CN111454980A - 重组载体的构建方法及其构建的重组载体及应用 - Google Patents

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CN111454980A CN202010288990.9A CN202010288990A CN111454980A CN 111454980 A CN111454980 A CN 111454980A CN 202010288990 A CN202010288990 A CN 202010288990A CN 111454980 A CN111454980 A CN 111454980A
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Abstract

本发明涉及分子生物学和蛋白质技术领域，具体涉及重组载体的构建方法及其构建的重组载体及应用。本发明提供的构建方法操作简便，本发明提供的重组载体能够表达包括IgG抗体、Fab抗体、Fv抗体、人源化ScFv‑Fc抗体以及鼠/人嵌合抗体等各类不同功能的抗体，提高了抗体表达效率。

Description

重组载体的构建方法及其构建的重组载体及应用
技术领域
本发明涉及分子生物学和蛋白质技术领域，具体涉及一种重组载体的构建方法及其构建的重组载体及应用。
背景技术
随着抗体工程的发展，建立在噬菌体外壳表达抗体片段的能力基础上的噬菌体展示技术产生，即从免疫后的脾细胞、外周血淋巴细胞等提取mRNA，逆转录成cDNA，利用PCR技术分别扩增出抗体的重链及轻链基因，按一定的方式将两者连接克隆到表达载体上，并在适当的宿主细胞中表达成有功能的抗体分子，从而利用抗原-抗体特异性结合进行筛选、扩增，再用亲和层析等手段纯化抗体片段。例如中国专利ZL 201610050665.2《进行抗体表达和组装的重组系统及应用》，专利申请日2016年1月26日，授权公告日2017年10月3日。该发明公开一种表达抗体重链和轻链的真核表达载体，其目的是提供一种重组真核表达载体及其构建方法，便于表达各类抗体。本发明还公开了pRTL1-HC和pRTL1-LC的上述真核表达载体的应用。本发明是以表达表达IgG抗体重链和轻链的真核表达载体为基础，进一步能够表达包括IgG抗体、Fab抗体、Fv抗体、人源化ScFv-Fc抗体以及鼠/人嵌合抗体等各类不同功能的抗体，有助于提高抗体表达Fv、Fab及ScFv等片段的表达效率，为能够成功表达各种不同功能的抗体起到关键性作用。但是双质粒系统存在转染前准备工作繁琐，转染时需要双倍剂量的转染试剂造成成本翻倍等问题。
因此，希望提供一种抗体表达效率高，操作简便的构建方法。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术中存在的上述缺陷，提供一种重组载体的构建方法及其构建的重组载体及应用。本发明提供的构建方法操作简便，抗体表达效率高。现有技术方案的缺陷：
第一方面，本发明提供了一种重组载体的构建方法，所述构建方法包括下述步骤：
1)pRTL1-LC质粒作为模板用于overlap PCR扩增目的片段做A2798C突变来毁掉SpeⅠ位点，扩增产物通过双酶切后连接到pRTL1-LC的对应位置制得pRTL2载体；
2)pRTL1-LC质粒作为模板用于overlap PCR扩增目的片段做A4132G和A4137C突变来毁掉SalⅠ位点，扩增产物通过双酶切后连接到pRTL2的对应位置制得pRTL3载体；
3)pRTL3载体作为模板用于overlap PCR扩增目的片段做T620A和G626C突变来加入SpeⅠ位点的同时毁掉EcoRⅠ位点，同时在尾端加入BamHⅠ、ClaⅠ和XbaⅠ位点，扩增产物通过双酶切后连接到pRTL3的对应位置制得pRTL4载体；
4)pRTL1-HC质粒作为模板用于overlap PCR扩增目的片段4685bp-1994bp部分，同时在尾端加入SalⅠ位点，扩增产物通过双酶切后连接到pRTL4的对应位置制得所述重组载体-pRTL5载体；或者
4’)pRTL1-HC质粒作为模板用于overlap PCR扩增目的片段573bp-1994bp部分，同时在5’端加入BamHⅠ位点，3’尾端加入ClaⅠ位点，扩增产物通过双酶切后连接到pRTL4的对应位置制得所述重组载体-pRTL6载体；
