CN117327159A - 一种蛋白a耐碱突变方法 - Google Patents

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CN117327159A CN202310950502.XA CN202310950502A CN117327159A CN 117327159 A CN117327159 A CN 117327159A CN 202310950502 A CN202310950502 A CN 202310950502A CN 117327159 A CN117327159 A CN 117327159A
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钱永常
张科
来灿钢
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Abstract

本申请公开了一种蛋白A耐碱突变方法，其属于生物工程技术领域。包括以下步骤：在目的蛋白C端增加GGGC序列，对蛋白A的A结构域选定多个突变位点；使蛋白A基于结构域A在所述多个突变位点构建多个载体；分别使用多个载体表达蛋白A的不同位点的突变蛋白；对多种突变蛋白表达结果进行检测，获得检测结果；基于所述检测结果，筛选出最优突变蛋白A。本申请的有益效果在于提供了一种具有高耐碱性的蛋白A耐碱突变方法。

Description

一种蛋白A耐碱突变方法
技术领域
本申请涉及生物工程技术领域，具体而言，涉及一种蛋白A耐碱突变方法。
背景技术
在蛋白分子的生产过程中需要去除污染物以确保蛋白产品的纯度。这些污染物包括非目的的生物分子或微生物如蛋白质、碳水化合物、脂类、细菌和病毒等。通常在目的产物洗脱后即从基质去除这些污染物，以便在随后的应用之前再生基质。此类去除通常包括被成为就地清洗(CIP)方法，其中使用了能够从固定相洗脱污染物的试剂。目前使用的最广泛的此类试剂是NaOH，浓度可根据污染的程度和基质性质从0.1M至1M不等。NaOH是一种能实现多途径地减少诸如微生物、蛋白质、脂质、核酸等污染物的有效CIP试剂。NaOH另一个优点是其很容易被去除而不用任何进一步处理。但此方案需要将基质暴露在pH超过13的极端碱性条件下，对基质耐碱能力要求很高。
发明内容
为了解决以上背景技术部分提到的技术问题，本申请的一些实施例提供了一种蛋白A耐碱突变方法，包括以下步骤：
在目的蛋白C端增加GGGC序列，对蛋白A的A结构域选定多个突变位点；
使蛋白A基于结构域A在所述多个突变位点构建多个载体；
分别使用多个载体表达蛋白A的不同位点的突变蛋白；
对多种突变蛋白表达结果进行检测，获得检测结果；
基于所述检测结果，筛选出最优突变蛋白A。
进一步地，
所述使蛋白A基于结构域A在所述多个突变位点构建多个载体包括：
S1.获取多种设计引物，多种设计引物包括第一设计引物、第二设计引物……和第n设计引物；
S2.基于PCR程序将其中两种种设计引物引入模板的突变位点，获取突变的目的基因；
S3.分别对模板和突变的目的基因进行双酶切，并获取第一酶切产物和第二酶切产物；
S4.对第一酶切产物和第二酶切产物进行T4连接，获取连接产物，并对连接产物通过Kana平板培养，并在Kana平板上提取质粒；
S5.用所述质粒作为模板，将其它设计引物引入模板的突变位点重复S3-S4，获取使蛋白A基于结构域A在所述多个突变位点构建的多个载体。
进一步地，
所述使蛋白A基于结构域A在所述多个突变位点构建多个载体还包括：
S6.用所述蛋白A基于结构域A在多个突变位点构建的多个载体作为模板，将其它设计引物引入到模板的突变位点中获取突变的目的基因；
重复S3-S5，再次获取使蛋白A基于结构域A在所述多个突变位点构建的多个载体。
进一步地，
在S2中，向所述第一酶切产物中加入10x Loading buffer进行1％琼脂糖凝胶电泳，观察核酸条带并切胶回收。
进一步地，
对连接产物通过Kana平板培养，并在Kana平板上提取质粒的方法为：
