0377-GL FW1 PRT Abet0377-GL FW2 PRT Abet0377-GL FW3 PRT Abet0377-GL FW4PRT Abet0380-GL VH ADN Abet0380-GL VH PRT Abet0380-GL CDR1 PRT Abet0380-GL CDR2PRT Abet0380-GL CDR3PRT Abet0380-GL FW1 PRT Abet0380-GL FW2 PRT Abet0380-GL FW3 PRT Abet0380-GL FW4 PRT Abet0380-GL VL ADN Abet0380-GL VL PRT Abet0380-GL CDR1 PRT Abet0380-GL CDR2PRT Abet0380-GL CDR3PRT Abet0380-GL FW1 PRT 538 Abet0380-GL FW2 PRT
539 Abet0380-GL FW3 PRT
540 Abet0380-GL FW4 PRT
541 Abet0382-GL VH ADN
542 Abet0382-GL VH PRT
543 Abet0382-GL CDR1 PRT
544 Abet0382-GL CDR2PRT
545 Abet0382-GL CDR3PRT
546 Abet0382-GL FW1 PRT
547 Abet0382-GL FW2 PRT
548 Abet0382-GL FW3PRT
549 Abet0382-GL FW4 PRT
550 Abet0382-GL VL ADN
551 Abet0382-GL VL PRT
552 Abet0382-GL CDR1 PRT
553 Abet0382-GL CDR2PRT
554 Abet0382-GL CDR3PRT
555 Abet0382-GL FW1 PRT
556 Abet0382-GL FW2 PRT
557 Abet0382-GL FW3 PRT
558 Abet0382-GL FW4PRT
Ejemplo 6: Especificidad de Abet0380-GL IgG1-TM en experimentos de unión de competición
La especificidad de Abet0380-GL IgG1-TM se examinó en experimentos de unión de competición. En resumen, se incubó Abet0380-GL IgG1-TM (0,5nM) (1 hora a temperatura ambiente) con un intervalo de diferentes concentraciones (10uM a 0,17nM) de un panel de péptidos Abeta humanos de longitud completa, truncados y piro (Abeta 1- 42, Abeta 1-43, Abeta 1-16, Abeta 12-28, Abeta 17-42, Abeta piro-3-42 o Abeta piro-11-42).
Después de la incubación entre Abet0380-GL IgG1-TM y los péptidos Abeta N-terminales, se añadió biotina Abeta 1­ 42 (1,5 nM) seguida por un anticuerpo Fc antihumano marcado con criptato de europio (0,8 nM) (CisBio Cat. No.
61HFCKLB) y estreptavidina-XLent! (5 nM) (CisBio Cat. No. 611SAXLB). A continuación, el ensayo se incubó durante otras 2 horas a temperatura ambiente antes de leer en un lector de placas Envision (PerkinElmer) usando un protocolo homogéneo estándar de lectura por fluorescencia resuelta en el tiempo (HTRF). En la ausencia de competición, la interacción de biotina Abeta 1-42 N-terminal con Abet0380-GL IgG1-TM (en complejo con estreptavidina-XLent! y anticuerpo Fc antihumano marcado con criptato de europio, respectivamente) a continuación se podría medir mediante transferencia de energía por transferencia de energía por resonancia de fluorescencia resuelta en el tiempo (TR-FRET) debido a la proximidad del donante criptato de europio y fluoróforos aceptores XL665. La competición del Abet0380-GL IgG1-TM: interacción de biotina Abeta 1-42 N-terminal por péptidos de prueba, por lo tanto, resultó en una reducción de la señal de ensayo. Los resultados se expresan como % de unión específica donde el 100% de unión específica fue derivado de pocillos que contienen estreptavidina-XLent! (5 nM), biotina Abeta N-terminal 1-42 (1,5 nM), Abet0380-GL IgG1-TM (0,5 nM) & anticuerpo Fc antihumano marcado con criptato de europio (0,8 nM). 0% de unión específica se derivó de pocillos en los que Abet0380-GL IgG1-TM se había omitido.
El volumen de ensayo final fue de 20 pl y todos los reactivos se prepararon en un tampón de ensayo que comprende MOPS pH 7,4 (50 mM), fluoruro de potasio (0,4 M), Tween 20 (0,1%) & BSA libre de ácido graso (0,1%). El ensayo se realizó en placas de ensayo negras de 384 pocillos de bajo volumen (Costar 3676).
En resumen, inhibición de Abet0380-GL IgG1-TM: Unión de Biotina Abeta 1-42 N-terminal fue observada con Abeta 1-42, Abeta 1-43, Abeta 17-42, Abeta Piro-3-42 y Abeta Piro-11-42 con valores IC50 que van desde 10'8 a 10'9 molar para este grupo. Sin inhibición de Abet0380-GL IgG1-TM: Unión de Biotina Abeta 1-42 N-terminal fue observada con Abeta 1-16 o Abeta 12-28 (Figura 18).
Ejemplo 7: Capacidad del anticuerpo Abet0144-GL para secuestrar beta amiloide 1-42 en un estudio PK-PD de ratas normales.
La capacidad del anticuerpo Abet0144-GL para secuestrar beta amiloide 1-42 se investigó en un estudio PK-PD en ratas normales. A las ratas se les administró por vía intravenosa Abet0144-GL (10 o 40 mg/kg) o vehículo semanalmente durante 2 semanas (en los días 0 y 7), y se sacrificaron una semana después de la 2a dosis. LCR se muestreó para beta amiloide libre y total 1-42, y del cerebro se tomaron muestras para la medición de beta amiloide total 1-42. Los niveles de beta amiloide 1-42 libre y total se midieron usando ensayos descritos anteriormente.
Como se muestra en la Figura 19, beta amiloide libre 1-42 en el LCR no fue significativamente alterado por cualquiera de 10 o 40 mg/kg de Abet0144-GL (5 y 18% de incremento, respectivamente, en comparación con vehículo; Figura 19). Beta amiloide total 1-42 en LCR fue significativamente mayor en un 38% a 10 mg/kg, y en un 139% a 40 mg/kg. Beta amiloide total 1-42 en tejido cerebral también se incrementó significativamente, en un 16% y 50% a 10 y 40 mg/kg respectivamente. En resumen, los datos de este estudio en ratas normales demuestran que Abet0144-GL no tuvo ningún efecto significativo sobre los niveles de beta amiloide libre 1-42 en LCR, mientras que los niveles de beta amiloide total 1-42 tanto en LCR como en el cerebro aumentaron. Este fue el perfil que se podría esperar de un anticuerpo con una afinidad por diana en el intervalo de decenas de nM.
