CN118005794A - 一种抗cldn18.2的重链抗体、相关产品和用途 - Google Patents

一种抗cldn18.2的重链抗体、相关产品和用途 Download PDF

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Abstract

本申请公开了一种抗CLDN18.2的重链抗体、相关产品和用途。所述重链抗体由重链可变区组成，所述重链可变区的CDR1的氨基酸序列包括SEQ ID No.6所示序列，所述重链可变区的CDR2的氨基酸序列包括SEQ ID No.12所示序列，所述重链可变区的CDR3的氨基酸序列包括SEQ ID No.18所示序列。本申请的抗CLDN18.2的重链抗体仅包括重链可变区，具备高亲和力和特异性，能够高效靶向CLDN18.2抗原，而不识别CLDN18.1，且结构简单，易于制备。此外，利用其制备的CAR‑T细胞能够特异性识别CLDN18.2阳性肿瘤细胞，同时还能释放多种细胞因子，对肿瘤细胞进行高效杀伤。

Description

一种抗CLDN18.2的重链抗体、相关产品和用途
本申请是申请号为2022115255188的分案申请，原申请的申请日为2022年11月30日，发明创造名称为《一种抗CLDN18.2的重链抗体、相关产品和用途》。
技术领域
本申请涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种抗CLDN18.2的重链抗体、相关产品和用途。
背景技术
重链抗体(heavy chain antibody，HcAb)发现于骆驼和鲨鱼类动物体内，是一种天然缺失轻链，只有重链组成的抗体。克隆其可变区可以得到只有重链可变区组成的单域抗体，称为VHH(Variabledomain of heavy chain of heavy chain antibody)，也称为纳米抗体(nanobody)，它是最小的功能性抗原结合片段。与普通抗体不同，纳米抗体是一条含有大约110个氨基酸的肽链，其分子量约为普通抗体的1/10，纳米抗体与普通抗体及重组单链抗体(single chain fragment variable，scFv)相比，具有分子小、稳定性好、可溶性好、易于表达、生产成本低等优点，在免疫实验、诊断与治疗中，具有广阔的应用前景。
Claudins(CLDNs)家族被发现在各种上皮组织中都存在着表达，在细胞间紧密连结中发挥着举足轻重的作用。CLDNs家族的数十个成员均为跨膜蛋白，在跨膜区内具有极高程度的一致性。CLDNs家族在维持上皮细胞的渗透压、保护屏障作用等起到重要作用，参与免疫防御过程；此外，CLDNs家族在许多肿瘤的发生发展过程中被观察到与平常相异的表达活动，并被作为肿瘤特异性标志蛋白得到各方各界的研究与讨论。CLDN18.2就是CLDNs家族的其中一位成员，在正常组织中表达水平非常低，但是研究发现在胃、乳腺、支气管等各个人体不同器官组织的原发性恶性肿瘤的发生发展过程中异常激活，呈现过度表达水平，在消化系统恶性肿瘤中尤为高发。所以，CLDN18.2因其高度选择、稳定地表达于胃癌等恶性实体瘤的特性，有望成为胃癌等一线治疗的新靶点。
CLDN18.2靶向治疗中的其中一个难点就在于具有一个与其结构非常相似的蛋白—CLDN18.1，该蛋白为由CLDN18基因第一个外显子的等位基因所形成的另一个剪切体。CLDN18.1与CLDN18.2的结构序列具有高度相似性，仅有位于胞外结构域ECL1序列上的7个氨基酸残基的差别。CLDN18.1仅在正常肺泡组织中高度表达，具有极高特异性。研究者与从业者开发的大多数靶向CLDN18.2的抗体通常也容易脱靶识别CLDN18.1，因此严重削弱了抗体药物的靶向性与安全性。因此开发特异性识别CLDN18.2而非CLDN18.1的抗体药物，成为开发过程中的难点所在。
综合上述，针对消化系统恶性肿瘤开发高效的CAR-T疗法，对于消化系统恶性肿瘤治疗领域具有重要意义。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本申请的目的在于提供一种抗CLDN18.2的重链抗体、相关产品和用途，用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的，本发明具体采用如下技术方案。
本申请的第一方面提供一种抗CLDN18.2的重链抗体，所述重链抗体由重链可变区组成，所述重链可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.1-SEQ ID No.6其中之一所示序列；所述重链可变区的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.7-SEQ ID No.12其中之一所示序列；所述重链可变区的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.13-SEQ ID No.18其中之一所示序列。
在某些实施方式中，所述重链可变区的氨基酸序列包括A1)或A2)：
A1)如SEQ ID No.38-SEQ ID No.43其中之一所示的氨基酸序列；
A2)与A1)所示的氨基酸序列具有至少80％以上同源性、且具有A1)所限定的氨基酸序列功能的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述重链可变区还包括框架区FR1-FR4：所述框架区FR1的氨基酸序列包括如SEQ ID No.19-SEQ ID No.23其中之一所示序列，所述框架区FR2的氨基酸序列包括如SEQ ID No.24-SEQ ID No.29其中之一所示序列，所述框架区FR3的氨基酸序列包括如SEQ ID No.30-SEQ ID No.35其中之一所示序列，所述框架区FR4的氨基酸序列包括如SEQ ID No.36或SEQ ID No.37所示序列。
本申请第二方面提供一种分离的多肽，所述多肽包括抗原结合结构域、铰链区和跨膜结构域，所述抗原结合结构域包含如上文所述的重链抗体。
在某些实施方式中，所述多肽为嵌合抗原受体。
在某些实施方式中，所述跨膜结构域包括CD8α跨膜区、CD28跨膜区或DAP10跨膜区中的一种或多种。
在某些实施方式中，所述铰链区包括CD8α铰链区。
在某些实施方式中，所述多肽自N端至C端依次包括所述重链抗体、铰链区和跨膜结构域。
本申请第三方面提供与如上文所述的重链抗体或如上文所述的多肽相关的生物材料，所述的生物材料包括如下中的一种或多种：
1)编码如上文所述重链抗体的核苷酸或编码如上文所述的多肽的核苷酸；
2)含有1)所述核苷酸的重组表达载体；
3)含有1)所述核苷酸的生物工程菌，或含有2)所述重组表达载体的生物工程菌。
在某些实施方式中，1)中，所述核苷酸的序列包括如SEQ ID No.44-SEQ ID No.49其中之一所示序列。
在某些实施方式中，所述重组表达载体选自慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺病毒载体。
优选地，所述重组表达载体为慢病毒载体。
本申请的第四方面提供一种细胞，所述细胞表达如上文所述的多肽。
在某些实施方式中，所述细胞选自T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞、肥大细胞和巨噬细胞中的一种或多种。
本申请的第五方面提供如上文所述的重链抗体或如上文所述的多肽或如上文所述的生物材料或如上文所述的细胞在制备体外检测产品、制备预防或治疗肿瘤药物中的用途。
在某些实施方式中，所述肿瘤为与表达CLND 18.2相关的肿瘤，优选地，选自膀胱癌、肝癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、胆道癌、白血病、淋巴瘤、胰腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、尿道癌、头颈癌、胃肠道癌、胃癌、食道癌、卵巢癌、肾癌、黑素瘤、前列腺癌和甲状腺癌中的一种或多种。
