CN117567627A - 一种抗psma的重链抗体、相关产品和用途 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及生物工程抗体制备领域,特别是涉及一种抗PSMA的重链抗体、相关产品和用途。本申请提供一种抗PSMA的重链抗体,包括重链可变区,所述重链可变区包括CDR1、CDR2和CDR3,所述CDR1的氨基酸序列为如SEQ ID No.1‑SEQ ID No.4其中之一所示序列;所述CDR2的氨基酸序列为如SEQ ID No.5‑SEQ ID No.9其中之一所示序列;所述CDR3的氨基酸序列为如SEQ ID No.10‑SEQ ID No.12其中之一所示序列。本发明的抗PSMA的重链抗体仅包括重链可变区,具备高亲和力和特异性,能够高效靶向PSMA抗原,且结构简单,易于制备。本发明利用抗PSMA的重链抗体构建嵌合抗原受体,嵌合抗原受体能够高效靶向PSMA。本发明的嵌合抗原受体细胞能够特异性识别PSMA阳性肿瘤细胞,并进行高效杀伤,同时还能释放细胞因子IFN‑γ发挥细胞杀伤作用。
Description
技术领域
本申请涉及生物医药技术领域,特别是涉及一种抗PSMA的重链抗体、相关产品和用途。
背景技术
重链抗体(heavy chain antibody,HcAb)发现于骆驼和鲨鱼类动物体内,是一种天然缺失轻链,只有重链组成的抗体。克隆其可变区可以得到只有重链可变区组成的单域抗体,称为VHH(Variabledomain of heavy chain of heavy chain antibody),也称为纳米抗体(nanobody),它是最小的功能性抗原结合片段。与普通抗体不同,纳米抗体是一条含有大约110个氨基酸的肽链,其分子量约为普通抗体的1/10,纳米抗体与普通抗体及重组单链抗体(single chain fragment variable,scFv)相比,具有分子小、稳定性好、可溶性好、易于表达、生产成本低等优点,在免疫实验、诊断与治疗中,具有广阔的应用前景。
前列腺癌(PCa)是危害男性健康的常见癌症之一,根据2021年美国国家癌症研究所统计结果,前列腺癌居男性恶性肿瘤发病率首位和死亡率的第二位。在我国,前列腺癌的发病率逐年上升,成为威胁男性健康的主要因素之一。前列腺癌具有潜伏期长、早期症状不明显和总体预后较差的特点。现阶段,原发性前列腺癌可以通过手术切除、化疗和放疗得到有效治疗,但依然存在着较高的复发可能性,特别是肿瘤扩散至淋巴结和骨骼后,其致死率将大幅提高。
前列腺特异性膜抗原(Prostate specific membrane antigen,PSMA)是一种由750个氨基酸组成的II型跨膜糖蛋白,包括胞内结构域、跨膜结构域和胞外结构域。PSMA是一种具有高敏感性和特异性的前列腺癌标记物,其在前列腺癌上皮细胞、尤其是在雄激素非依赖性前列腺癌及其转移灶中具有最高的表达,在前列腺癌患者的前列腺上皮细胞中的表达可达正常人的100~1000倍。同时,PSMA在前列腺外的实体肿瘤供应营养物质的新生血管的内皮细胞中也有表达,而在前列腺外的正常组织中不表达或仅少量表达。此外,PSMA的表达水平与前列腺癌的进展或转移相关,其表达随着疾病的进展呈增加趋势。PSMA受体在前列腺癌细胞中具有致癌信号传导作用,能够作用于谷氨酸受体并激活PI3K和Akt生长途径。研究表明,PSMA配体与PSMA受体结合会发生内化,从而导致细胞内捕获并延长配体的保留时间。这些特性使得PSMA成为治疗前列腺癌的理想靶标。
综合上述,探索针对PSMA开发的高效的嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)疗法,对于治疗前列腺癌具有重要意义。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点,本申请的目的在于提供一种抗PSMA的重链抗体、相关产品和用途,用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的,本发明具体采用如下技术方案。
本申请的第一方面提供一种抗PSMA的重链抗体,所述重链抗体包括重链可变区,所述重链可变区包括CDR1、CDR2和CDR3,所述重链可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQIDNo.1-SEQ ID No.4其中之一所示序列;所述重链可变区的CDR2的氨基酸序列如SEQIDNo.5-SEQ ID No.9其中之一所示序列;所述重链可变区的CDR3的氨基酸序列如SEQIDNo.10-SEQ ID No.12其中之一所示序列。
在某些实施方式中,所述重链可变区还包括框架区FR1-FR4:所述框架区FR1的氨基酸序列包括如SEQ ID No.13-SEQ ID No.16其中之一所示序列,所述框架区FR2的氨基酸序列包括如SEQ ID No.17-SEQ ID No.20其中之一所示序列,所述框架区FR3的氨基酸序列包括如SEQ ID No.21-SEQ ID No.25其中之一所示序列,所述框架区FR4的氨基酸序列包括如SEQ ID No.26或SEQ ID No.27所示序列。
在某些实施方式中,所述重链可变区的氨基酸序列包括A1)或A2):
A1)如SEQ ID No.28-SEQ ID No.32其中之一所示的氨基酸序列;
A2)与A1)所示的氨基酸序列具有至少80%以上同源性、且具有A1)所限定的氨基酸序列功能的氨基酸序列。
本申请第二方面提供一种分离的多肽,所述多肽包括抗原结合结构域、铰链区和跨膜结构域,所述抗原结合结构域包含如上文所述的重链抗体。
在某些实施方式中,所述多肽为嵌合抗原受体。
在某些实施方式中,所述跨膜结构域包括CD8α跨膜区、CD28跨膜区或DAP10跨膜区中的一种或多种。
在某些实施方式中,所述铰链区包括CD8α铰链区。
在某些实施方式中,所述信号肽包括CD8α信号肽;所述信号转导结构域包括免疫受体酪氨酸活化基序和/或共刺激分子;所述免疫受体酪氨酸活化基序的氨基酸序列包括SEQ IDNo.40所示的序列;所述共刺激分子包括4-1BB、CD28胞内区、OX40、ICOS或DAP10胞内区中的任意一种或至少两种的组合。
在某些实施方式中,所述多肽自N端至C端依次包括CD8α信号肽、所述重链抗体、CD8α铰链区、CD8α跨膜区、4-1BB和免疫受体酪氨酸活化基序。
本申请第三方面提供与如上文所述的重链抗体或如上文所述的多肽相关的生物材料,所述的生物材料包括如下中的一种或多种:
1)编码如上文所述重链抗体的核苷酸或编码如上文所述的多肽的核苷酸;
2)含有1)所述核苷酸的重组表达载体;
3)含有1)所述核苷酸的生物工程菌,或含有2)所述重组表达载体的生物工程菌。
在某些实施方式中,1)中,所述核苷酸的序列包括如SEQ ID No.33-SEQ ID No.37其中之一所示序列。
在某些实施方式中,所述重组表达载体选自慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺病毒载体。
优选地,所述重组表达载体为慢病毒载体。
本申请的第四方面提供一种细胞,所述细胞表达如上文所述的多肽。
在某些实施方式中,所述细胞选自293T细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞、肥大细胞和巨噬细胞中的一种或多种。
本申请的第五方面提供如上文所述的重链抗体或如上文所述的多肽或如上文所述的生物材料或如上文所述的细胞在制备体外检测产品、制备预防或治疗肿瘤药物中的用途。
在某些实施方式中,所述体外检测产品用于检测PSMA。
在某些实施方式中,所述肿瘤为与表达PSMA相关的肿瘤,优选地,选自膀胱癌、肝癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、胆道癌、白血病、淋巴瘤、胰腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、尿道癌、头颈癌、胃肠道癌、胃癌、食道癌、卵巢癌、肾癌、黑素瘤、前列腺癌或甲状腺癌中的一种或多种。