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Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Val Tyr
20 25 30
Thr Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val lie Gly Ser Ser Gly Gly Thr Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Gln Gln Leu Val Arg Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met
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Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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100 105
<210> 48
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0319
<400> 48
Ser Gly His Asn lie Met Asp Lys Trp Val Ser
5 10
<210> 49
<211>7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0319
<400> 49
Arg Asp Asp Lys Arg Pro Ser
5
<210> 50
<211>9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0319
<400> 50
SerSerGlnAspThrValThrArgVal
5
<210>51
<211> 22
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0319
<400> 51
SerTyrGluLeuThrGlnProProSerValSerValSerProGlyGln 5 10 15
ThrAlaSerlie ThrCys
20
<210> 52
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0319
<400> 52
TrpTyrGlnGlnLysProGlyArgSerProAlaLeuVallie Tyr 5 T0 15 <210> 53
<211> 32
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0319
<400> 53
Glylie ProGluArgPheSerAlaSerAsnSerGlyHlsThrAlaThr 5 10 15
LeuThrlie SerGlyThrGlnAlaThrAspGluAlaAspTyrTyrCys 20 25 30 <210> 54
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0319
<400> 54
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
5 10
<210> 55
<211> 375
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0321b
<400> 55
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctgcgta ccactcgaac cacgacccta tgtggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagtt attggttcta gtggtggtac gacagcttac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagata attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagagtgg 300 atggaccact cccgccccta ctactactac ggtatggacg tctgggggca ggggaccctg 360 gtcaccgtct cctca 375 <210> 56
<211> 125
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0321b
<400> 56
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Ala Tyr His Ser Asn His Asp
20 25 30
Pro Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val lie Gly Ser Ser Gly Gly Thr Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Trp Met Asp His Ser Arg Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met
100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 57
<211>5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0321b
<400> 57
His AspProMetTrp
5
<210> 58
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0321b
<400> 58
Vallie GlySerSerGlyGlyThrThrAla TyrAlaAspSerValLys
5 10 15
Gly
<210> 59
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0321b
<400> 59
GluTrpMetAspHisSerArgProTyrTyrTyrTyrGlyMetAspVal 5 10 15 <210> 60
<211> 30
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0321b
<400> 60
GluValGlnLeuLeuGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGly 5 10 15 SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerAlaTyrHisSerAsn
20 25 30 <210>61
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0321b
<400> 61
TrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal Ser
5 10
<210> 62
<211> 32
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0321b
<400> 62
Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
5 10 15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 63
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0321b
<400> 63
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
5 10
<210> 64
<211> 318
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0321b
<400> 64
tcgtacgagt tgactcagcc accctcagtgtccgtgtccc caggacagacggccagcatc 60 acctgctctg gacataactt ggaagataaatttgcttcct ggtatcaacagaagccaggc 120 cagtcccctg tcctgatcat ctatcgagatgacaagcggc cctcagggatccctgagcga 180 ttctctgcct ccaactctgg gcacactgccactctgacca tcagcgggacccaggctacg 240 gatgaggctg actattactg ttcgtcccag gacacggtga ctcgagtgtt cggcggaggg 300 accaagctga ccgtccta 318 <210> 65
<211> 106
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0321b
<400> 65
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 5 10 15
Thr Ala Ser lie Thr Cys Ser Gly His Asn Leu Glu Asp Lys Phe Ala 20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu lie lie Tyr 35 40 45
Arg Asp Asp Lys Arg Pro Ser Gly lie Pro Glu Arg Phe Ser Ala Ser 50 55 60
Asn Ser GlyHis Thr Ala Thr Leu Thr lie Ser Gly ThrGln Ala Thr 65 70 75 80 Asp Glu AlaAsp Tyr Tyr Cys Ser Ser Gln Asp Thr ValThr Arg Val 85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 66
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0321b
<400> 66
Ser Gly His Asn Leu Glu Asp Lys Phe Ala Ser
5 10
<210> 67
<211>7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0321b
<400> 67
Arg Asp Asp Lys Arg Pro Ser
5
<210> 68
<211>9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0321b
<400> 68
Ser Ser Gln Asp Thr Val Thr Arg Val
5
<210> 69
<211> 22
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0321b
<400> 69
SerTyrGluLeuThrGlnProProSerValSerValSerProGlyGln 5 10 15
ThrAlaSerlie ThrCys
20
<210> 70
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0321b
<400> 70
TrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnSerProValLeulie lie Tyr 5 10 15 <210>71
<211> 32
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0321b
<400> 71
Glylie ProGluArgPheSerAlaSerAsnSerGlyHisThrAlaThr 5 10 15 LeuThrlie SerGlyThrGlnAlaThrAspGluAlaAspTyrTyrCys 20 25 30 <210> 72
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0321b
<400> 72
PheGlyGlyGlyThrLysLeuThrValLeu
5 10
<210> 73
<211> 375
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0322b
<400> 73
gaggtgcagc tgttggagtc tggaggaggc ctggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctaacga agagttccag tacaacccta tgtggtgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagtt attggttcta gtggtggtgc gacagtttac 180
gcagacgccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccgagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctaag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagagtgg 300
atggaccact cccgccccta ctactactac ggtatggacg tctgggggca ggggaccctg 360
gtcaccgtct cctca 375
<210> 74
<211> 125
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0322b
<400> 74
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Asn Glu Glu Phe Gln Tyr Asn
20 25 30
Pro Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val lie Gly Ser Ser Gly Gly Ala Thr Val Tyr Ala Asp Ala Val
50 55 60
Ser Glu Asn Thr LeuTyr
Figure imgf000107_0001
Thr Ala Val Tyr TyrCys
Ala Arg Glu Trp Met Asp His Ser Arg Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met
100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 75
<211>5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0322b
<400> 75
Tyr ñsn Pro Met Trp
5
<210> 76
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0322b
<400> 76
Val lie Gly Ser Ser Gly Gly Ala Thr Val Tyr Ala Asp Ala Val Lys 5 10 15 Gly
<210> 77
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0322b
<400> 77
Glu Trp Met Asp His Ser Arg Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val 5 10 15 <210> 78
<211> 30
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0322b
<400> 78
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Asn Glu Glu Phe Gln
20 25 30 <210> 79
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0322b
<400> 79
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
5 10
<210> 80
<211> 32
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0322b
<400> 80
Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Glu Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 5 10 15 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210>81
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0322b
<400> 81
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
5 10
<210> 82
<211> 318
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0322b
<400> 82
tcgtacgagt tgactcagcc accctcagtgtccgtgtccc caggacagac ggccagcatc 60 acctgctctg gacataactt gggagataaatttgcttcct ggtatcaaca gaagccaggc 120 cagtcccctg tcctggtcat ctatcgagatgacaagcggc cctcagagat ccctgagcga 180 ttctctgcct ccaactctgg gcacactgccactctgacca tcagcgggac ccaggctacg 240 gatgaggctg actattactg ttcgtcccag gacacggtga ctcgagtgtt cggcggaggg 300 accaagctga ccgtcctg 318 <210> 83
<211> 106
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0322b
<400> 83
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
5 10 15
Thr Ala Ser lie Thr Cys Ser Gly His Asn Leu Gly Asp Lys Phe Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val lie Tyr
35 40 45
Arg Asp Asp Lys Arg Pro Ser Glu lie Pro Glu Arg Phe Ser Ala Ser
50 55 60
Asn Ser Gly His Thr Ala Thr Leu Thr lie Ser Gly Thr Gln Ala Thr
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Gln Asp Thr Val Thr Arg Val
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 84
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0322b
<400> 84
SerGlyHisAsnLeuGlyAspLysPheAlaSer
5 10
<210> 85
<211>7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0322b
<400> 85
ArgAspAspLysArgProSer
5
<210> 86
<211>9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0322b
<400> 86
SerSerGlnAspThrValThrArgVal
5
<210> 87
<211> 22
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0322b
<400> 87
SerTyrGluLeuThrGlnProProSerValSerValSerProGlyGln 5 10 15
ThrAlaSerlie ThrCys
20
<210> 88
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0322b
<400> 88
TrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnSerProValLeuVallie Tyr 5 10 15 <210> 89
<211> 32
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0322b
<400> 89
Figure imgf000111_0001
<210> 90
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0322b
<400> 90
PheGlyGlyGlyThrLysLeuThrValLeu
5 10
<210>91
<211> 375
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0323b
<400> 91
gaggtgcagctgttggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtccctgagactc 60
Figure imgf000111_0002
<210> 92
<211> 125
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0323b
<400> 92
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Thr Ser Thr Phe Gln Glu Asp
20 25 30
Thr Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val lie Gly Pro Asn Pro Lys Asn Asn Ala Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
AsnSerLysAsn Thr LeuTyr
Figure imgf000112_0001
AspThrAla Val Tyr TyrCys
Ala Arg Glu Trp Met Asp His Ser Arg Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met
100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 93
<211>5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0323b
<400> 93
Glu Asp Thr Met Trp
5
<210> 94
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0323b
<400> 94
Val lie Gly Pro Asn Pro Lys Asn Asn Ala Tyr Ala Asp Ser Val Lys
5 10 15
G1y
<210> 95
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0323b
<400> 95
Glu Trp Met Asp His Ser Arg Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
5 10 15
<210> 96
<211> 30
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0323b
<400> 96
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Thr Ser Thr Phe Gln
20 25 30 <210> 97
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0323b
<400> 97
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
5 10
<210> 98
<211> 32
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0323b
<400> 98
Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 5 10 15 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 99
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0323b
<400> 99
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
5 10
<210> 100
<211> 318
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0323b
<400> 100
tcgtacgagt tgactcagcc accctcagta tccgtgtccc caggacagac ggccagcatc 60 acctgctctg gacataactt ggaagataaa tttgcttcct ggtatcaaca gaagccaggc 120 cagtcccctg tcctggtcat ctatcgagat gacaagcggc cctctggggt ccctgagcga 180 ttctctgcct ccaactctgg gcacactgcc actctgacca tcagcgggac ccaggctacg 240 gatgaggctg actattactg ttcgtcccag gacacggtga ctcgagtgtt eggeggaggg 300 accaagctga tcgtccta 318 <210> 101
<211> 106
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0323b
<400> 101
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Glr
5 10 15