本申请的第六面提供一种检测产品，包括如上文所述的抗体或如上文所述的多肽或如上文所述的生物材料或如上文所述的细胞。
在某些实施方式中，所述产品用于检测CLND 18.2。
本申请的第七方面提供一种药物组合物，包括如上文所述的抗体或如上文所述的多肽或如上文所述的生物材料或如上文所述的细胞，以及药学上可接受的载体。
在某些实施方式中，所述药物组合物用于预防或治疗与表达CLND 18.2相关的肿瘤疾病。
优选地，所述与表达CLND 18.2相关的肿瘤选自膀胱癌、肝癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、胆道癌、白血病、淋巴瘤、胰腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、尿道癌、头颈癌、胃肠道癌、胃癌、食道癌、卵巢癌、肾癌、黑素瘤、前列腺癌和甲状腺癌中的一种或多种。
与现有技术相比，本申请的有益效果为：
(1)本发明的抗CLDN18.2的重链抗体仅包括重链可变区，具备高亲和力和特异性，能够高效靶向CLDN18.2抗原，且结构简单，易于制备。
(2)本发明利用抗CLDN18.2的重链抗体构建嵌合抗原受体，嵌合抗原受体能够高效靶向CLDN18.2，而不识别CLDN18.1。
(3)本发明的嵌合抗原受体细胞能够特异性识别CLDN18.2阳性肿瘤细胞，并进行高效杀伤，同时还能释放多种细胞因子包括TNF-α和IFN-γ因子等发挥细胞杀伤作用。
附图说明
图1A显示为本发明实施例2中采用Biacore检测抗CLDN18.2-A93 VHH抗体的亲和力曲线图。
图1B显示为本发明实施例2中采用Biacore检测抗CLDN18.2-A100 VHH抗体的亲和力曲线图。
图1C显示为本发明实施例2中采用Biacore检测抗CLDN18.2-A102 VHH抗体的亲和力曲线图。
图1D显示为本发明实施例2中采用Biacore检测抗CLDN18.2-A127 VHH抗体的亲和力曲线图。
图1E显示为本发明实施例2中采用Biacore检测抗CLDN18.2-B123 VHH抗体的亲和力曲线图。
图1F显示为本发明实施例2中采用Biacore检测抗CLDN18.2-B142 VHH抗体的亲和力曲线图。
图2A显示为本发明实施例3中6种抗CLDN18.2 VHH抗体识别CLDN18.2抗原的FACS检测结果图。
图2B显示为本发明实施例3中6种抗CLDN18.2 VHH抗体识别CLDN18.1抗原的FACS检测结果图。
图3A显示为本发明实施例4中表达CLDN18.2嵌合抗原受体的慢病毒载体(HDSIN03A93 41BBz)质粒图谱。
图3B显示为本发明实施例4中表达CLDN18.2嵌合抗原受体的慢病毒载体(HDSIN03A100 41BBz)质粒图谱。
图3C显示为本发明实施例4中表达CLDN18.2嵌合抗原受体的慢病毒载体(HDSIN03A102 41BBz)质粒图谱。
图3D显示为本发明实施例4中表达CLDN18.2嵌合抗原受体的慢病毒载体(HDSIN03A127 41BBz)质粒图谱。
图3E显示为本发明实施例4中表达CLDN18.2嵌合抗原受体的慢病毒载体(HDSIN03B123 41BBz)质粒图谱。
图3F显示为本发明实施例4中表达CLDN18.2嵌合抗原受体的慢病毒载体(HDSIN03B142 41BBz)质粒图谱。
图4显示为本发明实施例5中表达抗CLDN18.2抗体的嵌合抗原受体的结构示意图。
图5显示为本发明实施例9中T淋巴细胞的嵌合抗原受体表达率图。
图6A显示为本发明实施例10中6种CAR-T细胞对293T细胞的杀伤效果图。
图6B显示为本发明实施例10中6种CAR-T细胞对HGC-27-18.2细胞的杀伤效果图。
图6C显示为本发明实施例10中6种CAR-T细胞对N87-18.2细胞的杀伤效果图。
图7显示为本发明实施例11中6种CAR-T细胞分泌TNF-α细胞因子水平的柱状图。
图8显示为本发明实施例11中6种CAR-T细胞分泌IFN-γ细胞因子水平的柱状图。
图9显示为本发明实施例4中HD SIN03 CD19 CAR-KanaR质粒图谱。
具体实施方式
本发明采用表达CLDN18.2蛋白的CHO细胞免疫刺激羊驼产生高效价的抗体，并采用噬菌体展示技术构建了库容大于109的噬菌体展示骆驼VHH免疫文库，经淘选扩增获得6种候选抗体，包括CLDN18.2-A93、CLDN18.2-A100、CLDN18.2-A102、CLDN18.2-A127、CLDN18.2-B123和CLDN18.2-B142。发现其还原分子量小于40Kda，是普通抗体的1/10；通过Biacore检测，发现6种候选抗体的亲和力均达到nM级别；进一步发现6种候选抗体能特异性识别细胞表面的CLDN18.2抗原，而不识别CLDN18.1抗原。同时，构建了含有6种候选抗体的CAR-T细胞，发现其对CLDN18.2阳性的肿瘤细胞具有杀伤活性，并能高效分泌细胞因子TNF-α和IFN-γ。在此基础上完成了本发明。
本申请第一方面提供一种抗CLDN18.2的重链抗体，所述重链抗体由重链可变区组成，所述重链可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.1-SEQ ID No.6其中之一所示序列；所述重链可变区的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.7-SEQ ID No.12其中之一所示序列；所述重链可变区的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.13-SEQ ID No.18其中之一所示序列。
本申请的重链抗体由重链可变区组成，具有分子量小、亲和力高、对人体的免疫原性弱、更容易储藏和运输、更易表达、基因工程化改造等的优势。
SEQ ID No.1:GRTFSSYH
SEQ ID No.2:GSIAHIAGINV
SEQ ID No.3:RSILSFSV
SEQ ID No.4:GRIFRINN
SEQ ID No.5:GRTFGNYN
SEQ ID No.6:GFTLDYYS
SEQ ID No.7:ISWSGGIR
SEQ ID No.8:IFYSGTT
SEQ ID No.9:IFNGGHT
SEQ ID No.10:VSLGGTT
SEQ ID No.11:ISWSGSIT
SEQ ID No.12:ISGSGVST
SEQ ID No.13:AAAGVTLSRNEGDYAY
SEQ ID No.14:YANHNIANY
SEQ ID No.15:NANDLGFLAQNY
SEQ ID No.16:NADVYETPFSSKNY
SEQ ID No.17:AAASFDLTRDASRYAY
SEQ ID No.18:IARPIGNSWYCSIAYTDFGS
本发明中，所述重链可变区的CDR1的氨基酸序列包括SEQ ID No.1所示序列，CDR2的氨基酸序列包括SEQ ID No.7所示序列，CDR3的氨基酸序列包括SEQ ID No.13所示序列。
本发明中，所述重链可变区的CDR1的氨基酸序列包括SEQ ID No.2所示序列，CDR2的氨基酸序列包括SEQ ID No.8所示序列，CDR3的氨基酸序列包括SEQ ID No.14所示序列。
本发明中，所述重链可变区的CDR1的氨基酸序列包括SEQ ID No.3所示序列，CDR2的氨基酸序列包括SEQ ID No.9所示序列，CDR3的氨基酸序列包括SEQ ID No.15所示序列。
本发明中，所述重链可变区的CDR1的氨基酸序列包括SEQ ID No.4所示序列，CDR2的氨基酸序列包括SEQ ID No.10所示序列，CDR3的氨基酸序列包括SEQ ID No.16所示序列。
本发明中，所述重链可变区的CDR1的氨基酸序列包括SEQ ID No.5所示序列，CDR2的氨基酸序列包括SEQ ID No.11所示序列，CDR3的氨基酸序列包括SEQ ID No.17所示序列。
本发明中，所述重链可变区的CDR1的氨基酸序列包括SEQ ID No.6所示序列，CDR2的氨基酸序列包括SEQ ID No.12所示序列，CDR3的氨基酸序列包括SEQ ID No.18所示序列。