本申请的第六面提供一种检测产品,包括如上文所述的抗体或如上文所述的多肽或如上文所述的生物材料或如上文所述的细胞。
在某些实施方式中,所述检测产品用于检测PSMA。
本申请的第七方面提供一种药物组合物,包括如上文所述的抗体或如上文所述的多肽或如上文所述的生物材料或如上文所述的细胞,以及药学上可接受的载体。
本申请第八方面提供前述的药物组合物在制备用于预防或治疗与表达PSMA相关的肿瘤疾病的产品上的用途。
在某些实施方式中,所述与表达PSMA相关的肿瘤选自膀胱癌、肝癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、胆道癌、白血病、淋巴瘤、胰腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、尿道癌、头颈癌、胃肠道癌、胃癌、食道癌、卵巢癌、肾癌、黑素瘤、前列腺癌或甲状腺癌中的一种或多种。
与现有技术相比,本申请的有益效果为:
(1)本发明的抗PSMA的重链抗体仅包括重链可变区,具备高亲和力和特异性,能够高效靶向PSMA抗原,且结构简单,易于制备。
(2)本发明利用抗PSMA的重链抗体构建嵌合抗原受体,嵌合抗原受体能够高效靶向PSMA。
(3)本发明的嵌合抗原受体细胞能够特异性识别PSMA阳性肿瘤细胞,并进行高效杀伤,同时还能释放细胞因子IFN-γ发挥细胞杀伤作用。
附图说明
图1显示为本发明实施例2中采用Biacore检测抗PSMA VHH抗体的亲和力曲线图。
图2显示为本发明实施例3中5种抗PSMA VHH抗体分别与PC3(图2A)和PC3-PSMA细胞(图2B)的流式检测结果图。
图3显示为本发明实施例4中表达PSMA嵌合抗原受体的慢病毒载体质粒图谱。
图4显示为本发明实施例4中表达抗PSMA抗体的嵌合抗原受体的结构示意图。
图5显示为本发明实施例8中T淋巴细胞的嵌合抗原受体表达率的流式检测结果图。
图6显示为本发明实施例9中5种CAR-T细胞对293T细胞的杀伤效果图。
图7显示为本发明实施例9中5种CAR-T细胞对过表达PSMA的293T细胞的杀伤效果图。
图8显示为本发明实施例10中5种CAR-T细胞分泌IFN-γ细胞因子水平的柱状图。
图9显示为本发明实施例4中HD SIN03 CEA 1A6 CAR质粒图谱。
图10显示为本申请对比例1中的2种抗PSMA VHH抗体分别与PC3和PC3-PSMA细胞的流式检测结果图。
具体实施方式
为了使本申请的发明目的、技术方案和有益效果更加清晰,下面结合实施例对本申请作进一步说明。应理解,所述实施例只用于解释本申请,并非用于限定申请的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明,均为常规方法,熟悉此技术的人士可由本说明所揭露的内容容易地了解本申请的其他优点及功效。
本发明采用PSMA胞外段重组蛋白免疫刺激羊驼产生高效价的抗体,并采用噬菌体展示技术构建了库容大于109的噬菌体展示骆驼VHH免疫文库,经淘选扩增获得5种候选抗体,包括PSMA-1、PSMA-2、PSMA-4、PSMA-8和PSMA-9。发现其还原分子量小于40Kda,是普通抗体的1/10;通过ELISA检测,发现5种候选抗体都比较安全;通过流式检测,发现5种候选抗体可识别细胞表面的PSMA抗原。同时,构建了含有5种候选抗体的CAR-T细胞,发现其对PSMA阳性的肿瘤细胞具有杀伤活性,并能高效分泌细胞因子IFN-γ。在此基础上完成了本发明。
本申请第一方面提供一种抗PSMA的重链抗体,所述重链抗体包括重链可变区,所述重链可变区包括CDR1、CDR2和CDR3,所述重链可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQ IDNo.1-SEQ ID No.4其中之一所示序列;所述重链可变区的CDR2的氨基酸序列如SEQ IDNo.5-SEQID No.9其中之一所示序列;所述重链可变区的CDR3的氨基酸序列如SEQ IDNo.10-SEQ IDNo.12其中之一所示序列。
本申请的重链抗体由重链可变区组成,具有分子量小、亲和力高、对人体的免疫原性弱、更容易储藏和运输、更易表达、基因工程化改造等的优势。
SEQ ID No.1:GRTFSTYA
SEQ ID No.2:GRPFSNYN
SEQ ID No.3:GRIFSIDT
SEQ ID No.4:GRPLSNYN
SEQ ID No.5:ISWSGGSQ
SEQ ID No.6:ISGSGDYT
SEQ ID No.7:ITSGGDT
SEQ ID No.8:ISGSGSGSGEYT
SEQ ID No.9:ISGSGEYT
SEQ ID No.10:AAVSASSEDPLAVLQLGLRSHLDYDS
SEQ ID No.11:AADVAPWGTSPRYDY
SEQ ID No.12:NAGWYNDYDGYKEDY。
本发明中,所述重链可变区的CDR1的氨基酸序列包括SEQ ID No.1所示序列,CDR2的氨基酸序列包括SEQ ID No.5所示序列,CDR3的氨基酸序列包括SEQ ID No.10所示序列。
本发明中,所述重链可变区的CDR1的氨基酸序列包括SEQ ID No.2所示序列,CDR2的氨基酸序列包括SEQ ID No.6所示序列,CDR3的氨基酸序列包括SEQ ID No.11所示序列。
本发明中,所述重链可变区的CDR1的氨基酸序列包括SEQ ID No.3所示序列,CDR2的氨基酸序列包括SEQ ID No.7所示序列,CDR3的氨基酸序列包括SEQ ID No.12所示序列。
本发明中,所述重链可变区的CDR1的氨基酸序列包括SEQ ID No.4所示序列,CDR2的氨基酸序列包括SEQ ID No.8所示序列,CDR3的氨基酸序列包括SEQ ID No.11所示序列。
本发明中,所述重链可变区的CDR1的氨基酸序列包括SEQ ID No.2所示序列,CDR2的氨基酸序列包括SEQ ID No.9所示序列,CDR3的氨基酸序列包括SEQ ID No.11所示序列。
本发明中,所述重链可变区包括框架区FR1-FR4。优选地,所述FR1的氨基酸序列包括SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15或SEQ ID No.16所示序列。优选地,所述FR2的氨基酸序列包括SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19或SEQ ID No.20所示序列。优选地,所述FR3的氨基酸序列包括SEQ ID No.21、SEQ ID No.22、SEQ ID No.23、SEQIDNo.24、SEQ ID No.25所示序列。优选地,所述FR4的氨基酸序列包括SEQ ID No.26或SEQID No.27所示序列。
SEQ ID No.13:QVQLVESGGGWVQAGGSLRLSCAAS
SEQ ID No.14:QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTAS
SEQ ID No.15:QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAAS
SEQ ID No.16:EVQLVESGGGLVQIGGSLRLSCAAS
SEQ ID No.17:TGWFRQAPGKEREFVAA
SEQ ID No.18:MGWFRQFPGKEREFVAG
SEQ ID No.19:MGWYRQAPGKQRELVAD
SEQ ID No.20:MGWFRQSPGKEREFVAG
SEQ ID No.21:YYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYC
SEQ ID No.22:YYGTSVEGRFTISGDNAKNTVYLQMNSMKPEDTAVYYC