Thr Ala Ser lie Thr Cys Ser Gly His Asn Leu Glu Asp Lys Phe Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln S€ Pro Val Leu Val lie Tyr
35 40 45
Arg Asp Asp Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Glu Arg Phe Ser Ala S€
50 55 60
Asn Ser Gly His Thr Ala Thr Leu Thr lie Ser Gly Thr Gln Ala Thr
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Gln Asp Thr Val Thr Arg Val
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu lie Val Leu
100 105
<210> 102
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0323b
<400> 102
Ser Gly His Asn Leu Glu Asp Lys Phe Ala Ser
5 10
<210> 103
<211>7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0323b
<400> 103
Arg Asp Asp Lys Arg Pro Ser
5
< 210 > 104
<211>9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0323b
<400> 104
SerSerGlnAspThrValThrArgVal
5
<210> 105
<211> 22
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0323b
<400> 105
SerTyrGluLeuThrGlnProProSerValSerValSerProGlyGln 5 10 15
ThrAlaSerlie ThrCys
20
<210> 106
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0323b
<400> 106
TrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnSerProValLeuVallie Tyr 5 10 15 <210> 107
<211> 32
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0323b
<400> 107
GlyValProGluArgPheSerAlaSerAsnSerGlyHisThrAlaThr 5 10 15
LeuThrlie SerGlyThrGlnAlaThrAspGluAlaAspTyrTyrCys 20 25 30 <210> 108
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0323b
< 400 > 108
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu lie Val Leu
5 10
<210> 109
<211> 375
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0328
<400> 109
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggcttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccagaga ccccttcaaggcggacacta tgtggtgggt ccgccaggct 120 ccaaggaaga ggctggagtg ggtctcagtt attggtgccc acaccaccaa cagcgcgtac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatctccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagagtgg 300 atggaccgct cccgccccta ctactactac ggtatggacg tctgggggca ggggaccctg 360
gtcaccgtct cctca 375
<210> 110
<211> 125
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0328
<400> 110
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Asp Pro Phe Lys Ala Asp
20 25 30
Thr Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Arg Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val lie Gly Ala His Thr Thr Asn Ser Ala Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Trp Met Asp Arg Ser Arg Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met
100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 111
<211>5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0328
< 400 > 111
AlaAspThrMetTrp
5
<210> 112
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0328
<400> 112
Vallie GlyAlaHls ThrThrAsnSerAlaTyrAlaAspSerValLys 5 10 15
G1Y
<210> 113
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0328
<400> 113
GluTrpMetAspArgSerArgProTyrTyrTyrTyrGlyMetAspVal 5 10 15 <210> 114
<211> 30
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0328
<400> 114
GluValGlnLeuLeuGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGly 5 10 15 SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerArgAspProPheLys
20 25 30 <210> 115
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0328
<400> 115
TrpValArgGlnAlaProArgLysArgLeuGluTrpValSer
5 10
<210> 116
<211> 32
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0328
<400> 116
Figure imgf000118_0001
<210> 117
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0328
<400> 117
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
5 10
<210> 118
<211> 318
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0328
<400> 118
tcgtacgagt tgactcagcc accctcagtg tccgtgtccc caggacagac ggtcagcatc 60
acctgctctg gacgtaactt ggaagataaa tttgcttcct ggtatcaaca gaagccaggc 120
cagtcccctg tcctggtcat ctatcgagat gacaagcggc cctcaggggt ccctgagcga 180 ttctctgcct ccaactccgg gcacactgcc actctgacca tcagcgggac ccaggctacg 240
gatgaggctg actattactg ttcgtcccag gacacggtga ctcgagtgtt cggcggaggg 300 accaagctga ccgtccta 318 <210> 119
<211> 106
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0328
<400> 119
GlnProProSerValSerValSerProGlyGln
10 15
CysSerGlyArgAsnLeuGluAspLysPheAla 25 30
Figure imgf000119_0001
<210> 120
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0328
<400> 120
SerGlyArgAsnLeuGluAspLysPheAlaSer
5 10
<210> 121
<211>7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0328
<400> 121
ArgAspAspLysArgProSer
5
<210> 122
<211>9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0328
<400> 122
SerSerGlnAspThrValThrArgVal
5
<210> 123
<211> 22
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0328
< 400 > 123
Ser TyrGlu Leu ThrGln Pro Pro SerVal Ser Val Ser Pro Gly Gln 5 10 15
Thr Val Ser lie Thr Cys
20
<210> 124
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0328
<400> 124
Trp Tyr GlnGln Lys Pro Gly Gln SerPro Val LeuVal lie Tyr 5 10 15 <210> 125
<211> 32
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0328
<400> 125
Gly Val Pro GluArg Phe SerAla Ser Asn Ser Gly His ThrATa Thr 5 10 15 Leu Thr lie Ser Gly ThrGln Ala Thr Asp GluAla Asp Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 126
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0328
<400> 126
Phe Gly GlyGly Thr Lys Leu ThrVal Leu
5 10
<210> 127
<211> 375
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0329
<400> 127
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctacgtt taacctcaag cgcgagacta tgtggtgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctccgtt attggttccc accaggagcg cacgagctac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagagtgg 300
atggaccact cccgccccta ctactactac ggtatggacg tctgggggca ggggaccctg 360
gtcaccgtct cctca 375
<210> 128
<211> 125
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0329
<400> 128
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Thr Phe Asn Leu Lys Arg Glu
20 25 30
Thr Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val lie Gly Ser His Gln Glu Arg Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
AsnSer Lys Asn Thr LeuTyr
Figure imgf000121_0001
AspThr Ala Val Tyr TyrCys
Ala Arg Glu Trp Met Asp His Ser Arg Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met
100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 129
<211>5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0329
<400> 129
Arg Glu Thr Met Trp
5
<210> 130
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0329
<400> 130
Vallie GlySerHlsGlnGluArgThrSerTyrAlaAspSerValLys 5 10 15
Gly
<210> 131
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0329
<400> 131
GluTrpMetAspHisSerArgProTyrTyrTyrTyrGlyMetAspVal
Figure imgf000122_0001
<210> 133
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0329
<400> 133
TrpValArgGlnAlaProGly LysGlyLeuGluTrpValSer
5 10
<210> 134
<211> 32
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0329
<400> 134
Figure imgf000122_0002
<210> 135
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0329
<400> 135
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
5 10
<210> 136
<211> 318
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0329
<400> 136
tcgtacgagt tgactcagcc accctcagtgtccgtgtccc caggacagac ggccagcatc 60 acctgctctg gacataacgt gagcgacaagtggatgacgt ggtatcagca gaagccaggc 120 cagtcccctg tcctggtcat ctatcgagatgacaagcggc cctcagggat ccctgagcga 180 ttctctgcct ccaactctgg gcacactgccactctgacca tcagcgggac ccaagctacg 240 gatgaggctg actattactg ttcgtcccag gacacggtga ctcgagtgtt cggcggaggg 300 accaagctga ccgtccta 318 <210> 137
<211> 106
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0329
<400> 137
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
5 10 15
Thr Ala Ser lie Thr Cys Ser Gly His Asn Val Ser Asp Lys Trp Met
20 25 30
Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val lie Tyr
35 40 45
Arg Asp Asp Lys Arg Pro Ser Gly lie Pro Glu Arg Phe Ser Ala Ser
50 55 60
Asn Ser Gly His Thr Ala Thr Leu Thr lie Ser Gly Thr Gln Ala Thr
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Gln Asp Thr Val Thr Arg Val
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 138
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0329
<400> 138
SerGlyHisñsnValSerñspLysTrpMetThr
5 10
<210> 139
<211>7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0329
<400> 139
ArgAspAspLysArgProSer
5
<210> 140
<211>9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0329
<400> 140
SerSerGlnAspThrValThrArgVal
5
<210> 141
<211> 22
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0329
<400> 141
SerTyrGluLeuThrGTnProProSerVaTSerVaTSerProGTyGTn 5 10 15
ThrAlaSerlie ThrCys
20
<210> 142
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0329
<400> 142
TrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnSerProValLeuVallie Tyr 5 10 15 <210> 143
<211> 32
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0329
<400> 143
Gly lie Pro Glu Arg Phe Ser Ala Ser Asn Ser Gly His Ihr Ala Ihr
5 10 15
Leu Thr lie Ser Gly Thr Gln Ala Thr Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 144
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0329
<400> 144
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
5 10
<210> 145
<211> 375
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0332
<400> 145
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggagtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctcttccga ctcctggcac accgacatta tgtggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaaga ggctggagtg ggtctcagtt attggtaact cgaacaagaa gatcgcctac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagagtgg 300 atggaccact cccgccccta ctactactac ggtatggacg tctgggggca ggggaccctg 360 gtcaccgtct catea 375 <210> 146
<211> 125
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0332
<400> 146
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Glu 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Ser Asp Ser Trp His Thr Asp 20 25 30
lie Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Val lie Gly Asn Ser Asn Lys Lys lie Ala Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Glu Trp Met Asp His Ser Arg Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met 100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 147
<211>5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0332
<400> 147
Thr Asp lie Met Trp
5
<210> 148
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0332
<400> 148
Val lie Gly Asn Ser Asn Lys Lys lie Ala Tyr Ala Asp Ser Val Lys 5 10 15
G1y
<210> 149
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0332
<400> 149
Glu Trp Met Asp His Ser Arg Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val 5 10 15
<210> 150
<211> 30
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0332
<400> 150
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Glu 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Ser Asp Ser Trp His
20 25 30 <210> 151
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0332
<400> 151
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Val Ser
5 10
<210> 152
<211> 32
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0332
<400> 152
Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 5 10 15 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 153
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0332
<400> 153
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
5 10
<210> 154
<211> 318
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0332
<400> 154
tcgtacgagt tgactcagcc accctcagtg tccgtgtccc cagggcagac ggccagcatc 60 acctgctctg gacataacat cggcgcgaag tgggtgagct ggtatcaaca gaagccaggc 120 cagtcaccta tcctggtcat ctatcgagat gacaagcggc cctcagggat ccctgagcga 180 ttctctgcct ccaactctgg gcacactgcc actctgacca tcagcgggac ccaggctacg 240 gatgaggctg actattactg tcaggcgcag ggccaggtga ccaggtcgtt eggeggaggg 300 accaagctga ccgtccta 318 <210> 155
<211> 106
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0332
<400> 155
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Glr
5 10 15
Thr Ala Ser lie Thr Cys Ser Gly His Asr lie Gly Ala Lys Trp Val
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln S€ Pro lie Leu Val lie Tyr
35 40 45
Arg Asp Asp Lys Arg Pro Ser Gly lie Pro Glu Arg Phe Ser Ala S e
50 55 60
Asn Ser Gly His Thr Ala Thr Leu Thr lie Ser Gly Thr Gln Ala Thr
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Gln Gly Gln Val Thr Arg S e
