CN101025420A - 一种禽流感病毒乳胶凝集检测试剂盒及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于快速检测禽流感病毒的乳胶凝集试剂盒。利用水溶性碳化二亚胺将兔抗禽流感病毒核蛋白IgG偶联到羧化聚苯乙烯胶乳颗粒的表面，建立了禽流感病毒乳胶凝集检测方法，再辅以其它配套试剂制备了禽流感病毒乳胶凝集检测试剂盒。禽流感病毒乳胶凝集检测试剂盒由盒体和设在盒体内的乳胶诊断试剂、样本处理液A，样本处理液B，阳性对照样品和阴性对照样品组成。所述的试剂盒能够直接对禽流感病毒进行检测，具有特异性强、灵敏度高、操作简便和诊断快速的显著优点。

Description

一种禽流感病毒乳胶凝集检测试剂盒及应用

                                      技术领域

本发明属于禽类免疫学技术领域，涉及免疫学、应用化学等相关领域。具体地讲本发明涉及一种禽流感病毒乳胶凝集检测试剂盒及该试剂盒在禽流感病毒检测中的应用。

                                      背景技术

众所周知，禽流感是一种严重危害养禽业和危及人类健康的烈性传染病。1997年“香港禽流感”事件是第一次禽流感直接跨种传播给人，2004年的东南亚禽流感，更加引起全世界对禽流感跨种传播的极大关注。我国2004年也有16个省市50个疫点也大面积暴发了禽流感疫情，引起了我国养禽业的重大损失。

目前，检测禽流感的病原学方法主要有病毒的分离鉴定、中和试验(SN)、琼脂扩散试验(AGP)、RT-PCR、免疫荧光试验(IF)和酶联免疫吸附试验(ELISA)等。病毒的分离鉴定是检测AIV的最根本、最经典的方法，但该方法存在着固有的一些不足之处，比如操作相对繁琐、需要的时间长，容易受到污染以及生物安全性等问题。中和试验比较烦琐，而且需要很有经验的人员来操作。琼脂扩散和免疫荧光试验在敏感性和特异性方面都不尽人意，且田间样本复杂多变，干扰大，样本处理难，使得这些方法在临床检测中的应用受到一定限制。酶联免疫吸附试验虽然相对容易一些，但仍然需要一定的仪器设备和操作技能。乳胶凝集试验(Latex Aagglutination Test，LAT)由于其迅速、简单和无须专门的技能和任何仪器设备而具有巨大的优势。

从上个世纪中叶聚苯乙烯乳胶颗粒开始用做凝集试验的材料以来，由于其所具有的独特优点，如：操作简便，不需要特殊的仪器，肉眼判断，也不需要对操作过程进行培训；时间短，一般在2分钟之内可以出结果；价格低廉，检测单份样品比其它血清学、病原学方法便宜得多；适合于现场检测等，在临床检验中得到了广泛的应用。其意义有：①传染性疾病的诊断：细菌、真菌、寄生虫、立克次体、病毒的感染检测；②自身免疫病诊断：如抗核抗体、类风湿因子等检测；传统的乳胶凝集试验(LAT)是以惰性聚苯乙烯胶乳颗粒作为载体，吸附特定的抗原或抗体，当遇到相应的抗体和抗原成份时，会形成肉眼可见的凝集颗粒。在应用乳胶凝集技术建立病原学检测方法时，一般是将特异性抗体致敏到乳胶颗粒表面，普通聚苯乙烯胶乳和抗体的结合为无选择性的物理静电吸附，由于抗体的分子量小，很难结合到乳胶表面，即使致敏上的抗体也容易从乳胶颗粒上脱落或者变性失活，导致致敏好的乳胶试剂保存期短，难以适合产品开发的需要。为此，本申请人以带有羧基基团(-COOH)的羧化聚苯乙烯胶乳为载体，以双功能试剂水溶性碳化二亚胺(EDAC)为介质，经化学反应将抗体(IgG)分子偶联到乳胶表面。本发明的方法克服了普通乳胶致敏抗体时，致敏量少，不稳定，抗体容易脱落等缺点，提高了抗体的结合效率，而且致敏上的抗体不容易从乳胶颗粒上脱落，进而提高乳胶的敏感性和保质期，适合了产品开发和大规模生产的要求。

                                      发明内容

本发明的第一个目的是组装一种用于检测所有亚型禽流感病毒的乳胶凝集试剂盒。

本发明的第二个目的是试剂盒在禽流感病毒检测中的应用。

本发明的总体技术路线图见图1所示。

本发明是这样实现的：

本申请人从分离得到的禽流感病毒毒株QLG-001(该毒株保藏在CCTCC，保藏编号：CCTCC-V200512)中提取核蛋白，然后免疫家兔得到免疫血清，从该免疫血清中提取IgG，用该IgG制敏羧化乳胶得到乳胶诊断试剂，并以该乳胶诊断试剂为核心试剂组装了一种用于快速检测禽流感病毒的乳胶凝集试剂盒。本发明的试剂盒是由盒体和包含在盒体内的乳胶诊断试剂、样品处理液A，样品处理液B，阳性对照样品和阴性对照样品组成。