SEQ ID No.23:NYAISVKGRFFISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAAYYC
SEQ ID No.24:YYGTSVKGRFTISRDNAKNTVFLQMNSLKREDTAVYYC
SEQ ID No.25:YYGTSVEGRFTISGDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYC
SEQ ID No.26:WGQGTQVTVSS
SEQ ID No.27:WGQGTQVTVAS。
本发明中,所述框架区FR1的氨基酸序列包括SEQ ID No.13所示序列,FR2的氨基酸序列包括SEQ ID No.17所示序列,FR3的氨基酸序列包括SEQ ID No.21所示序列,FR4的氨基酸序列包括SEQ ID No.26所示序列。
本发明中,所述框架区FR1的氨基酸序列包括SEQ ID No.14所示序列,FR2的氨基酸序列包括SEQ ID No.18所示序列,FR3的氨基酸序列包括SEQ ID No.22所示序列,FR4的氨基酸序列包括SEQ ID No.26所示序列。
本发明中,所述框架区FR1的氨基酸序列包括SEQ ID No.15所示序列,FR2的氨基酸序列包括SEQ ID No.19所示序列,FR3的氨基酸序列包括SEQ ID No.23所示序列,FR4的氨基酸序列包括SEQ ID No.27所示序列。
本发明中,所述框架区FR1的氨基酸序列包括SEQ ID No.16所示序列,FR2的氨基酸序列包括SEQ ID No.20所示序列,FR3的氨基酸序列包括SEQ ID No.24所示序列,FR4的氨基酸序列包括SEQ ID No.26所示序列。
本发明中,所述框架区FR1的氨基酸序列包括SEQ ID No.15所示序列,FR2的氨基酸序列包括SEQ ID No.18所示序列,FR3的氨基酸序列包括SEQ ID No.25所示序列,FR4的氨基酸序列包括SEQ ID No.26所示序列。
本发明中,所述重链可变区的氨基酸序列包括A1)或A2):A1)如SEQ ID No.28-SEQID No.32其中之一所示的氨基酸序列;A2)与A1)所示的氨基酸序列具有至少80%以上同源性、且具有A1)所限定的氨基酸序列功能的氨基酸序列。SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.32具体序列见下方,分别对应PSMA-1、PSMA-2、PSMA-4、PSMA-8和PSMA-9。
SEQ ID No.28(加黑斜体代表框架区,下划线为CDR区):
SEQ ID No.29(加黑斜体代表框架区,下划线为CDR区):
SEQ ID No.30(加黑斜体代表框架区,下划线为CDR区):
SEQ ID No.31(加黑斜体代表框架区,下划线为CDR区):
SEQ ID No.32(加黑斜体代表框架区,下划线为CDR区):
本发明中,所述重链抗体的制备方法为:将所述重链抗体的编码基因插入表达载体,得到重组表达载体,将所述重组表达载体导入细胞并进行培养,进行分离纯化,得到所述重链抗体。
本申请的另一方面提供一种分离的多肽,所述多肽包括抗原结合结构域、铰链区和跨膜结构域,所述抗原结合结构域包含上文所述的重链抗体。
本发明中,利用所述重链抗体构建多肽,所述多肽能够高效靶向PSMA。
本发明中,所述铰链区包括CD8α铰链区。
本发明中,所述跨膜结构域包括CD8α跨膜区、CD28跨膜区或DAP10跨膜区中的一种或多种。
本发明中,所述多肽还包括信号肽和/或信号转导结构域。优选地,所述信号肽包括CD8α信号肽。优选地,所述信号转导结构域包括免疫受体酪氨酸活化基序。更优选地,所述信号转导结构域还包括共刺激分子,所述共刺激分子包括4-1BB、CD28胞内区、OX40、ICOS或DAP10胞内区中的任意一种或至少两种的组合。在某些具体实施方式中,所述信号肽的氨基酸序列包括SEQ ID No.38所示的序列。在某些具体实施方式中,所述免疫受体酪氨酸活化基序的氨基酸序列包括SEQ ID No.40所示的序列。
MALPVTALLLPLALLLHAARP(SEQ ID No.38)。
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQ EGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
(SEQ ID No.40)。
本发明中,所述多肽包括CD8α信号肽、所述重链抗体、CD8α铰链区、CD8α跨膜区、共刺激分子4-1BB和免疫受体酪氨酸活化基序。所述CD8α铰链区和跨膜区的氨基酸序列为
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC(SEQ ID No.39)。
本申请的另一方面与如上文所述的重链抗体或如上文所述的多肽相关的生物材料,所述的生物材料包括如下中的一种或多种:
1)编码如上文所述重链抗体的核苷酸或编码如上文所述的多肽的核苷酸;
2)含有1)所述核苷酸的重组表达载体;
3)含有1)所述核苷酸的生物工程菌,或含有2)所述重组表达载体的生物工程菌。
本发明中,1)中,编码如上文所述重链抗体的核苷酸的序列包括如SEQ ID No.33-SEQ IDNo.37其中之一所示序列。
SEQ ID No.33:
caggtccagctcgtcgagtcaggcggaggctgggtccaggctggaggaagtctgaggctgagctgcgcagcaagcggcaggacattttccacatacgccaccggctggttcaggcaggcacccggaaaagagagggagttcgtggctgctatctcctggtccggcggctcccagtactacgctgattccgtgaagggccgctttaccatctccagggacaatgctaagaacaccgtgtacctccagatgaacagcctgaagcccgaggacaccgctgtgtactattgcgccgccgtgtccgcctcctctgaggaccctctggccgtgctccagctgggactgaggtcccacctggactacgattcctggggacagggcacccaggtgaccgtgtctagc。
SEQ ID No.34:
caggtccagctcgtcgagtcaggcggaggcctcgtgcagcctggaggaagtctgaggctgagctgcacagcctccggcaggccattttccaactacaacatgggctggttcaggcagtttcctggaaaagagagggagtttgtggctggcatttccggcagcggggactacacatactacgggaccagcgtggagggacgattcacaatctccggcgacaacgctaagaacaccgtgtacctgcagatgaacagcatgaagcctgaggacaccgcagtgtactattgcgcagccgacgtggccccctggggaacctcccctagatacgactattggggccagggtacccaggtgaccgtgtccagc。
SEQ ID No.35:
caggtccagctcgtcgagtcaggcggaggcctcgtgcaggctggaggaagtctgaggctgagctgcgcagcaagcggcaggatcttttccatcgacacaatgggttggtacaggcaggcacctggaaaacagagagagctggtggctgatatcacatccggcggcgacaccaactacgcaatttccgtgaagggaaggttcttcatctcccgggacaacgccaagaacacagtgtacctccagatgaactccctgaaacccgaagatactgctgcctactactgcaacgccggctggtacaacgactacgatggctacaaggaggactactggggacagggaacacaggtgaccgtggcctcc。