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 156
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0332
<400> 156
Ser Gly His Asn lie Gly Ala Lys Trp Val Ser
5 10
<210> 157
<211>7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0332
<400> 157
Arg Asp Asp Lys Arg Pro Ser
5
<210> 158
<211>9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0332
<400> 158
GlnAlaGlnGlyGlnValThrñrgSer
5
<210> 159
<211> 22
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0332
<400> 159
SerTyrGluLeuThrGlnProProSerValSerValSerProGlyGln 5 10 15 ThrAlaSerlie ThrCys
20
<210> 160
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0332
<400> 160
TrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnSerProlie LeuVallie Tyr 5 10 15 <210> 161
<211> 32
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0332
<400> 161
Glylie ProGluArgPheSerAlaSerAsnSerGlyHisThrAlaThr 5 10 15
LeuThrlie SerGlyThrGlnAlaThrAspGluAlaAspTyrTyrCys 20 25 30 <210> 162
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0332
< 400 > 162
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
5 10
<210> 163
<211> 375
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0342
<400> 163
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc etggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cgactttcgc aggtccgtca tgtggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagtt attggtgccc agacccagaa caaggcgtac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagagtgg 300 atggaccact cccgccccta ctactactac ggtatggacg tctgggggca ggggaeeetg 360 gtcaccgtct cctca 375 <210> 164
<211> 125
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0342
<400> 164
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Arg Arg Ser
20 25 30
Val Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val lie Gly Ala Gln Thr Gln Asn Lys Ala Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Trp Met Asp His Ser Arg Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met
100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 165
<211>5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
< 220 >
< 223 > A be t0342
< 400 > 165
ArgSerValMetTrp
5
<210> 166
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0342
<400> 166
Vallie GlyAlaGlnThrGlnAsnLysAlaTyrAlaAspSerValLys 5 10 15 G1v
<210> 167
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0342
<400> 167
GluTrpMetAspHisSerArgProTyrTyrTyrTyrGlyMetAspVal 5 10 15 <210> 168
<211> 30
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0342
<400> 168
GluValGlnLeuLeuGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGly 5 10 15
SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheAspPheArg
20 25 30 <210> 169
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0342
<400> 169
TrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal Ser
5 10
<210> 170
<211> 32
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0342
<400> 170
Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
5 10 15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 171
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0342
<400> 171
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
5 10
<210> 172
<211> 318
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0342
<400> 172
tcgtacgagt tgactcagcc accctcagtgtccgtgtccc caggacagacggccagcatc 60 acctgctctg gacataactt ggaagataaatttgcttcct ggtatcaacagaagccaggc 120 cagtcccccg tcctggtcat ctatcgggatgacaagcggc cctcagggatccctgagcga 180 ttctctgcct ccaactctgg ggacactgccactctgacca tcagcgggacccaggctatg 240 gatgaggctg actattactg tcaggcgcag gacagtacca ctcgagtgtt cggcggaggg 300 actaagctga ccgtccta 318 <210> 173
<211> 106
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0342
<400> 173
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 5 10 15
Thr Ala Ser lie Thr Cys Ser Gly His Asn Leu Glu Asp Lys Phe Ala 20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val lie Tyr 35 40 45
Arg Asp Asp Lys Arg Pro Ser Gly lie Pro Glu Arg Phe Ser Ala Ser 50 55 60
Asn Ser Gly Asp Thr Ala Thr Leu Thr lie Ser Gly Thr Gln Ala Met 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Gln Asp Ser Thr Thr Arg Val 85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 174
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0342
<400> 174
Ser Gly His Asn Leu Glu Asp Lys Phe Ala Ser
5 10
<210> 175
<211>7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0342
<400> 175
Arg Asp Asp Lys Arg Pro Ser
5
<210> 176
<211>9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0342
<400> 176
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5
<210> 177
<211> 22
<212> PRT
<213> Homo sapiens
< 220 >
< 223 > A be t0342
< 400 > 177
Ser TyrGlu Leu ThrGln Pro Pro SerVal Ser Val Ser Pro Gly Gln 5 10 15
Thr Ala Ser lie Thr Cys
20
<210> 178
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0342
<400> 178
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<211> 32
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0342
<400> 179
Gly lie Pro GluArg Phe SerAla SerAsn Ser GlyAsp ThrATa Thr 5 10 15 Leu Thr lie Ser Gly ThrGln Ala MetAsp GluAla Asp Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 180
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0342
<400> 180
Phe Gly GlyGly Thr Lys Leu ThrVal Leu
5 10
<210> 181
<211> 375
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0343
<400> 181
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<211> 125
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0343
<400> 182
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Phe Asn His Gln
20 25 30
Val Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val lie Gly Lys Thr Asn Glu Asn lie Ala Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Trp Met Asp His Ser Arg Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met
100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 183
<211>5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0343
<400> 183
His Gln Val Met Trp
5
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<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0343
<400> 184
Val lie Gly Lys Thr Asn Glu Asn lie Ala Tyr Ala Asp Ser Val Lys 5 10 15 Gly
<210> 185
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0343
<400> 185
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<211> 30
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0343
<400> 186
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Phe Asn
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<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0343
<400> 187
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5 10
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0343
<400> 188
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0343
<400> 189
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
5 10
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<220>
<223> Abet0343
<400> 190
cagagcgtct tgactcagcc accctcagtgtccgtgtccc caggacagac ggccagcatc 60 acctgctctg gacataactt ggaagataaatttgcttcct ggtatcaaca gaagtcaggc 120 cagtcccctg tcctggtcat ctatcgagatgacaagcggc cctcagggat ccctgagcga 180 ttctctgcct ccaactctgg gcacactgccactctgacca tcagcgggac ccaggctacg 240 gatgaggctg actattactg ttcgtcccag gacacggtga ctcgagtgtt cggcggaggg 300 accaagctga ccgtccta 318 <210> 191
<211> 106
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0343
<400> 191
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Thr Ala Ser lie Thr Cys Ser Gly His Asn Leu Glu Asp Lys Phe Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln Ser Pro Val Leu Val lie Tyr
35 40 45
Arg Asp Asp Lys Arg Pro Ser Gly lie Pro Glu Arg Phe Ser Ala Ser
50 55 60
Asn Ser Gly His Thr Ala Thr Leu Thr lie Ser Gly Thr Gln Ala Thr
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Gln Asp Thr Val Thr Arg Val
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
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<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
< 220 >
< 223 > A b e t0343
< 400 > 192
SerGlyHisAsnLeuGluAspLysPheAlaSer
5 10
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<211>7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0343
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5
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<211>9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0343
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5
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<211> 22
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0343
<400> 195
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20
<210> 196
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0343
<400> 196
TrpTyrGlnGlnLysSerGly SerProVal LeuVallie Tyr 5 10 15 <210> 197
<211> 32
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0343
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Gly lie Pro Glu Arg Phe Ser Ala Ser Asn Ser Gly His Ihr Ala Ihr
5 10 15
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20 25 30
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<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0343
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5 10
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<211> 375
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0344
<400> 199
gaggtgcagc tattggagtc tgggggaggc ttggtacagc etggggggtc cctgagtctc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc gtttatacta tgtggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagtt attggtggga acgagacccg gaaggcctac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagggaca attccaagaa caggctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagagtgg 300 atggaccact cccgccccta ctactactac ggtatggacg tctgggggca ggggaeeetg 360 gtcaccgtct cctca 375 <210> 200
<211> 125
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0344
<400> 200
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
5 10 15
Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Val Tyr 20 25 30
Thr Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Val lie Gly Gly Asn Glu Thr Arg Lys Ala Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly ArgPhe Thr lie SerArg Asp Asn Ser LysAsn Arg Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln MetAsn Ser Leu ArgAla Glu Asp Thr AlaVal Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Glu Trp Met Asp His Ser Arg Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met 100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 201
<211>5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0344
<400> 201
Val Tyr Thr Met Trp
5
<210> 202
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0344
<400> 202
Val lie Gly Gly Asn Glu Thr Arg Lys Ala Tyr Ala Asp Ser Val Lys 5 10 15
G1y
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<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0344
<400> 203
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<211> 30
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<213> Homo sapiens
< 220 >
< 223 > A b e t0344
< 400 > 204
GluValGlnLeuLeuGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGly 5 10 15
SerLeuSerLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSer
Figure imgf000141_0001
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0344
<400> 205
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5 10
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<211> 32
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0344
<400> 206
Figure imgf000141_0002
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<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0344
<400> 207
TrpGlyGlnGlyThrLeuValThrVal SerSer
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<220>
<223> Abet0344
<400> 208
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0344
<400> 209
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5 10 15
Thr Ala Ser lie Thr Cys Ser Gly His Asn Leu Glu Asp Lys Phe Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln Ser Pro Val Leu Val lie Tyr
35 40 45
Arg Asp Asp Lys Arg Pro Ser Gly lie Pro Glu Arg Phe Ser Ala Ser
50 55 60
Asn Ser Gly HisThr Ala Thr Leu Thr lie SerGly Thr GlnAla Thr
65 70 75 80
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85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
