CN116655794A - 一种靶向t细胞淋巴瘤细胞的免疫细胞及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种靶向T细胞淋巴瘤细胞的免疫细胞及其制备方法和应用。本发明针对T细胞淋巴瘤细胞表面的抗原蛋白，通过免疫羊驼，分别获得了抗CD5和抗CD30的纳米抗体。在所得纳米抗体的基础上，本发明进一步利用基因工程技术，将所述纳米抗体表达于免疫细胞中，得到了相应的免疫细胞。经验证发现，本发明所述免疫细胞可以靶向T细胞淋巴瘤细胞并对其有效杀伤，具有抗肿瘤能力。除T细胞淋巴瘤细胞外，本发明所述免疫细胞也可靶向CD5及CD30阳性肿瘤细胞，用于CD5和CD30阳性肿瘤的治疗。

Description

一种靶向T细胞淋巴瘤细胞的免疫细胞及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及一种靶向T细胞淋巴瘤细胞的免疫细胞及其制备方法和应用。
背景技术
T细胞淋巴瘤(T-Cell lymphoma,TCL)是一组异质性非常大的起源于成熟T细胞的淋巴细胞恶性肿瘤，因肿瘤定位、病理特征和临床表现而有所不同。尽管TCL发病率低，但绝大部分TCL的共同特征是病程具侵袭性和治疗反应差，并且大多数淋巴结型TCL对常规化疗方案的反应较差，特别是对于治疗后进展的患者。近年来，嵌合抗原受体T细胞(chimericantigen receptor-T cells,CAR-T)在血液肿瘤治疗中获得了巨大的成功，并且在T细胞淋巴瘤的治疗中也开始崭露头角。但CAR-T治疗过程中，T细胞淋巴瘤由于抗原逃逸以及肿瘤抑制性免疫微环境等导致治疗效果欠佳。因此，新的靶向治疗方式仍然处于积极探索中，同时也需提供效果好的嵌合抗原受体T细胞以优化CAR-T对T细胞淋巴瘤的治疗效果。
开发针对T细胞恶性肿瘤的CAR-T疗法需要靶向肿瘤的T细胞，同时也保留正常T细胞和CAR-T细胞，或至少保留它们的一些亚群。大多数靶抗原在正常细胞和肿瘤细胞之间共享，使得肿瘤细胞的特异性靶向具有挑战性。现有靶向肿瘤抗原而保留CAR-T细胞的策略包括：靶向CAR-T细胞扩张期间会下调的泛-T抗原，如CD5，从而防止或减少CAR-T细胞之间相互杀伤，或靶向仅在正常细胞的一个少量亚群上表达的抗原，如CD4、CD30或CCR4等，从而保留大部分CAR-T细胞亚群。
纳米抗体(Nanobody,Nb)是驼类外周血中一种自然存在的抗体。目前，CAR结构中的胞外抗原结合域大多是基于单克隆抗体单链可变区(single chain antibodyfragment，scFv)设计的，具有较高的免疫原性，Nb可以降低这种免疫原性。同时，基于Nb的CAR-T可以充分发挥其T细胞免疫治疗的优势，诱导炎症细胞因子的释放以及CD8+T细胞的细胞毒性作用。但现有关于抗CD5等的纳米抗体较少，需基于靶向肿瘤抗原而保留CAR-T细胞的策略获得合适的纳米抗体，进一步获得对T细胞淋巴瘤细胞杀伤效果好的免疫细胞，开发针对T细胞恶性肿瘤的CAR-T疗法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有上述技术的缺陷和不足，提供一种靶向T细胞淋巴瘤细胞的免疫细胞及其制备方法和应用。
本发明的第一个目的是提供一种纳米抗体。
本发明的第二个目的是提供一种嵌合抗原受体。
本发明的第三个目的是提供一种质粒。
本发明的第四个目的是提供一种重组慢病毒。
本发明的第五个目的是提供一种嵌合抗原受体免疫细胞。
本发明的第六个目的是提供所述嵌合抗原受体免疫细胞的制备方法。
本发明的第七个目的是提供一种药物组合物。
本发明的第八个目的是提供所述纳米抗体，所述嵌合抗原受体、所述质粒、所述重组慢病毒、所述嵌合抗原受体免疫细胞或所述药物组合物在制备恶性肿瘤治疗药物中的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明提供了一种纳米抗体，所述纳米抗体是利用重组的CD5-His和CD30-His蛋白免疫羊驼得到。具体地，所述纳米抗体为抗CD5或抗CD30的纳米抗体。其中，抗CD5的纳米抗体命名为NbCD5-1C，其CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列依次如SEQ ID NO.3、5和7所示，编码CDR1、CDR2和CDR3的核苷酸序列(基因)依次如SEQ ID NO.4、6和8所示；NbCD5-1C的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码该重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。抗CD30的纳米抗体命名为NbCD30-2B，其CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列依次如SEQ IDNO.11、13和15所示，编码CDR1、CDR2和CDR3的核苷酸序列(基因)依次如SEQ ID NO.12、14和16所示；NbCD30-2B的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，编码该重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