所述的样品处理液A和B的组分及含量按重量/体积为：

样品处理液A

Na₂B₄O₇·10H₂O       13.3g/L

H₃BO₃                16.08g/L

NaCl                 8.5g/L

补充蒸馏水至1L。

样品处理液B

Na₂B₄O₇·10H₂O      13.3g/L

H₃BO₃               16.08g/L

NaCl                8.5g/L

N-乙酰-L-半胱氨酸   5g/L

NonidetP-40(NP-40)  5ml/L

补充蒸馏水至1L。

所述的阳性对照样品是灭活的禽流感病毒             1ml/管

阴性对照样品是无特定病原微生物(SPF)鸡胚尿囊液    1ml/管

其中所说的阳性对照样品的血清型是经过灭活的禽流感病毒H9N2亚型。

适用于权利要求1-3任一项的检测试剂盒的禽流感Avian influenza virus病毒株QLG-001，保藏在CCTCC，保藏编号CCTCC-V200512。

显而易见，本发明制备的试剂盒不仅适用于在检测禽流感病毒上的应用，其中包括在检测禽流感病毒H9亚型上的应用。

能直接对样本中的禽流感病毒进行检测。若样本中含有禽流感病毒，则乳胶试剂在30秒内出现明显均匀一致的凝集，判为阳性结果；若样本中不含有禽流感病毒，则乳胶试剂在30秒内液滴仍然呈原有的均匀乳状，判为阴性结果。

与现有技术相比本发明具有如下优点：

1、直接对禽流感病毒进行检测，具有特异性强，灵敏度高，检测时间短(30秒之内出结果)，检测样品范围宽(鸡胚尿囊液、喉头拭子和各种内脏组织)的特点；

2、本发明的试剂盒适用于对禽流感病毒H1-H15所有亚型进行检测，显而易见，本发明组装的试剂盒也可用于普通禽流感病毒的特异检测。

3、本发明的检测方法不需要任何特殊仪器、设备，具有检测成本低的特点。试剂盒操作简便，不需由专业人员操作。保存期长，在4℃条件下放置半年不会影响其敏感性。

                                      附图说明

图1：是本发明总体技术路线图；

图1是本发明分离、鉴定的禽流感病毒株QLG-001负染病毒粒子的电镜照片(×60000)

                                      具体实施方式

实施例1禽流感毒株的分离和鉴定

用于本发明的编号为QLG-001禽流感毒株，于2003年4月5日从湖北省某地送检鸭中分离得到，经中国流感中心鉴定为H9N2亚型，通过电镜观察、血清学试验、致病力及动物回归试验结果证实该病毒分离株为典型的A型流感病毒。EID₅₀及致病性试验(IVPI以及ICPI)表明该病毒为低致病力毒株(LPAIV)。该禽流感毒株QLG-001于2005年9月2日保藏在CCTCC，保藏编号为CCTCC-V200512。该病毒株的保藏方式是将其置于-80℃条件下冻干保存。

具体分离、鉴定步骤如下：

(1)送检病鸭发病情况及剖检病变

蛋鸭产蛋量迅速下降(下降至10％)，产小型蛋、畸形蛋。剖检可见卵泡萎缩，有的充血、出血。种鸭苗在20日龄开始发病，饮食颓废，甚至废绝，拉白色稀粪，呼吸道症状并不典型，主要表现为神经症状，时而卧地不起，时而高高跃起，垂死挣扎，与以前有关同亚型禽流感毒株症状的报道差别较大。6天后，死亡率达到高峰，日死淘率在5％以上，剖检发现，心脏冠状沟脂肪有出血点，心肌出现大面积灰白色条状坏死，这一点也正是发病鸭的典型病变。此后虽使用过多种抗菌药和抗病毒药，仍无明显效果。

(2)病毒分离

采集病鸭气管、肺、肾脏，用玻璃匀浆器匀浆后加入灭菌的生理盐水，制成10％的悬液，加入双抗(最终浓度为1000U/mL)于37℃孵育30min后，6000r/min离心30min后取上清，将上清作无菌检验，合格者保存备用。将无菌上清液经尿囊腔接种9日龄鸡胚，0.2mL/胚。将接种后的鸡胚置37℃孵育，弃去24h内死亡鸡胚。24h后死亡鸡胚，无菌收获绒毛尿囊液。鸡胚分别于36h-48h死亡，收获鸡胚尿囊液，每一代尿囊液作无菌检验后再继续传代。经鸡胚接种收获的第2代含病毒的鸡胚尿囊液对鸡红细胞凝集作用(HA)明显增高2-5个滴度。经无菌检验合格者作为连续传代用毒种。

(3)病毒鉴定

1)血清学鉴定

取病毒分离为阳性的尿囊液，用ND、IB、IBD及EDS_-76抗血清进行HI试验，不产生抑制现象，表明分离株并非上述病毒株。AGP试验表明，制备的AGP抗原与A型禽流感病毒的阳性血清之间在48小时后可产生沉淀线，与阳性抗原和阳性血清之间的沉淀线恰好相连，从而初步证实该分离株为A型流感病毒。

2)血凝素亚型鉴定

分离株尿囊液经与H5、H7和H9血凝素分型血清进行交互试验，证明该分离株为H9亚型。该毒株提交用于专利程序的生物材料的名称为QLG-001，该禽流感病毒株已于2005年9月2日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号CCTCC NO：V200512。克隆该毒株NA基因，经测序、Blast比较，证明与H9N2亚型流感病毒同源性最高可达99％。