SEQ ID No.36:
gaggtgcagctggtggagagcggaggaggactggtgcagattggagggagtctgaggctgagctgtgccgcaagcgggaggccactgagtaactataacatgggatggttcaggcagagccccggcaaagagagggagttcgtggctggcatttcaggcagcggaagcggaagcggcgagtacacatactacggaacctccgtgaagggcaggttcaccatttccagggacaacgccaagaatacagtgttcctgcagatgaactctctgaagagggaggacacagccgtgtactattgcgccgccgacgtggccccctggggaacctcccctagatacgactactggggccagggcacccaggtcactgtgtccagc。
SEQ ID No.37:
caggtccagctcgtcgagtcaggcggaggcctcgtgcaggctggaggaagtctgaggctgagctgcgcagcaagcggcaggccattttccaactacaacatgggctggttcaggcagtttcctggaaaggagagggagtttgtggccggcatttccggaagtggggagtacacatactacggcacatcagtggagggacggtttaccatcagcggcgacaatgctaagaacaccgtgtacctgcagatgaacagcctgaagcccgaggacaccgccgtgtactattgcgccgccgacgtggccccttggggaacctcccctagatacgactactggggccagggcacccaggtgaccgtcagttcc。
本发明中,2)中,所述重组表达载体包括1)中所述的核苷酸。所述重组表达载体为病毒载体或非病毒载体。例如,非病毒载体包括:质粒,噬菌粒,柯斯质粒,人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1衍生的人工染色体(PAC),噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体,以及动物病毒等。病毒载体包括:逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。载体可含有多种控制表达的元件,包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外,载体还可含有复制起始位点。载体还可包括协助其进入细胞的成分,包括但不限于,病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳。优选地,所述重组表达载体选自慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺病毒载体,更优地为慢病毒载体。
本发明中,3)中,所述生物工程菌含有1)所述的核苷酸的重组表达载体,或含有2)所述的重组表达载体。优选地,所述生物工程菌例如可以为大肠杆菌。
本申请的另一方面提供一种细胞,所述细胞表达如上文所述的多肽。
本发明中,所述细胞选自293T细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞、肥大细胞和巨噬细胞中的一种或多种。在一些实施方式中,所述细胞由所述重组表达载体和辅助质粒转染哺乳细胞制备得到,如293T细胞。
本发明利用所述重链抗体制备嵌合抗原受体,并进一步制备嵌合抗原受体免疫细胞(CAR-T细胞),所述嵌合抗原受体免疫细胞能够特异性识别PSMA阳性肿瘤细胞,并进行高效杀伤,同时还能释放细胞因子IFN-γ发挥细胞杀伤作用。
本申请的另一方面提供如上文所述的重链抗体或如上文所述的多肽或如上文所述的生物材料或如上文所述的细胞在制备体外检测产品、制备预防或治疗肿瘤药物中的用途。
在某些实施方式中,体外检测产品用于检测PSMA。
在某些实施方式中,所述肿瘤为与表达PSMA相关的肿瘤,优选地,选自膀胱癌、肝癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、胆道癌、白血病、淋巴瘤、胰腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、尿道癌、头颈癌、胃肠道癌、胃癌、食道癌、卵巢癌、肾癌、黑素瘤、前列腺癌或甲状腺癌中的一种或多种。
本申请的另一方面提供一种检测产品,包括如上文所述的重链抗体或如上文所述的多肽或如上文所述的生物材料或如上文所述的细胞。
本发明中,所述产品用于检测PSMA。
本发明中,所述检测产品选自试剂盒、芯片和膜条。本申请的试剂盒可以是胶体金免疫试剂盒、化学发光试剂盒、放射免疫试剂盒、酶联免疫试剂盒或荧光免疫试剂盒。该试剂盒将其中包含的重链抗体、多肽、生物材料、或细胞直接使用即可。同时,试剂盒中还可以包括检测所必需的常规缓冲液、洗涤液、包被液等试剂。
本发明中,所述检测产品通常可以针对作用靶标PSMA抗原,以PSMA抗原作为生物标志物进行诊断。所述的检测产品还可以包括抗PSMA抗体的标记物,所述抗PSMA抗体的标记物通常可以用于标记抗PSMA抗体。在一些实施方式中,标记物包括:荧光标记物、显色标记物、报告基因、定位信号等。具体地,可检测标记物包括酶、辅基、荧光材料、发光材料,生物发光材料、放射性材料、正电子发射金属以及非放射性顺磁性金属离子。也可包含一个以上的标记物。用于标记抗体的标记依赖于使用的特定检测方法例如ELISA(酶联免疫吸附测定法)和免疫荧光技术、免疫放射技术、免疫酶技术和免疫胶体金技术、免疫组织化学染色(组织)样品、流式细胞计量术等。对于本领域已知的检测方法,合适的标记为本领域技术人员所熟知。
本申请另一方面提供一种药物组合物,包括如上文所述的抗体或如上文所述的多肽或如上文所述的生物材料或如上文所述的细胞,以及药学上可接受的载体。
本申请另一方面提供前述的药物组合物在制备用于预防或治疗与表达PSMA相关的肿瘤疾病的产品中的用途;优选地,所述与表达PSMA相关的肿瘤选自膀胱癌、肝癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、胆道癌、白血病、淋巴瘤、胰腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、尿道癌、头颈癌、胃肠道癌、胃癌、食道癌、卵巢癌、肾癌、黑素瘤、前列腺癌或甲状腺癌中的一种或多种。
本发明中,所述的药学可接受的载体指不会在所施用的病人身上引发过敏反应或其他不适影响的载体。药学可接受的载体包括,例如,一种或多种水、生理盐水、磷酸缓冲液、左旋糖、甘油、乙醇和其他类似物,以及上述物质的组合。可作为药学上可接受的载体或辅料的一些物质的具体例子是糖类,如乳糖、葡萄糖和蔗糖;淀粉,如玉米淀粉和土豆淀粉;纤维素及其衍生物,如甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素;西黄蓍胶粉末;麦芽;明胶;滑石;固体润滑剂,如硬脂酸和硬脂酸镁;硫酸钙;植物油,如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油;多元醇,如丙二醉、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇;海藻酸;乳化剂,如Tween;润湿剂,如月桂基硫酸钠;着色剂;调味剂;压片剂、稳定剂、抗氧化剂;防腐剂;无热原水;等渗盐溶液;和磷酸盐缓冲液等。这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味。
本发明中,药学可接受的载体可进一步包括能提高抗体的保存期限或效用的微量辅助物质,例如湿润剂或乳化剂、防腐剂或缓冲液。
本申请另一方面提供一种用于预防或治疗与表达PSMA相关的肿瘤疾病的方法,向对象施加有效剂量的前述的药物组合物。