基于本发明获得的纳米抗体，利用基因工程技术，本发明还构建了以所述纳米抗体作为抗原结合结构域的嵌合抗原受体和嵌合抗原受体免疫细胞，所述免疫细胞可以有效杀伤CD5和/或CD30阳性人T淋巴瘤细胞。因此，本发明请求保护所述嵌合抗原受体、嵌合抗原受体免疫细胞及其制备方法和应用。
本发明提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括信号肽、抗原结合结构域、铰链区、跨膜结构域、共刺激信号结构域和胞内信号传导结构域；所述抗原结合结构域为抗CD5和/或CD30的纳米抗体。
具体地，所述抗CD5的纳米抗体为纳米抗体NbCD5-1C；所述抗CD30的纳米抗体为纳米抗体NbCD30-2B；所述纳米抗体的氨基酸序列及编码基因的核苷酸序列如上所述。
可选地，所述铰链区为CD8铰链区，所述跨膜结构域为CD8跨膜结构域，所述共刺激信号结构域为CD28、4-1BB共刺激信号结构域，所述胞内信号传导结构域为CD3ζ胞内信号传导结构域。
作为一种可选的实施方式，本发明利用纳米抗体NbCD5-1C构建的嵌合抗原受体命名为SP-NbCD5-1C-CAR，其完整氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示，编码该氨基酸序列的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。
作为一种可选的实施方式，本发明利用纳米抗体NbCD30-2B构建的嵌合抗原受体命名为SP-NbCD30-2B-CAR，其完整氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示，编码该氨基酸序列的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示。
作为一种可选的实施方式，本发明利用纳米抗体NbCD5-1C和NbCD30-2B构建的双特异性嵌合抗原受体的完整氨基酸序列如SEQ ID NO.21所示，编码该氨基酸序列的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示；所述纳米抗体NbCD5-1C和NbCD30-2B通过(GGGGS)4柔性肽作为连接序列串联起来。
本发明还提供了一种质粒，所述质粒中含有本发明所述纳米抗体的编码基因，或含有本发明所述嵌合抗原受体的编码基因。
具体地，质粒(载体)的种类包括本领域熟知的细菌质粒、表达载体、慢病毒载体等；在表达载体中，除了含有复制起点外，还可含有标记基因和其他翻译控制元件。
可选地，本发明用于表达纳米抗体时所用载体为pcDNA3.1-IRES-EGFP，所述pcDNA3.1-IRES-EGFP通过在载体pcDNA3.1中插入IRES和GFP构建得到。
可选地，本发明用于构建含嵌合抗原受体的载体为慢病毒载体pCppt；更具体为pCppt-hCMV-IRES-GFP或pCppt-hCMV-IRES-RFP。
本发明还提供了一种重组慢病毒，所述重组慢病毒由转染有含有本发明所述嵌合抗原受体的编码基因的质粒和辅助质粒的细胞制备得到。
具体地，所述辅助质粒有2个，分别为psPAX2和pMD2.G，所述细胞为HEK 293T。
本发明还提供了一种嵌合抗原受体免疫细胞，所述细胞表达本发明所述的嵌合抗原受体；所述免疫细胞为T细胞。
本发明还提供了所述嵌合抗原受体免疫细胞的制备方法，所述方法为：将本发明任一所述嵌合抗原受体的编码基因通过慢病毒或者逆转录病毒的方式转导到细胞中。
可选地，本发明中是通过构建表达所述嵌合抗原受体的重组慢病毒载体，再通过慢病毒包装转导到细胞中。
本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括本发明所述嵌合抗原受体免疫细胞；所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。
本发明还请求保护所述纳米抗体、所述嵌合抗原受体、所述质粒、所述重组慢病毒、所述嵌合抗原受体免疫细胞或所述药物组合物在制备恶性肿瘤治疗药物中的应用。
具体地，所述恶性肿瘤为CD5和/或CD30阳性肿瘤。
可选地，所述恶性肿瘤为T细胞淋巴瘤。
具体地，所述T细胞淋巴瘤为CD5和/或CD30阳性。
本发明具有以下有益效果：
本发明针对T细胞淋巴瘤细胞表面的抗原蛋白，通过免疫羊驼，分别获得了抗CD5和抗CD30的纳米抗体。在所得纳米抗体的基础上，本发明进一步利用基因工程技术，将所述纳米抗体表达于免疫细胞中，得到了相应的免疫细胞。经验证发现，本发明所述免疫细胞可以靶向T细胞淋巴瘤细胞并对其有效杀伤，具有抗肿瘤能力。除T细胞淋巴瘤细胞外，本发明所述免疫细胞也可靶向CD5及CD30阳性肿瘤细胞，用于CD5和CD30阳性肿瘤的治疗。