3)电镜观察

电子显微镜下，经负染处理的病毒粒子呈圆形或椭圆形，直径80～120nm，有囊膜，为典型的禽流感病毒粒子(见图2)。

(4)禽流感病毒株QLG-001的生物学特性

1)EID₅₀的测定

该病毒分离株尿囊液EID₅₀结果见表1。按Reed和Muench法计算EID₅₀为10^-6.59/0.2ml。

                               表1AIV分离株EID₅₀测定结果

病毒稀释度(％)dilution titer	鸡胚总数(6)No.of all embryos(six)		累计(Accumulation)		死亡率Mortality(％)
						死亡(Dead)	存活(Alive)	死亡(Dead)	存活(Alive)
	10-3	6	0	23						0	100
10-4					6	0	17	0	100
	10-5	5	1	11						1	91.6
10-6					4	2	6	3	66.6
	10-7	2	4	2						7	22.2
10-8					0	6	0	13	0

注：距离比例＝(高于50％死亡率的百分数-50％)/(高于50％百分数-低于50％死亡率的百分数)＝(91.6-50)/(91.6-22.2)＝0.59

logEID₅₀＝距离比例×稀释度对数之间的差+高于50％死亡率的稀释度的对数＝0.59×(-1)+(-6)＝-6.59

EID₅₀＝10^-6.59/0.2ml。

2)IVPI的测定

每只鸡静脉接种0.2ml 1∶10倍稀释的滤菌尿囊液，观察10天，在接种后第5天有1只死亡，第6天死亡1只，到第10天无死亡鸡，计算IVPI为0.74(见表2)。

                                             表2AIV分离株IVPI测定结果

接种后状态state of post-inoculation	计分Mark	接种后天数(天)No.of day after inoculation(day)										共计Total	累积Accumulation	ICPI
															1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
		正常(Normal)	0	8	7	6	4	3	3	3	3														3	3	43	43×0＝0	0.74
发病(Disease)	1											0	1	2	4	4	3	3	3	3	3	26	26×1＝26
		死亡(Dead)	3	0	0	0	0	1	2	2	2													2	2	11	11×3＝33
总和(Total)												8	8	8	8	8	8	8	8	8	8	80	59

注：IVPI＝累计分数/正常、发病、死亡共计总和＝(43×0)+(26×1)+(11×3)/(43+26+11)＝59/80＝0.74

3)ICPI的测定

每只鸡脑内接种0.05ml 1∶10倍稀释的滤菌尿囊液，观察8天，在接种后第2天鸡群开始发病，到第5天，试验鸡全部死亡，计算ICPI为1.30(见表3)。

                                             表3AIV分离株ICPI测定结果

接种后状态State of post-inoculation	计分Mark	接种后天数(天)No.of day after inoculation(day)								共计Total	累积Accumulation	ICPI
													1	2	3	4	5	6	7	8
		正常(Normal)	0	10	8	6	2	0	0												0	0	26	26×0＝04×1＝450×2＝100104	1.30
发病(Disease)	1									0	2	2	0	0	0	0	0	4
		死亡(Dead)	2	0	0	2	8	10	10										10	10	50
总和(Total)										10	10	10	10	10	10	10	10	80

注：ICPI＝累计分数/正常、发病、死亡共计总和＝(26×0)+(4×10)+(50×2)/(26+4+50)＝104/80＝1.30

4)对鸡的致病力试验

以0.2ml/只感染非免疫鸡后，在第3天，有2只出现轻度的临床症状，精神呆滞，瞌睡，流涎，流泪，饮食较差，拉白色粪便，第5天有1只鸡死亡，其余的或正发病或已逐渐康复，最终死亡1只。在接种病毒后第7天采血，攻毒组血清中能检测到抗H9亚型流感抗体，HI价为5-6log2，对照组HI为阴性，并且从病料中均分离出该亚型毒株。

5)动物回归试验

以0.2ml/只接种非免疫鸭后，第2天有1只鸭出现神经症状，扭头歪颈，4天后有2只鸭死亡，剖检症状与临床中一致。血凝实验表明，攻毒组血清中能检测到抗H9亚型流感抗体，对照组HI为阴性，接种鸡胚后亦能分离出该亚型毒株。剖检可见，腿部肌肉有出血点，喉头、气管有明显淤血：肝脏肿大，有出血点；十二指肠及小肠黏膜红肿，有程度不同的出血点或出血斑；腺胃与食道，腺胃与肌胃交界处有带状出血；胰腺出血，有淡黄色斑点状坏死点；花斑肾。

(5)病毒的理化特性

1)血凝素热稳定性试验

分离株尿囊液经56℃水浴5min，其HA效价下降2个滴度，56℃水浴200min后已检测不到HA效价，说明其血凝素为热不稳定型(见表4)。

                           表456℃水浴不同时间(min)后血凝素热稳定性测定结果

时间(min)	0	5	10	15	30	60	90	120	150	200	过夜	类型
													HA效价(log2)	10	8	8	7	6	4	3	2	2	0	0	热不稳定

2)耐热性

AIV分离株的耐热性鉴定的结果见表5。AIV分离株在4℃放置60min后，对鸡胚的感染力不变，50℃放置60min、60℃放置10min后均检测不到HA效价，表明该分离株对热敏感(见表5)。

                   表5不同温度、时间处理后接种鸡胚的感染数^*

温度(℃)时间(min)	4℃60min	50℃15min	50℃30min	50℃60min	60℃10min	类型
							HA效价(log2)	4/4	3/4	1/4	0/4	0/4	热不稳定

注：分母为接种鸡胚数，分子为尿囊液HA阳性胚数

3)化学特性

AIV分离株化学特性鉴定见表6。AIV分离株经乙醚、氯仿和酸处理接种鸡胚后，均检测不到HA效价，表明该分离株对乙醚、氯仿和酸均敏感(见表6)。

             表6AIV分离株经不同方法处理后对鸡胚的感染数^*

组别(Groups)	乙醚(Ether)	氯仿(Chloroform)	酸(Acid)
				试验组(Treated group)	0/4	0/4	0/4
对照组(Control group)	4/4	4/4	4/4