其中，所述pRTL5载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述pRTL6载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
优选地，步骤1)中，所述双酶切的位点为pRTL1-LC上游1284bp处的NheⅠ酶切位点和和下游3029bp处的NdeⅠ酶切位点。
优选地，步骤2)中，所述双酶切的位点为pRTL2上游3973bp处的NotⅠ酶切位点和下游626bp处的EcoRⅠ酶切位点。
优选地，步骤3)中，所述双酶切的位点为pRTL3上游4132bp处的SalⅠ酶切位点和下游1295bp处的NheⅠ酶切位点。
优选地，步骤4)中，所述双酶切的位点为pRTL4上游3987bp处的NotⅠ酶切位点和下游4144bp处的SalⅠ酶切位点，或者
步骤4’)中，所述双酶切的位点为pRTL4上游1283bp处的BamHⅠ酶切位点和下游1291bp处的ClaⅠ酶切位点。
优选地，所述轻链和重链各自拥有启动子区。
优选地，所述pRTL载体的启动子为hEF1-HTLV启动子和/或组成型表达启动子GAP。
优选地，所述pRTL载体的信号肽选自外源蛋白自身的天然信号肽、IL2信号肽、Igkappa信号肽和hGHRH信号肽中的一种或多种。
第二方面，本发明提供了一种由本发明所述的方法构建的重组载体。
优选地，所述表达载体的宿主细胞为大肠杆菌。
优选地，所述大肠杆菌为E.coli XLI-Blue。
第三方面，本发明提供了本发明所述的重组载体在抗体表达中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明只需构建单个质粒用于转染，减少前期质粒制备过程的工作量；
2、本发明的单个质粒与双质粒系统(30μg的pRTL1-HC与30μg的pRTL1-LC质粒)相比较，转染试剂需要量减半，转染效率显著提高，每升表达纯化抗体的产量可以提高到30mg；
3、本发明可以在不改变抗体骨架氨基酸的序列前提下，能够高效表达相对应的由H链和L链组成的天然状态的人源抗体。
附图说明
图1为重组载体pRTL5的结构示意图；
图2为重组载体pRTL6的结构示意图；
图3为VH和VL的PCR扩增结果的电泳鉴定图；
图4为pRTL5-1A5和pRTL6-1A5的菌落PCR的电泳鉴定图；
图5为pRTL5-1A5和pRTL6-1A5表达纯化的抗体的SDS-PAGE结果；
图6为表达纯化的1A5抗体与hIL6的亲和力检测结果；
图7为利用Western blot方法检测1A5抗体识别hIL6的结果；
图8为1A5抗体的溶解度曲线。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而制得一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
第一方面，本发明提供了一种重组载体的构建方法，所述构建方法包括下述步骤：
1)pRTL1-LC质粒作为模板用于overlap PCR扩增目的片段做A2798C突变来毁掉SpeⅠ位点，扩增产物通过双酶切后连接到pRTL1-LC的对应位置制得pRTL2载体；
2)pRTL1-LC质粒作为模板用于overlap PCR扩增目的片段做A4132G和A4137C突变来毁掉SalⅠ位点，扩增产物通过双酶切后连接到pRTL2的对应位置制得pRTL3载体；
3)pRTL3载体作为模板用于overlap PCR扩增目的片段做T620A和G626C突变来加入SpeⅠ位点的同时毁掉EcoRⅠ位点，同时在尾端加入BamHⅠ、ClaⅠ和XbaⅠ位点，扩增产物通过双酶切后连接到pRTL3的对应位置制得pRTL4载体；
4)pRTL1-HC质粒作为模板用于overlap PCR扩增目的片段4685bp-1994bp部分，同时在尾端加入SalⅠ位点，扩增产物通过双酶切后连接到pRTL4的对应位置制得所述重组载体-pRTL5载体；或者
