CN102216467A - 用于微生物快速生长和检测的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于在待测样本中检测采自微生物尤其是致病微生物的特定物质如核心寡糖的检测方法。本发明还涉及用于该微生物快速生长使得与当前的方法相比，明显早地检测成为可能的组合物和方法，。在具体的实施方案中，本发明旨在沙门氏菌属、志贺氏菌属、李斯特氏菌属的快速生长和/或检测。

Description

用于微生物快速生长和检测的组合物和方法
发明领域
本发明涉及用于在待测样本中，检测采自微生物尤其致病微生物的特定物质的方法。本发明还涉及用于该微生物快速生长使得与当前的方法相比，明显早地检测成为可能的组合物和方法。
发明背景
由于食物产品从本质上是生物的，其能够支持多种微生物的生长。根据统计，在美国每年发生七千六百万例食源性疾病，在医疗护理和生产力降低方面花费六十五亿到349亿美元的(Buzby和Roberts，1997；Mead等人，1999)。据统计在欧洲沙门氏菌属的经济和卫生服务的花费在六亿两千万到三十亿欧元之间(David Byrne，European Commissioner for health and consumer protection，2000)。
沙门氏菌属，属，弯曲杆菌属，大肠杆菌O157:H7以及志贺氏菌属是形成大多数食源性疾病案例的原因。例如，沙门氏菌属和李斯特菌属单独地对分别为31％和28％的食物相关的死亡负责(Mead等人1999)，而在日本，在1981年到1995年之间，沙门氏菌病占总的食源性疾病爆发的14％以上(Lee等人，2001)。实际上，根据估计细菌是多达60％的需要住院的食源性疾病的病例的病因。因此，对微生物污染产品的低效率的及慢速的检测造成的延迟是造成浪费的最大因素之一。按照当前的检测方法，生产商必须为微生物繁殖结果等待三到七天。该延迟所产生的成本是显著的——降低了供应链的效率，占用库存并且增加损坏。
不适当的或者不完善的检测的成本可能是昂贵的，如果不会带来更多问题的话。例如，1999年Sara Lee在其食物被认为与李斯特氏菌属爆发有关之后，与其BiI Mar Foods单位的三千五百万磅热狗和熟肉的召回有关的花费估计有七千六百万美元。根据《The Scotsman》，2006年Cadbury Schweppes在为沙门氏菌属污染巧克力的召回成本，广告，损失的收入以及随后对其生产操作的改进花费了估计有两千万英镑。更近的在2009年，美国花生公司，作为2008年经营收入估计有两千五百万美元的公司，在被确认是美国花生中一次较大的沙门氏菌爆发的源头之后，递交了破产请求。
因此，在食物、饲料和环境样品中检测致病性微生物如沙门氏菌属，志贺氏菌属和李斯特氏菌属的存在具有重大的经济意义。然而，用于该微生物检测的传统培养方法不仅是劳动力密集的，而且耗时。通常这样的方法基于已经使用超过五十年的标准步骤。
除此之外，致病性的微生物能够在环境中长期处于受严重的胁迫状态，所述的“活的非可培养状态(VNC)”或者“不能立即培养(NIC)”状态。该受严重的胁迫的微生物仅仅显示出弱的，通常在检测限上的代谢活性，并且其失去在非选择性平面皿培养基上形成聚落，或者在非选择性肉汤培养基中生长的能力(Reissbrodt等人，2002)。然而，当这种不可培养的聚落存在于食物和动物饲料中时，如果食用，其仍然可能导致疾病。由于这样受胁迫的微生物可能无法充分地活化以至于能够被检测，这带来了特别的问题。
因此，任意诊断中在进一步培养、铺板和检测之前通常包括旨在活化该细胞的额外的细胞培养步骤。因此，在非选择性的培养介质中预先富集对于传统的方法而言是关键的要素(Stephens等人，2000)。例如，沙门氏菌属的检测需要长达5天的数个培养阶段；分析通常包括富集步骤，从而活化“生病的”细菌，并且检测通常受到该富集肉汤和培养基的性能的限制。