注：分母为接种鸡胚数，分子为尿囊液HA阳性胚数

实施例2兔抗禽流感病毒核蛋白免疫血清的制备及检验

1免疫抗原的制备

(1)病毒的增殖

取QLG-1毒株，用灭菌生理盐水作10^-4稀释，无特定病原微生物(SPF)鸡胚尿囊腔接种，每胚0.2mL，接种后密封针孔，37℃继续孵育。每12小时照蛋1次，将24小时前死亡鸡胚弃去，24小时至72小时死亡的鸡胚置于4℃冷却过夜，收获鸡胚尿囊液，HA效价≥9log2，方为合格。

(2)病毒的灭活

将收获合格的鸡胚尿囊液冻融3次后，加入终浓度为0.2％的甲醛，充分混合均匀后置换至另一无菌容器内，37℃作用24小时，每隔6小时振摇1次。灭活鸡胚尿囊液抽样接种9-11日龄SPF鸡胚，每胚0.2mL。鸡胚在观察期内无死亡，连续传2代收获鸡胚尿囊液HA均为阴性，即确认为病毒灭活完全。灭活病毒置4℃保存待用，保存期不超过1个月。

(3)病毒的提纯

灭活的鸡胚尿囊液10,000r/min离心，取上清，再经27,000r/min离心2小时，弃去上清，收取沉淀病毒，用PBS缓冲液制备成病毒悬液。溶解的病毒悬液再进行蔗糖梯度离心，27,000r/min离心2小时，收获40％处的蛋白沉淀带，再经27,000r/min离心2小时脱糖。

(4)禽流感病毒核蛋白的制备

在提纯的病毒悬液中加入2％(V/V)的Triton-X100，37℃作用6h后35,000r/min离心2小时，沉淀用生理盐水溶解，即为纯化的核蛋白。用紫外分光光度计(280nm)测定纯化抗原的浓度，调整蛋白浓度为1mg/mL。

2免疫程序

用体重2.0kg以上的健康家兔，首次免疫于后足皮内各注射弗氏完全佐剂抗原250μg，1周后，于两后肢肿大的腘窝淋巴结内各注射弗氏不完全佐剂抗原1mg，第2周于肌肉和皮下多点注射弗氏不完全佐剂抗原5mg，4周后耳静脉注射无佐剂抗原5mg，1周后采血测试效价。待琼脂双扩散试验效价达到1∶32时颈动脉放血。收集血清置-70℃低温冰箱保存备用。具体免疫程序见表7。

                                表7制备兔抗禽流感病毒核蛋白的免疫程序

序号	程序	第△次	第△天	途径(部位)	剂型	剂量	材料准备及注意事项
								1	基础免疫	1	0	两后跟足掌皮下	弗氏完全佐剂抗原	250μg/足共500μg/只
2	基础免疫	2	7	1.肿大的胴窝淋巴结2.背部两侧皮下，共6点4.腿部肌肉，共4点5.腹腔内	弗氏不完全佐剂抗原	2mg/淋巴结1mg/只1mg/只1mg/只	准备用具：实验家兔固定架、剪刀、镊子、止血钳、酒精棉球、棉花及注射器。
								3	加强免疫	3	21	1.腿部肌肉，共4点2.腹腔内	弗氏不完全佐剂抗原	5mg/只5mg/只	准备用具：实验家兔固定架、剪刀、镊子、止血钳、酒精棉球、棉花及注射器等。
4	加强免疫	4	60	加强免疫耳静脉注射	纯化的无佐剂抗原	10mg/只	静注前先于皮下注射2mg(脱敏)，半小时后再行静注，静注速度宜慢。
								5	试血	5	67	由耳静脉放血1ml于真空采血管中			AGP检测抗体效价达1∶32以上即可
6	采血	6	67-70	颈动脉放血致死			准备用具：实验家兔固定架、剪刀、镊子、止血钳、酒精棉球、棉花、一次性输液器及灭菌盐水瓶等。

3IgG抗体的提取及保存

待提纯的血清先于4℃，12,000r/min离心10min，弃杂质，然后每份血清加4倍体积0.06M，pH4.5的醋酸盐缓冲液，然后在室温下缓慢加入辛酸(25L/mL)，边滴加边搅拌，滴完后室温继续搅拌30min，然后4℃静置2h，12,000r/min离心10min，取上清调pH值至7.4，用45％的饱和硫酸铵沉淀，pH7.4，0.01MPBS溶解后透析过夜。透析完后分装到1.5mLEP管中，分装量为1mL，冻存于-80℃，待用。注意避免反复冻融和污染。

实施例3禽流感病毒乳胶凝集检测方法的建立

取125μL10％羧化乳胶放入EP管中，pH9.6，0.1M碳酸缓冲液洗3遍，再用pH4.5，0.01M磷酸缓冲液选3遍，然后加入0.5％的水溶性碳化二亚胺在磷酸缓冲液中室温作用4h，后用pH8.5，0.01M硼酸缓冲液洗3遍，将乳胶用1ml硼酸缓冲液悬浮后加入适量的IgG致敏一定时间后加入终止剂终止反应。。

1最佳偶联IgG量的确定

在1mL硼酸缓冲液悬浮的羧化乳胶中，分别加入不同量的IgG，从200μg、400μg、600μg递增至1800μg，第6步后收集上清，经UV-120分光光度计测定上清中剩余的蛋白量，计算IgG的偶联效率，公式如下：