附图说明
图1为抗CD5的纳米抗体阳性单克隆的第三轮ELISA结果。
图2为抗CD30的纳米抗体阳性单克隆的第三轮ELISA结果。
图3为抗CD5的纳米抗体阳性单克隆的流式鉴定结果。
图4为抗CD30的纳米抗体阳性单克隆的流式鉴定结果。
图5为ELISA方法检测的纳米抗体NbCD5-1C的亲和力结果；***p<0.001，****p<0.0001。
图6为SPR方法检测的纳米抗体NbCD5-1C的亲和力结果。
图7为ELISA方法检测的纳米抗体NbCD30-2B的亲和力结果；****p<0.0001。
图8为SPR方法检测的纳米抗体NbCD30-2B的亲和力结果。
图9为表达Nb-CAR的重组慢病毒载体的结构示意图。
图10为NbCD5-1C-CAR-T细胞的体外功能验证结果；**p<0.01，****p<0.0001。
图11为NbCD30-2B-CAR-T细胞的体外功能验证结果；***p<0.001，****p<0.0001。
图12为NbCD5-CAR-T、NbCD30-CAR-T和双特异性NbCD5-CD30-CAR-T细胞的体外功能验证结果；其中，上面两图分别为NbCD5-CAR-T、NbCD30-CAR-T和双特异性NbCD30-CD5-CAR-T细胞针对高表达CD30和CD5的Karpas-299细胞在不同效靶比下的杀伤结果；下面两图分别为NbCD5-CAR-T、NbCD30-CAR-T和双特异性Nb CD30-CD5-CAR-T细胞针对只表达CD30极低表达CD5靶抗原的细胞(CD30+CD5-SupT1)在不同效靶比下的杀伤结果；**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
图13为NbCD5-CAR-T、NbCD30-CAR-T和双特异性NbCD30-CD5-CAR-T细胞对小鼠荷瘤模型体内肿瘤的影响；*p<0.05，***p<0.001，****p<0.0001，ns无显著差异。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
本发明中，术语“纳米抗体”、“VHH”、“VHH抗体片段”无区别地使用，并且表示在骆驼科动物中发现的抗体的单个重链的可变结构域。在没有轻链的情况下，纳米抗体具有三个CDR，分别为CDR1、CDR2和CDR3，它是具有完整功能的最小的抗原结合片段。通常先获得天然缺失轻链和重链恒定区1(CH1)的抗体后，再克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的纳米抗体(Nanobody，Nb)也被称为VHH。纳米抗体/单域抗体作为一种新型的小分子抗体片段，由驼类天然的重链抗体重链可变区(VHH)克隆获得。
实施例1抗CD5和抗CD30的纳米抗体的获得
1、CD5抗原蛋白的制备
利用RNA提取试剂盒提取人Karpas-299细胞的RNA，参考Vazyme公司的III RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)反转试剂盒说明书，将提取所得RNA经逆转录反转成cDNA。以cDNA为模板，通过PCR获得CD5抗原蛋白的胞外区基因序列；PCR所用引物是参考基因登录号为NM_014207.4的序列进行设计，引物序列如下所示：
CD5引物F：CGGCTCAGCTGGTATGACCC；
CD5引物R：GGGGTTTGGATCCTGGCATG；
将PCR扩增所得CD5胞外区基因序列连接入3.1蛋白表达载体中进行重组表达，并通过Ni柱纯化，获得纯化的CD5-His蛋白。
2、CD30抗原蛋白的制备
CD30抗原的制备同CD5，区别在于PCR所用引物不同。CD30 PCR所用引物是参考基因登录号为NM_001243.5的序列进行设计，引物序列如下所示：
CD30引物F：TTCCCACAGGATCGACCCTT；
CD30引物R：CCCTGCATCCAGAACGGGCT；
将PCR扩增所得CD30胞外区基因序列连接入3.1蛋白表达载体中进行重组表达，并通过Ni柱纯化，获得纯化的CD30-His蛋白。
3、纳米抗体文库的构建
以纯化的CD5-His蛋白和CD30-His蛋白作为抗原蛋白对羊驼进行免疫，一共免疫四次，每两周进行1次免疫，每次免疫1mg抗原蛋白，在每次免疫的同时，抽取羊驼血来备用，以便后续验证四次免疫后的效价，在最后一次免疫6天后，抽取羊驼外周血液50mL。具体地，免疫时，抗原的体积在2mL以下，将抗原蛋白和佐剂按体积比为1：1的比例乳化使其形成均匀混合物，4℃保存；每次在羊驼颈部淋巴结附近分左右两侧注射，每侧分2点注射，每点注射0.4mL混合好的抗原；免疫后观察半小时确认羊驼状态良好，无不适症状。通过密度梯度离心法分离外周血单核细胞并用Trizol进行总RNA提取，通过反转录试剂盒反转录成cDNA，以所得cDNA为模板，通过PCR扩增抗体片段，一共进行两轮扩增，第一轮PCR得到纳米抗体的可变区和恒定区VHH-CH2，第二轮扩增得到纳米抗体的可变区VHH。用sfi I内切酶酶切后，将其连接入噬菌体质粒pComb3XSS载体中。将构建好的噬菌体重组质粒连接产物进行电转至噬菌体宿主菌SS320，进行扩增和纯化噬菌体文库，得到羊驼免疫的纳米抗体噬菌体文库。为了验证VHH基因插入率，随机选取建库平板上的单菌落，通过菌落PCR并对阳性菌落进行Sanger测序计算VHH基因的正确插入率以及检测序列多样性。