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<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0344
<400> 210
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5 10
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<211>7
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<220>
<223> Abet0344
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<211>9
<212> PRT
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<220>
<223> Abet0344
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<220>
<223> Abet0344
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0344
<400> 214
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<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0344
<400> 215
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<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0344
< 400 > 216
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
5 10
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<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0368
<400> 217
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttagtacagc egggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cgactttggg ccgagcccta tgtggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagtt attggtaagg acacccagaa cagcacgtac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagga cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgaa agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagagtgg 300 atggaccact cccgccccta ctactactac ggtatggacg tctgggggca ggggaeeetg 360 gtcaccgtct cctca 375 <210> 218
<211> 125
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0368
<400> 218
Pro Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val lie Gly Lys Asp Thr Gln Asn Ser Thr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asp Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Trp Met Asp His Ser Arg Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met
100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 219
<211>5
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< 220 >
< 223 > A b e t0368
< 400 > 219
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<220>
<223> Abet0368
<400> 220
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G1y
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<223> Abet0368
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<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0368
<400> 222
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<223> Abet0368
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<223> Abet0368
<400> 224
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20 25 30
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<223> Abet0368
<400> 225
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<212> ADN
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<223> Abet0368
<400> 226
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<211> 106
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0368
<400> 227
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20 25 30
Figure imgf000147_0001
<210> 228
<211> 11
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<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0368
<400> 228
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<223> Abet0368
<400> 229
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<211>9
<212> PRT
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<223> Abet0368
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<211> 22
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<213> Homo sapiens
<220>
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SerTyrGluLeuThrGlnProProSerValSerValSerProGlyGln
5 10 15
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20
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5 10 15
<210> 233
<211> 32
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0368
<400> 233
Glylie Pro Glu ArgPhe SerAlaSerAsnSerGlyHisThrAlaThr 5 10 15
LeuThrlie SerGlyAlaGlnAla ThrAspGluAlaAspTyrTyrCys
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<210> 234
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0368
<400> 234
rValLeu
<210> 235
<211> 375
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0369
<400> 235
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ctggtacagc etggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctcttcgtt ccagatctcg aagaacacta tgtggtgggt ccgccgggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagtt attggtaagg acgagacccg cttcaactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa caccctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagagtgg 300
atggaccact cccgccccta ctactactac ggtatggacg tctgggggca ggggaeeetg 360
gtcaccgtct cctca 375
<210> 236
<211> 125
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0369
<400> 236
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Ser Phe Gln lie Ser Lys Asn
20 25 30
Thr Met Trp Trp Val Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp VaT
35 40 45
Ser Val lie Gly Lys Asp Glu Thr Arg Phe Asn Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
r Lys Asn Thr LeuTyr
Leu Gln MetAsn Ser Leu ArgAla GluAsp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Trp Met Asp Hls Ser Arg Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met
100 105 110
Asp Val Trp GTy GTn GTy Thr Leu VaT Thr VaT Ser Ser
115 120 125
<210> 237
<211>5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0369
<400> 237
Lys Asn Thr Met Trp
5
<210> 238
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0369
<400> 238
Vallie GlyLysAspGluThrArgPheAsnTyrAlaAspSerValLys 5 10 15
Gly
<210> 239
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0369
<400> 239
GluTrpMetAspHisSerArgProTyrTyrTyrTyrGlyMetAspVal 5 10 15 <210> 240
<211> 30
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0369
<400> 240
Figure imgf000150_0001
<210> 241
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0369
<400> 241
TrpValArgArgAlaProGly LysGlyLeuGluTrpValSer
5 10
<210> 242
<211> 32
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0369
<400> 242
Figure imgf000150_0002
<210> 243
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0369
<400> 243
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
5 10
<210> 244
<211> 318
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0369
<400> 244
tcgtacgggt tgactcagcc accctcagtg tccgtgtccc caggacagac ggccagcatc 60 acctgctctg gacgtaacat eggggaeagc: tgggtcgcgt ggtatcaaca gaagccaggc 120 cagtcccctg tcctggtcat ctatcgagat gacaagcggc cctcagggat ccctgagcga 180 ttctctgcct ccaactctgg gcacactgcc actctgacca tcagcgggac ccaggctacg 240 gatgaggctg actattactg ttcgtcccag gacacggtga ctcgagtgtt eggeggaggg 300 accaagctga ccgtccta 318 <210> 245
<211> 106
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0369
<400> 245
Ser Tyr Gly Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
5 10 15
Thr Ala Ser lie Thr Cys Ser Gly Arg Asn lie Gly Asp Ser Trp Val
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val lie Tyr
35 40 45
Arg Asp Asp Lys Arg Pro Ser Gly lie Pro Glu Arg Phe Ser Ala Ser
50 60
Asn Ser Gly His Thr Ala Thr Leu Thr lie Ser Gly Thr Gln Ala Thr
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Gln Asp Thr Val Thr Arg Val
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 246
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0369
<400> 246
SerGlyArgAsnlie GlyAspSerTrpValAla
5 10
<210> 247
<211>7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0369
<400> 247
ArgAspAspLysArgProSer
5
<210> 248
<211>9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0369
<400> 248
SerSerGlnAspIhrValIhr ArgVal
5
<210> 249
<211> 22
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0369
<400> 249
Serlyr GlyLeuIhr GlnProProSerValSerValSerProGlyGln 5 10 15
Ihr AlaSerlie Ihr Cys
20
<210> 250
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0369
<400> 250
Irp lyr GlnGlnLysProGlyGlnSerProValLeuVallie lyr 5 10 15 <210> 251
<211> 32
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0369
<400> 251
Gly lie Pro Glu Arg Phe Ser Ala Ser Asn Ser Gly His Ihr Ala Ihr
5 10 15
Leu Thr lie Ser Gly Thr Gln Ala Thr Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 252
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0369
<400> 252
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
5 10
<210> 253
<211> 375
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0370
<400> 253
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc etggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt ccactttccc atgagcgcca tgtggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagtc attggtgaga ccccggagag gcaggcctac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagag cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagagtgg 300 atggaccact cccgccccta ctactactac ggtatggacg tctgggggca ggggaeeetg 360 gtcaccgtct cctca 375 <210> 254
<211> 125
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0370
<400> 254
Figure imgf000154_0001
<210> 255
<211>5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0370
<400> 255
MetSerAlaMetTrp
5
<210> 256
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0370
<400> 256
Vallie GlyGluThrProGluArqGlnAlaTyrAlaAspSerValLys 5 10 15
Gly
<210> 257
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0370
<400> 257
GluIrp MetAspHisSerArgProlyrlyr lyr lyr GlyMetAspVal 5 10 15 <210> 258
<211> 30
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0370
<400> 258
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe His Phe Pro
20 25 30 <210> 259
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0370
<400> 259
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
5 10
<210> 260
<211> 32
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0370
<400> 260
Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ser Thr Leu Tyr Leu Gln 5 10 15 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 261
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0370
<400> 261
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
5 10
<210> 262
<211> 318
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0370
<400> 262
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<211> 106
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0370
<400> 263
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
5 10 15
Thr Ala Ser lie Thr Cys Thr Thr Pro His Phe Asn Ser Lys Phe Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val lie Tyr
35 40 45
Arg Asp Asp Lys Arg Pro Ser Gly lie Pro Glu Arg Phe Ser Ala Ser
50 55 60
Asn Ser Gly His Thr Ala Thr Leu Thr lie Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Gln Asp Ser Thr Thr Arg Val
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 264
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0370
<400> 264
Thr Thr Pro His Phe Asn Ser Lys Phe Aia Ser
5 T0
<210> 265
<211>7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0370
<400> 265
Arg Asp Asp Lys Arg Pro Ser
5
<210> 266
<211>9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0370
<400> 266
GlnAlaGlnAspSerThrThrArgVal
5
<210> 267
<211> 22
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0370
<400> 267
SerTyrGluLeuThrGlnProProSerValSerValSerProGlyGln 5 10 15
ThrAlaSerlie ThrCys
20
<210> 268
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0370
<400> 268
TrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnSerProValLeuVallie Tyr 5 10 15 <210> 269
<211> 32
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0370
<400> 269
Glylie ProGluArgPheSerAlaSerAsnSerGlyHlsThrAlaThr 5 10 15
LeuThrlie SerGlyThrGlnAlaMetAspGluAlaAspTyrTyrCys 20 25 30 <210> 270
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0370
< 400 > 270
Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu
5 10
<210> 271
<211> 375
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0371
<400> 271
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<211> 125
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0371
<400> 272
Figure imgf000158_0001
Ala Arg Glu Trp Met Asp His Ser Arg Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met
100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 273
<211>5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0371
< 400 > 273
PheAspThrMetTrp
5
<210> 274
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0371