IgG的偶联效率(％)＝(IgG的初始加入量-剩余的IgG量)/IgG的初始加入量×100％

经试验验证，在1mL浓度为1％的羧化乳胶中，当加入的IgG量为800-1000μg时，偶联效率达到最大，此时乳胶检测的灵敏度最高，稳定性最好。具体结果见表8：

                   表8不同IgG加入量时的偶联效率

IgG的初始加入量(μg)	偶联到乳胶上的IgG量(μg)	偶联效率(％)
			200	62	31
400	148	37
			600	276	46
800	520	65
			1000	690	69
1200	648	54
			1400	700	50
1600	672	42
			1800	684	38

2最佳偶联时间的选择

在1mL硼酸缓冲液悬浮的羧化乳胶中，加入1000μgIgG，在室温作用不同的时间(0.5、1、2、4、，6、8、10、12、14h)，作用完后收集上清，经UV-120分光光度计测定上清中剩余的蛋白量，计算IgG的偶联效率，公式如下：

IgG的偶联效率(％)＝(IgG的初始加入量-剩余的IgG量)/IgG的初始加入量×100％

经试验验证，当偶联时间达到8h时，偶联到乳胶微球上的IgG量基本上不再变化，此时偶联效率达到最大，所以选用8h作为最佳偶联时间。具体结果见表9：

                             表9不同致敏时间时的偶联效率

偶联时间	IgG的初始加入量(μg)	偶联到乳胶上的IgG量(μg)	偶联效率(％)
				0.5h	1000	325	32.5
1h	1000	283	28.3
				2h	1000	410	41
4h	1000	520	52
				6h	1000	640	64
8h	1000	690	69
				10h	1000	690	69
12h	1000	700	70
				14h	1000	695	69.5

3偶联反应终止剂的选择

抗体与乳胶微球过度偶联会导致抗体失活，从而降低抗体-微球基质与抗原结合的能力。所以需要在反应体系中引入其它氨基基团以终止偶联反应。常用的终止剂为乙醇胺和甘氨酸。经试验验证乙醇胺的终止效果要好于甘氨酸，故选用乙醇胺作为终止剂，所用的浓度为0.1M，剂量为1mL浓度为1％的羧化乳胶中加入50μL 0.1M乙醇胺，反应时间为15min。

实施例4LAT的敏感性试验和特异性试验

1、敏感性试验

将禽流感各亚型(H1～15)尿囊液病毒倍比稀释，分别用致敏好的乳胶诊断试剂检测，发现可与1∶64稀释的尿囊液毒反应(+++)，达到了较好的敏感性(该试验结果由国家禽流感参考实验室验证)。结果见表10

                                        表10敏感性试验(n＝5)

稀释度	AIV	尿囊液原毒(HA效价28)	1∶2	1∶4	1∶8	1∶16	1∶32	1∶64	1∶128
										检测结果	H1	++++	++++	++++	++++	++++	++++	+++	-
H2	++++	++++	++++	++++	++++	++++	+++	-
									H3		++++	++++	++++	++++	+++	-	-	-
H4	++++	++++	++++	++++	++++	++++	+++	-
									H5		++++	++++	++++	++++	++++	++++	+++	-
H6	++++	++++	++++	++++	++++	++++	+++	-
									H7		++++	++++	++++	++++	++++	++++	+++	-
H8	++++	++++	++++	++++	++++	++++	+++	-
									H9		++++	++++	++++	++++	++++	++++	+++	-
H10	++++	++++	++++	++++	++++	++++	+++	-
									H11		++++	++++	++++	++++	++++	++++	+++	-
H12	++++	++++	++++	++++	++++	++++	+++	-
									H13		++++	++++	++++	++++	+++	-	-	-
H14	++++	++++	++++	++++	++++	++++	+++	-
									H15		++++	++++	++++	++++	++++	++++	+++	-

注：：“++++”全部乳胶凝集，颗粒聚于液滴边缘，液体完全透明；“+++”大部分乳胶凝集，颗粒明显，液体稍混浊；

“++”约50％乳胶凝集，但颗粒较细，液体较混浊：“+”有少许凝集，液体呈混浊；“-”液滴呈原有的均匀乳状。

2、特异性试验

致敏好的乳胶试剂禽流感病毒反应呈强阳性，与鸡主要的呼吸道病毒如：鸡新城疫病毒(NDV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、传染性支气管炎病毒(52、120株)、鸡减蛋综合症病毒(EDSV-76)、禽副粘病毒2型(PMV-2)、SPF鸡胚尿囊液均不反应，达到了较好的特异性。结果见表11。

                             表11特异性试验(n＝5)

病毒种类	EDSV-76	NDV	IBV-120	IBV-52	IBDV	PMV-2	阴性尿囊液
								检测结果	-	-	-	-	-	-	-

实施例5乳胶凝集试剂盒的重复性试验

1批内重复性试验

制备3批禽流感病毒乳胶凝集检测试剂盒(批号为0481、0482、0483)，每批5个(试剂盒编号从01-05)，在每批试剂盒中随机抽取3个试剂盒对灭活的H9N2亚型、H4N6亚型、H3N2亚型、H1N1亚型禽流感病毒和鸡新城疫病毒(NDV)进行检测，观察其敏感性、特异性和稳定性。结果表明，其敏感性、特异性和稳定性没有变化，说明本LAT方法的批内重复性良好。结果见表12、13、14：