将连接产物转入DH5α，冰上孵育后热激；
再次冰上孵育；
加入无抗LB后摇床培养，离心后取无抗LB重悬菌液涂布Kana平板；
将Kana平板置于培养箱中培养；
一段时间后，挑取Kana平板上阳性单克隆菌P筛选并送样测序，取测序结果完整的菌株，在完整的菌株中提取质粒。
进一步地，
所述分别对多个载体在蛋白A的不同位点进行突变蛋白表达的方法包括：
将多个载体分别转入BL21感受态混合均匀，冰上孵育后热激，再次冰上孵育，加入无抗LB后摇床培养，离心后取无抗LB重悬菌液涂布Kana平板，将Kana平板倒置于培养箱中培养；
一段时间后将阳性单克隆进行培养，培养一段时间后再加入0.1％IPTG继续培养一段时间，获取培养产物；
对培养产物进行SDS-PAGE跑胶检测，获得蛋白表达情况。
将已经表达的培养产物转接LB培养基，培养一段时间后再加入0.1％IPTG继续培养一段时间，收集表达后的菌体蛋白。
进一步地，
所述对多种突变蛋白表达结果进行检测，获得检测结果包括：
将多个表达后的菌体蛋白放置到碱性的环境中处理；
使用双向琼脂扩散实验对碱性环境中的菌体蛋白进行活性检测；
获取活性检测的数据。
进一步地，
基于所述检测结果，筛选出最优突变蛋白A包括：
根据活性检测的数据，筛选出预设时间后活性最高的耐碱突变蛋白A做为最优突变蛋白A。
附图说明
构成本申请的一部分的附图用来提供对本申请的进一步理解，使得本申请的其它特征、目的和优点变得更明显。本申请的示意性实施例附图及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。
另外，贯穿附图中，相同或相似的附图标记表示相同或相似的元素。应当理解附图是示意性的，元件和元素不一定按照比例绘制。
在附图中：
图1是根据本申请实施例的整体的流程框图；
图2示出了SPA5-6和对照r-SPA的24小时1M NaOH处理的活性变化折线图；
图3显示了重叠PCR<XbaI,SalI>双酶切结果；Line1为酶切跑胶结果，Line2为Marker；
图4显示了载体和单突变目的基因<SalI,BamHI>双酶切结果。Line1为载体<SalI,BamHI>双酶切跑胶结果，Line2为Marker，Line3为单突变目的基因<SalI,BamHI>双酶切跑胶结果；
图5显示了DomainA-5作为模板进行PCR的结果。Line1为PCR的结果，Line2为Marker；
图6显示了SPA5-6蛋白胶图。Line1为Marker，Line2为SPA5-6蛋白；
图7显示了SPA5蛋白胶图。Line1为Marker，Line2为SPA5蛋白；
图8显示了SPA5和对照r-SPA的24小时1M NaOH处理的活性变化折线图。
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本公开的实施例。虽然附图中显示了本公开的某些实施例，然而应当理解的是，本公开可以通过各种形式来实现，而且不应该被解释为限于这里阐述的实施例。相反，提供这些实施例是为了更加透彻和完整地理解本公开。应当理解的是，本公开的附图及实施例仅用于示例性作用，并非用于限制本公开的保护范围。
另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与有关发明相关的部分。在不冲突的情况下，本公开中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
需要注意，本公开中提及的“第一”、“第二”等概念仅用于对不同的装置、模块或单元进行区分，并非用于限定这些装置、模块或单元所执行的功能的顺序或者相互依存关系。
需要注意，本公开中提及的“一个”、“多个”的修饰是示意性而非限制性的，本领域技术人员应当理解，除非在上下文另有明确指出，否则应该理解为“一个或多个”。
下面将参考附图并结合实施例来详细说明本公开。
参照图1-8，
一种蛋白A耐碱突变方法，包括以下步骤：
在目的蛋白C端增加GGGC序列，对蛋白A的A结构域选定多个突变位点；