纳米抗体文库的构建结果显示，本发明成功构建得到了库容量为4.32×108的纳米抗体文库，达到建库要求，表明该文库有可能获得具有较高特异性和序列多样性的Nbs，可以进行后续筛选。另克隆阳性率达到100％，测序结果显示均为独立不重复序列，序列多样性良好，序列进行遗传进化树分析显示序列独立性良好。
4、纳米抗体噬菌体文库的扩增和富集筛选
将构建所得的纳米抗体SS320大肠杆菌文库转接到含四环素的2-YT液体培养基中，37℃、200rpm培养至OD值为0.5，加入辅助噬菌体M13K07进行侵染；轻轻混匀后在37℃下孵育30min；在2-YT培养基中加入氨苄抗生素，37℃、200rpm摇菌过夜培养，以扩增展示纳米抗体的噬菌体；将过夜菌液转移到50mL离心管中，离心取上清液，添加20％(wt/vol)PEG6000/2.5M NaCl溶液纯化噬菌体；离心弃上清，用PBS重悬沉淀后再次离心，取上清至新的离心管中，添加20％(wt/vol)PEG6000/2.5M NaCl溶液重新沉淀噬菌体；离心弃上清，将沉淀重新悬浮于1mL PBS中；离心后将上清液转移到新的离心管中，添加甘油至终浓度为20％，保存于-80℃中，随后进行噬菌体的筛选。
噬菌体的筛选：用CD5和CD30抗原蛋白包被免疫管，封闭后，加入纯化浓缩的噬菌体文库，与抗原蛋白孵育，清洗除去未结合的噬菌体，将结合蛋白的噬菌体洗脱进行扩增和纯化，同时进行滴定宿主菌稀释涂板，以检测筛选后的噬菌体滴度(纳米抗体噬菌体滴度测定：将噬菌体按10倍梯度进行稀释，取不同稀释倍数的噬菌体侵染对数生长期的SS320菌，37℃过夜培养，通过计算第二天的菌落数目得到纳米抗体噬菌体的滴度)，即为第一轮筛选过程。如此反复筛选3轮后，挑选最后涂布平板的单克隆，分别进行噬菌体的扩增和纯化，通过噬菌体单克隆ELISA实验验证筛选后的抗体与抗原蛋白的结合能力。
5、阳性单克隆的筛选与鉴定
从经三轮筛选后得到的SS320大肠杆菌文库中挑选单个克隆进行培养，利用辅助噬菌体M13K07进行侵染，进行单克隆噬菌体的制备；将单克隆噬菌体加入到包被有CD5-His或CD30-His蛋白的培养板中，室温孵育1h；用200μL PBST清洗板子后，加入anti-M13K07-HRP抗体，室温孵育1h；用200μL PBST清洗板子后，加入100μL TMB单组份显色液，室温孵育30min后加入100μL终止液；利用酶标仪检测450nm处的吸光度(判定阳性克隆方法为实验孔比对照组(BSA)的OD450读值比值大于等于2)。
将最后筛选得到的噬菌体稀释涂布平板后，进行两轮单克隆噬菌体ELISA检测，第一轮ELISA挑选5个96孔平板单克隆，根据第一轮ELISA结果，挑选其中OD450读值较高的96个单克隆进行二轮ELISA，挑选最高的24个阳性克隆继续第三轮ELISA。抗CD5纳米抗体阳性单克隆的第三轮ELISA结果如图1所示，由图1可知，针对CD5抗原，获得21个阳性单克隆。将这些阳性单克隆进行Sanger测序并用软件DNAMAN进行序列比对，去掉重复序列，得到6个不同的CD5-ELISA阳性单克隆。之后用流式细胞术对筛选到的阳性克隆进行鉴定，进一步纯化抗体进行抗原抗体ELISA结合鉴定序列特异性。
抗CD30的纳米抗体阳性单克隆的第三轮ELISA结果如图2所示，由图2可知，针对CD30抗原，获得16个阳性单克隆。将这些阳性单克隆进行Sanger测序并用软件DNAMAN进行序列比对，去掉重复序列，得到10个不同的CD30-ELISA阳性单克隆。之后用流式细胞术对筛选到的阳性克隆进行鉴定，进一步纯化抗体进行抗原抗体ELISA结合鉴定序列特异性。
前面已经筛选得到了可以与CD5或CD30抗原蛋白结合的纳米抗体，鉴于细胞表面抗原和纯化的抗原之间可能存在空间位阻的差异，因此前面筛选的纳米抗体需要进行靶细胞筛选验证。故接下来，通过流式细胞术检测，筛选得到能有效结合细胞的纳米抗体，同时也可以进一步筛选去掉假阳性克隆。将纯化后的单克隆噬菌体与细胞共孵育1h，用PBS清洗掉细胞上未结合的单克隆噬菌体，由于构建的噬菌体载体上携带His标签序列，因此可以用抗His-PE流式分析荧光抗体标记结合了带His标签的单克隆噬菌体的Karpas-299靶细胞，再用流式细胞术进行鉴定。