本发明中，所述重链可变区包括框架区FR1-FR4。优选地，所述FR1的氨基酸序列包括SEQ ID No.19或SEQ ID No.20或SEQ ID No.21或SEQ ID No.22或SEQ ID No.23所示序列。优选地，所述FR2的氨基酸序列包括SEQ ID No.24或SEQ ID No.25或SEQ ID No.26或SEQ ID No.27或SEQ ID No.28或SEQ ID No.29所示序列。优选地，所述FR3的氨基酸序列包括SEQ ID No.30或SEQ ID No.31或SEQ ID No.32或SEQ ID No.33或SEQ ID No.34或SEQIDNo.35所示序列。优选地，所述FR4的氨基酸序列包括SEQ ID No.36或SEQ ID No.37所示序列。
SEQ ID No.19:QVQLVESGGGLVQVGGSLRLSCAAS
SEQ ID No.20:EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS
SEQ ID No.21:EVQVVESGGGTVQPGGSLRLSCATS
SEQ ID No.22:QVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCAAS
SEQ ID No.23:QLQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS
SEQ ID No.24:MGWFRQAPGKEREFVAA
SEQ ID No.25:MGWYRQTPGKQRDFVAH
SEQ ID No.26:MGWYRQAPGNQREWVAH
SEQ ID No.27:MYWYRQAAGKQREFVAG
SEQ ID No.28:MGWFRQAPGKEREFVAG
SEQ ID No.29:IAWFRQAPGKEREGVSC
SEQ ID No.30:DYTSSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYC
SEQ ID No.31:TYADSVKGRFIISRDSATNTMSLQMNNLKPEDTATYYC
SEQ ID No.32:NYADSVKGRATISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYC
SEQ ID No.33:NAADSVKGRFTVSRDNAKNTMYLQMSAMKPDDTAVYYC
SEQ ID No.34:DYGDSVKGRFTISRDNAENTLYLQMNNLKPEDTAVYFC
SEQ ID No.35:KYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAIYYC
SEQ ID No.36:WGQGTQVTSSS
SEQ ID No.37:WGQGTQVTVSS
本发明中，所述框架区FR1的氨基酸序列包括SEQ ID No.19所示序列，FR2的氨基酸序列包括SEQ ID No.24所示序列，FR3的氨基酸序列包括SEQ ID No.30所示序列，FR4的氨基酸序列包括SEQ ID No.36所示序列。
本发明中，所述框架区FR1的氨基酸序列包括SEQ ID No.20所示序列，FR2的氨基酸序列包括SEQ ID No.25所示序列，FR3的氨基酸序列包括SEQ ID No.31所示序列，FR4的氨基酸序列包括SEQ ID No.37所示序列。
本发明中，所述框架区FR1的氨基酸序列包括SEQ ID No.21所示序列，FR2的氨基酸序列包括SEQ ID No.26所示序列，FR3的氨基酸序列包括SEQ ID No.32所示序列，FR4的氨基酸序列包括SEQ ID No.37所示序列。
本发明中，所述框架区FR1的氨基酸序列包括SEQ ID No.22所示序列，FR2的氨基酸序列包括SEQ ID No.27所示序列，FR3的氨基酸序列包括SEQ ID No.33所示序列，FR4的氨基酸序列包括SEQ ID No.37所示序列。
本发明中，所述框架区FR1的氨基酸序列包括SEQ ID No.23所示序列，FR2的氨基酸序列包括SEQ ID No.28所示序列，FR3的氨基酸序列包括SEQ ID No.34所示序列，FR4的氨基酸序列包括SEQ ID No.37所示序列。
本发明中，所述框架区FR1的氨基酸序列包括SEQ ID No.23所示序列，FR2的氨基酸序列包括SEQ ID No.29所示序列，FR3的氨基酸序列包括SEQ ID No.35所示序列，FR4的氨基酸序列包括SEQ ID No.37所示序列。
本发明中，所述重链可变区的氨基酸序列包括A1)或A2)：A1)如SEQ ID No.38-SEQID No.43其中之一所示的氨基酸序列；A2)与A1)所示的氨基酸序列具有至少80％以上同源性、且具有A1)所限定的氨基酸序列功能的氨基酸序列。SEQ ID No.38、SEQ ID No.39、SEQID No.39、SEQ ID No.40、SEQ ID No.41、SEQ ID No.42、SEQ ID No.43具体序列见下方，分别对应CLDN18.2-A93、CLDN18.2-A100、CLDN18.2-A102、CLDN18.2-A127、抗CLDN18.2-B123和CLDN18.2-B142。
SEQ ID No.38(代表框架区，下划线为CDR区):
SEQ ID No.39(代表框架区，下划线为CDR区):
SEQ ID No.40(代表框架区，下划线为CDR区):
SEQ ID No.41(代表框架区，下划线为CDR区):
SEQ ID No.42(代表框架区，下划线为CDR区):
SEQ ID No.43(代表框架区，下划线为CDR区):
本发明中，所述重链抗体的制备方法为：将所述重链抗体的编码基因插入表达载体，得到重组表达载体，将所述重组表达载体导入细胞并进行培养，进行分离纯化，得到所述重链抗体。
本申请的另一方面提供一种分离的多肽，所述多肽包括抗原结合结构域、铰链区和跨膜结构域，所述抗原结合结构域包含上文所述的重链抗体。
本发明中，利用所述重链抗体构建多肽，所述多肽能够高效靶向CLDN18.2。
本发明中，所述铰链区包括CD8α铰链区。
本发明中，所述跨膜结构域包括CD8α跨膜区、CD28跨膜区或DAP10跨膜区中的一种或多种。
本发明中，所述多肽还包括信号肽或信号转导结构域。优选地，所述信号肽包括CD8α信号肽。优选地，所述信号转导结构域包括免疫受体酪氨酸活化基序。更优选地，所述信号转导结构域还包括共刺激分子，所述共刺激分子包括4-1BB、CD28胞内区、OX40、ICOS或DAP10胞内区中的任意一种或至少两种的组合。在某些具体实施方式中，所述信号肽的氨基酸序列包括SEQ ID No.50所示的序列。在某些具体实施方式中，所述免疫受体酪氨酸活化基序的氨基酸序列包括SEQ ID No.52所示的序列。
MALPVTALLLPLALLLHAARP(SEQ ID No.50)。
RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID No.52)。
本发明中，所述多肽包括CD8α信号肽、所述重链抗体、CD8α铰链区、CD8α跨膜区和免疫受体酪氨酸活化基序。所述CD8α铰链区和跨膜区的氨基酸序列为
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC(SEQ ID No.51)。
本申请的另一方面与如上文所述的重链抗体或如上文所述的多肽相关的生物材料，所述的生物材料包括如下中的一种或多种：
1)编码如上文所述重链抗体的核苷酸或编码如上文所述的多肽的核苷酸；
2)含有1)所述核苷酸的重组表达载体；
3)含有1)所述核苷酸的生物工程菌，或含有2)所述重组表达载体的生物工程菌。
本发明中，1)中，编码如上文所述重链抗体的核苷酸的序列包括如SEQ ID No.44-SEQ IDNo.49其中之一所示序列。
SEQ ID No.44:
caggtgcagctggtggagagcggggggggcctggtgcaggtgggcgggagcctgaggctgagctgcgccgccagcggcaggacattcagcagctaccacatggggtggttccggcaggcccccggcaaggagagggagttcgtggccgccatcagctggagcgggggcatcagggactacacaagcagcgtgaagggcaggttcaccatcagccgggacaacgccaaaaacaccgtgtacctgcaaatgaacagcctcaagccagaggacaccgccgtgtactactgtgccgccgctggcgtcactctgtccaggaacgagggggattacgcttattgggggcagggcacacaggtgacaagcagcagc
SEQ ID No.45:
gaggtgcagctggtggagagcggggggggcctggtgcagcccggcggcagcctgaggctgagctgcgccgccagcgggagcatcgcccacatcgccgggatcaacgtgatggggtggtaccggcagacccccggcaagcagagggacttcgtggcccacatcttttacagcggcaccacaacatacgccgatagcgtgaagggcaggttcatcatcagccgggatagcgccaccaacaccatgagcctgcagatgaacaatctgaagcccgaggacacagccacatactactgctacgccaaccacaacatcgccaactattgggggcagggcacacaggtgaccgtgtcctcc
SEQ ID No.46:
gaagtgcaggtggtggagagcggcggcggcacagtgcagcccggcggcagcctgaggctgagctgcgccacaagccggagcatcctgagcttcagcgtgatggggtggtacaggcaggcccccggcaaccagcgggagtgggtggcccacatcttcaacggggggcacacaaactacgccgatagcgtgaaggggagggccaccatcagccgggataacgccaagaacacagtgtacctgcagatgagcagcctgaagcccgaggacaccgccgtgtactactgcaacgccaacgacctgggcttcctggcccagaactactgggggcaggggacacaggtgacagtgagcagc
SEQ ID No.47:
caggtgcagctggtggagagcggcggcgggagcgtgcagcccggcgggagcctgaggctgagctgcgccgcctccggccggatcttccgcattaacaacatgtactggtacaggcaggccgccgggaagcagcgggagttcgtggccggggtgagcctgggcggcaccaccaacgccgccgatagcgtgaagggccggttcacagtgagcagggataacgccaagaacaccatgtacctgcagatgagcgccatgaagcctgatgacaccgccgtctactactgtaacgctgacgtctatgagaccccctttagtagtaagaactactggggccagggcacacaggtgaccgtgagtagcSEQ ID No.48:
cagctgcagctggtggagagcggcgggggcctggtacagcccggcggcagcctccggctgtcctgcgccgccagcgggagaacatttgggaactacaatatggggtggtttaggcaggcccctggcaaggagcgggagttcgtcgccgggatcagctggagcggcagcatcaccgattacggcgactccgtgaaggggaggttcaccatcagccgggataacgccgagaacacactgtacctgcagatgaacaacctgaagcccgaggatacagccgtgtacttctgcgccgccgccagcttcgacctgaccagggacgccagcaggtacgcctactggggccagggcacacaggtgacagtgagcagc
SEQ ID No.49:
cagctgcagctggtggagagcgggggcggcctggtgcagcccggcgggagcctgaggctgagctgcgccgccagcgggttcaccctggactactactccatcgcctggttcaggcaggcccccggcaaggagcgggagggggtgagctgcatctccggcagcggggtgagcacaaagtacgccgatagcgtgaagggccggttcaccatcagcagggataacgccaagaacacagtgtacctgcagatgaacagcctgaagcccgaggatacagccatctactactgcatcgcccggcccatcgggaacagctggtactgcagcatcgcctacaccgacttcggcagctggggccaggggacacaggtgacagtgagcagc
本发明中，2)中，所述重组表达载体包括1)中所述的核苷酸。所述重组表达载体为病毒载体或非病毒载体。例如，非病毒载体包括：质粒，噬菌粒，柯斯质粒，人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1衍生的人工染色体(PAC)，噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体，以及动物病毒等。病毒载体包括：逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。载体可含有多种控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。载体还可包括协助其进入细胞的成分，包括但不限于，病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳。优选地，所述重组表达载体选自慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺病毒载体，更优地为慢病毒载体。
本发明中，3)中，所述生物工程菌1)所述的重组表达载体。优选地，所述生物工程菌由所述重组表达载体和辅助质粒转染哺乳细胞制备得到，如293T细胞。
本申请的另一方面提供一种细胞，所述细胞表达如上文所述的多肽。
本发明中，所述细胞选自T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞、肥大细胞和巨噬细胞中的一种或多种。
本发明利用所述重链抗体制备嵌合抗原受体，并进一步制备嵌合抗原受体免疫细胞(CAR-T细胞)，所述嵌合抗原受体免疫细胞能够特异性识别CLDN18.2阳性肿瘤细胞，并进行高效杀伤，同时还能释放多种细胞因子包括TNF-α和IFN-γ因子等发挥细胞杀伤作用。
本申请的另一方面提供如上文所述的重链抗体或如上文所述的多肽或如上文所述的生物材料或如上文所述的细胞在制备体外检测产品、制备预防或治疗肿瘤药物中的用途。
在某些实施方式中，所述肿瘤为与表达CLND 18.2相关的肿瘤，优选地，选自膀胱癌、肝癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、胆道癌、白血病、淋巴瘤、胰腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、尿道癌、头颈癌、胃肠道癌、胃癌、食道癌、卵巢癌、肾癌、黑素瘤、前列腺癌和甲状腺癌中的一种或多种。
本申请的另一方面提供一种检测产品，包括如上文所述的重链抗体或如上文所述的多肽或如上文所述的生物材料或如上文所述的细胞。
本发明中，所述产品用于检测CLND 18.2。
本发明中，所述检测产品选自试剂盒、芯片和膜条。