使蛋白A基于结构域A在所述多个突变位点构建多个载体；
分别使用多个载体表达蛋白A的不同位点的突变蛋白；
对多种突变蛋白表达结果进行检测，获得检测结果；
基于所述检测结果，筛选出最优突变蛋白A。
进一步地，
所述使蛋白A基于结构域A在所述多个突变位点构建多个载体包括：
S1.获取多种设计引物，多种设计引物包括第一设计引物、第二设计引物……和第n设计引物；
S2.基于PCR程序将其中两种设计引物引入模板的突变位点，获取突变的目的基因；
S3.分别对模板和突变的目的基因进行双酶切，并获取第一酶切产物和第二酶切产物；
S4.对第一酶切产物和第二酶切产物进行T4连接，获取连接产物，并对连接产物通过Kana平板培养，并在Kana平板上提取质粒；
S5.用所述质粒作为模板，将其它设计引物引入模板的突变位点重复S3-S4，获取使蛋白A基于结构域A在所述多个突变位点构建的多个载体。
其中，
S1中，
多种设计引物包括第一设计引物、第二设计引物……和第n设计引物。本实施例优选提供制备一种载体的实施方式：
在制备这一种载体所用到的多种设计引物包括第一设计引物、第二设计引物、第三设计引物、第四设计引物、第五设计引物和第六设计引物。第一设计引物、第二设计引物、第三设计引物、第四设计引物、第五设计引物和第六设计引物分别为domainA F1'、domainAR1'、domainA F2'、domainA R2'、domainA F3'、domainA R3'。
DomainAF1'为TGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAA；
DomainAR1'为AGCAGGTTCGCGGACTGGGACGGATC；
DomainAF2'为GATCCGTCCCAGTCCGCGAACCTGCT；
DomainAR2'为AATAAATTAGCACTTTGACTAGGGTCGTC；
DomainAF3'为GACGACCCTAGTCAAAGTGCTAATTTATT；
DomainA R3'为CCGCCGCCGGATCCTTTCGCGTCGACCTTAGGAGCTT。
S2中，
基于PCR将其中两种设计引物引入模板的突变位点，获取突变的目的基因；
模板为单次重复蛋白A domain A SPA11蛋白表达前体载体。
模板的突变位点包括：R27L、N28L、K35Y、S41W。
PCR包括PCR体系和PCR程序。
具体如下：
首先，
PCR体系为：
试剂名称 使用量
PrimeSTAR Max 20μl
F' 2μl
R' 2μl
6#质粒 0.5μl
H2O 15.5μl
PCR程序：
PCR产物中加入10xLoading buffer进行1％琼脂糖凝胶电泳，150V，15min后观察核酸条带并切胶回收。
将回收产物重叠PCR。
PCR体系为：
试剂名称 使用量
PrimeSTAR Max 20μl
domainA F1' 2μl
domainA R3' 2μl
第一片段 0.5μl
第二片段 0.5μl
第三片段 0.5μl
H2O 15.5μl
PCR程序：
PCR产物中加入10x Loading buffer进行1％琼脂糖凝胶电泳，150V，15min后观察核酸条带并切胶回收目的基因。
切胶回收的目的基因便是突变目的基因。
S3中，
分别对模板和突变的目的基因进行双酶切，并获取第一酶切产物和第二酶切产物。
模板是单次重复蛋白A domain A SPA11蛋白表达前体载体。
双酶切过程如下：
使用<Xbal,SalI>对模板进行双酶切，37℃酶切2小时。
酶切体系为：
同时使用<Xbal,SalI>对S2中突变的目的基因进行双酶切，37℃酶切2小时。
酶切体系为：
突变的目的基因酶切后的产物为第一酶切过度产物(即为目的基因片段)插入基因酶切体系混合物，具体序列见序列1。模板酶切后的产物为第二过度酶切产物待插入基因的酶切后载体酶切体系混合物，具体序列见序列2。