本申请提供的方法中,对象为哺乳动物,例如为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。灵长目动物例如为猴、猿或智人。
“有效剂量”是指药物可以出现药效的剂量。因为药物要有一定的剂量被机体吸收后,才能达到一定的药物浓度,只有达到一定的药物浓度才能出现药物作用。如果剂量过小,在体内不能获得有效浓度,药物就不能发挥其有效作用。但是如果剂量过大,超过一定限度,药物的作用可出现质的变化,对机体可能产生不同程度的毒性。因此要发挥药物的有效作用,同时又要避免其不良反应,就必须严格掌握用药的剂量范围。
本申请所提供的药物组合物可以适应于任何形式的给药方式,可以是口服或胃肠外给药,例如,可以是经肺、经鼻、经直肠和/或静脉注射,更具体可以是真皮内、皮下、肌内、关节内、腹膜内、肺部、口腔、舌下含服、经鼻、经皮、阴道、口服或胃肠外给药。
本领域技术人员可根据给药方式,选择合适的制剂形式,例如,适合于口服给药的制剂形式可以是包括但不限于丸剂、片剂、咀嚼剂、胶囊剂、颗粒剂、滴剂或糖浆等,再例如,适合于胃肠外给药的制剂形式可以是包括但不限于溶液、悬浮液、可复水的干制剂或喷雾剂等,再例如,适合于直肠给药的通常可以是栓剂。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式,本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用,本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用,在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前,应理解,本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案;还应当理解,本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案,而不是为了限制本发明的保护范围;在本发明说明书和权利要求书中,除非文中另外明确指出,单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时,应理解,除非本发明另有说明,每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义,本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外,根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载,还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
实施例1抗PSMA的重链抗体的获得
本实施例中,利用噬菌体展示技术对PSMA免疫过的羊驼VHH免疫文库进行淘选,通过ELISA筛选,从而获得了高亲和力的抗PSMA的重链抗体。包括如下步骤:
1.1噬菌体纳米抗体库的构建
采用PSMA胞外段重组蛋白(Acro,货号:PSA-H5264)免疫羊驼,ELISA检测血清效价后,抽取外周血;分离淋巴细胞,获得外周血单核淋巴细胞沉淀,提取总RNA,再以RNA为模板反转录为第一链cDNA,然后利用巢式PCR扩增VHH基因;将VHH基因片段克隆到New Lib VHHXE载体中,电转反应产物到含有helper phage的超级态细胞中,扩大培养后,收获phage,即为免疫库。
1.2噬菌体纳米抗体库的筛选
首先取293T细胞与抗体库共孵育进行负筛,然后取上清,分别与293T-PSMA细胞(构建过程详见实施例6)、293T细胞进行孵育;采用4℃预冷的PT缓冲液,清洗4次;感染NEBalpha 5F’细胞,加入M13K07辅助噬菌体(由研究机构保存,可购买获得)后,过夜培养;Drop法涂板,第二天统计富集程度;PEG8000/NaCI沉淀法分离纯化噬菌体,进入下一轮筛选;出现富集后,以所得的噬菌体为模板,扩增VHH区域,进行二代测序,获得5种抗PSMA的纳米抗体,5种候选抗体,命名为PSMA-1、PSMA-2、PSMA-4、PSMA-8和PSMA-9。
5种候选抗体PSMA-1、PSMA-2、PSMA-4、PSMA-8和PSMA-9的氨基酸序列分别为SEQID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31和SEQ ID No.32所示序列。
5种候选抗体PSMA-1、PSMA-2、PSMA-4、PSMA-8和PSMA-9的核苷酸序列分别为SEQID No.33、SEQ ID No.34、SEQ ID No.35、SEQ ID No.36和SEQ ID No.37所示序列。
实施例2
本实施例中,对实施例1得到的5种候选抗体进行VHH Fc纳米抗体表达、纯化以及抗体亲和力测定。包括如下步骤:
2.1VHH Fc纳米抗体表达和纯化
将实施例1得到的5种候选抗体分别克隆到带有小鼠Fc标签的真核表达质粒中,在293T细胞进行表达,并采用Protein A亲和层析进行纯化。得到纯化后5种带有小鼠Fc标签的抗PSMA抗体,包括抗PSMA-1VHH Fc抗体、抗PSMA-2VHH Fc抗体、抗PSMA-4VHH Fc抗体、抗PSMA-8VHH Fc抗体、抗PSMA-9VHH Fc抗体,通过酶标仪检测OD280的吸光值并计算得到浓度,通过SDS-PAGE胶检测纯度和分子量。
5种带有小鼠Fc标签的PSMA VHH抗体的质量检测结果见表1。
表1抗体表达检测结果
2.2抗体亲和力测定
将步骤2.1得到的5种带有小鼠Fc标签的抗PSMA VHH抗体通过Biacore进行亲和力的测定。
Biacore是基于表面等离子共振(surface Plasmon resonance,SPR)开发的生物分析传感技术,可检测跟踪溶液中的分子与固定在芯片表面的分子结合、解离的整个变化过程,以传感图的形式进行记录,并提供动力学和亲和力数据,测定过程中,将纯化后的抗PSMA VHH抗体固化到芯片表面,流动相为含有PSMA蛋白的溶液,测定结果如表2和图1。
表2抗PSMA抗体与人PSMA蛋白的亲和力测试结果
抗体 | ka(1/Ms) | kd(1/s) | KD(M) |
PSMA-1-Fc | 8.95E+03 | 2.84E-04 | 3.17E-08 |
PSMA-2-Fc | 8.53E+04 | 2.41E-04 | 2.82E-09 |
PSMA-4-Fc | 4.66E+04 | 7.30E-04 | 1.57E-08 |
PSMA-8-Fc | 5.77E+04 | 4.27E-04 | 7.40E-09 |
PSMA-9-Fc | 8.59E+04 | 2.18E-04 | 2.54E-09 |
Ka为结合常数,与Kd相反,值越大亲和力越强。
Kd为解离常数,表示解离反应的快慢,Kd越大代表解离越快,Kd越小代表解离越慢。
KD为平衡解离常数,KD表示处于平衡状态时解离程度,KD越大说明解离越多,代表亲和力越弱;KD越小说明解离越少,代表亲和力越强。
平衡解离常数KD=Kd/Ka
从表2和图1可知,这5种带有小鼠Fc标签的抗PSMA VHH抗体的亲和力均达到10-8级别。
实施例3
本实施例3中,对抗PSMA的重链抗体进行流式测定。
将稳定过表达PSMA蛋白的PC3细胞(PC3-PSMA-GFP,制备过程详见实施例6)与实施例2中步骤2.1得到的纯化的5种带有小鼠Fc标签的抗PSMA VHH抗体(抗PSMA-1 VHH Fc抗体、抗PSMA-2 VHH Fc抗体、抗PSMA-4 VHH Fc抗体、抗PSMA-8 VHH Fc抗体和抗PSMA-9 VHHFc抗体)在冰浴下孵育30min,然后用APC标记的羊抗鼠IgG抗体孵育30min,采用流式细胞仪检测(FACS),结果见图2A和图2B。
同时设立空白对照组,以野生型的PC3细胞为空白对照组。