抗CD5的纳米抗体阳性单克隆的流式鉴定结果如图3所示，由图3所示结果可知，本发明鉴定到了流式阳性率较高的单克隆，得到了1个anti-CD5的纳米抗体，将其命名为纳米抗体NbCD5-1C。纳米抗体NbCD5-1C的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码该重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。其中，纳米抗体NbCD5-1C的CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列依次如SEQ ID NO.3、5和7所示；编码纳米抗体NbCD5-1C的CDR1、CDR2和CDR3的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.4、6和8所示。
抗CD30的纳米抗体阳性单克隆的流式鉴定结果如图4所示，由图4所示结果可知，本发明鉴定到了流式阳性率较高的单克隆，得到了1个anti-CD30的纳米抗体，将其命名为纳米抗体NbCD30-2B。纳米抗体NbCD30-2B的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，编码该重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。其中，纳米抗体NbCD30-2B的CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列依次如SEQ ID NO.11、13和15所示；编码纳米抗体NbCD30-2B的CDR1、CDR2和CDR3的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.12、14和16所示。
实施例2纳米抗体的重组表达及亲和力测定
1、纳米抗体的重组表达
本发明将筛选到的纳米抗体NbCD5-1C(SEQ ID NO.2所示)通过柔性多肽linker((GGGGS)4)连接至人IgG-FC片段(连接FC片段是为提高抗体表达产量以及增加抗体稳定性，FC片段还能作为标签蛋白结合protein A达到抗体纯化的目的)，同时，在纳米抗体序列的N端添加信号肽(MYRMQLLSCIALSLAL VTNS)，将SP-NbCD5-1C-Linker-FC片段插入至pcDNA3.1-IRES-EGFP质粒的Nhe I和Not I酶切位点之间，获得重组表达质粒pcDNA3.1-SP-NbCD5-1C-Linker-Fc-IRES-EGFP。取测序正确的重组质粒进行提取并转染至HEK 293T细胞中进行蛋白表达；表达完成后收集细胞上清过滤离心；经过Protein A亲和层析纯化获得纯度较高的纳米抗体NbCD5-1C。
所述IgG-FC片段的序列如下所示：
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
采用相同的方法，利用筛选到的纳米抗体NbCD30-2B(SEQ ID NO.10所示)构建得到重组表达质粒pcDNA3.1-SP-NbCD30-2B-Linker-Fc-IRES-EGFP。取测序正确的重组质粒进行提取并转染至HEK 293T细胞中进行蛋白表达；表达完成后收集细胞上清过滤离心；经过Protein A亲和层析纯化获得纯度较高的纳米抗体NbCD30-2B。
2、亲和力检测
(1)ELISA检测抗体亲和力
利用ELISA检测方法验证筛选得到的纳米抗体结合抗原蛋白的能力，将制备得到的CD5或CD30抗原蛋白过夜包被ELISA空白板，以经过表达纯化后不同稀释度的抗体作为分析物进行实验(作为一抗结合抗原蛋白)，用靶向FC片段的抗体作为二抗检测纳米抗体与抗原蛋白的结合。为了验证抗体结合能力的稳定性，使用抗体梯度稀释ELISA实验检测各个稀释度抗体与抗原蛋白之间的亲和力，对照为BSA蛋白。
(2)SPR方法检测抗体亲和力
通过SPR实验(表面等离子体共振技术)，使用Biacore T100分析系统进一步检测抗体的亲和力(KD值越小，抗体对其靶标的亲和力越大)。先将CD5-His或CD30-His蛋白共价偶联至CM5传感器芯片，再用不同浓度的纳米抗体进行亲和力检测，最后使用软件测定缔合和解离速率常数，测定NbCD5-1C对CD5蛋白的亲和力，以及NbCD30-2B对CD30蛋白的亲和力。
ELISA方法检测的纳米抗体NbCD5-1C的亲和力结果如图5所示，由图5可知，NbCD5-1C抗体稀释量效关系很好，抗体稀释后结合能力下降慢，且与对照组的量效关系曲线相比有显著性差异。SPR方法检测的纳米抗体NbCD5-1C的亲和力结果如图6所示，由图6可知，NbCD5-1C与CD5蛋白具有非常高的亲和力，亲和力常数(KD)为6.30×10-11，具有皮摩尔(pM)级别。上述结果均表明经筛选鉴定得到的抗CD5纳米抗体(NbCD5-1C)与人CD5蛋白均具有很高的亲和力。
ELISA方法检测的纳米抗体NbCD30-2B的亲和力结果如图7所示，由图7可知，NbCD30-2B抗体稀释量效关系很好，抗体稀释后结合能力下降慢，且与对照组的量效关系曲线相比有显著性差异。SPR方法检测的纳米抗体NbCD30-2B的亲和力结果如图8所示，由图8可知，NbCD30-2B与CD30蛋白具有非常高的亲和力，亲和力常数(KD)为4.17×10-11，具有皮摩尔(pM)级别。上述结果均表明经筛选鉴定得到的抗CD30纳米抗体(NbCD30-2B)与人CD30蛋白均具有很高的亲和力。