4’)pRTL1-HC质粒作为模板用于overlap PCR扩增目的片段573bp-1994bp部分，同时在5’端加入BamHⅠ位点，3’尾端加入ClaⅠ位点，扩增产物通过双酶切后连接到pRTL4的对应位置制得所述重组载体-pRTL6载体；
其中，所述pRTL5载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述pRTL6载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明中，在不改变抗体骨架氨基酸序列的前提下，能够高效表达相对应的由H链和L链组成的天然状态的人源抗体外，只需构建单个质粒用于转染，减少前期质粒制备过程的工作量，与双质粒系统相比较，转染试剂需要量减半，转染效率显著提高，同时能够提高每升表达纯化抗体的产量。
所述pRTL1-LC和pRTL1-HC为申请人的另一项在先专利申请，具体可参见申请公告号为CN105505884B的中国专利申请，该专利申请在此通过参考全文引入。对于上述制粒的获得及制备方法，后续不再进行赘述。
下面对于上述各步骤进行详细说明。
以制备重组载体-pRTL5载体为例进行说明。
步骤1)：
根据本发明，所述overlap PCR的引物为：
pRTL2-2797正向引物序列如SEQ ID NO：18所示；
pRTL2-2814反向引物序列如SEQ ID NO：19所示；
pRTL2-1263正向引物序列如SEQ ID NO：20所示；
pRTL2-3130反向引物序列如SEQ ID NO：21所示。
根据本发明，所述双酶切的位点为pRTL1-LC上游1284bp处的NheⅠ酶切位点和和下游3029bp处的NdeⅠ酶切位点。
步骤2)：
根据本发明，所述overlap PCR的引物为：
pRTL3-4131正向引物序列如SEQ ID NO：22所示；
pRTL3-4142反向引物序列如SEQ ID NO：23所示；
pRTL3-3900正向引物序列如SEQ ID NO：24所示；
pRTL3-647反向引物序列如SEQ ID NO：25所示。
根据本发明，所述双酶切的位点为pRTL2上游3973bp处的NotⅠ酶切位点和下游626bp处的EcoRⅠ酶切位点。
步骤3)：
根据本发明，所述overlap PCR的引物为：
pRTL4-616正向引物序列如SEQ ID NO：26所示；
pRTL4-631反向引物序列如SEQ ID NO：27所示；
pRTL4-4118正向引物序列如SEQ ID NO：28所示；
pRTL4-1282反向引物序列如SEQ ID NO：29所示。
根据本发明，所述双酶切的位点为pRTL3上游4132bp处的SalⅠ酶切位点和下游1295bp处的NheⅠ酶切位点。
步骤4)：
根据本发明，所述PCR的引物为：
pRTL5-3914正向引物序列如SEQ ID NO：30所示；
pRTL5-2反向引物序列如SEQ ID NO：31所示。
所述双酶切的位点为pRTL4上游3987bp处的NotⅠ酶切位点和下游4144bp处的SalⅠ酶切位点。
本发明中，所述pRTL2载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述pRTL3载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述pRTL4载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
根据本发明，所述pRTL1-LC和pRTL1-HC各自拥有启动子区。
根据本发明，优选地，所述pRTL载体的启动子为hEF1-HTLV启动子和/或组成型表达启动子GAP。
根据本发明，优选地，所述pRTL载体的信号肽选自外源蛋白自身的天然信号肽、IL2信号肽、Ig kappa信号肽和hGHRH信号肽中的一种或多种。
以制备重组载体-pRTL6载体为例进行说明。
步骤1)：
根据本发明，所述overlap PCR的引物为：
pRTL2-2797正向引物序列如SEQ ID NO：18所示；
pRTL2-2814反向引物序列如SEQ ID NO：19所示；
pRTL2-1263正向引物序列如SEQ ID NO：20所示；
pRTL2-3130反向引物序列如SEQ ID NO：21所示。