从图2A和图2B可知,表明本申请的抗PSMA的重链抗体能够特异性识别细胞表面的PSMA抗原。
实施例4
本实施例4中,制备表达抗PSMA VHH的重链抗体的嵌合抗原受体的慢病毒载体。
嵌合抗原受体的示意图如图4所示,包括EF1α启动子、信号肽、anti-PSMA VHH、CD8α铰链区、跨膜区、共刺激分子和免疫受体酪氨酸活化基序。
CD8α信号肽的氨基酸序列为:MALPVTALLLPLALLLHAARP(SEQ ID No.38)。
CD8α铰链区和跨膜区的氨基酸序列为:
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC(SEQ ID No.39)。
共刺激分子为4-1BB,其氨基酸序列为:
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID No.55)。
免疫受体酪氨酸活化基序的氨基酸序列为:
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID No.40)。
4.1构建慢病毒载体
分别以实施例2得到的抗PSMA-1 VHH Fc抗体、抗PSMA-2 VHH Fc抗体、抗PSMA-4VHH Fc抗体、抗PSMA-8 VHH Fc抗体和抗PSMA-9 VHH Fc抗体,采用如表3对应的引物合成5种含有CD8α信号肽的抗PSMA VHH Fc抗体片段(简称为抗体片段),然后将抗体片段分别与CD8a hinge-TM-41BB-CD3Z片段和酶切后的HD SIN03 CEA 1A6-41BBz质粒连接,得到5种慢性病毒载体,载体图谱如图3所示,嵌合抗原受体的示意图如图4所示。
表3
具体构建方法见如下步骤:
4.1.1片段CD8a signal-VHH的制备
使用表3中对应抗体的引物(见表3),以实施例2合成的5种带有小鼠Fc标签的抗PSMA VHH抗体的核苷酸序列为模板,分别PCR扩增,得到5种PCR扩增片段。按照表4配制PCR反应体系,按照表7程序进行PCR反应。
1%琼脂糖电泳,用ZymocleanTM Gel DNA Recovery kit分别回收5种PCR扩增片段,每个PCR扩增片段的长度均在500bp左右,得到5种含有CD8α信号肽的抗PSMA VHH抗体片段。
表4PCR反应体系
4.1.2片段CD8a hinge-TM-41BB-CD3Z的制备
使用CD8H2-F和Vector-R两条引物(见表5),以HD SIN03 CEA 1A6-41BBz质粒(质粒图谱见图9)为模板,进行PCR扩增。按照表6配制PCR反应体系,按照表7程序进行PCR反应。
1%琼脂糖电泳,用ZymocleanTM Gel DNA Recovery kit回收片段,长度为700bp,得到CD8a hinge-TM-41BB-CD3Z片段。
表5
表6PCR反应体系
表7
4.1.3酶切载体的制备
将HD SIN03 CEA 1A6-41BBz质粒(质粒图谱见图9)采用BamHI-HF和EcoRI-HF双酶切,1%琼脂糖电泳ZymocleanTM Gel DNA Recovery kit回收载体,长度为7710bp。酶切反应体系见表8。
表8
4.2重组与转化
4.2.1将本实施例中步骤4.1.3的回收载体分别和本实施例中步骤4.1.1的CD8asignal-VHH片段和本实施例中步骤4.1.2的CD8a hinge-TM-41BB-CD3Z片段用ClonExpress II one step cloning kit完成重组反应,反应条件:37℃,30min,得到重组产物。重组反应体系见表9。
表9
4.2.2取12μL本实施例中步骤4.2.1得到的重组产物热转化至大肠杆菌stbl3感受态中(100μL),用kana抗性平板挑选阳性单克隆菌种进行下一步的测序鉴定。
4.3 PCR鉴定与测序鉴定
以LV-F2、LV-R为引物(详见表12)按照表10的反应体系配制,然后按照表11的程序进行PCR反应,得到PCR产物,然后经1%琼脂糖电泳和EB染色鉴定,PCR产物的长度为1200bp左右。
表10
按照表10制备PCR反应体系后按照表11程序进行PCR。
表11
PCR结束后,挑选鉴定正确的克隆送公司测序(测序引物为LV-F2和LV-R,引物见表12),最后挑选正确克隆摇菌用质粒大提试剂盒提取质粒,阳性克隆为构建的慢病毒载体。
表12
引物 | 序列 | 序列编号 |
LV-F2 | tcttggttcattctcaagcctc | SEQ ID No.53 |
LV-R | gcaacatagttaagaatacc | SEQ ID No.54 |
实施例5
本实施例中,对实施例4得到的慢病毒载体进行慢病毒的包装,包括以下步骤:
(1)以1.6×107细胞数接种293T细胞于15cm培养皿中,37℃,5% CO2培养过夜准备包装病毒,培养基为含DMEM,添加10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS);
(2)分别将14.5μg实施例4得到的慢病毒载体与16.7μg辅助质粒pMDlg-RRE、16.7μg辅助质粒pRSV-REV以及6.5μg包膜质粒VSVg溶入2mL无血清DMEM培养液,混匀;
(3)将163.2μg PEI(1μg/μL)溶解于2mL的无血清DMEM培养液中,轻轻混匀(或1000rpm涡旋5秒钟),室温孵育5min,得到PEI混合液;
(4)转染复合物的形成:将步骤(3)得到的PEI混合液加入DNA混合液中,加入后立即涡旋混合或轻轻混匀,室温下孵育20min,得到转染复合物;
(5)将步骤(4)得到的转染复合物4mL滴加入含25mL DMEM培养基的15cm培养皿中,4-5h小时后,更换含2%FCS的DMEM培养基,培养48h后,收集病毒上清。
实施例6
本实施例中,过表达细胞株的构建,包括如下:
PSMA-GFP慢病毒的获得:14.5μg的PSMA-GFP质粒(购自云舟生物)、16.7μg辅助质粒pMDlg-RRE、16.7μg辅助质粒pRSV-REV以及6.5μg包膜质粒VSVg进行共转染获得,步骤同实施例5。
过表达PSMA蛋白的293T细胞(简记为293T-PSMA)的获得:将293T细胞按照1×106个/孔接种到6孔板中,加入1mL的PSMA-GFP慢病毒,得到。
过表达PSMA蛋白的PC3细胞(简记为PC3-PSMA)的获得:将PC3细胞按照1×106个/孔接种到6孔板中,加入1mL的PSMA-GFP慢病毒,得到。
实施例7
本实施例中,对实施例5得到的病毒进行慢病毒滴度检测,包括以下步骤:
将500μL Junkat细胞(1×105个细胞)接种细胞于24孔培养板,形成细胞悬液;实施例5得到的慢病毒上清分别以50μL、10μL和2μL添加到细胞悬液中,并添加polybrene至终浓度为8μg/mL;然后于37℃和5% CO2培养过夜后,更换新鲜培养基;感染72h后,收集细胞,400g离心5min,弃上清,流式缓冲液(PBS+2%新生牛血清)洗一次;按1:100稀释比例加入MonoRabTMRabbit Anti-Camelid VHH Cocktail[iFluor 488]抗体,冰上孵育30min;然后用1mL流式缓冲液清洗两次后,采用流式细胞仪检测;取阳性率为5~20%的细胞样品,计算滴度。
滴度(TU/mL)=细胞数量(105)×阳性率/病毒体积(mL)。
实施例8
本实施例中,利用实施例7制备的慢病毒转导T淋巴细胞。
8.1 T淋巴细胞的复苏
将复苏的PBMC细胞200g离心9min,弃上清,用T细胞培养基重悬沉淀,计数,调节密度至1.5×106cells/mL,并接种到48孔细胞培养板中,静置2h后进行活化。
8.2 T淋巴细胞的活化
将PBMC用T细胞培养基(X-VIVO+10% FBS+IL-2(300U/mL)调整密度到1.5×106cells/mL,1:100添加T cell transact(商品化偶联CD3和CD28的磁珠),接种到合适的培养容器活化24h,得到的活化的T细胞。
8.3 T细胞感染