此外，本发明通过分别更换靶抗原，还对纳米抗体NbCD5-1C和NbCD30-2B的特异性进行了检测，结果发现，用CD30抗原蛋白包板，NbCD5-1C不具备结合能力，用CD5抗原蛋白包板，NbCD30-2B不具备结合能力，而靶向CD30的单抗的scFv-CD30确与CD5抗原蛋白具有一定的结合能力，表明本发明所得纳米抗体NbCD5-1C和NbCD30-2B脱靶性很低，抗原特异性强。
实施例3Nb-CAR-T细胞的制备及体外功能验证
1、表达Nb-CAR(Nb嵌合抗原受体)结构的慢病毒载体的构建
在构建重组慢病毒载体之前，本发明分别利用NbCD5-1C和NbCD30-2B构建了相应的Nb-CAR结构，分别为SP-NbCD5-1C-CAR和SP-NbCD30-2B-CAR。
所述SP-NbCD5-1C-CAR的完整氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示，编码该氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。所述SP-NbCD30-2B-CAR的完整氨基酸序列如SEQ IDNO.19所示，编码该氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示。
通过在载体pCppt(pCppt-hCMV-IRES-GFP)中连接Nb-CAR结构获得表达所述Nb-CAR的重组慢病毒载体。具体地，表达SP-NbCD5-1C-CAR的重组慢病毒载体命名为pCppt-hCMV-SP-NbCD5-1C-CAR-IRES-GFP，表达SP-NbCD30-2B-CAR的重组慢病毒载体命名为pCppt-hCMV-SP-NbCD30-2B-CAR-IRES-RFP，所述表达Nb-CAR的重组慢病毒载体的示意图如图9所示，由图9可知，整个Nb-CAR结构是在CMV启动子的后面，其中，SP部分指信号肽，NbCD5-1C部分为抗CD5的纳米抗体，NbCD30-2B部分为抗CD30的纳米抗体，CAR则包括CD8铰链区、CD8跨膜结构域、CD28、4-1BB共刺激信号结构域和CD3ζ胞内信号传导结构域，CAR后面通过IRES序列连接有GFP或RFP荧光蛋白。
2、慢病毒包装
在制备CAR-T细胞前，先进行慢病毒包装。
用多聚赖氨酸预处理培养皿并用HEK 293T细胞铺板；次日观察细胞密度达到80％后，用Opti-MEM培养基(一个10cm培养皿对应1mL)配脂质体试剂PEI-质粒混合液；其中，目的载体pCppt-hCMV-SP-NbCD5-1C-CAR-IRES-GFP或pCppt-hCMV-SP-NbCD30-2B-CAR-IRES-RFP用量为10μg，辅助质粒psPAX2用量为10μg，pMD-2G用量为4μg，加入培养皿中，共转染HEK293T细胞；8～12小时后，荧光显微镜下观察是否转染成功，同时更换新鲜培养基10mL；包装后48小时后进行慢病毒回收，500g离心病毒液以去除细胞碎片，0.45μm滤膜过滤；将10mL病毒液加到50mL离心管中，然后用加入病毒浓缩试剂(3mL50％ PEG 6000+1.28mL 4mol/LNaCl+1.37mL PBS)，混匀后放置4℃冰箱过夜；次日，4℃，4000rpm，40min离心，管底上可见白色沉淀，弃上清，加适量体积KBM 581培养基重悬慢病毒颗粒，立即进行T细胞的感染或分装于-80℃保存用。
3、CAR-T细胞制备
慢病毒包装完成后，进行CAR-T细胞的制备。
首先采集分离健康供者外周血单个核细胞(PBMC)：取10mL正常人外周血加入到40mL PBS溶液中，混匀，再取两个50mL无菌离心管，用巴氏管加入25mL人淋巴细胞分离液，缓慢加入25mL混匀的外周血，避免破坏液面分层，室温500g,离心40分钟，升速5，降速0；离心结束后小心吸出中间乳白色层(PBMCs)于新的50mL离心管中，并加入3～5倍体积PBS稀释，室温350g离心15分钟，升速5，降速5；弃上清液，PBS重悬细胞，室温300g离心5分钟，弃上清液。
通过CD8磁珠进行CD8细胞分选：用PBS溶液将细胞重悬10×106个细胞/mL，按照每1×106个细胞加入60μL人CD8磁珠细胞阴选试剂盒(广州培镨生物)中的Cocktail，混匀，室温孵育15分钟；加入10倍体积的PBS，室温300g离心7分钟，弃上清液；每1×106个细胞加入60μL人CD8磁珠细胞阴选试剂盒中的Streptavidin Particles，振荡混匀，室温孵育20分钟；加入PBS将细胞重悬至20～80×106个细胞/mL的浓度，体积为9mL，用5mL巴氏管将细胞悬液移入三个12×75mm流式管中，每管3mL，静置于BD IMagnet中贴合6～8分钟；小心吸出上清于离心管中，再准备三个新的12×75mm流式管，重复两次与BD IMagnet贴合，将细胞悬液转移至无菌的15mL离心管，室温350g离心5分钟，弃上清液；将分选出来的初始CD8+T淋巴细胞以1×106个细胞/mL的浓度悬于淋巴细胞无血清培养基KBM581(1％双抗)中，使用anti-CD3、anti-CD28和人IL-2细胞因子激活，anti-CD3、anti-CD28两者终浓度为25μL/mL，人IL-2终浓度为10μg/mL，将细胞加入6孔培养板或者T25培养瓶中，并置于培养箱(37℃，5％ CO2)中进行培养。