因此，为了恢复来自潜在地含有异源的细菌种群的临床标本，食物和其他产品的微生物，可以使用三大类培养介质：(1)为初步分离目的的非选择性的介质；(2)富集肉汤以及(3)选择性的和/或分化性的琼脂糖。该介质的配方通常复杂，并且包括不仅抑制特定的细菌种类生长，也即它们是选择性的，同时也检测几种生物化学特性，所述的生物化学特性在对样品中存在的微生物进行早期鉴别是重要的，也即，它们是分化性的。为了进行合理的选择，微生物学家必须知道各个配方的成分以及所包括的各个化合物的目的及相对浓度。不幸的是，可得到的介质通常过于复杂，以及多种组分的效果和量通常很少为人所知。通常，所使用的介质与使用了几个世纪的介质是一样的，并可能是一开始为了完全不同的生物体开发的。例如，由于这些缺陷，当前对沙门氏菌属的检测率在15天内低于50％，以及在28天内低于90％(King，2009)。
因此，需要明确界定，不含有多余的组分的培养介质，所述的培养介质可能具有少的或者没有副作用，并且对于即使受胁迫的微生物的生长和快速培养而言是优化的，。该培养介质应该不需要二次的/额外的培养步骤。也有对新的和更好的检测方法的需要，所述的方法使得能够分离和/或鉴定非常低数量的，以及位于异源微生物群落的环境下的致病性微生物。进一步地，任意的该方法应该等同地适用于从大范围内的来源中检测微生物，所述的来源如化妆品、食物产品、临床样品和环境样品，所述的食物产品包括冷冻的、冻干的和液体的产品，所述的临床样品如尿、大便或者血液样品和环境样品。
发明概述
在本发明的第一个方面，提供了用于至少一种微生物的生长的培养介质，其必要地包括：
(i)基础肉汤；
(ii)至少一种生长抑制剂，其选自煌绿、萘啶酸和氯化锂所组成的组；和
(iii)可选地，至少一种生长促进剂，其选自连四硫酸钠、连四硫酸钾、柠檬酸铁铵和柠檬酸钠所组成的组。
为了避免产生怀疑，此处使用的术语“必要地包括”包括仅包括所规定的材料或者步骤，以及不相当地影响到本发明的基本的和创新的特征的范围内的额外组分或者元素。
可以将介质分类为简单的、复杂的或者经界定的。基础肉汤或者基础培养基从根本上是维持细菌的具有最少的附加成分的简单培养基。一般地说该基础肉汤只需提供能量的来源，以及具有保持正确的渗透压。蛋白胨、胰化蛋白胨、肉汁(蛋白胨、肉的提取物，可选地酵母提取物和氯化钠)，L-肉汤(胰化蛋白胨、酵母提取物和氯化钠)，革兰氏阴性肉汤、胰蛋白酶大豆肉汤、含有酵母的胰蛋白酶大豆肉汤和改良的胰蛋白酶大豆肉汤是本领域适用的基础组分。蛋白胨是几种水溶的蛋白质衍生物，其通过将蛋白质(或者多种蛋白质)在消化过程中，由酸或者酶部分水解得到。胰蛋白酶大豆肉汤一般地包括例如胰化蛋白胨(酪蛋白的胰腺消化物)，大豆胨(大豆粉木瓜蛋白酶消化物)和氯化钠。改良的胰蛋白酶大豆肉汤可以进一步地包括葡萄糖、胆汁盐和磷酸二钾盐。具体地，基础肉汤选自胰化蛋白胨、肉汁、L-肉汤、革兰氏阴性肉汤、蛋白胨、胰蛋白酶大豆肉汤、具有酵母的胰蛋白酶大豆肉汤和改良的胰蛋白酶大豆肉汤所组成的组。更具体地，基础肉汤选自蛋白胨、胰蛋白酶大豆肉汤、具有酵母的胰蛋白酶大豆肉汤和改良的胰蛋白酶大豆肉汤所组成的组。
在具体的实施方案中，所述的生长抑制剂是煌绿，一种三芳基甲烷染料(CAS号为633-03-4)。
煌绿是已知抑制革兰氏阳性细菌和大多数革兰氏阴性细菌的染料。在本领域中其以变化的量使用，例如，在DifcoTM m煌绿肉汤中25mg/L，以及在煌绿连四硫酸盐胆汁肉汤中70mg/L，在MLCB琼脂糖中4.5-6mg/L，以及在Muller Kauffmann连四硫酸盐肉汤中10mg/L。尽管已经使用了几个世纪，发明人惊奇地发现煌绿的该浓度对于例如沙门氏菌属和志贺氏菌属的生长而言不是最优的。实际上，据认为该高浓度对于沙门氏菌属和志贺氏菌属的充分和快速的生长是有害的，并可能妨碍“生病的”或者“受胁迫的”细菌的恢复。沙门氏菌属的特定的株如伤寒沙门氏菌、副伤寒沙门氏菌以及其他已知是对煌绿敏感的株，并且目前没有适当的培养介质在株之间显示出有差别的抑制(Chau和Leung，2008)。