将第一酶切过度产物加入10x Loading buffer进行1％琼脂糖凝胶电泳，150V，15min后观察核酸条带并切胶回收，获得的是第一酶切产物即插入基因具体序列与序列1相同。
将第二过度酶切产物加入10x Loading buffer进行1％琼脂糖凝胶电泳，150V，15min后观察核酸条带并切胶回收，获得的是第二酶切产物(即为载体片段)载体具体序列与序列2相同。
S4中，
对第一酶切产物和第二酶切产物进行T4连接，获取连接产物，并对连接产物通过Kana平板培养，并在Kana平板上提取质粒。
首先，
对第一酶切产物和第二酶切产物进行T4连接，获取连接产物的方法为：
连接体系：
T4连接；
pET28a<NcoI,XhoI>：2μL；
PCR回收结果<NcoI,XhoI>：18μL；
Solution I:20μL-40μL；
在16℃的环境下，T4连接5h，获得连接产物。
然后，
对连接产物通过Kana平板培养，并在Kana平板上提取质粒的方法包括：
将连接产物转入DH5α，冰上孵育后热激；冰上孵育的时间为30min。热激的温度为42℃，热激的时间为90s。
再次冰上孵育；时间为2-3min。
加入无抗LB后摇床培养，离心后取无抗LB重悬菌液涂布Kana平板；无抗LB的量为500μL。摇床培养时间为40min。离心的参数为4000rpm离心5min。
将Kana平板置于培养箱中培养；培养温度为37℃，培养时间为6-12小时。
一段时间后，挑取Kana平板上阳性单克隆菌P筛选并送样测序，取测序结果完整的菌株，在完整的菌株中提取质粒。
S5中，
用所述质粒作为模板，将其它设计引物引入模板的突变位点重复S3-S4，获取使蛋白A基于结构域A在所述多个突变位点构建的多个载体。
具体为：
PCR体系为：
试剂名称 使用量
PrimeSTAR Max 20μl
domainA F4' 2μl
domainA R4' 2μl
6#质粒 0.5μl
H2O 15.5μl
PCR程序：
PCR产物中加入10x Loading buffer进行1％琼脂糖凝胶电泳，150V，15min后观察核酸条带并切胶回收目的基因。
将回收的目的基因与提取的质粒分别进行BamHI，SalI双酶切。
酶切体系：
突变的目的基因酶切后的产物为第一酶切过度产物。模板酶切后的产物为第二过度酶切产物。
将第一酶切过度产物加入10x Loading buffer进行1％琼脂糖凝胶电泳，150V，15min后观察核酸条带并切胶回收。回收的是第一酶切产物。
将第二酶切过度产物加入10x Loading buffer进行1％琼脂糖凝胶电泳，150V，15min后观察核酸条带并切胶回收。回收的是第二酶切产物。
对第一酶切产物和第二酶切产物进行T4连接，获取连接产物，并对连接产物通过Kana平板培养，并在Kana平板上提取质粒。
首先，
对第一酶切产物和第二酶切产物进行T4连接，获取连接产物的方法为：
连接体系：
T4连接；
pET28a<NcoI,XhoI>：2μL；
PCR回收结果<NcoI,XhoI>：18μL；
Solution I:20μL-40μL；
在16℃的环境下，T4连接5h，获得连接产物。
然后，
对连接产物通过Kana平板培养，并在Kana平板上提取质粒的方法包括：
将连接产物转入DH5α，冰上孵育后热激；冰上孵育的时间为30min。热激的温度为42℃，热激的时间为90s。
再次冰上孵育；时间为2-3min。
加入无抗LB后摇床培养，离心后取无抗LB重悬菌液涂布Kana平板；无抗LB的量为500μL。摇床培养时间为40min。离心的参数为4000rpm离心5min。
将Kana平板置于培养箱中培养；培养温度为37℃，培养时间为6-12小时。
一段时间后，挑取Kana平板上阳性单克隆菌P筛选并送样测序，取测序结果完整的菌株，在完整的菌株中提取质粒。
最后，
质粒为domainA-5。该质粒是蛋白A基于结构域A在所述多个突变位点构建的多个载体中的一个。
其中，
S6中，
用所述蛋白A基于结构域A在多个突变位点构建的多个载体作为模板，将其它设计引物引入到模板的突变位点中获取突变的目的基因；