根据本发明，所述双酶切的位点为pRTL1-LC上游1284bp处的NheⅠ酶切位点和和下游3029bp处的NdeⅠ酶切位点。
步骤2)：
根据本发明，所述overlap PCR的引物为：
pRTL3-4131正向引物序列如SEQ ID NO：22所示；
pRTL3-4142反向引物序列如SEQ ID NO：23所示；
pRTL3-3900正向引物序列如SEQ ID NO：24所示；
pRTL3-647反向引物序列如SEQ ID NO：25所示。
根据本发明，所述双酶切的位点为pRTL2上游3973bp处的NotⅠ酶切位点和下游626bp处的EcoRⅠ酶切位点。
步骤3)：
根据本发明，所述overlap PCR的引物为：
pRTL4-616正向引物序列如SEQ ID NO：26所示；
pRTL4-631反向引物序列如SEQ ID NO：27所示；
pRTL4-4118正向引物序列如SEQ ID NO：28所示；
pRTL4-1282反向引物序列如SEQ ID NO：29所示。
根据本发明，所述双酶切的位点为pRTL3上游4132bp处的SalⅠ酶切位点和下游1295bp处的NheⅠ酶切位点。
步骤4)：
根据本发明，所述PCR的引物为：
pRTL6-1283正向引物序列如SEQ ID NO：32所示；
pRTL6-2693反向引物序列如SEQ ID NO：33所示。
根据本发明，所述双酶切的位点为pRTL4上游1283bp处的BamHⅠ酶切位点和下游1291bp处的ClaⅠ酶切位点。
根据本发明，所述pRTL1-LC和pRTL1-HC各自拥有启动子区。
根据本发明，优选地，所述pRTL载体的启动子为hEF1-HTLV启动子和/或组成型表达启动子GAP。
根据本发明，优选地，所述pRTL载体的信号肽选自外源蛋白自身的天然信号肽、IL2信号肽、Ig kappa信号肽和hGHRH信号肽中的一种或多种。
第二方面，本发明提供了由本发明所述的方法构建的重组载体。
优选地，所述重组载体的宿主细胞为大肠杆菌。
优选地，所述大肠杆菌为E.coli XLI-Blue。
第三方面，本发明提供了上述重组载体在抗体表达中的应用。例如，上述抗体可以为IgG抗体、Fab、ScFv-FC以及融合蛋白。
实施例
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，如无特别说明，所用的各材料均可通过商购获得，如无特别说明，所用的方法为本领域的常规方法。实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
实施例1
一、IL6抗体1A5序列真核表达载体的构建
以高亲和力的抗hIL-6蛋白ScFv抗体的噬菌体克隆1A5(1A5重链的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示；1A5-VH的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示；1A5轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示；1A5-VL的核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示)为模板，分别设计引物1A5-VL上游引物/1A5-VL下游引物扩增轻链可变区1A5-VL和引物1A5-VH上游引物/1A5-VH下游引物扩增重链可变区1A5-VH的DNA片段。以引物1A5-VH上游引物和引物1A5-VH下游引物进行PCR扩增。其中，引物1A5-VH上游引物序列如SEQ ID NO：14所示，其中GAATTC为EcoRI识别位点；引物1A5-VH下游引物序列如SEQ IDNO：15所示，其中GCTAGC为NheI识别位点。在一灭菌的0.2ml PCR管中，依次加入12μl无菌水、7μl的2×Taq master mix酶(康为世纪公司)，0.2μl的引物1A5-VH上游引物(终浓度2pmol)、0.2μl的引物1A5-VH下游引物(终浓度2pmol)、10ng的质粒溶液(浓度为382ng/μl)，用无菌水补足至总体积20μl，将离心管至于PCR仪中。