<400> 274
Vallie GlySerSerGlyGlyThrThrVal TyrAlaAspSerValLys 5 10 15 G1v
<210> 275
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0371
<400> 275
GluTrpMetAspHisSerArgProTyrTyrTyrTyrGTyMetAspVaT 5 TO T5 <210> 276
<211> 30
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0371
<400> 276
GluValGlnLeuSerGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGly 5 10 15 SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerHisAspAlaPhePro
20 25 30 <210> 277
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0371
<400> 277
TrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal Ser
5 10
<210> 278
<211> 32
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0371
<400> 278
Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
5 10 15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 279
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0371
<400> 279
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
5 10
<210> 280
<211> 318
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0371
<400> 280
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<211> 106
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0371
<400> 281
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 5 10 15
Thr Ala Ser lie Thr Cys Ser Gly His Asn lie Ser Ser Ser Trp Val 20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val lie Tyr 35 40 45
Arg Asp Asp Lys Arg Pro Ser Gly lie Pro Glu Arg Phe Ser Ala Ser 50 55 60
Asn Ser Gly His Thr Ala Thr Leu Thr lie Ser Gly Thr Gln Ala Thr 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Gln Asp Thr Val Thr Arg Val
90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 282
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0371
<400> 282
Ser Gly His Asn lie Ser Ser Ser Trp Val Ser
5 10
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<211>7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0371
<400> 283
Arg Asp Asp Lys Arg Pro Ser
5
<210> 284
<211>9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0371
<400> 284
Ser Ser Gln Asp Thr Val Thr Arg Val
5
<210> 285
<211> 22
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0371
< 400 > 285
Ser TyrGlu Leu ThrGln Pro Pro SerVal Ser Val Ser Pro Gly Gln 5 10 15 Thr Ala Ser lie Thr Cys
20
<210> 286
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0371
<400> 286
Trp Tyr GlnGln Lys Pro Gly Gln SerPro Val LeuVal lie Tyr 5 10 15 <210> 287
<211> 32
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0371
<400> 287
Gly lie Pro GluArg Phe SerAla SerAsn Ser GlyHis Thr Ala Thr 5 10 15 Leu Thr lie Ser Gly ThrGln Ala Thr Asp GluAla Asp Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 288
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0371
<400> 288
Phe Gly GlyGly Thr Lys Leu ThrVal Leu
5 10
<210> 289
<211> 375
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0372
<400> 289
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<211> 125
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0372
<400> 290
Figure imgf000163_0001
<210> 291
<211>5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0372
<400> 291
lie Glu Thr Met Trp
5
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0372
<400> 292
Vallie GlyLysGlyMetAsnAsnValSerTyrAlaAspSerValLys 5 10 15
Gly
<210> 293
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<212> PRT
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<220>
<223> Abet0372
<400> 293
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<211> 30
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0372
<400> 294
Figure imgf000164_0001
<210> 295
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0372
<400> 295
TrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal Ser
5 10
<210> 296
<211> 32
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0372
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Figure imgf000164_0002
<210> 297
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0372
<400> 297
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<212> ADN
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<223> Abet0372
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<211> 106
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0372
<400> 299
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
5 10 15
Thr Ala Ser lie Thr Cys Ser Gly His Asn Leu Glu Asp Lys Phe Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val lie Tyr
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Arg Asp Asp Lys Arg Pro Ser Gly lie Pro Glu Arg Phe Ser Ala Ser
50 55 60
Asn Ser Gly His Thr Ala Thr Leu Thr lie Ser Gly Thr Gln Ala Thr
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Gln Asp Thr Val Thr Arg Val
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 300
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
< 220 >
<223> Abet0372
<400> 300
SerGlyHisAsnLeuGluAspLysPheAlaSer
5 10
<210> 301
<211>7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0372
<400> 301
ArgAspAspLysArgProSer
5
<210> 302
<211>9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0372
<400> 302
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5
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<211> 22
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0372
<400> 303
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20
<210> 304
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0372
<400> 304
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<211> 32
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0372
<400> 305
5 10 15
Leu Thr lie Ser Gly Thr Gln Ala Thr Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 306
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0372
<400> 306
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<211> 125
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0373
<400> 308
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Asp Phe Glu Arg Ser
20 25 30
Val Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val lie Gly Ser Gly Lys Thr Asn lie Thr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
AsnSerLysAsn Thr LeuTyr
Figure imgf000168_0001
AspThrAla Val Tyr TyrCys
Ala Arg Glu Trp Met Asp His Ser Arg Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met
100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
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<211>5
<212> PRT
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<220>
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<400> 309
Arg Ser Val Met Trp
5
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<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0373
<400> 310
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5 10 15
G1y
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<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0373
<400> 311
Glu Trp Met Asp His Ser Arg Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
5 10 15
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<211> 30
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0373
<400> 312
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Asp Phe Glu
20 25 30 <210> 313
<211> 14
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<211> 32
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<211> 11
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<211> 106
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<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0373
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5 10 15
Thr Ala Ser lie Thr Cys Ser Gly His Asn Leu Glu Asp Lys Phe Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln S€ Pro Val Leu Val lie Tyr
35 40 45
Arg Asp Asp Lys Arg Pro Ser Glu lie Pro Glu Arg Phe Ser Ala Ser
50 55 60
Asn Ser Gly His Thr Ala Thr Leu Thr lie Ser Gly Thr Gln Ala Thr
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Gln Asp Thr Val Thr Arg Val
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
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<211> 11
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Ser Gly His Asn Leu Glu Asp Lys Phe Ala Ser
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SerTyrGluLeuThrGlnProProSerValSerValSerProGlyGln 5 10 15 ThrAlaSerlie ThrCys
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<400> 325
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<211> 125
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0374
<400> 326
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Gln Phe Lys Asp Thr
20 25 30
Pro Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val lie Gly Asp Gln Asn His Lys Lys Ala Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Trp Met Asp His Ser Arg Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met
100 105 110
Asp Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
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<211>5
<212> PRT
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5
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Gly
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<220>
<223> Abet0374
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35 40 45
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115 120 125
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<211>5
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Gly
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50 55 60
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0378
<400> 362
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Phe Glu Thr Asp 20 25 30
lie Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Val lie Gly Thr Asn Thr Asp Asn Val Ala Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Glu Trp Met Asp His Ser Arg Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met 100 105 110
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115 120 125
<210> 363
<211>5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0378
<400> 363
Thr Asp lie Met Trp
5
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0378
<400> 364
Val lie Gly Thr Asn Thr Asp Asn Val Ala Tyr Ala Asp Ser Val Lys 5 10 15
G1y
<210> 365
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0378
<400> 365
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<211> 30
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0378
<400> 366
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Ser Leu ñrg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Phe Glu
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<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0378
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5 10
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0378
<400> 368
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0378
<400> 369
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5 10
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<223> Abet0378
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acctgctctg gacataactt ggaagataaa tttgcttcct ggtatcaaca gaagccaggc 120
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ttctctgcct ccaactctgg gcacactgcc actctgacca tcagcgggac ccaggctacg 240
gatgaggctg actattactg ctcgtcctag gacacggtga ctcgggtgtt cggcggaggg 300
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5 10 15
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20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val lie Tyr
35 40 45
Arg Asp Asp Lys Arg Pro Ser Gly lie Pro Glu Arg Phe Ser Ala Ser
50 55 60
Asn Ser Gly His Thr Ala Thr Leu Thr lieSer Gly Thr Gln AlaThr 65 70 75 80
TerAsp Thr Val Thr ArgVal
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
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<400> 372
Ser Gly His Asn Leu Glu Asp Lys Phe Ala Ser
5 10
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<211>7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
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<223> Abet0378
<400> 373
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<220>
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<220>
<223> Abet0378
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<223> Abet0378
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<211> 375
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<211> 125
<212> PRT
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<220>