慢病毒的感染：培养2天后，使用自动细胞计数器进行培养过程中细胞数目的计算，吸取足量的细胞(1～3×106cell/1mL病毒浓缩重悬液(10mL病毒原液浓缩成1mL病毒浓缩重悬液))加入病毒浓缩重悬液，混匀后按5×105cell/500μL的密度加入到48孔细胞培养皿，每孔500μL，37℃，800g离心90分钟，之后置于培养箱(37℃，5％ CO2)中；8～12小时后更换新鲜淋巴细胞无血清培养基KBM581，置于培养箱(37℃，5％ CO2)中，补充人细胞因子；期间每隔2～3天更换培养基并补充对应浓度的IL-2细胞因子，扩大培养到7～14天，获得靶向CD5的Nb-CAR-T细胞，命名为NbCD5-1C-CAR-T。采用相同方法获得靶向CD30的Nb-CAR-T细胞，命名为NbCD30-2B-CAR-T。
4、CAR-T细胞的体外功能验证
为验证制备得到的CAR-T细胞的体外生物学活性，在培养过程中通过Promega公司的CytoTox 96非放射性细胞毒性检测试剂盒，通过测定LDH的释放进行了体外杀伤实验的验证。
将经过NbCD5-1C-CAR病毒感染的CD8+T淋巴细胞(NbCD5-1C-CAR-T)按不同比例与高表达CD5的Karpas-299细胞进行杀伤，实验首先消化培养的阳性靶细胞Karpas-299(CD5+人T淋巴瘤细胞)，以及对照阴性靶细胞Raji(CD5-人淋巴瘤细胞)，500g离心5min，重悬计数；实验靶细胞按照细胞量为104/孔加入V底96孔板，CD8+T淋巴细胞按照效靶细胞数目比10:1、5:1、2.5:1、1.25:1、0.625:1、0.3125:1的比例混匀后加入，总体积为150μL；背景对照组为等体积的无血清培养基KBM581，体积校正对照组加入等体积无血清培养基KBM581和10μL的10×细胞裂解液，效应细胞自释放组只加入等量的CD8+T淋巴细胞，靶细胞自释放组加入104个靶细胞，靶细胞最大释放组为104个靶细胞在16.7μL的10×细胞裂解液中充分裂解(收样前裂解)，KBM581培养基的自发组加入150μL 581培养基，KBM581培养基的最大释放组加入150μL 581培养基，再加入16.7μL的10×细胞裂解液(收样前裂解)，每组均设有3个副孔。加完样品后，室温下500g离心3分钟，37℃培养箱孵育24h。
收样前，靶细胞的最大释放组加入16.7μL的10×细胞裂解液，KBM581的最大释放组加入16.7μL的10×细胞裂解液，37℃培养箱孵育1～2h，培养板于室温下500g离心5分钟；随后，每孔取30μL上清液体转移至新的平底96孔板，加入30μL的LDH反应底物，室温避光反应30分钟后，加入30μL的终止液，检测490nm吸光度。细胞杀伤比例计算公式如下：
杀伤率＝(实验孔-效应细胞自发孔-靶细胞自发孔)/(靶细胞最大裂解孔-靶细胞自发孔)×100％
本发明制备所得的NbCD5-1C-CAR-T细胞的体外功能验证结果如图10所示，由图10可知，NbCD5-1C-CAR-T对靶细胞有较好的杀伤效应，10:1效靶比下的杀伤率为75％，并且在10:1、5:1、2.5:1、1.25:1效靶比下的杀伤率相比于对照组都有显著性差异，在10:1、5:1、2.5:1甚至达到****p<0.0001。
制备所得的NbCD30-2B-CAR-T体外功能验证实验大体同上，区别在于，将经过NbCD30-2B-CAR病毒感染的CD8+T淋巴细胞(NbCD30-2B-CAR-T)按不同比例与高表达CD30的Karpas-299细胞进行杀伤，实验首先消化培养的阳性靶细胞Karpas-299(CD30+人T淋巴瘤细胞)，以及对照阴性靶细胞Raji(CD30-人淋巴瘤细胞)。
本发明制备所得的NbCD30-2B-CAR-T细胞的体外功能验证结果如图11所示，由图11可知，NbCD30-2B-CAR-T对靶细胞有较好的杀伤效应，10:1效靶比下的杀伤率为63％，并且在各个梯度效靶比下的杀伤率相比于对照组都具有显著性差异，在10:1、5:1、2.5:1、1.25:1、0.3125:1甚至达到****p<0.0001。
实施例4纳米抗体来源的CD30和CD5双特异性CAR-T及体内外功能验证