在PCR反应体系中，PCR反应的温度变化过程为：先升温至94℃，保持5分钟，接着按以下的温度变化程序循环30次：升温至94℃，保持20秒，降温至60℃，保持20分钟，升温至72℃，保持40秒，最后于72℃保持10分钟，结束扩增反应。经PCR扩增，得到两端分别带有EcoRI和NheI的限制性内切酶酶切的插入片段，电泳结果如图3所示。然后用PCR纯化试剂盒(QIAGEN,Cat.No.28004)按照说明书进行PCR产物的纯化。利用DNA含量测定仪NanoDrop 2000c测定DNA的浓度。将纯化的PCR产物和pRTL5或pRTL6载体分别进行酶切反应。PCR产物的酶切体系为：PCR产物：1μg；10×buffer4：2μl；EcoRI-HF：1μl；NheI-HF：1μl；BSA：0.2μl；补足ddH2O至20μl；pRTL5或pRTL6载体的酶切体系为：pRTL5或pRTL6载体：1μg；10×buffer4：2μl；EcoRI-HF：1μl；NheI-HF：1μl；BSA：0.2μl；补足ddH2O至20μl。37℃酶切2h。1％的琼脂糖凝胶电泳，利用胶回收试剂盒(QIAGEN,Cat.No.28706)按照说明书进行切胶回收酶切后的产物。利用DNA含量测定仪NanoDrop2000c测定DNA的浓度。回收DNA产物用T4DNA连接酶连接到用EcoRI和NheI限制性内切酶酶切的pRTL5或pRTL6载体骨架上。连接体系中插入片段DNA与载体的摩尔比为7:1。连接体系为：插入片段DNA：28ng；酶切后的pRTL5或pRTL6载体100ng；10×T4DNA ligase buffer：2μl；T4DNA连接酶：1μl；补足ddH2O至20μl，16℃连接3h。将连接产物42℃热激转化到大肠杆菌XL1-blue化学感受态中。转化的菌液涂布于含有25ug/ml的zeocin的低盐LB平板上，37℃过夜培养。挑取平板上长出的单克隆菌落，进行菌落PCR鉴定，如图4所示。PCR所用引物和程序与前所述相同。将鉴定正确的单克隆摇菌，提取质粒pRTL5-VH或pRTL6-VH。
以引物1A5-VL上游引物和引物1A5-VL下游引物进行PCR扩增。进行PCR扩增VL基因。其中，引物1A5-VL上游引物序列如SEQ ID NO：16所示，其中ACTAGT为SpeI识别位点；引物1A5-VL下游引物序列如SEQ ID NO：17所示，其中CGTACG为BsiWI识别位点。在一灭菌的0.2ml PCR管中，依次加入12μl无菌水、7μl的2×Taq master mix酶(康为世纪公司)，0.2μl的引物1A5-VL上游引物(终浓度2pmol)、0.2μl的引物1A5-VL下游引物(终浓度2pmol)、10ng的质粒溶液(浓度为667ng/μl)，用无菌水补足至总体积20μl，将离心管至于PCR仪中。在PCR反应体系中，PCR反应的温度变化过程为：先升温至94℃，保持5分钟，接着按以下的温度变化程序循环30次：升温至94℃，保持20秒，降温至60℃，保持20分钟，升温至72℃，保持40秒，最后于72℃保持10分钟，结束扩增反应。经PCR扩增，得到两端分别带有SpeI和BsiWI的限制性内切酶酶切的插入片段，然后用PCR纯化试剂盒(QIAGEN,Cat.No.28004)按照说明书进行PCR产物的纯化。利用DNA含量测定仪NanoDrop 2000c测定DNA的浓度。将纯化的PCR产物和pRTL5-VH或pRTL6-VH载体分别进行酶切反应。PCR产物的酶切体系为：PCR产物：1μg；10×buffer4：2μl；SpeI-HF：1μl；BsiWI：1μl；BSA：0.2μl；补足ddH2O至20μl；pRTL5-VH或pRTL6-VH载体的酶切体系为：pRTL5-VH或pRTL6-VH载体：1μg；10×buffer4：2μl；SpeI-HF：1μl；BsiWI：1μl；BSA：0.2μl；补足ddH2O至20μl。37℃酶切2h后55℃酶切2h。1％的琼脂糖凝胶电泳，利用胶回收试剂盒(QIAGEN,Cat.No.28706)按照说明书进行切胶回收酶切后的产物。利用DNA含量测定仪NanoDrop 2000c测定DNA的浓度。回收DNA产物用T4DNA连接酶连接到用SpeI和BsiWI限制性内切酶酶切的pRTL5-VH或pRTL6-VH载体骨架上。连接体系中插入片段DNA与载体的摩尔比为7:1。连接体系为：插入片段DNA：28ng；酶切后的pRTL5-VH或pRTL6-VH载体100ng；10×T4DNA ligase buffer：2μl；T4DNA连接酶：1μl；补足ddH2O至20μl。16℃连接3h。