                 表12批内重复试验(试剂盒批号0481)

试剂盒编号	H9N2	H3N2	H4N6	H1N1	NDV
						048101048102048104	++++++++++++	++++++++++++	++++++++++++	++++++++++++	---

                      表13批内重复试验(试剂盒批号0482)

试剂盒编号	H9N2	H3N2	H4N6	H1N1	NDV
						048202048103048104	++++++++++++	++++++++++++	++++++++++++	++++++++++++	---

              表14批内重复试验(试剂盒批号0483)

试剂盒编号	H9N2	H3N2	H4N6	H1N1	NDV
						048302048104048105	++++++++++++	++++++++++++	++++++++++++	++++++++++++	---

2批间重复性试验

在不同时间制备3批禽流感病毒乳胶凝集检测试剂盒(批号为0481、0482、0483)，对同一份灭活的H9N2亚型、H4N6亚型、H3N2亚型、H1N1亚型禽流感病毒和新城疫病毒进行检测，观察其敏感性、特异性和稳定性。结果表明，其敏感性、特异性和稳定性没有变化，说明本LAT方法的批间重复性良好。结果见表15

                                   表15批间重复试验

试剂盒批号	H9N2	H3N2	H4N6	H1N1	NDV
						048104820483	++++++++++++	++++++++++++	++++++++++++	++++++++++++	---

实施例6试剂盒对试验感染动物不同样本的检测

1动物感染试验方案

动物试验均在通过验收许可的具有负压装置的小动物房中的鸡高效隔离器中进行，所有的淘汰动物都经焚尸炉焚烧处理。

1)禽流感病毒毒株：本发明分离得到的禽流感毒株编号为QLG-1，该毒株于2005年9月2日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC-V200512，(HA效价2¹⁰)；H1N1尿囊液原毒(HA效价2¹⁰)；H3N2尿囊液原毒(HA效价2¹¹)：H4N6尿囊液原毒(HA效价2¹¹)：NDV尿囊液原毒(HA效价2⁸)；由华农业大学动物医学院动物病毒室提供。

2)试验方案：实验前测定所有鸡的血凝抑制(HI)效价，选取抗体水平为阴性的鸡120只进行攻毒试验。试验分为H9N2、H1N1、H3N2、H4N6四个人工感染组，每组30只，同时平行设1000EID₅₀、100EID₅₀、10EID₅₀、1EID₅₀和0.1EID₅₀5个攻毒剂量，每个剂量组6只。攻毒方式为胸部肌肉注射0.3mL/只。

2试验样本检测结果

                                      表16禽试验样本检测结果

禽流感病毒类型	H9N2			H1N1			H3N2			H4N6
													总样本数	阳性结果	阳性率	总样本数	阳性结果	阳性率	总样本数	阳性结果	阳性率	总样本数	阳性结果	阳性
	喉头拭子	106	85	80.2％	106	86	81.1％	106	69	65.1％	106	85													80.2％
心													30	6	20％	30	6	20％	30	4	13.3％	30	6	20％
	肝	30	25	83.3％	30	26	86.7％	30	21	70％	30	26													86.7％
脾													30	26	86.7％	30	26	86.7％	30	22	73.3％	30	26	86.7％
	肺	30	29	96.7％	30	28	93.3％	30	26	86.7％	30	29													96.7％
肾													30	27	90％	30	27	90％	30	24	80％	30	27	90％
	胰脏	30	20	66.7％	30	21	70％	30	18	60％	30	20													66.7％
泄殖腔													30	4	13.3％	30	3	10％	30	3	10％	30	4	13.3％
	肌肉	30	0	0％	30	0	0％	30	0	0％	30	0													0％

四个不同亚型的流感病毒对鸡的致病力相当，当攻毒剂量为1000EID₅₀时，第3天有4只鸡死亡，死亡率为3.3％(4/120)，但其它的鸡都能够耐过并且表现出良好的精神状态，直到20天时鸡只仍然没有出现死亡，20天后我们将所有存活的鸡处死并收集内脏组织进行LAT检测。从表中可以看出，我们制备的乳胶试剂可以从各组攻毒鸡的喉头拭子和组织脏器中检测出禽流感病毒，其中肺脏的检出率最高，可以达到96.7％，其次是肾脏，脾脏、肝脏、胰脏的检出率相当，胸部肌肉的检测结果都为阴性。喉头拭子的检出率大约在80％左右。四个亚型的禽流感病毒中。对H3N2的检出率要略低于其它亚型一些，这与敏感性试验结果(见表10)是一致的。

3阴性符合率

80份阴性喉头拭子和15份内脏组织均采自SPF鸡，病毒分离鉴定的结果均为阴性，结果见表17：

                      表17阴性符合率检测结果

	数量	病毒分离鉴定阴性结果	LAT阴性结果	阴性符合率
					喉头拭子	80	80	80	100％
心脏	15	15	15	100％
					肝脏	15	15	15	100％
脾脏	15	15	15	100％
					肺脏	15	15	15	100％
肾脏	15	15	15	100％
					胰脏	15	15	15	100％
泄殖腔	15	15	15	100％
					胸部肌肉	15	15	15	100％