发明人发现了一系列浓度的煌绿针对例如革兰氏阳性细菌提供抑制效果，同时使得沙门氏菌属(包括伤寒沙门氏菌和副伤寒沙门氏菌)和志贺氏菌属能快速地恢复并生长。因此，在具体的实施方案中，所述的培养介质包括煌绿，其用量约为0.05至约0.25mg/L之间，或者在约0.1至约0.25mg/L之间，更具体地0.15mg/L。
从本领域中介质中已知的水平来看，这些“低水平”是令人吃惊的。人们相信由于本领域已知的长期的培养方法，在可能长达48小时的培养持续时间内使用高浓度的煌绿抑制竞争微生物以前是必要的。然而在本发明的介质中，生长效率是微生物能在单一的培养基中20小时之内培养到适合的检测水平，具体地约4-15个小时，更具体地约4-8个小时，以及再更具体地4-6个小时。在其他的实施方案中，如果用于表面棉签试验，这可能进一步地缩减到约30分钟至约4小时，具体地约1、1.5、2、2.5或者3小时。结果是可以使用令人吃惊地低的水平的煌绿，并且其仍然在抑制特定的竞争性微生物上起效长达20小时，而且其充分地低，从而对感兴趣的微生物，如沙门氏菌属和/或志贺氏菌属的生长没有影响。
尽管量一般以mg/L或者g/L提及，应当理解组合物可以干的性质预先混合提供，如为片、粉末、颗粒或者其他合适的干的形式，分别地或者顺序地加到水中。如果需要，所属的组合物也能以多个包装系统中分开的组分提供。在这个情况下，所述的量指在合适的水中稀释之后组分的最终浓度。例如，含有0.5mg煌绿的小包干粉稀释于2升水中，达到浓度为0.25mg/L。
在其他的实施方案中，所述的介质含有萘啶酸和/或氯化锂作为抑制剂(或者多种抑制剂。)
萘啶酸(CAS编号为389-08-2)有效抑制革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。在较低的浓度下，其以细菌抑制的方式起效果；也即其抑制细菌的生长和繁殖。在更高的浓度下，其为杀菌的，意味着其杀死细菌而不仅仅抑制其生长。在具体的实施方案中，所述的介质包括量为约1至3mg/L，更具体地约2mg/L的萘啶酸。
氯化锂(CAS编号为7447-41-8)抑制革兰氏阴性细菌的生长，而不影响革兰氏阳性细菌的生长。在具体的实施方案中，介质包含约1至3g/L，更具体低约2g/L的量的氯化锂。
萘啶酸和/或氯化锂作为生长抑制剂的使用在用于李斯特菌属生长的培养介质中是有利的。
在具体的实施方案中，培养介质可以选地包括生长促进剂。
对于沙门氏菌属而言，发现了当基础肉汤包括蛋白胨时，包括连四硫酸钠或者其盐是有利的。出人意料的是，发明人发现培养介质中连四硫酸钠水平高于20g/L时沙门氏菌属的生长显著地受抑制。由于在本领域中对沙门氏菌属进行阳性选择和培养时，高于20g/L的水平是惯常地使用的。因此，优选地连四硫酸钠以约1至约20g/L的量存在，更具体地约4至约15g/L，6至约15g/L，再更具体地约7至约15g/L，约8至12g/L或者约8g/L。
在供选择的实施方案中，在不背离本发明精神的前提下可以使用适量的硫代硫酸钠和碘代替连四硫酸钠。这是由于碘能和硫代硫酸钠原位反应产生连四硫酸钠(以及碘化钠)。在其他的实施方案中，可以使用连四硫酸钾、无水连二硫酸钡、其盐或者能够释放连四硫酸根阴离子(S4O6 2-)的化合物，这些化合物的混合物。
在其他的实施方案中，所述的培养介质包括生长促进剂，其中所述的生长促进剂为柠檬酸铁铵。
在特定的实施方案中，使用约200至1000mg/L的量的柠檬酸铁铵(CAS编号为1185-57-5)，更具体地约200至约500mg/L，再更具体地约200至约300mg/L，以及进一步再更具体地约250mg/L。
在再另一个实施方案中，培养介质进一步地包括生长促进剂柠檬酸钠。
在特定的实施方案中，使用约10至20g/L，约12至18g/L以及更具体地约15g/L的量的柠檬酸三钠盐(CAS编号为68-04-2)。