分别将连接产物用化学转化的方法转化至大肠杆菌XLI-Blue感受态细胞中(endA1supE44thi-1hsdR17recA1gyrA96relA1lac[F′proAB lacIqZΔM15Tn10(Tetr)])，在含有25μg/ml Zeocin抗生素的低盐LB固体培养基上培养14h。挑取几个单菌落于25μg/mlZeocin抗生素的低盐LB液体培养基中培养过夜，同时利用测序引物进行菌落PCR鉴定，1％的琼脂糖凝胶电泳检测，证明目的基因成功插入真核表达载体。
重组质粒DNA测序结果经过比对，重组质粒中插入片段的序列与原序列完全一致，达到100％的吻合度，可以证明本发明成功将抗IL6抗体1A5序列插入真核表达载体，且插入方向正确，分别命名为pRTL5-1A5或pRTL6-1A5。
二、质粒转染表达和表达后纯化
将测序正确的阳性克隆大量摇菌，按照QIAGEN plasmid Midi Kit说明书中提质粒，用0.22μm的滤膜过滤后共转染至状态良好的CHO细胞中，30μg的pRTL5-1A5或pRTL6-1A5质粒通过转染试剂分别转染到30ml的1×106cell/ml的CHO细胞后表达抗体，2天后更换新鲜培养基继续培养5天，将培养组分经4000rpm，22℃离心10分钟，收集培养上清。利用30kDa孔径的超滤管(Millipore)用PBS替换培养基成分以及浓缩组分，再用protein G+Aagarose(G-bioscience)凝胶进行纯化，聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE电泳，5％浓缩胶80V电压，12％分离胶120V电压)分析验证，测得抗体浓度。抗体表达量分别为7mg/L和9mg/L。
由图5可知，由pRTL5-1A5或pRTL6-1A5转染表达的抗IL6抗体1A5分别成功表达，非还原条件下，二硫键未被破坏，抗体的轻重链不能打开，加入DTT可打开二硫键成线性结构，抗体重链大小55KDa，轻链大小26KDa。
利用ELISA的方法，鉴定此IgG抗体能与hIL-6结合。hIL-6、GST蛋白和BSA蛋白分别以100μL溶解于PBS中的3μg/mL包被ELISA板孔，4℃过夜。弃尽板孔内溶液，以PBST(0.25％Tween20)配置的2％脱脂乳每孔200μL 37℃封闭2h。弃尽板孔内溶液，每孔加入100μL以PBST(0.25％Tween20)配置的5％脱脂乳稀释的300ng/μL的抗hIL-6抗体1A5作为一抗，37℃孵育1h。弃净板孔内溶液，用200μL PBST(0.25％Tween20)洗板5次后，每孔加入100μL以PBST(0.25％Tween20)配置的2％脱脂乳1:5000稀释的GE的HRP标记的羊抗人IgG抗体，37℃孵育1h。弃尽板孔内溶液，用200μL PBST(0.25％Tween20)洗板3次后，每孔加入100μLQuantblu底物显色液，3-5分钟后读值并进行统计分析。结果如图6所示。此抗体可以特异性识别并结合hIL-6分子。
利用Western blot方法检测此抗体能识别重组hIL-6。将重组hIL-6进行SDS-PAGE电泳后，电转移到0.2μm的NC膜上。封闭液(5％脱脂乳溶于0.05％的PBST中)封闭过夜后，加入封闭液稀释的终浓度为2μg/mL的单克隆抗体室温孵育2h，0.05％的PBST洗涤3次后以封闭液1:5000稀释的GE的HRP标记的羊抗人IgG抗体孵育1h。PBST洗涤3次后用科晶生物科技有限公司的化学发光液显色，ProteinSimple公司的FluorChemHD2system进行荧光和化学发光捕获照相，结果如图7所示。此抗体可以特异性识别并结合hIL-6。