收集步骤8.2得到的活化的T细胞,调整细胞密度为3×105cells/mL,按照感染复数MOI=10加入实施例7得到的慢病毒,添加polybrene至终浓度为8μg/mL;于37℃、5% CO2环境中培养过夜后更换新鲜培养基。每2-3天进行传代。
8.4嵌合抗原受体表达
本实施例中步骤8.3感染5天后,取3×105的T细胞,4℃、400g离心5min,弃上清,流式缓冲液(PBS+2%兔血清)洗一次;按1:100稀释比例加入MonoRabTMRabbit Anti-CamelidVHH Cocktail(iFluor 488)抗体,冰上孵育30min;然后用1mL流式缓冲液清洗两次后,采用流式细胞仪检测T淋巴细胞的嵌合抗原受体感染效率,结果见图5。
从图5可知,感染后的CAR-T细胞有明显的阳性细胞群,表明成功构建了5种表达不同结构嵌合抗原受体的CAR-T细胞,分别为嵌合抗原受体的抗原结合结构域含有PSMA-1、PSMA-2、PSMA-4、PSMA-8和PSMA-9抗体。PSMA-1、PSMA-2、PSMA-4、PSMA-8和PSMA-9抗体对应的CAR-T细胞感染效率分别为:62.7%、59.2%、77.4%、75.6%和75.0%。
实施例9
本实施例中,利用实施例8制备的5种CAR-T细胞进行体外毒性实验,包括以下步骤:
(1)在E-Plate 96的孔中加入50μL培养基。
(2)将E-Plate 96放到RTCA Station上。
(3)RTCA系统进行扫描(“Scan Plate”),检测基线(Background)。
(4)取出E-Plate 96,在孔中加入100μL混合均匀的靶细胞细胞悬液,293T细胞(PSMA-)、293T-PSMA作为靶细胞,使每孔中细胞数目为15,000cells/100μL。
(5)将E-Plate 96置于超净台中室温放置30min。
(6)将E-Plate 96放到培养箱中的RTCA Station上。
(7)运行程序,监测各孔中细胞的电阻值。
(8)24h后,暂停程序,在E-Plate 96按效靶比0.5:1、2:1加入CAR-T细胞50μl。其中各实验组和各对照组如下:
实验组:靶细胞+效应细胞;
对照组:靶细胞单独培养;
(9)继续运行程序。
CAR-T杀伤效率计算公式为:
杀伤率(%)=(1-实验组靶细胞CI/对照组靶细胞CI)*100%
CI值在该实验中与细胞死亡量成反比,细胞死亡量越多,CI值越低。结果见图6和图7。
从图6和图7可知,本发明构建的CAR-T细胞对PSMA阴性的293T细胞无明显杀伤作用,对PSMA阳性的肿瘤细胞具有杀伤活性,表明本发明构建的CAR-T细胞不仅具备高效肿瘤杀伤能力,还具备高特异性。
实施例10
本实施例中,检测CAR-T细胞因子IFN-γ的分泌情况,包括如下:
10.1细胞培养上清
实验分为三组,一组为实施例8中的效应细胞于37℃单独培养18h,一组为实施例8中的效应细胞和293T细胞于37℃共培养18h,一组为实施例8中的效应细胞和PSMA阳性的293T细胞(293T-PSMA)于37℃共培养18h,其中效靶比为1:1。同时设立Control T组(未进行慢病毒感染)。PSMA阳性的293T细胞(293T-PSMA)的获得详见实施例6。
培养结束后,将细胞培养物于400×g离心10min去除沉淀物,取上清置于-80℃贮存待检。
10.2检测IFN-γ
10.2.1试剂:使用联科生物ELISA试剂盒(货号为:人γ干扰素ELISA试剂盒:EK180-96)进行检测,检测前将所有的试剂、样本恢复至25℃,按照使用说明配制1×洗液,1×检测缓冲液,检测抗体。
10.2.2标准品及样品配制标准品:使用5%1640培养基2倍稀释标准品原液,一共8个稀释梯度,包括零浓度。
样品:使用5%1640培养基按比稀释样品。
10.2.3检测步骤
(1)浸泡酶标板:加入300μL 1×洗液静置浸泡30s,弃掉洗液之后,在吸水纸上将微孔板拍干;
(2)加标准品:标准品孔加入100μL 2倍倍比稀释的标准品,空白孔加入100μL 5%1640培养基;
(3)加样本:样本孔加入100μL本实施例中步骤10.1得到的细胞培养上清;
(4)加检测抗体:每孔加入50μL稀释的检测抗体(1:100稀释);
(5)孵育:使用封板膜封板,300rpm振荡,25℃孵育2h;
(6)洗涤:弃掉液体,每孔加入300μL洗液洗板,洗涤6次;
(7)加酶孵育:每孔加入100μL稀释的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(1:100稀释);
(8)孵育:使用新的封板膜封板,300rpm振荡,25℃孵育45min;
(9)洗涤:重复步骤(6);
(10)加底物显色:每孔加入100μL显色底物TMB,避光,25℃孵育15min;
(11)加终止液:每孔加入100μL终止液,充分混匀;
(12)检测读数:使用酶标仪进行双波长检测,测定450nm最大吸收波长和630nm参考波长下的OD值,校准后的OD值为450nm的测定值减去630nm的测定值。结果见图8。
IFN-γ因子分泌结果如图8所示,自发MOCK组为单独的CAR-T细胞组,几乎检测不到细胞因子IFN-γ释放,同样在CAR-T细胞与PSMA阴性的293T细胞的共培养物中也几乎检测不到IFN-γ因子,而在CAR-T细胞和PSMA阳性的293T-PSMA细胞(PSMA+)的共培养物中检测到较高含量的IFN-γ因子。
对比例11
本实施例按照实施例1相同的筛选流程得到两种淘汰的抗体,命名为PSMA-A30和PSMA-11。
2种淘汰抗体的氨基酸序列分别为SEQ ID No.56和SEQ ID No.57,具体信息如下:
PSMA-A30:
QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRPFSNYNMGWFRQFPGKEREFVAGITGSGDY TYYGTSVEGRFTISGDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAADVAPWGTSPRNDYWGQGT QVTVSS(SEQ ID No.56);
PSMA-11:
QVQLVESGGGWVQAGGSLRLSCAASGRTFSTYATGWFRQAPGKEREFVAAISWSGG SQYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAADVAPWGTSPRYDYWGQ GTQVTVSS(SEQ ID No.57)。
按照实施例2相同的方法,对PSMA-A30和PSMA-11两种抗体进行VHH Fc纳米抗体表达、纯化以及抗体亲和力测定,并按照实施例3的方法对其进行流式测定,结果见表13和图10。
表13抗体表达检测结果
蛋白名称 | 浓度(mg/mL) | 还原分子量Kda | 非还原分子量Kda | 纯度(SDS-PAGE) |
anti-PSMA-A30 | 1.72 | 39 | 78 | >95% |
anti-PSMA-11 | 1.62 | 40 | 80 | >95% |
从图10来看,这两个抗体不能特异性识别细胞表面的PSMA抗原,因此效果不好。
综上所述,本发明筛选并制备的抗PSMA的重链抗体,将其作为抗原结合结构域构建嵌合抗原受体和CAR-T细胞,所得CAR-T细胞对PSMA阳性的肿瘤细胞具有明显的杀伤活性和特异性,且能够分泌高水平的细胞因子,表明本发明的重链抗体能够有效应用于免疫治疗,对于开发肿瘤治疗药物具有重要意义。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效,而非用于限制本申请。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本申请的精神及范畴下,对上述实施例进行修饰或改变。因此,举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变,仍应由本申请的权利要求所涵盖。
Claims (16)