本发明中，所述检测产品通常可以针对作用靶标CLND 18.2抗原，以CLND 18.2抗原作为生物标志物进行诊断。所述的产品还可以包括抗CLND 18.2抗体的标记物，所述抗CLND18.2抗体的标记物通常可以用于标记抗CLND 18.2抗体，可选用的标记物的种类包括但不限于生物素、荧光素、辣根过氧化物酶、磁珠和琼脂糖珠中的一种或多种。
本申请的另一方面提供一种药物组合物，包括如上文所述的抗体或如上文所述的多肽或如上文所述的生物材料或如上文所述的细胞，以及药学上可接受的载体。
本发明中，所述药物组合物用于预防或治疗与表达CLND 18.2相关的肿瘤疾病。优选地，所述肿瘤包括表达CLND 18.2抗原的肿瘤，癌症的非限制性实例包括膀胱癌、肝癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、胆道癌、白血病、淋巴瘤、胰腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、尿道癌、头颈癌、胃肠道癌、胃癌、食道癌、卵巢癌、肾癌、黑素瘤、前列腺癌和甲状腺癌。
本发明中，所述的药学可接受的载体指不会在所施用的病人身上引发过敏反应或其他不适影响的载体。药学可接受的载体包括，例如，一种或多种水、生理盐水、磷酸缓冲液、左旋糖、甘油、乙醇和其他类似物，以及上述物质的组合。
本发明中，药学可接受的载体可进一步包括能提高抗体的保存期限或效用的微量辅助物质，例如湿润剂或乳化剂、防腐剂或缓冲液。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
实施例1抗CLDN18.2的重链抗体的获得
本实施例中，利用噬菌体展示技术对CLDN18.2免疫过的羊驼VHH免疫文库进行淘选，通过ELISA筛选，从而获得了高亲和力的抗CLDN18.2的重链抗体。包括如下步骤：
1.1噬菌体纳米抗体库的构建
采用表达CLDN18.2的CHO-Claudin 18.2细胞免疫羊驼，ELISA检测血清效价后，抽取外周血；分离淋巴细胞，获得外周血单核淋巴细胞沉淀，提取总RNA，再以RNA为模板反转录为第一链cDNA，然后利用巢式PCR扩增VHH基因；将VHH基因插入pMECS噬菌体展示载体，电转化TG1感受态细胞后，取菌液进行文库鉴定，剩余所有培养物均匀涂布于LB/AMPGLU平板，待菌长出收集菌苔，加入1/3体积的50％甘油，混匀分装，-80℃保存，成功构建了库容大于109的噬菌体展示骆驼VHH免疫文库。
1.2噬菌体纳米抗体库的淘选与扩增
将过表达CLDN 18.2蛋白的293T细胞(293T-CLDN 18.2)，用500μL 3％BSA进行封闭。
将步骤1.1构建的噬菌体展示骆驼VHH免疫文库用5％血清-PBS及3％ BSA进行稀释以及封闭。
最后将封闭后的293T-CLDN 18.2与封闭后的噬菌体文库稀释液共孵育，然后离心去除未结合噬菌体，进行淘洗；收集特异性结合的噬菌体，进行下一轮亲和淘选；将淘洗后的噬菌体文库进行培养扩增，用于下一轮淘选或者分析。
1.3特异性噬菌体克隆的鉴定及分析
将步骤1.2文库淘选的噬菌体滴加在平板上，用灭菌牙签随机挑取多个单克隆接种于2YT培养基中，cell：phage＝1：20的比例加入M13K07噬菌体培养过夜，取上清用细胞ELISA鉴定单克隆。阳性克隆进行测序。
共筛选到6种候选抗体，命名为CLDN18.2-A93、CLDN18.2-A100、CLDN18.2-A102、CLDN18.2-A127、CLDN18.2-B123和CLDN18.2-B142。
6种候选抗体CLDN18.2-A93、CLDN18.2-A100、CLDN18.2-A102、CLDN18.2-A127、CLDN18.2-B123和CLDN18.2-B142的氨基酸序列分别为SEQ ID No.38、SEQ ID No.39、SEQID No.40、SEQ ID No.41、SEQ ID No.42和SEQ ID No.43所示序列。
6种候选抗体CLDN18.2-A93、CLDN18.2-A100、CLDN18.2-A102、CLDN18.2-A127、CLDN18.2-B123和CLDN18.2-B142的核苷酸序列分别为SEQ ID No.44、SEQ ID No.45、SEQID No.46、SEQ ID No.47、SEQ ID No.48和SEQ ID No.49所示序列。
实施例2
本实施例中，对实施例1得到的6种候选抗体进行VHH Fc纳米抗体表达、纯化以及抗体亲和力测定。包括如下步骤：
2.1VHH Fc纳米抗体表达和纯化
将实施例1得到的6种候选抗体分别克隆到带有人Fc标签的真核表达质粒PTT5-Human-FC中，在293T细胞进行表达，并采用Protein A/G亲和层析进行纯化。得到纯化后6种带有人Fc标签的抗CLDN18.2 VHH抗体，包括抗CLDN18.2-A93 VHH Fc抗体、抗CLDN18.2-A100 VHH Fc抗体、抗CLDN18.2-A102 VHH Fc抗体、抗CLDN18.2-A127 VHH Fc抗体、抗CLDN18.2-B123 VHH Fc抗体、抗CLDN18.2-B142 VHH Fc抗体，通过酶标仪检测OD280的吸光值并计算得到浓度，通过SDS-PAGE胶检测纯度和分子量。
6种带有人Fc标签的CLDN18.2 VHH抗体的质量检测结果见表1。
表1蛋白表达量及其他相关信息
蛋白名称 浓度(mg/mL) 还原分子量Kda 非还原分子量Kda 纯度(SDS-PAGE)
CLDN18.2-A93-Fc 5.28 39Kda 78Kda >95％
CLDN18.2-A100-Fc 4.92 38Kda 76Kda >95％
CLDN18.2-A102-Fc 1.3 39Kda 78Kda >95％
CLDN18.2-A127-Fc 0.83 39Kda 78Kda >95％
CLDN18.2-B123-Fc 4.59 39Kda 78Kda >95％
CLDN18.2-B142-Fc 3.47 39Kda 78Kda >95％
2.2抗体亲和力测定
将步骤2.1得到的6种带有人Fc标签的抗CLDN18.2 VHH抗体通过Biacore进行亲和力的测定。
Biacore是基于表面等离子共振(surface Plasmon resonance,SPR)开发的生物分析传感技术，可检测跟踪溶液中的分子与固定在芯片表面的分子结合、解离的整个变化过程，以传感图的形式进行记录，并提供动力学和亲和力数据，测定过程中，将步骤2.1纯化后的抗CLDN18.2 VHH抗体固化到芯片表面，流动相为含有人Claudin-18.2蛋白的溶液，测定结果如表2和图1A至1F。
表2 6种带有人Fc标签的抗CLDN18.2VHH抗体与人Claudin-18.2蛋白的亲和力测试结果
抗体 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
CLDN18.2-A93-Fc 9.59E+05 4.99E-04 5.21E-10
CLDN18.2-A100-Fc 4.97E+05 6.41E-04 1.29E-09
CLDN18.2-A102-Fc 8.30E+05 4.86E-04 5.86E-10
CLDN18.2-A127-Fc 1.29E+06 5.82E-04 4.53E-10
CLDN18.2-B123-Fc 4.69E+05 6.39E-04 1.36E-09
CLDN18.2-B142-Fc 1.28E+06 4.45E-04 3.48E-10
Ka为结合常数，与Kd相反，值越大亲和力越强。
Kd为解离常数，表示解离反应的快慢，Kd越大代表解离越快，Kd越小代表解离越慢。
KD为平衡解离常数，KD表示处于平衡状态时解离程度，KD越大说明解离越多，代表亲和力越弱；KD越小说明解离越少，代表亲和力越强。
平衡解离常数KD＝Kd/Ka
从表2和图1A至1F可知，这6种带有人Fc标签的抗CLDN18.2 VHH抗体的亲和力均达到nM级别。
实施例3
本实施例3中，对抗CLDN18.2的重链抗体进行流式测定。