本发明用(GGGGS)4柔性肽作为连接序列，通过将NbCD30和NbCD5串联，构建得到了双特异性的Nb-CAR结构，即NbCD30-Linker-NbCD5-CAR，其完整氨基酸序列如SEQ ID NO.21所示，编码该氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示。所述利用与实施例3相同的方法，本发明还构建得到了相应的双特异性CAR-T，命名为NbCD5-CD30-CAR-T。通过体外实验验证制备的双特异性Nb-CAR-T细胞的功能，选择分选后高表达CD30和CD5的T细胞淋巴瘤细胞系Karpas-299细胞作为阳性靶细胞验证杀伤双靶点靶细胞的能力，以只表达CD30极低表达CD5靶抗原的细胞(CD30+CD5-SupT1)作为抗原逃逸模型验证其防脱靶能力，以不表达CD30和CD5的淋巴瘤细胞系Raji细胞作为阴性对照靶细胞，进行体外杀伤实验；设置不同的效应细胞与靶细胞比例，形成五组效靶比梯度，分别为5:1、2.5:1、1.25:1、0.625:1、0.3125:1，实验结果通过乳酸脱氢酶(LDH)法细胞毒性检测。NbCD5-1C-CAR-T、NbCD30-2B-CAR-T和双特异性的NbCD5-CD30-CAR-T细胞的体外功能验证结果如图12所示，由图12可知，Karpas-299细胞作为阳性靶细胞，不管是单靶点CD30/CD5-CAR-T还是双特异性CAR-T都有着明显的杀伤效果；体外实验还证明，对于CD30和CD5双阳性靶细胞，双特异性CAR-T能达到单靶点CD30/CD5-CAR-T相同的杀伤能力，并且在较高效靶比5:1以及2.5:1的情况下有更好的杀伤效果。
实施例5动物模型功能验证
本发明进一步在体内小鼠荷瘤模型中验证了构建的NbCD30/CD5-CAR-T细胞的功能。具体地，选取6～8周的体态大小接近的NCG免疫缺陷鼠，每只在其背部皮下注射方式接种6×106Karpas-299细胞，7～10天后测量肿瘤体积(V＝1/2*长径*短径2)，当肿瘤体积约为100mm3时，给成瘤均一的小鼠随机分为四组，将T细胞通过尾静脉回输的方式注射小鼠体内，第一组NC-CAR-T是感染了CAR空载的T细胞，第二组是NbCD30-CAR-T细胞，第三组是NbCD5-CAR-T细胞，第四组是双特异性Nb CD30-CD5-CAR-T细胞；每组6只小鼠，每只小鼠回输的细胞数为3×106；同时，给三组小鼠腹腔注射huaman IL-2，注射剂量为1-2ug huamanIL-2/只小鼠，每隔2～3天注射一次，并且纵向监测各组肿瘤的动态生长情况(每3天测量一次小鼠肿瘤体积，并观察小鼠生存状态)。在回输完CAR-T细胞三周左右，颈椎脱臼法处死小鼠取肿瘤，进行肿瘤大小对比观测以及后续实验。
NbCD5-CAR-T、NbCD30-CAR-T和双特异性NbCD30-CD5-CAR-T细胞对小鼠荷瘤模型体内肿瘤的影响如图13所示，由图13可知，与NC-CAR-T细胞对照组相比，NbCD30-CAR-T和NbCD5-CAR-T细胞显著抑制肿瘤的体积，并且双特异性NbCD30-CD5-CAR-T细胞对小鼠皮下肿瘤的抑制能力显著强于单靶点。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体为抗CD5或抗CD30的纳米抗体；所述抗CD5的纳米抗体的CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列依次如SEQ ID NO.3、5和7所示；所述抗CD30的纳米抗体的CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列依次如SEQ ID NO.11、13和15所示。
2.根据权利要求1所述纳米抗体，其特征在于，所述抗CD5的纳米抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述抗CD30的纳米抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQID NO.9。
3.一种嵌合抗原受体，其特征在于，包括信号肽、抗原结合结构域、铰链区、跨膜结构域、共刺激信号结构域和胞内信号传导结构域；所述抗原结合结构域为抗CD5和/或CD30的纳米抗体。
4.根据权利要求3所述嵌合抗原受体，其特征在于，所述纳米抗体为权利要求1或2所述纳米抗体。
5.一种质粒，其特征在于，含有权利要求1或2所述纳米抗体的编码基因，或含有权利要求3或4所述嵌合抗原受体的编码基因。
6.一种重组慢病毒，其特征在于，所述重组慢病毒由转染有含权利要求3或4所述嵌合抗原受体的编码基因的质粒和辅助质粒的细胞制备得到。
7.一种嵌合抗原受体免疫细胞，其特征在于，所述细胞表达权利要求3或4所述嵌合抗原受体。
8.权利要求7所述嵌合抗原受体免疫细胞的制备方法，其特征在于，将权利要求3或4所述嵌合抗原受体的编码基因通过慢病毒或者逆转录病毒的方式转导到细胞中。
9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求7所述的嵌合抗原受体免疫细胞。
10.权利要求1或2所述纳米抗体，权利要求3或4所述嵌合抗原受体、权利要求5所述质粒、权利要求6所述重组慢病毒、权利要求7所述嵌合抗原受体免疫细胞或权利要求9所述药物组合物在制备恶性肿瘤治疗药物中的应用。
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