<223> Abet0379
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5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ala Glu Thr
20 25 30
Pro Leu Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val lie Gly Ser Asn Gln Asn Lys Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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115 120 125
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<212> PRT
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< 220 >
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<220>
<223> Abet0379
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Gly
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<220>
<223> Abet0379
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<220>
<223> Abet0379
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5 10
< 210> 386
<211> 32
<212> PRT
<213> Homo sapiens
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<223> Abet0379
<400> 386
Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asp Thr Leu Tyr Leu Gln
5 10 15
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Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
5 10
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<211> 318
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<223> Abet0379
<400> 388
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accaagctga ccgtccta 318 <210> 389
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<400> 389
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<212> PRT
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<212> PRT
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<220>
<223> Abet0379
<400> 393
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<220>
<223> Abet0379
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<223> Abet0379
<400> 395
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<220>
<223> Abet0379
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<213> Homo sapiens
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5 10 15
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Gly
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<400> 403
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Figure imgf000192_0002
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<400> 405
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<223> Abet0380
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<400> 413
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<223> Abet0380
<400> 414
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<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0381
<400> 416
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Ser Val lie Gly Thr Gln Pro Asn Arg Leu Thr Tyr ATa Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg ATa GTu Asp Thr ATa VaT Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Glu Trp Met Asp His Ser Arg Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Gly lie 100 105 110
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<220>
<223> Abet0381
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<220>
<223> Abet0381
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Gly
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0381
<400> 419
Glu Trp Met Asp Hls Ser ñrg Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Gly lie Asp Val 5 10 15
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<211> 30
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<213> Homo sapiens
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<223> Abet0381
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<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0381
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5 10
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<211> 32
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0381
<400> 422
ArgPheThrlie SerArgAspAsnSerLysAsnThrLeuTyrLeuGln 5 10 15
MetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCysAlaArg 20 25 30 <210> 423
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0381
<400> 423
TrpGlyGlnGlyThrLeuValThrVal SerPro
5 10
<210> 424
<211> 318
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0381
<400> 424
tcgtacgagt tgactcagcc accctcagtg tccgcgtccc caggacagac ggccagcatc 60
acctgctctg gacataactt ggaagataaa tttgtttcct ggtatcaaca gaagccaggc 120
cagtcccctg tcctggtcat ctatcgagat gacaagcgac cctcagggat ccctgagcga 180
ttctctgcct ccaactctgg gcacactgcc actctgacca tcagcgggac ccaggctacg 240
gatgaggcta actattactg ttcgtcccag gacacggtga ctcgagcgtt oggoggaggg 300
accaagctga ccgtccta 318
<210> 425
<211> 106
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0381
<400> 425
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ser Pro Gly Gln
5 10 15
Thr Ala Ser lie Thr Cys Ser Gly His Asn Leu Glu Asp Lys Phe Val
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val lie Tyr
35 40 45
Arg Asp Asp Lys Arg Pro Ser Gly lie Pro Glu Arg Phe Ser Ala Ser
50 55 60
Asn Ser Gly His Thr Ala Thr Leu Thr lieSer Gly Thr Gln AlaThr 65 70 75 80
GlnAsp Thr Val Thr ArgAla
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 426
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0381
<400> 426
Ser Gly His Asn Leu Glu Asp Lys Phe Val Ser
5 10
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<211>7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0381
<400> 427
Arg Asp Asp Lys Arg Pro Ser
5
<210> 428
<211>9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0381
<400> 428
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5
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<211> 22
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0381
<400> 429
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20
<210> 430
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0381
<400> 430
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<211> 32
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0381
<400> 431
Glylie ProGluArgPheSerAlaSerAsnSerGlyHisThrAlaThr 5 10 15 LeuThrlie SerGlyThrGlnAlaThrAspGluAlaAsnTyrTyrCys 20 25 30 <210> 432
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0381
< 400 > 432
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
5 10
<210> 433
<211> 375
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0382
<400> 433
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<211> 125
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0382
<400> 434
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe His Phe Thr Asn Ser
20 25 30
lie Met Irp Irp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val lie Gly Ser Glu Ala His Arg Val Thr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Trp Met Asp His Ser Arg Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met
100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 435
<211>5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0382
< 400 > 435
AsnSerlie MetTrp
5
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<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0382
<400> 436
Vallie GlySerGluAlaHisArgVal ThrTyrAlaAspSerValLys 5 10 15 Gly
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0382
<400> 437
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0382
<400> 438
GluValGlnLeuLeuGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGly 5 10 15
SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheHisPheThr
20 25 30 <210> 439
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0382
<400> 439
TrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal Ser
5 10
<210> 440
<211> 32
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0382
<400> 440
Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
5 10 15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
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<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0382
<400> 441
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
5 10
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<211> 318
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0382
<400> 442
tcgtacgagt tgattcagcc accctcagtg tccgtgtccc caggacagac agccagcatc 60 acctgctctg gacataactt ggaagataaa tttgcttcct ggtatcaaca gaagccaggc 120 cagtcccctg tcctggtcat ctatcgagat gacaagcggc cctcagggat ccctgagcga 180 ttctctgcca ccaactctgg gcacactgcc actctgacca tcagcgggac ccaggctacg 240 gatgaggctg actattactg ttcgtcccag gactcggtga ctcgagtgtt eggeggaggg 300 accaagctga ccgtccta 318 <210> 443
<211> 106
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0382
<400> 443
GlnProProSerValSerValSerProGlyGln
10 15
CysSerGlyHisAsnLeuGluAspLysPheAla 25 30
Figure imgf000203_0001
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<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0382
<400> 444
SerGlyHisAsnLeuGluAspLysPheAlaSer
5 10
<210> 445
<211>7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0382
<400> 445
ArgAspAspLysArgProSer
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<211>9
<212> PRT
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<220>
<223> Abet0382
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< 220 >
< 223 > A be t0382
< 400 > 447
Figure imgf000204_0001
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<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0382
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0382
<400> 449
Figure imgf000204_0002
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0382
<400> 450
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5 10
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<213> Homo sapiens
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<223> Abet0383
<400> 451
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0383
<400> 452
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Trp Tyr
20 25 30
Pro Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp lie
35 40 45
Ser Val lie Gly Ala Asp Asn Ala Lys lie Ala Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly ArgPhe Thr lie SerArg Asp Asn Ser LysAsn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln MetAsn Ser Leu ArgAla Glu Asp Thr AlaVal Tyr TyrCys
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100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
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<211>5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
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<223> Abet0383
<400> 453
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5
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0383
<400> 454
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5 10 15
Gly
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0383
<400> 455
Glu Trp Met Gly His Ser Arg Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val 5 10 15 <210> 456
<211> 30
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0383
<400> 456
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp
20 25 30 <210> 457
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0383
<400> 457
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp lie Ser
5 10
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<211> 32
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0383
<400> 458
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0383
<400> 459
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5 10
<210> 460
<211> 318
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<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0383
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<211> 106
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0383
<400> 461
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
5 10 15
Thr Ala Ser lie Thr Cys Ser Gly His Asn Leu Gly Asp Lys Phe Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val lie Tyr
35 40 45
Arg Asp Asp Lys Arg Pro Ser Gly lie Pro Glu Arg Phe Ser Ala Ser
50 55 60
Asn Ser Gly His Thr Ala Thr Leu Thr lie Ser Gly Thr Gln Ala Thr
65 70 75 80
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85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
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<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0383
<400> 462
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5 10