1.一种抗PSMA的重链抗体,其特征在于,所述重链抗体包括重链可变区,所述重链可变区包括CDR1、CDR2和CDR3,
所述CDR1的氨基酸序列为如SEQ ID No.1-SEQ ID No.4其中之一所示序列;
所述CDR2的氨基酸序列为如SEQ ID No.5-SEQ ID No.9其中之一所示序列;
所述CDR3的氨基酸序列为如SEQ ID No.10-SEQ ID No.12其中之一所示序列。
2.如权利要求1所述的重链抗体,其特征在于,包括如下技术特征中的一项或多项:
1)所述CDR1的氨基酸序列包括SEQ ID No.1所示序列,CDR2的氨基酸序列包括SEQIDNo.5所示序列,CDR3的氨基酸序列包括SEQ ID No.10所示序列;
2)所述CDR1的氨基酸序列包括SEQ ID No.2所示序列,CDR2的氨基酸序列包括SEQIDNo.6所示序列,CDR3的氨基酸序列包括SEQ ID No.11所示序列;
3)所述CDR1的氨基酸序列包括SEQ ID No.3所示序列,CDR2的氨基酸序列包括SEQIDNo.7所示序列,CDR3的氨基酸序列包括SEQ ID No.12所示序列;
4)所述CDR1的氨基酸序列包括SEQ ID No.4所示序列,CDR2的氨基酸序列包括SEQIDNo.8所示序列,CDR3的氨基酸序列包括SEQ ID No.11所示序列;
5)所述CDR1的氨基酸序列包括SEQ ID No.2所示序列,CDR2的氨基酸序列包括SEQIDNo.9所示序列,CDR3的氨基酸序列包括SEQ ID No.11所示序列。
3.如权利要求1所述的重链抗体,其特征在于,所述重链可变区还包括框架区FR1-FR4:所述框架区FR1的氨基酸序列包括如SEQ ID No.13-SEQ ID No.16其中之一所示序列,所述框架区FR2的氨基酸序列包括如SEQ ID No.17-SEQ ID No.20其中之一所示序列,所述框架区FR3的氨基酸序列包括如SEQ ID No.21-SEQ ID No.25其中之一所示序列,所述框架区FR4的氨基酸序列包括如SEQ ID No.26或SEQ ID No.27所示序列。
4.如权利要求3所述的重链抗体,其特征在于,包括如下技术特征中的一项或多项:
1)所述框架区FR1的氨基酸序列包括SEQ ID No.13所示序列,FR2的氨基酸序列包括SEQ ID No.17所示序列,FR3的氨基酸序列包括SEQ ID No.21所示序列,FR4的氨基酸序列包括SEQ ID No.26所示序列;
2)所述框架区FR1的氨基酸序列包括SEQ ID No.14所示序列,FR2的氨基酸序列包括SEQ ID No.18所示序列,FR3的氨基酸序列包括SEQ ID No.22所示序列,FR4的氨基酸序列包括SEQ ID No.26所示序列;
3)所述框架区FR1的氨基酸序列包括SEQ ID No.15所示序列,FR2的氨基酸序列包括SEQ ID No.19所示序列,FR3的氨基酸序列包括SEQ ID No.23所示序列,FR4的氨基酸序列包括SEQ ID No.27所示序列;
4)所述框架区FR1的氨基酸序列包括SEQ ID No.16所示序列,FR2的氨基酸序列包括SEQ ID No.20所示序列,FR3的氨基酸序列包括SEQ ID No.24所示序列,FR4的氨基酸序列包括SEQ ID No.26所示序列;
5)所述框架区FR1的氨基酸序列包括SEQ ID No.15所示序列,FR2的氨基酸序列包括SEQ ID No.18所示序列,FR3的氨基酸序列包括SEQ ID No.25所示序列,FR4的氨基酸序列包括SEQ ID No.26所示序列。
5.如权利要求1所述的重链抗体,其特征在于,所述重链可变区的氨基酸序列包括A1)或A2):
A1)如SEQ ID No.28-SEQ ID No.32其中之一所示的氨基酸序列;
A2)与A1)所示的氨基酸序列具有至少80%以上同源性、且具有A1)所限定的氨基酸序列功能的氨基酸序列。
6.一种分离的多肽,其特征在于,所述多肽包括抗原结合结构域、铰链区和跨膜结构域,所述抗原结合结构域包括如权利要求1-5任一项所述的重链抗体。
7.如权利要求6所述的多肽,其特征在于,所述多肽为嵌合抗原受体;
和/或,所述跨膜结构域包括CD8α、CD28或DAP10中的一种或多种;
和/或,所述铰链区包括CD8α;
和/或,所述多肽自N端至C端依次包括所述重链抗体、铰链区和跨膜结构域;
和/或,所述多肽还包括信号肽和/或信号转导结构域;优选地,所述信号肽包括CD8α信号肽;所述信号转导结构域包括免疫受体酪氨酸活化基序和/或共刺激分子;所述免疫受体酪氨酸活化基序的氨基酸序列包括SEQ ID No.40所示的序列;所述共刺激分子包括4-1BB、CD28胞内区、OX40、ICOS或DAP10胞内区中的任意一种或至少两种的组合;更优选地,所述多肽自N端至C端依次包括CD8α信号肽、所述重链抗体、CD8α铰链区、CD8α跨膜区、4-1BB和免疫受体酪氨酸活化基序。
8.与如权利要求1-5任一项所述的重链抗体或如权利要求6或7所述的多肽相关的生物材料,其特征在于,所述生物材料包括如下中的一种或多种:
1)编码如权利要求1-5任一项所述的重链抗体的核苷酸、或编码如权利要求6或7所述的多肽的核苷酸;
2)含有1)所述核苷酸的重组表达载体;
3)含有1)所述核苷酸的生物工程菌,或含有2)所述重组表达载体的生物工程菌。
9.如权利要求8所述的生物材料,其特征在于,
1)中,所述核苷酸的序列包括如SEQ ID No.33-SEQ ID No.37其中之一所示序列;
和/或,2)中,所述重组表达载体选自慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺病毒载体;优选为慢病毒载体。
10.一种细胞,其特征在于,所述细胞表达如权利要求6或7所述的多肽。
11.如权利要求10所述的细胞,其特征在于,所述细胞选自293T细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞、肥大细胞和巨噬细胞中的一种或多种。
12.如权利要求1-5任一项所述的重链抗体、如权利要求6或7所述的多肽、如权利要求8或9所述的生物材料、或如权利要求10或11所述的细胞在制备体外检测产品、制备预防或治疗肿瘤药物中的用途。
13.如权利要求12所述的用途,其特征在于,所述体外检测产品用于检测PSMA;
和/或,所述肿瘤药物中的肿瘤为与表达PSMA相关的肿瘤,优选地,所述肿瘤选自膀胱癌、肝癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、胆道癌、白血病、淋巴瘤、胰腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、尿道癌、头颈癌、胃肠道癌、胃癌、食道癌、卵巢癌、肾癌、黑素瘤、前列腺癌或甲状腺癌中的一种或多种。
14.一种检测产品,其特征在于,包括如权利要求1-5任一项所述的重链抗体、如权利要求6或7所述的多肽、如权利要求8或9所述的生物材料、或如权利要求10或11所述的细胞;优选地,所述产品用于检测PSMA。
15.一种药物组合物,其特征在于,包括如权利要求1-5任一项所述的重链抗体、如权利要求6或7所述的多肽、如权利要求8或9所述的生物材料、或如权利要求10或11所述的细胞,以及药学上可接受的载体。
16.如权利要求15所述的药物组合物在制备用于预防或治疗与表达PSMA相关的肿瘤疾病的产品中的用途;优选地,所述与表达PSMA相关的肿瘤选自膀胱癌、肝癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、胆道癌、白血病、淋巴瘤、胰腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、尿道癌、头颈癌、胃肠道癌、胃癌、食道癌、卵巢癌、肾癌、黑素瘤、前列腺癌或甲状腺癌中的一种或多种。
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