模板是domainA-5。设计引物是domainA-6F'和domainA R4’。
重复S3-S5，再次获取使蛋白A基于结构域A在所述多个突变位点构建的多个载体。获得的一种质粒为domainA-5-6。
其中domainA-5和domainA-5-6均为本发明制备的载体，且是多个载体中的两个。
进一步地，
所述分别对多个载体在蛋白A的不同位点进行突变蛋白表达的方法包括：
将多个载体分别与BL21感受态混合均匀；
对培养产物进行SDS-PAGE跑胶检测，获得蛋白表达情况。
将已经表达的培养产物转接LB培养基，培养一段时间后再加入0.1％IPTG，收集表达后的菌体蛋白。
本实施例中为，取1μL domainA-5-6质粒加入BL21感受态，混匀后冰上孵育30min，随后42℃热激90s，补加500mL无抗LB，37℃摇床30min，混合均匀。涂布LB Kana平板。将阳性BL21株系接入3mL LB培养基，37℃培养4-5h，再加入0.1％IPTG，20℃培养6-12小时，取1mL处理，SDS-PAGE跑胶(全菌，上清，沉淀)检测目的蛋白表达情况。
确定有表达后，将已经表达的蛋白转接300mL LB，37℃培养4-5h，再加入0.1％IPTG，20℃培养过夜，收集表达后的菌体蛋白。
IPTG为异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷。
本实施例中还为，取1μL domainA-5质粒加入BL21感受态，混匀后冰上孵育30min，随后42℃热激90s，补加500mL无抗LB，37℃摇床30min，混合均匀。
混合均匀后进行培养，获取培养产物；涂布LB Kana平板。将阳性BL21株系接入3mLLB培养基，37℃培养4-5h，再加入0.1％IPTG，20℃培养6-12小时，取1mL处理，SDS-PAGE跑胶(全菌，上清，沉淀)检测目的蛋白表达情况。
确定有表达后，将已经表达的蛋白转接300mL LB，37℃培养4-5h，再加入0.1％IPTG，20℃培养过夜，收集表达后的菌体蛋白。
进一步地，
所述对多种突变蛋白表达结果进行检测，获得检测结果包括：
将多个表达后的菌体蛋白放置到碱性的环境中处理；
使用双向琼脂扩散实验对碱性环境中的菌体蛋白进行活性检测；
获取活性检测的数据。
本实施例中为：
将菌体蛋白分别用1M NaOH处理，处理24小时，中间8小时，12小时，24小时分别取样，做三次平行重复，处理后取出的样品进行置换，置换3次，再浓缩至200-400μL后进行活性检测。
活性检测使用双向琼脂扩散实验，使用生理盐水加热溶解琼脂，制备1％琼脂平板，打孔后按0.5mg/mL，0.25mg/mL，0.125mg/mL，0.0625mg/mL，0.03125mg/mL，0.0156mg/mL浓度梯度加样，37℃扩散48h，如果是阳性反应，则抗体复合物会在相应的孔处形成一条沉淀线。如果在0.125mg/mL的孔位置甚至更低浓度的孔位置有沉淀线的出现，则判定为样品有活性。在越低浓度的孔位置出现沉淀线则判定为活性越强。
进一步地，
基于所述检测结果，筛选出最优突变蛋白A包括：
根据活性检测的数据，筛选出预设时间后活性最高的耐碱突变蛋白A做为最优突变蛋白A。由图2和图8，SPA5在1M NaOH处理24小时后仍有活性，而SPA5-6在1M NaOH处理24小时后已无活性。因此SPA5有着相较于SPA5-6更强的耐碱能力。
具体的，
domainA-5-6的序列连接方式为：HHHHHH-VDAKFD-Domain A’(1)-QAPKVDAKFD-Domain A’(2)-QAPKVDAKFD-Domain A’(3)-QAPKVDAKFD-Domain A’(4)-QAPKVDAKFD-Domain A’(5)-QAPKVDAKFD-Domain A’(6)-QAPKGSGGGC。
参照附图图2，可以发现本发明制备的domainA-5和domainA-5-6在一段时间过后，蛋白活性均远远高于野生的rSPA。