将稳定过表达CLDN18.2蛋白的293T细胞(293T-claudin 18.2-GFP，制备过程详见实施例7)或稳定过表达CLDN18.1蛋白的293T细胞(293T-claudin 18.1-GFP，制备过程详见实施例7)分别与实施例2中步骤2.1得到的纯化的6种带有人Fc标签的抗CLDN18.2 VHH抗体(抗CLDN18.2-A93 VHH Fc抗体、抗CLDN18.2-A100 VHH Fc抗体、抗CLDN18.2-A102VHH Fc抗体、抗CLDN18.2-A127 VHH Fc抗体、抗CLDN18.2-B123 VHH Fc抗体和抗CLDN18.2-B142 VHHFc抗体)在冰浴下孵育30min，然后用APC标记的羊抗鼠IgG抗体孵育30min，采用流式细胞仪检测(FACS)，结果见图2A和图2B。
同时设立空白对照组，以野生型的293T细胞为空白对照组。
从图2A和图2B可知，表明本申请的抗CLDN18.2的重链抗体能够特异性识别细胞表面的CLDN18.2抗原，而不识别细胞表面的CLDN18.1抗原。
实施例4
本实施例4中，制备表达抗CLDN18.2 VHH的重链抗体的嵌合抗原受体的慢病毒载体。
嵌合抗原受体的示意图如图4所示，包括启动子、信号肽、anti-CLDN18.2 VHH、CD8α铰链区、跨膜区和免疫受体酪氨酸活化基序。
CD8α信号肽的氨基酸序列为：MALPVTALLLPLALLLHAARP(SEQ ID No.50)。
CD8α铰链区和跨膜区的氨基酸序列为：
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC(SEQ ID No.51)。
免疫受体酪氨酸活化基序的氨基酸序列为：
RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQE GLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID No.52)。
4.1构建慢病毒载体
分别以实施例2得到的抗CLDN18.2-A93 VHH Fc抗体、抗CLDN18.2-A100 VHH Fc抗体、抗CLDN18.2-A102 VHH Fc抗体、抗CLDN18.2-A127 VHH Fc抗体、抗CLDN18.2-B123 VHHFc抗体和抗CLDN18.2-B142 VHH Fc抗体，采用如表3对应的引物合成6种含有CD8α信号肽的抗CLDN18.2 VHH Fc抗体片段(简称为抗体片段)，然后将抗体片段分别与CD8ahinge-TM-41BB-CD3Z片段和酶切后的HD SIN03 CD19 CAR-KanaR质粒连接，得到6种慢性病毒载体，包括HD SIN03 A93 41BBz、SIN03 A100 41BBz、SIN03 A102 41BBz、SIN03 A12741BBz、SIN03B123 41BBz、SIN03 B142 41BBz。
慢病毒载体HD SIN03 A93 41BBz、SIN03 A100 41BBz、SIN03 A102 41BBz、SIN03A12741BBz、SIN03 B123 41BBz、SIN03 B142 41BBz的图谱分别如图3A、3B、3C、3D、3E和3F所示。
表3
具体构建方法见如下步骤：
4.1.1片段CD8a signal-VHH的制备
使用表3中对应抗体的引物(见表3)，以实施例2合成的6种带有人Fc标签的抗CLDN18.2VHH抗体的核苷酸序列为模板，分别PCR扩增，得到6种PCR扩增片段。按照表4配制PCR反应体系，按照表7程序进行PCR反应。
1％琼脂糖电泳，用ZymocleanTM Gel DNA Recovery kit分别回收6种PCR扩增片段，每个PCR扩增片段的长度均在450bp左右，得到6种含有CD8α信号肽的抗CLDN18.2 VHH抗体片段。
表4PCR反应体系
4.1.2片段CD8a hinge-TM-41BB-CD3Z的制备
使用CD8aH-F和Vector-R两条引物(见表5)，以HD SIN03 CD19 CAR-KanaR质粒(质粒图谱见图9)为模板，进行PCR扩增。按照表6配制PCR反应体系，按照表7程序进行PCR反应。其中HD SIN03 CD19 CAR-KanaR质粒以3G11-BBz质粒(专利申请号：201710357213.3)为基础，将氨苄抗性基因更换为卡那抗性基因，且将5'LTR片段截短，变成含有末端自我失活(SIN)结构的病毒载体(质粒图谱见图9)。
1％琼脂糖电泳，用ZymocleanTM Gel DNA Recovery kit回收片段，长度为695bp，得到CD8a hinge-TM-41BB-CD3Z片段。
表5
表6PCR反应体系
表7
4.1.3酶切载体的制备
将HD SIN03 CD19 CAR-KanaR质粒(质粒图谱见图9)，采用BamHI-HF和EcoRI-HF双酶切，1％琼脂糖电泳ZymocleanTM Gel DNA Recovery kit回收载体，长度为7710bp。酶切反应体系见表8。
表8
4.2重组与转化
4.2.1将本实施例中步骤4.1.3的回收载体分别和本实施例中步骤4.1.1的CD8asignal-VHH片段和本实施例中步骤4.1.2的CD8a hinge-TM-41BB-CD3Z片段用ClonExpress II one step cloning kit完成重组反应，反应条件：37℃，30min，得到重组产物。重组反应体系见表9。
表9
Contents Volume(μL)
步骤4.1.3的HD SIN03 CD19 CAR-KanaR 200ng
步骤4.1.1的CD8a signal-VHH片段 18ng
步骤4.1.2的CD8a hinge-TM-41BB-CD3Z片段 28ng
5×Buffer 4μL
重组酶 2μL
Total volume Add ddH2O to 20μL
4.2.2取10μL本实施例中步骤4.2.1得到的重组产物热转化至大肠杆菌stbl3感受态中(100μL)，用kana抗性平板挑选阳性单克隆菌种进行下一步的测序鉴定。
4.3PCR鉴定与测序鉴定
以LV-F2、LV-R为引物(详见表12)按照表10的反应体系配制，然后按照表11的程序进行PCR反应，得到PCR产物，然后经1％琼脂糖电泳和EB染色鉴定，PCR产物的长度为1200-1300bp。
表10
按照表10制备PCR反应体系后按照表11程序进行PCR。
表11
PCR结束后，挑选鉴定正确的克隆送公司测序(测序引物为LV-F2和LV-R，引物见表12)，最后挑选正确克隆摇菌用质粒大提试剂盒提取质粒，阳性克隆为构建的慢病毒载体。
表12
引物 序列 序列编号
LV-F2 tcttggttcattctcaagcctc SEQ ID No.67
LV-R gcaacatagttaagaatacc SEQ ID No.68
实施例5
本实施例中，对实施例4得到的慢病毒载体进行慢病毒的包装，包括以下步骤：
(1)以1.6×107细胞数接种293T细胞于15cm培养皿中，37℃，5％ CO2培养过夜准备包装病毒，培养基为含DMEM，添加10％胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)；
(2)分别将14.5μg实施例4得到的慢病毒载体与16.7μg辅助质粒pMDlg-RRE、16.7μg辅助质粒pRSV-REV以及6.5μg包膜质粒VSVg溶入2mL无血清DMEM培养液，混匀；
(3)将163.2μg PEI(1μg/μL)溶解于2mL的无血清DMEM培养液中，轻轻混匀(或1000rpm涡旋5秒钟)，室温孵育5min，得到PEI混合液；
(4)转染复合物的形成：将步骤(3)得到的PEI混合液加入DNA混合液中，加入后立即涡旋混合或轻轻混匀，室温下孵育20min，得到转染复合物；
(5)将步骤(4)得到的转染复合物4mL滴加入含25mL DMEM培养基的15cm培养皿中，4-5h小时后，更换含2％FCS的DMEM培养基，培养48h后，收集病毒上清。
实施例6
本实施例中，对实施例5得到的包装过的慢病毒进行慢病毒浓缩，包括以下步骤：
将实施例5中步骤(5)得到的病毒上清用0.45μm滤膜过滤后收集到50mL离心管中，加入1/4的PEG-NaCl病毒浓缩液，上下颠倒混匀，4℃放置过夜；然后于4℃和3500rpm下离心30min；去上清，病毒沉淀中加入RPMI 1640培养基(含10％ FBS)，以溶解重悬病毒沉淀；浓缩后的慢病毒悬液分装成50μL每份，保存在成品管中，储存在-80℃。