从表11中可以看出，对于不带毒的健康鸡的样本，检测结果其阴性符合率分别达到100％，基本上消除了由样本中的杂质所引起的非特异性凝集。

4新城疫病毒(NDV)感染鸡LAT检测结果

用新城疫尿囊液病毒(HA2¹¹)攻毒20只，胸部肌肉注射尿囊液原毒0.5mL。由表18的结果可以看出，特异性符合率达到了100％。

            表18新城疫病毒(NDV)感染鸡LAT检测结果

	数量	病毒分离鉴定阳性结果	LAT阳性结果	特异性符合率
					喉头拭子	20	20	0	100％
心脏	20	20	0	100％
					肝脏	20	20	0	100％
脾脏	20	20	0	100％
					肺脏	20	20	0	100％
肾脏	20	20	0	100％
					胰脏	20	20	0	100％
泄殖腔	20	20	0	100％
					胸部肌肉	20	20	0	100％

5动物试验的结果分析

从动物试验的结果可以看出，将兔抗禽流感病毒核蛋白(NP)免疫血清提取IgG后致敏羧化聚苯乙烯乳胶，可以检测出所有亚型的禽流感病毒，与新城疫等其它病毒不反应，说明本发明具有良好的特异性和敏感性。从攻毒后鸡的喉头拭子和内脏组织中均可以检测到禽流感病毒，内脏组织的检出率要高于喉头拭子，与病毒分离鉴定的结果相比，肺脏组织浸出液的检出率最高，达到了96.7％，而且阴性符合率也达到了100％。符合了诊断试剂的要求。

实施例7LAT试剂盒与其它检测禽流感病毒方法的比较

1LAT试剂盒与病毒分离的比较

在湖南省兽医总站进行田间试验评估，共检测临床送检样本123份，与病毒分离鉴定进行比较，两者的符合率为96％。具体结果见表19：

      表19LAT试剂盒与病毒分离的比较结果

病毒分离结果	LAT试剂盒的检测结果
				阳性	阴性	总数
	阳性	27	1				28
阴性				4	91	95
	总数	31	92				123

2LAT试剂盒与禽流感病毒免疫层析试剂盒的比较

在湖南省兽医总站进行田间试验评估，共检测临床送检样本123份，与禽流感病毒免疫层析试纸条检测试剂盒(Animal Genetics，Inc.(476-1 Pajang-dong，Jangan-gu，Suwon-si，Kyonggi-do，Korea))进行比较，，两者的符合率为96.7％。具体结果见表20：

表20LAT试剂盒与免疫层析试剂盒的比较结果

免疫层析试纸条结果	LAT试剂盒的检测结果
				阳性	阴性	总数
	阳性	28	1				29
阴性				3	91	94
	总数	31	92				123

3LAT试剂盒与禽流感病毒荧光RT-PCR的比较

在深圳出入境检验检疫局进行田间试验评估，与禽流感病毒荧光RT-PCR试剂盒(深圳太太基因有限公司)进行比较，共检测样本218份，其中鸡胚培养尿囊液病毒2份，阳性结果2份；鸡大腿(骨髓)23份，其中4份阳性；鸡翅膀(骨髓)23份，其中6份阳性；喉头拭子30份，全部为阴性；肝脏10份，其中3份阳性；胰脏10份，其中1份阳性；脾脏30份，其中6份阳性；肺脏30份，其中10份阳性；肾脏30份，其中7份阳性；肌肉(腿部)30份，其中3份阳性；218份样本中共有阳性结果42份。在检测过的30只鸡中有10只为禽流感阳性(以肺脏、肾脏检出结果为主要判断依据)。荧光RT-PCR检测上述218份样品，其中阳性8份。在检测过的30只鸡中有3只为禽流感阳性。初步分析，LAT的检出率要高于荧光RT-PCR。结果见表21：

                             表21LAT试剂盒与荧光RT-PCR试剂盒的比较结果

	尿囊液	鸡大腿(骨髓)	鸡翅膀(骨髓)	喉头拭子	肝脏	胰脏	脾脏	肺脏	肾脏	肌肉(腿部)
											样本总数(份)	2	23	23	30	10	10	30	30	30	30
LAT阳性	2	4	6	0	3	1	6	10	7	3
											荧光RT-PCR阳性	2	0	1	0	1	1	1	2	2	0

实施例9本发明的试剂盒保存期试验

1、致敏乳胶试剂的保存期试验结果

将同一批致敏的乳胶试剂分装成小份，分别在4℃和室温下保存1至6个月，每月定期进行LAT试验，分别与灭活的H9N2亚型、H4N6亚型、H3N2亚型、H1N1亚型禽流感病毒和新城疫病毒反应，观察其敏感性、特异性和稳定性，以确定乳胶试剂的保存期。在本试验中，申请人制备了三批乳胶诊断试剂(批号分别为0405、0406、0407)，同时进行平行试验。通过本试验，乳胶试剂经4℃保存6个月以上其特异性，稳定性、敏感性均不发生改变。结果见表22、23、24：

                           表22乳胶诊断试剂保存期试验(批号0405)

禽流感病毒种类	H9N2			H3N2			H4N6			H1N1			NDV
																检测时间(月)	1	3	6	1	3	6	1	3	6	1	3	6	1	3	6
检测结果	#	#	#	#	#	#	#	#	#	#	#	#	-	-	-

注：“#”表示“++++”的凝集程度

                             表23乳胶诊断试剂保存期试验(批号0406)

禽流感病毒种类	H9N2			H3N2			H4N6			H1N1			NDV
																检测时间(月)	1	3	6	1	3	6	1	3	6	1	3	6	1	3	6
检测结果	#	#	#	#	#	#	#	#	#	#	#	#	-	-	-

注：“#”表示“++++”的凝集程度

                          表24乳胶诊断试剂保存期试验(批号0407)