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<211>7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0383
<400> 463
ArgAspAspLysArgProSer
5
<210> 464
<211>9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0383
<400> 464
SerSerGlnAspThrValThrArgVal
5
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<211> 22
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0383
<400> 465
SerTyrGluLeuThrGlnProProSerValSerValSerProGlyGln 5 10 15 ThrAlaSerlie ThrCys
20
<210> 466
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0383
<400> 466
TrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnSerProValLeuVallie Tyr 5 10 15 <210> 467
<211> 32
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0383
<400> 467
Gly lie Pro Glu Arg Phe Ser Ala Ser Asn Ser Gly His Ihr Ala Ihr
5 10 15
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20 25 30
<210> 468
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0383
<400> 468
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5 10
<210> 469
<211> 375
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0343-GL
<400> 469
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gtcaccgtct cctca 375 <210> 470
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0343-GL
<400> 470
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Phe Asn His Gln 20 25 30
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Ala Arg Glu Trp Met Asp His Ser Arg Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met 100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 471
<211>5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0343-GL
<400> 471
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5
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0343-GL
<400> 472
Val lie Gly Lys Thr Asn Glu Asn lie Ala Tyr Ala Asp Ser Val Lys 5 10 15
G1y
<210> 473
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0343-GL
<400> 473
Glu Trp Met Asp His Ser Arg Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val 5 10 15
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<211> 30
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0343-GL
<400> 474
GluValGlnLeuLeuGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGly 5 10 15
SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheAsnPheAsn
20 25 30 <210> 475
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0343-GL
<400> 475
TrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal Ser
5 10
<210> 476
<211> 32
<212> PRT
<213> Homo sapiens
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<223> Abet0343-GL
<400> 476
ArgPheThrlie SerArgAspAsnSerLysAsnThrLeuTyrLeuGln 5 10 15
MetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCysAlaArg 20 25 30 <210> 477
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0343-GL
<400> 477
TrpGlyGlnGlyThrLeuValThrVal SerSer
5 10
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<211> 318
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<220>
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20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val lie Tyr
35 40 45
Arg Asp Asp Lys Arg Pro Ser Gly lie Pro Glu Arg Phe Ser Ala Ser
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
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<213> Homo sapiens
<220>
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
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<213> Homo sapiens
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<220>
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20
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<223> Abet0343-GL
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<213> Homo sapiens
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<223> Abet0343-GL
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<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0343-GL
< 400 > 486
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gtcaccgtct cctca 375 <210> 488
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0369-GL
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50 55 60
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65 70 75 80
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<223> Abet0369-GL
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<223> Abet0369-GL
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5 10 15
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<223> Abet0369-GL
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5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Phe Asn Glu Gln
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Thr Leu Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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<223> Abet0377-GL
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<213> Homo sapiens
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<223> Abet0377-GL
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65 70 75 80
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<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0377-GL
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<220>
<223> Abet0380-GL
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AspValTrpGlyGln
115
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<211>5
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<223> Abet0380-GL
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5
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<213> Homo sapiens
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<400> 542
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Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 543
<211>5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0382-GL
< 400 > 543
AsnSerlie MetTrp
5
<210> 544
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0382-GL
<400> 544
Vallie GlySerGluAlaHisArgVal ThrTyrAlaAspSerValLys 5 10 15
Gly
<210> 545
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0382-GL
<400> 545
GluTrpMetAspHisSerArgProTyrTyrTyrTyrGlyMetAspVal 5 10 15 <210> 546
<211> 30
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0382-GL
<400> 546
GluValGlnLeuLeuGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGly 5 10 15 SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheHisPheThr
20 25 30 <210> 547
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0382-GL
<400> 547
TrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal Ser
5 10
<210> 548
<211> 32
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0382-GL
<400> 548
Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
5 10 15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Ihr Ala Val lyr lyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 549
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0382-GL
<400> 549
Irp Gly Gln Gly Ihr Leu Val Ihr Val Ser Ser
5 10
<210> 550
<211> 318
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0382-GL
<400> 550
tcgtacgagt tgactcagcc accctcagtg tccgtgtccc caggacagac ggccagcatc 60 acctgctctg gacataactt ggaagataaa tttgcttcct ggtatcaaca gaagccaggc 120 cagtcccctg tcctggtcat ctatcgagat gacaagcggc cctcagggat ccctgagcga 180 ttctctgcct ccaactctgg gcacactgcc actctgacca tcagcgggac ccaggctatg 240 gatgaggctg actattactg ttcgtcccag gacacggtga ctcgagtgtt cggcggaggg 300 accaagctga ccgtccta 318 <210> 551
<211> 106
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0382-GL
<400> 551
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
5 10 15
Thr Ala Ser lie Thr Cys Ser Gly His Asn Leu Glu Asp Lys Phe Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val lie Tyr
35 40 45
Arg Asp Asp Lys Arg Pro Ser Gly lie Pro Glu Arg Phe Ser Ala Ser
50 55 60
Asn Ser Gly His Thr Ala Thr Leu Thr lieSer Gly Thr Gln AlaMet 65 70 75 80
GlnAsp Thr Val Thr ArgVal
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 552
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0382-GL
<400> 552
Ser Gly His Asn Leu Glu Asp Lys Phe Ala Ser
5 10
<210> 553
<211>7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0382-GL
<400> 553
Arg Asp Asp Lys Arg Pro Ser
5
<210> 554
<211>9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0382-GL
<400> 554
Ser Ser Gln Asp Thr Val Thr Arg Val
5
<210> 555
<211> 22
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0382-GL
< 400 > 555
SerTyrGluLeuThrGlnProProSerValSerValSerProGlyGln
5 10 15
ThrAlaSerlie ThrCys
20
<210> 556
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0382-GL
<400> 556
TrpTyr Gln Gln Lys Pro GlyGln SerPro Val LeuVallieTyr
5 T0 15
<210> 557
<211> 32
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0382-GL
<400> 557
Glylie Pro Glu Arg Phe SerAla SerAsn Ser GlyHlsThrAlaThr
5 10 15
LeuThr lieSerGlyThrGln AlaMetAspGluAla AspTyrTyrCys
20 25 30
<210> 558
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Abet0382-GL
<400> 558
PheGlyGlyGlyThrLysLeuThrValLeu
5 10
Secuencias para pA1-42 Humano, pA1-40 humano, pA17-42 humano, pA1-43 humano, pA1-42 murino y truncados
[0368]
Péptido Beta Amiloide 1-42 Humano Biotinilado: Biotin-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA (SEQ ID NO: 559).
Péptido Beta Amiloide 1-42 Humano: DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA (SEQ ID NO: 560).
Péptido Beta Amiloide 1-40 Humano Biotinilado: Biotin-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV (SEQ ID NO: 561).
Péptido Beta Amiloide 1-40 Humano: DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV (SEQ ID NO: 562).
Péptido Beta Amiloide 1 -42 Murino: DAEFGHDSGFEVRHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA(SEQ ID NO: 563). Péptido Beta Amiloide 1-42 Murino Biotinilado: Biotin-DAEFGHDSGFEVRHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA (SEQ ID NO: 564).
Péptido____ Beta____ Amiloide_____ 1-42_____Murino-LC-Biotinilado: Biotin-(Cadena de Enlace)-DAEFGHDSGFEVRHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA (SEQ ID NO: 565).
Péptido Beta Amiloide 1-40 Murino: DAEFGHDSGFEVRHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV (SEQ ID NO: 566). Péptido____ Beta____ Amiloide_____ 1-40_____Murino-LC-Biotinilado: Biotin-(Cadena de Enlace)-DAEFGHDSGFEVRHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV (SEQ ID NO: 567).
Péptido________ Beta________ Amiloide________ 1-42________ Codificado________ Biotinilado: Biotin-AIAEGDSHVLKEGAYMEIFDVQGHVFGGLIFRVVDLGSHNVA (SEQ ID NO: 568).
Péptido Beta Amiloide 1-43 Humano: DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIAT (SEQ ID NO: 569).
Péptido Truncado Beta Amiloide 29-42 Humano: KKKGAIIGLMVGGVVIA (SEQ ID NO: 570).
Péptido Truncado Beta Amiloide 29-40 Humano: KKKGAIIGLMVGGVV (SEQ ID NO: 571).
Péptido Truncado Beta Amiloide 1-16 Humano: DAEFRHDSGYEVHHQK (SEQ ID NO: 572).
Péptido Truncado Beta Amiloide 11-22 Humano: EVRHQKLVFFAE (SEQ ID NO: 573).
Péptido Truncado Beta Amiloide 12-28 Humano: VRHQKLVFFAEDVGSNK (SEQ ID NO: 574).
Péptido Truncado Beta Amiloide 17-42 Humano: LVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA (SEQ ID NO: 575).
Péptido Truncado Beta Amiloide 11-42 Humano: EVRHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA (SEQ ID NO: 576). Péptido Truncado Beta Amiloide 3-42 Humano: EFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA (SEQ ID NO: 577).

Claims (6)

REIVINDICACIONES
1. Una molécula de anticuerpo para I3A1-42 humano, donde la molécula de anticuerpo comprende un dominio VH y un dominio VL, donde el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 524 y donde el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 533.
2. La molécula de anticuerpo de la reivindicación 1, donde la molécula de anticuerpo está codificada por la secuencia de ácido nucleico depositada con el número de acceso NCIMB 41890.
3. La molécula de anticuerpo de la reivindicación 1 o 2, donde la molécula de anticuerpo es un scFv.
4. Una composición que comprende la molécula de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para su uso en terapia.
5. La composición de la reivindicación 4 para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.
6. La composición de la reivindicación 4 para su uso en la mejora de la cognición o en la reducción del deterioro cognitivo en un paciente con la enfermedad de Alzheimer o con Síndrome de Down.
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