实施例7
本实施例中，过表达细胞株的构建，包括如下：
Claudin 18.2-GFP慢病毒的获得：14.5μg的claudin 18.2-GFP质粒(购自云舟生物)、16.7μg辅助质粒pMDlg-RRE、16.7μg辅助质粒pRSV-REV以及6.5μg包膜质粒VSVg进行共转染获得，步骤同实施例5。
claudin 18.1-GFP慢病毒的获得：14.5μg的claudin 18.1-GFP质粒(购自云舟生物)、16.7μg辅助质粒pMDlg-RRE、16.7μg辅助质粒pRSV-REV以及6.5μg包膜质粒VSVg进行共转染获得，步骤同实施例5。
过表达CLDN18.2蛋白的293T细胞(简记为293T-CLDN 18.2)的获得：将293T细胞按照1×106个/孔接种到6孔板中，加入1mL的claudin 18.2-GFP慢病毒，得到。
过表达CLDN18.1蛋白的293T细胞(简记为293T-CLDN 18.1)的获得：将293T细胞按照1×106个/孔接种到6孔板中，加入1mL的claudin 18.1-GFP慢病毒，得到。
过表达CLDN18.2蛋白的HGC27细胞(HGC-27-18.2-GFP细胞)的获得：将HGC-27细胞按照1×106个/孔接种到6孔板中，加入1mL的claudin 18.2-GFP慢病毒，得到。
过表达CLDN18.2蛋白的N87细胞(N87-18.2-GFP)的获得：将NCI-N87细胞按照1×106个/孔接种到6孔板中，加入1mL的claudin 18.2-GFP慢病毒，得到。
实施例8
本实施例中，对实施例6得到的经浓缩后的病毒进行慢病毒滴度检测，包括以下步骤：
将500μL Junkat细胞(1×105个细胞)接种细胞于24孔培养板，形成细胞悬液；实施例6得到的浓缩后的慢病毒分别以1μL、0.2μL和0.04μL添加到细胞悬液中，并添加polybrene至终浓度为5μg/mL；然后于37℃和5％CO2培养过夜后，更换新鲜培养基；感染72h后，收集细胞，400g离心5min，弃上清，流式缓冲液(PBS+2％新生牛血清)洗一次；按1:100稀释比例加入MonoRabTMRabbit Anti-Camelid VHH Cocktail[iFluor 488]抗体，冰上孵育30min；然后用1mL流式缓冲液清洗两次后，采用流式细胞仪检测；取阳性率为5～20％的细胞样品，计算滴度。
滴度(TU/mL)＝细胞数量(105)×阳性率/病毒体积(mL)。
实施例9
本实施例中，利用实施例8滴度符合要求的慢病毒转导T淋巴细胞。
9.1T淋巴细胞的复苏
将复苏的PBMC细胞200g离心9min，弃上清，用T细胞培养基重悬沉淀，计数，调节密度至1.5-2×106cells/mL，并接种到48孔细胞培养板中，静置2h后进行活化。
9.2T淋巴细胞的活化
将PBMC用T细胞培养基(X-VIVO+10％ FBS+IL-2(300U/mL)调整密度到2×106cells/mL，1:100添加T cell transact，接种到合适的培养容器活化24-48h，同时满足使细胞密度维持在2×106cells/ml，得到的活化的T细胞。
9.3T细胞感染
收集步骤9.2得到的活化的T细胞，调整细胞密度为1×106/mL，按照感染复数MOI＝10加入实施例8得到的慢病毒，添加polybrene至终浓度为5μg/mL；于37℃、5％ CO2环境中培养过夜后更换新鲜培养基。每2-3天进行传代。
9.4嵌合抗原受体表达
本实施例中步骤9.3感染5天后，取3×105的T细胞，4℃、400g离心5min，弃上清，流式缓冲液(PBS+2％兔血清)洗一次；按1:100稀释比例加入MonoRabTMRabbit Anti-CamelidVHH Cocktail(iFluor 488)抗体，冰上孵育30min；然后用1mL流式缓冲液清洗两次后，采用流式细胞仪检测T淋巴细胞的嵌合抗原受体感染效率，结果见图5。
从图5可知，感染后的CAR-T细胞有明显的阳性细胞群，表明成功构建了6种表达不同结构嵌合抗原受体的CAR-T细胞，分别为嵌合抗原受体的抗原结合结构域含有CLDN18.2-A93、CLDN18.2-A100、CLDN18.2-A102、CLDN18.2-A127、CLDN18.2-B123和CLDN18.2-B142抗体。
CLDN18.2-A93、CLDN18.2-A100、CLDN18.2-A102、CLDN18.2-A127、CLDN18.2-B123和CLDN18.2-B142抗体对应的CAR-T细胞标记分别为CLDN18.2(A93)、CLDN18.2(A100)、CLDN18.2(A102)、CLDN18.2(A127)、CLDN18.2(B123)和CLDN18.2(B142)。
实施例10
本实施例中，利用实施例9制备的6种CAR-T细胞进行体外毒性实验，包括以下步骤：
10.1靶细胞接种
取293T细胞(claudin 18.2-)、HGC-27-18.2-GFP细胞(claudin 18.2+)、N87-18.2-GFP细胞(claudin 18.2+)作为靶细胞，400g离心5min，5％ FBS的1640培养基重悬，计数，调整靶细胞浓度为1×105/mL。
其中，HGC-27-18.2-GFP细胞(claudin 18.2+)和N87-18.2-GFP细胞(claudin18.2+)的制备详见实施例7。
10.2效应细胞接种
以实施例9制备的6种CAR-T细胞(CLDN18.2(A93)、CLDN18.2(A100)、CLDN18.2(A102)、CLDN18.2(A127)、CLDN18.2(B123)和CLDN18.2(B142))和对照T(未进行慢病毒感染)细胞为效应细胞；将效应细胞400g离心5min，5％ FBS的1640培养基重悬，计数，调节细胞密度至所需浓度A(所调CAR-T密度＝3×105cells/mL/感染效率)；
10.3效应细胞倍比稀释
将A浓度的CAR-T细胞3倍稀释至浓度为B的CAR+T细胞，将B浓度的CAR-T细胞3倍稀释至浓度为C的CAR-T细胞；
10.4将效应细胞和靶细胞按照效靶比为0.3:1、1:1和3:1加入至含有培养基的96孔板中(根据靶细胞选择合适的96孔板)，每组3个复孔，每孔总体积200μL；
10.5于37℃孵育18h后，将裂解液(10×)20μL加到孔里；并不定期观察细胞裂解情况，确保细胞裂解完全；
10.6配置底物，将12mL assay buffer(乳酸)加入到substrate mix(四唑盐类)/瓶，混匀避光待用(约两块96孔板用量)，得到底物溶液；
10.7用排枪将步骤10.5处理后的所有孔吹吸6-8次后，500g离心5min，取50μL/孔上清至新的酶标板(平底96孔板)中。
10.8把步骤10.6配好的底物溶液以50μL/孔加到步骤10.7的新的酶标板中，盖好平板，室温避光孵育约30min；
10.9每孔加入50μL终止液(乙酸)，30min内在490nm测量吸光值。
导出数据，分析作图。细胞毒性计算公式为(均扣除空白培养基对照)：
图6A、图6B、图6C分别为构建的含有抗CLDN18.2的重链抗体的CAR-T细胞对293T细胞、HGC-27-18.2-GFP细胞和N87-18.2-GFP细胞的杀伤效果图。
从图6A、图6B和6C可知，本申请构建的CAR-T细胞(CLDN18.2(A93)、CLDN18.2(A100)、CLDN18.2(A102)、CLDN18.2(A127)、CLDN18.2(B123)和CLDN18.2(B142))对CLDN18.2阳性肿瘤细胞(包括HGC-27-18.2-GFP(claudin 18.2+)和N87-18.2-GFP(claudin18.2+))具有高效杀伤活性，且对CLDN18.2阴性细胞(293T(claudin 18.2-))无杀伤作用，说明构建的CAR-T细胞具备高特异性。
实施例11
本实施例中，检测CAR-T细胞因子的分泌情况，包括如下：
11.1细胞培养上清