以上描述仅为本公开的一些较佳实施例以及对所运用技术原理的说明。本领域技术人员应当理解，本公开的实施例中所涉及的发明范围，并不限于上述技术特征的特定组合而成的技术方案，同时也应涵盖在不脱离上述发明构思的情况下，由上述技术特征或其等同特征进行任意组合而形成的其它技术方案。例如上述特征与本公开的实施例中公开的(但不限于)具有类似功能的技术特征进行互相替换而形成的技术方案。
序列表
序列1
CTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCAATGCACCACCACCATCACCACGTGGACGCGAAATTCGACGCGGATAACAACTTTAACAAAGAGCAGCAGAACGCATTCTATGAAATCCTGAACATGCCGAACCTGAATGAAGAACAGCTGAACGGCTTCATCCAGTCTCTGAAAGATGATCCGTCCCAGTCCGCGAACCTGCTGAGCGAAGCTAAAAAACTGAACGAAAGCCAGGCGCCGAAGCAGGCGCCGAAAGTTGATGCTAAGTTTGACGCAGACAATAATTTCAATAAGGAACAACAAAATGCGTTTTACGAGATTCTTAATATGCCAAATCTTAACGAGGAGCAACTTAACGGTTTTATTCAAAGCCTAAAAGACGACCCTAGTCAAAGTGCTAATTTATTATCTGAGGCGAAGAAGTTAAATGAGAGTCAAGCACCTAAACAAGCTCCTAAGG
序列2
TCGACGCGAAAGGATCCGGCGGCGGCTGCTAACTCGAGGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACTATATCCGGATTGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAATTAATTCTTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGTTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTAGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGTATTACTGTTTATGTAAGCAGACAGTTTTATTGTTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATACACTCCGCTATCGCTACGTGACTGGGTCATGGCTGCGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGGCAGCTGCGGTAAAGCTCATCAGCGTGGTCGTGAAGCGATTCACAGATGTCTGCCTGTTCATCCGCGTCCAGCTCGTTGAGTTTCTCCAGAAGCGTTAATGTCTGGCTTCTGATAAAGCGGGCCATGTTAAGGGCGGTTTTTTCCTGTTTGGTCACTGATGCCTCCGTGTAAGGGGGATTTCTGTTCATGGGGGTAATGATACCGATGAAACGAGAGAGGATGCTCACGATACGGGTTACTGATGATGAACATGCCCGGTTACTGGAACGTTGTGAGGGTAAACAACTGGCGGTATGGATGCGGCGGGACCAGAGAAAAATCACTCAGGGTCAATGCCAGCGCTTCGTTAATACAGATGTAGGTGTTCCACAGGGTAGCCAGCAGCATCCTGCGATGCAGATCCGGAACATAATGGTGCAGGGCGCTGACTTCCGCGTTTCCAGACTTTACGAAACACGGAAACCGAAGACCATTCATGTTGTTGCTCAGGTCGCAGACGTTTTGCAGCAGCAGTCGCTTCACGTTCGCTCGCGTATCGGTGATTCATTCTGCTAACCAGTAAGGCAACCCCGCCAGCCTAGCCGGGTCCTCAACGACAGGAGCACGATCATGCGCACCCGTGGGGCCGCCATGCCGGCGATAATGGCCTGCTTCTCGCCGAAACGTTTGGTGGCGGGACCAGTGACGAAGGCTTGAGCGAGGGCGTGCAAGATTCCGAATACCGCAAGCGACAGGCCGATCATCGTCGCGCTCCAGCGAAAGCGGTCCTCGCCGAAAATGACCCAGAGCGCTGCCGGCACCTGTCCTACGAGTTGCATGATAAAGAAGACAGTCATAAGTGCGGCGACGATAGTCATGCCCCGCGCCCACCGGAAGGAGCTGACTGGGTTGAAGGCTCTCAAGGGCATCGGTCGAGATCCCGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTTACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCCAGGGTGGTTTTTCTTTTCACCAGTGAGACGGGCAACAGCTGATTGCCCTTCACCGCCTGGCCCTGAGAGAGTTGCAGCAAGCGGTCCACGCTGGTTTGCCCCAGCAGGCGAAAATCCTGTTTGATGGTGGTTAACGGCGGGATATAACATGAGCTGTCTTCGGTATCGTCGTATCCCACTACCGAGATATCCGCACCAACGCGCAGCCCGGACTCGGTAATGGCGCGCATTGCGCCCAGCGCCATCTGATCGTTGGCAACCAGCATCGCAGTGGGAACGATGCCCTCATTCAGCATTTGCATGGTTTGTTGAAAACCGGACATGGCACTCCAGTCGCCTTCCCGTTCCGCTATCGGCTGAATTTGATTGCGAGTGAGATATTTATGCCAGCCAGCCAGACGCAGACGCGCCGAGACAGAACTTAATGGGCCCGCTAACAGCGCGATTTGCTGGTGACCCAATGCGACCAGATGCTCCACGCCCAGTCGCGTACCGTCTTCATGGGAGAAAATAATACTGTTGATGGGTGTCTGGTCAGAGACATCAAGAAATAACGCCGGAACATTAGTGCAGGCAGCTTCCACAGCAATGGCATCCTGGTCATCCAGCGGATAGTTAATGATCAGCCCACTGACGCGTTGCGCGAGAAGATTGTGCACCGCCGCTTTACAGGCTTCGACGCCGCTTCGTTCTACCATCGACACCACCACGCTGGCACCCAGTTGATCGGCGCGAGATTTAATCGCCGCGACAATTTGCGACGGCGCGTGCAGGGCCAGACTGGAGGTGGCAACGCCAATCAGCAACGACTGTTTGCCCGCCAGTTGTTGTGCCACGCGGTTGGGAATGTAATTCAGCTCCGCCATCGCCGCTTCCACTTTTTCCCGCGTTTTCGCAGAAACGTGGCTGGCCTGGTTCACCACGCGGGAAACGGTCTGATAAGAGACACCGGCATACTCTGCGACATCGTATAACGTTACTGGTTTCACATTCACCACCCTGAATTGACTCTCTTCCGGGCGCTATCATGCCATACCGCGAAAGGTTTTGCGCCATTCGATGGTGTCCGGGATCTCGACGCTCTCCCTTATGCGACTCCTGCATTAGGAAGCAGCCCAGTAGTAGGTTGAGGCCGTTGAGCACCGCCGCCGCAAGGAATGGTGCATGCAAGGAGATGGCGCCCAACAGTCCCCCGGCCACGGGGCCTGCCACCATACCCACGCCGAAACAAGCGCTCATGAGCCCGAAGTGGCGAGCCCGATCTTCCCCATCGGTGATGTCGGCGATATAGGCGCCAGCAACCGCACCTGTGGCGCCGGTGATGCCGGCCACGATGCGTCCGGCGTAGAGGATCGAGATCTCGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCT

Claims (8)

1.一种蛋白A耐碱突变方法，其特征在于，包括以下步骤：
在目的蛋白C端增加GGGC序列，对蛋白A的A结构域选定多个突变位点；
使蛋白A基于结构域A在所述多个突变位点构建多个载体；
分别使用多个载体表达蛋白A的不同位点的突变蛋白；
对多种突变蛋白表达结果进行检测，获得检测结果；
基于所述检测结果，筛选出最优突变蛋白A。
2.根据权利要求1所述的蛋白A耐碱突变方法，其特征在于：所述使蛋白A基于结构域A在所述多个突变位点构建多个载体的方法包括：
S1.获取多种设计引物，多种设计引物包括第一设计引物、第二设计引物……和第n设计引物；
S2.基于PCR将其中两种设计引物引入模板的突变位点，获取突变的目的基因；
S3.分别对模板和突变的目的基因进行双酶切，并获取第一酶切产物和第二酶切产物；
S4.对第一酶切产物和第二酶切产物进行T4连接，获取连接产物，并对连接产物通过Kana平板培养，并在Kana平板上提取质粒；
S5.用所述质粒作为模板，将其它设计引物引入模板的突变位点重复S3-S4，获取使蛋白A基于结构域A在所述多个突变位点构建的多个载体。
3.根据权利要求2所述的蛋白A耐碱突变方法，其特征在于：
所述使蛋白A基于结构域A在所述多个突变位点构建多个载体的方法还包括：
S6.用所述蛋白A基于结构域A在多个突变位点构建的多个载体作为模板，将其它设计引物引入到模板的突变位点中获取突变的目的基因；
重复S3-S5，再次获取使蛋白A基于结构域A在所述多个突变位点构建的多个载体。
4.根据权利要求2或3所述的蛋白A耐碱突变方法，其特征在于：
在S3中，向所述第一酶切产物中加入10x Loading buffer进行1％琼脂糖凝胶电泳，观察核酸条带并切胶回收。
5.根据权利要求4所述的蛋白A耐碱突变方法，其特征在于：
对连接产物通过Kana平板培养，并在Kana平板上提取质粒的方法包括：
将连接产物转入DH5α，冰上孵育后热激；
再次冰上孵育；
加入无抗LB后摇床培养，离心后取无抗LB重悬菌液涂布Kana平板；
将Kana平板置于培养箱中培养；
一段时间后，挑取Kana平板上阳性单克隆菌P筛选并送样测序，取测序结果完整的菌株，在完整的菌株中提取质粒。
6.根据权利要求2或3所述的蛋白A耐碱突变方法，其特征在于：
所述分别对多个载体在蛋白A的不同位点进行突变蛋白表达的方法包括：
将多个载体分别转入BL21感受态混合均匀，冰上孵育后热激，再次冰上孵育，加入无抗LB后摇床培养，离心后取无抗LB重悬菌液涂布Kana平板，将Kana平板倒置于培养箱中培养；
一段时间后将阳性单克隆进行培养，培养一段时间后再加入0.1％IPTG继续培养一段时间，获取培养产物；
对培养产物进行SDS-PAGE跑胶检测，获得蛋白表达情况。
将已经表达的培养产物转接LB培养基，培养一段时间后再加入0.1％IPTG继续培养一段时间，收集表达后的菌体蛋白。
7.根据权利要求6所述的蛋白A耐碱突变方法，其特征在于：
所述对多种突变蛋白表达结果进行检测，获得检测结果的方法包括：
将多个表达后的菌体蛋白放置到碱性的环境中处理；
使用双向琼脂扩散实验对碱性环境中的菌体蛋白进行活性检测；
获取活性检测的数据。
8.根据权利要求7所述的蛋白A耐碱突变方法，其特征在于：
基于所述检测结果，筛选出最优突变蛋白A的方法包括：
根据活性检测的数据，筛选出预设时间后活性最高的耐碱突变蛋白A做为最优突变蛋白A。
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