蛋白质热稳定性参照Protein Thermal ShiftTM Dye Kit(ThermoFisherScientific,Cat.4461146)说明书，用Roche LightCycler Nano Real-Time PCR System读值后统计分析。结果如图8所示。此抗体可以在72℃以下稳定存在。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
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Claims (10)

1.一种重组载体的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括下述步骤：
1)pRTL1-LC质粒作为模板用于overlap PCR扩增目的片段做A2798C突变来毁掉SpeⅠ位点，扩增产物通过双酶切后连接到pRTL1-LC的对应位置制得pRTL2载体；
2)pRTL1-LC质粒作为模板用于overlap PCR扩增目的片段做A4132G和A4137C突变来毁掉SalⅠ位点，扩增产物通过双酶切后连接到pRTL2的对应位置制得pRTL3载体；
3)pRTL3载体作为模板用于overlap PCR扩增目的片段做T620A和G626C突变来加入SpeⅠ位点的同时毁掉EcoRⅠ位点，同时在尾端加入BamHⅠ、ClaⅠ和XbaⅠ位点，扩增产物通过双酶切后连接到pRTL3的对应位置制得pRTL4载体；
4)pRTL1-HC质粒作为模板用于overlap PCR扩增目的片段4685bp-1994bp部分，同时在尾端加入SalⅠ位点，扩增产物通过双酶切后连接到pRTL4的对应位置制得所述重组载体-pRTL5载体；或者
4’)pRTL1-HC质粒作为模板用于overlap PCR扩增目的片段573bp-1994bp部分，同时在5’端加入BamHⅠ位点，3’尾端加入ClaⅠ位点，扩增产物通过双酶切后连接到pRTL4的对应位置制得所述重组载体-pRTL6载体；
其中，所述pRTL5载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述pRTL6载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
2.根据权利要求1所述的重组载体的构建方法，其特征在于，步骤1)中，所述双酶切的位点为pRTL1-LC上游1284bp处的NheⅠ酶切位点和和下游3029bp处的NdeⅠ酶切位点。
3.根据权利要求1所述的重组载体的构建方法，其特征在于，步骤2)中，所述双酶切的位点为pRTL2上游3973bp处的NotⅠ酶切位点和下游626bp处的EcoRⅠ酶切位点。
4.根据权利要求1所述的重组载体的构建方法，其特征在于，步骤3)中，所述双酶切的位点为pRTL3上游4132bp处的SalⅠ酶切位点和下游1295bp处的NheⅠ酶切位点。
5.根据权利要求1所述的重组载体的构建方法，其特征在于，步骤4)中，所述双酶切的位点为pRTL4上游3987bp处的NotⅠ酶切位点和下游4144bp处的SalⅠ酶切位点，或者
步骤4’)中，所述双酶切的位点为pRTL4上游1283bp处的BamHⅠ酶切位点和下游1291bp处的ClaⅠ酶切位点。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的重组载体的构建方法，其特征在于，所述pRTL1-LC和pRTL1-HC各自拥有启动子区。
7.根据权利要求6所述的重组载体的构建方法，其特征在于，所述pRTL载体的启动子为hEF1-HTLV启动子和/或组成型表达启动子GAP；
优选地，所述pRTL载体的信号肽选自外源蛋白自身的天然信号肽、IL2信号肽、Igkappa信号肽和hGHRH信号肽中的一种或多种。
8.由权利要求1-7中任意一项所述的方法构建的重组载体。
9.根据权利要求8所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体的宿主细胞为大肠杆菌；
优选地，所述大肠杆菌为E.coliXLI-Blue。
10.权利要求8或9所述的重组载体在抗体表达中的应用。
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