禽流感病毒种类	H9N2			H3N2			H4N6			H1N1			NDV
																检测时间(月)	1	3	6	1	3	6	1	3	6	1	3	6	1	3	6
检测结果	#	#	#	#	#	#	#	#	#	#	#	#	-	-	-

注：“#”表示“++++”的凝集程度

2试剂盒其它试剂保存期试验结果

申请人制备了三批试剂盒，将其同时放于4-8℃进行保存期试验，结果表明，阳性样品对照在4-8℃保存6个月后进行LAT试验，其敏感性不发生改变。阴性样品对照在4-8℃条件下保存6个月后进行LAT试验，结果仍为阴性。样本处理液A、B在4-8℃保存6个月后其质量和性状也不发生改变。说明试剂盒其它试剂在4-8℃可以保存6个月。

实施例10禽流感病毒乳胶凝集检测试剂盒的组装

1快速检测鸡禽流感病毒抗体的试剂盒包括：

1)乳胶抗原          1管                         (1ml/管)

2)阳性对照          1管                         (1ml/管)

3)阴性对照          1管                         (1ml/管)

4)样品处理液A       1瓶                         (100ml/瓶)

5)样品处理液B       1瓶                         (100ml/瓶)

2相关溶液的配制

1)样品处理液A的配制：称取Na2B4O7·10H2O 13.3g，H3BO3 16.08g，NaCl 8.5g，ddH2O 800mL，调pH值为8.4后定容至1000mL。高压灭菌(121℃，30分钟高压蒸汽)后分装，置4℃贮存，用于处理内脏组织。

2)样品处理液B的配制：称取Na2B4O7·10H2O 13.3g，H3BO3 16.08g，NaCl 8.5g，ddH2O 800mL，调pH值为8.4后定容至1000mL。高压灭菌(121℃，30分钟高压蒸汽)后加入5g N-乙酰-L-半胱氨酸，5mL NP-40，混匀后分装，置4℃贮存，用于处理喉头拭子。

3)阳性对照的配制：用经甲醛灭活的H9亚型禽流感病毒作为阳性对照样品。

4)阴性对照的配制：无菌收取SPF鸡胚尿囊液，4℃，12,000r/min离心30min后加入0.02％NaN3防腐。分装成0.5mL/管，置-20℃贮存。

实施例11本发明试剂盒的使用方法

1、样品制备

1)临床鸡胚分离病毒尿囊液样本的处理方法：尿囊液样本于12000rpm离心5min取上清待检。

2)内脏组织检测样本的处理方法：称取内脏组织块0.5克，置于匀浆器中，加样本处理液A1ml，研磨完全后取出组织浸出液，冻融3遍，然后于4℃，12000rpm离心15min，取上清待检。

3)喉头拭子检测样本的处理方法：用无菌棉拭子于鸡喉头部沾取渗出液，然后浸泡于0.8ml样本处理液B中，在蜗漩仪上剧烈震荡1min后挤出棉拭子中的液体，弃棉拭子，液体部分冻融3次后于37℃温箱中作用15min，后于4℃，12000rpm离心15min，取上清待检。

2、检测

取检测样品、阳性对照、阴性对照各8-10μl，分置于玻璃片上，各加等量的乳胶，搅拌混匀，摇动30秒后观察结果。

3、结果判定

1)对照试验：30秒内出现如下结果，试验方可成立：阳性对照与乳胶诊断试剂作用出现明显均匀一致的凝集，阴性对照与乳胶诊断试剂不凝集。

2)30秒内出现明显均匀一致的凝集者判为阳性30秒内液滴呈原有的均匀乳状为阴性。

尽管本发明的内容是结合本实施例进行说明，但是不能认为是对本发明范围的限制，本发明的范围由所附权利要求书限定。另外，本领域的技术人员在所附权利要求书限定的范围内对本发明进行各种改动或修饰，这些改动或修饰形式同样落在本发明的保护范围内。

Claims (6)

1、一种适用于禽流感病毒检测的乳胶凝集试剂盒，它包含盒体和设在盒体内的检测试剂，其特征在于，所述的检测试剂是能与禽流感病毒特异反应的乳胶试剂，其它组分包括样品处理液A和样品处理液B，阳性对照样品和阴性对照样品。

2、权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的的乳胶试剂是从禽流感病毒中提取核蛋白，然后免疫家兔得到免疫血清，从该免疫血清中提取IgG，用该IgG制敏羧化乳胶得到的，所述的样品处理液A和B的组分及含量按重量/体积为：

样品处理液A

Na₂B₄O₇·10H₂O    13.3g/L

H₃BO₃             16.08g/L

NaCl              8.5g/L

补充蒸馏水至1L。

样品处理液B

Na₂B₄O₇·10H₂O      13.3g/L

H₃BO₃               16.08g/L

NaCl                8.5g/L

N-乙酰-L-半胱氨酸   5g/L

Nonidet P-40(NP-40) 5ml/L

补充蒸馏水至1L。

所述的阳性对照样品是灭活的禽流感病毒    1ml/管

所述的阴性对照样品是SPF鸡胚尿囊液       1ml/管

3、权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，其中所说的阳性对照样品的血清型是H9N2亚型。

4、适用于权利要求1-3任一项的检测试剂盒的禽流感Avian influenza virus病毒株QLG-001，保藏在CCTCC，保藏编号CCTCC NO：V200512。

5、权利要求1-3任一项的试剂盒在检测禽流感病毒上的应用。

6、权利要求5的应用，其中包括在检测禽流感病毒H9亚型上的应用。

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