实验分为三组，一组为实施例9中的效应细胞于37℃单独培养18h，一组为实施例9中的效应细胞和293T细胞于37℃共培养18h，一组为实施例9中的效应细胞和CLDN 18.2阳性的293T细胞(293T-CLDN 18.2)于37℃共培养18h，其中效靶比为1:1。同时设立Control T组(未进行慢病毒感染)。CLDN 18.2阳性的293T细胞(293T-CLDN 18.2)的获得详见实施例7。
培养结束后，将细胞培养物于400×g离心10min去除沉淀物，取上清置于-80℃贮存待检。
11.2检测IFN-α和IFN-γ
11.2.1试剂：使用联科生物ELISA试剂盒(货号分别为：人γ干扰素ELISA试剂盒：EK180-96；人肿瘤坏死因子α(TNF-α)ELISA试剂盒：EK182-96)进行检测，检测前将所有的试剂、样本恢复至25℃，按照使用说明配制1×洗液，1×检测缓冲液，检测抗体。
11.2.2标准品及样品配制标准品：使用5％1640培养基2倍稀释标准品原液，一共8个稀释梯度，包括零浓度。
样品：使用5％1640培养基按比稀释样品。
11.2.3检测步骤
(1)浸泡酶标板：加入300μL 1×洗液静置浸泡30s，弃掉洗液之后，在吸水纸上将微孔板拍干；
(2)加标准品：标准品孔加入100μL 2倍倍比稀释的标准品，空白孔加入100μL 5％1640培养基；
(3)加样本：样本孔加入100μL本实施例中步骤11.1得到的细胞培养上清；
(4)加检测抗体：每孔加入50μL稀释的检测抗体(1:100稀释)；
(5)孵育：使用封板膜封板，300rpm振荡，25℃孵育2h；
(6)洗涤：弃掉液体，每孔加入300μL洗液洗板，洗涤6次；
(7)加酶孵育：每孔加入100μL稀释的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(1:100稀释)；
(8)孵育：使用新的封板膜封板，300rpm振荡，25℃孵育45min；
(9)洗涤：重复步骤(6)；
(10)加底物显色：每孔加入100μL显色底物TMB，避光，25℃孵育15min；
(11)加终止液：每孔加入100μL终止液，充分混匀；
(12)检测读数：使用酶标仪进行双波长检测，测定450nm最大吸收波长和630nm参考波长下的OD值，校准后的OD值为450nm的测定值减去630nm的测定值。结果见图7和8。
IFN-α因子分泌结果如图7所示，其中自发为CAR-T细胞单独培养物，在CAR-T细胞单独培养物检测到微量IFN-α因子，同样在CAR-T细胞与18.2阴性的293T细胞的共培养物中检测到微量IFN-α因子，而在CAR-T细胞和18.2阳性的293T-CLDN 18.2细胞(claudin18.2+)的共培养物中检测到较高含量的IFN-α因子。
FN-γ因子分泌结果如图8所示，其中自发为CAR-T细胞单独培养物，在CAR-T细胞单独培养物中几乎检测不到IFN-γ因子，同样在CAR-T细胞与18.2阴性的293T细胞的共培养物中也几乎检测不到IFN-γ因子，而在CAR-T细胞和18.2阳性的293T-CLDN 18.2细胞(claudin 18.2+)的共培养物中检测到较高含量的IFN-γ因子。
从图7和图8综合可知，表明本申请构建的CAR-T细胞能对CLDN 18.2阳性的肿瘤细胞释放细胞因子而发挥杀伤功能，且具备高特异性，而对CLDN 18.2阴性细胞则无细胞因子分泌。
综上可知，本申请通过瞬时转染方式，以CLDN18.2重组蛋白免疫羊驼，构建噬菌体展示纳米抗体库，根据该噬菌体展示纳米抗体库对抗CLDN18.2抗体进行筛选，获得重链可变区的CDR为氨基酸序列如SEQ ID NO.38～43所示的抗CLDN18.2的重链抗体，通过抗体亲和力的测定Ka、Kd和KD，证明本申请获得的抗CLDN18.2的重链抗体可特异性的结合CLDN18.2抗原且亲和力高。本申请的抗CLDN18.2的重链抗体能特异性识别CLDN18.2，而不识别CLDN18.1。本发明提供的抗CLDN18.2的重链抗体具有较好的亲和力，将其作为抗原结合结构域构建了嵌合抗原受体，并利用该嵌合抗原受体制备CAR-T细胞，并且通过实验验证了构建的CAR-T细胞对CLDN18.2阳性的肿瘤细胞具有杀伤活性，且与CLDN18.2阳性细胞共培养后，高效分泌细胞因子TNF-α和IFN-γ，说明纳米抗体、及其构建的嵌合抗原受体以及CAR-T细胞能够提高对肿瘤细胞尤其是胃癌的杀伤能力。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本申请。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本申请的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本申请的权利要求所涵盖。

Claims (12)

1.一种抗CLDN18.2的重链抗体，其特征在于，所述重链抗体由重链可变区组成，所述重链可变区的CDR1的氨基酸序列包括SEQ ID No.6所示序列，所述重链可变区的CDR2的氨基酸序列包括SEQ ID No.12所示序列，所述重链可变区的CDR3的氨基酸序列包括SEQIDNo.18所示序列。
2.如权利要求1所述的重链抗体，其特征在于，所述重链可变区还包括框架区FR1-FR4，所述框架区的FR1的氨基酸序列包括SEQ ID No.23所示序列，所述框架区的FR2的氨基酸序列包括SEQ ID No.29所示序列，所述框架区的FR3的氨基酸序列包括SEQ ID No.35所示序列，所述框架区的FR4的氨基酸序列包括SEQ ID No.37所示序列。
3.如权利要求1所述的重链抗体，其特征在于，所述重链可变区的氨基酸序列包括SEQIDNo.43所示的氨基酸序列。
4.一种分离的多肽，其特征在于，所述多肽为嵌合抗原受体，所述多肽自N端至C端依次由CD8α信号肽、抗原结合结构域、CD8α铰链区、CD8α跨膜结构域和免疫受体酪氨酸活化基序，所述抗原结合结构域包括如权利要求1-3任一项所述的重链抗体。
5.与如权利要求1-3任一项所述的重链抗体或如权利要求4所述的多肽相关的生物材料，其特征在于，所述生物材料包括如下中的一种或多种：
1)编码如权利要求1-3任一项所述的重链抗体的核苷酸或编码如权利要求4所述的多肽的核苷酸；
2)含有1)所述核苷酸的重组表达载体；
3)含有1)所述核苷酸的生物工程菌，或含有2)所述重组表达载体的生物工程菌。
6.如权利要求5所述的生物材料，其特征在于，1)中，所述核苷酸的序列包括如SEQ IDNo.49所示序列；
和/或，2)中，所述重组表达载体选自慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺病毒载体。
7.如权利要求6所述的生物材料，其特征在于，所述重组表达载体为慢病毒载体。
8.一种细胞，其特征在于，所述细胞表达如权利要求4所述的多肽。
9.如权利要求8所述的细胞，其特征在于，所述细胞选自T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞和巨噬细胞中的一种或多种。
10.如权利要求1-3任一项所述的重链抗体或如权利要求4所述的多肽或如权利要求5-7所述的生物材料或如权利要求8或9所述的细胞在制备体外检测产品、制备预防或治疗肿瘤药物中的用途，所述体外检测产品为用于检测CLND 18.2的试剂盒、芯片或膜条，所述肿瘤为胃癌。
11.一种用于体外检测CLND 18.2的检测产品，其特征在于，包括如权利要求1-3任一项所述的重链抗体或如权利要求4所述的多肽或如权利要求5-7所述的生物材料或如权利要求8或9所述的细胞。
12.一种用于预防或治疗与表达CLND 18.2相关的肿瘤疾病的药物组合物，其特征在于，
包括如权利要求1-3任一项所述的重链抗体或如权利要求4所述的多肽或如权利要求5-7所述的生物材料或如权利要求8或9所述的细胞，以及药学上可接受的载体，所述与表达CLND 18.2相关的肿瘤疾病为胃癌。
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