在特定的实施方案中，所述的培养介质用于沙门氏菌属的生长。在其他的实施方案中，所述的培养介质用于志贺氏菌属的生长。在再进一步的实施方案中，所述的培养介质用于李斯特菌属的生长。
根据本发明的第二个方面，本发明提供了从微生物细胞中，将核心寡糖单体释放出来的方法，其包括：
(i)在含有所述的微生物的至少一个培养样品中加入洗涤剂，从而提供洗涤剂-培养物溶液；并且
(ii)将所述的洗涤剂-培养物溶液加热到足以释放所述的核心寡糖的温度。
细菌脂多糖(LPS)对于全部的革兰氏阴性细菌和一些革兰氏阳性细菌而言是外膜的关键组分。人们认为它们在该细菌感染的患者中，是造成炎症反应的原因。革兰氏阴性细菌的实例包括大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌和弯曲杆菌。李斯特菌是革兰氏阳性的细菌。
多数经表征的LPS具有相同的主要结构；确定了LPS的结构中包括三个不同的区：脂类A区，核心寡糖以及O-多糖链(图12a)。该结构在脂类A及LPS的内核中是尤其保守的。由于这一结构上的保守，脂类A区的结合物，如抗体可能不具有对特定种的特异性，而导致在任何分子检测步骤中的假阳性。进一步地，针对如核心区的多种结合物的应用是差强人意的，由于该结合物可能对同一表位进行竞争，由于表位之间的类似性可能妨碍彼此各自的结合反应。因此，现有技术的检测方法依赖于对如沙门氏菌属的细胞表面或者鞭毛有特异性的结合物，由于这些容易达到。
一般通过含水酚萃取，随后纯化来分离LPS。经分离的LPS随后可以通过如SDS-PAGE、质谱和NMR进行表征(Raetz，1996)。本发明人发现可以通过使用快速的方法，使核心寡糖区释放或者使其可及，或者可以进行检测，所述的检测例如通过抗体结合技术，所述的方法使用洗涤剂以及加热。这一套简单方法的不适用于如细胞表面抗原或者鞭毛的检测，由于已知洗涤剂与脂类相互作用，并且会破坏或者扰乱结合物可能与之反应的脂类A表位。同时可以单独地使用洗涤剂，加热的使用是进一步有利的，由于其将LPS分解为可检测的单体，并且具有着杀死病原菌的附加好处。优选地，所述的洗涤剂是十二烷基磺酸钠(SDS)或者吐温20、40、60或者80。
出人意料地，在下文所述的直接测定中，本发明人发现SDS的使用能够增强结合物如抗体和表位之间的结合高达10倍。类似地，尽管其他的洗涤剂在直接测定(如下所示)中，妨碍和阻止抗体结合，出人意料地本发明人发现了吐温20、40、60和80很少或者没有这样的效果，例如，在竞争测定中。这与现有技术中现成的示教形成了鲜明的对比，所述示教如Qualtiere等人，1977。
所述的洗涤剂可以以液体加入培养样品中，例如溶解于如水等溶剂中，或者在SDS的情况下以固体的形式加入。用于本方法的特定的洗涤剂浓度为从约0.1％至约2％，具体地约0.5％至约1％(w/v或者v/v)。
优选地，所述的洗涤剂在水中溶解或者稀释，并以液体加入，得到前文所述的浓度。优选地，洗涤剂溶液中不存在进一步的组分如缓冲液等等。因此，在优选的实施方案中，所述洗涤剂溶液仅包括洗涤剂，溶于水中的十二烷基磺酸钠或者吐温20、40、60或者80。
在本方法的下一步中，将洗涤剂-培养物溶液加热到足以使核心寡糖释放的温度。优选地，将所述溶液(或多种溶液)加热到足以杀死样品中可能存在的细菌的温度，所述细菌具体地为沙门氏菌、志贺氏菌或者李斯特菌。具体的温度包括从约60℃到约100℃，具体地约65、70、75、80、85、90、95到约100℃。对于本领域技术人员而言，显而易见的是步骤(i)和(ii)可以依次进行，同时进行，或者所述培养样品和/或洗涤剂可以在合并之前分别地加热。所述的洗涤剂-培养物溶液可以加热约30秒到约20分钟，具体地约2分钟到约15分钟，以及更具体地约2、3、4、5、6、7、8、9到约10分钟。
在本发明的第三个方面，提供了检测感兴趣的微生物在待测样本中存在或不存在的检测方法，所述的方法包括：
(i)将所述的检测样品在培养介质中培养，所述的培养介质允许感兴趣的微生物的增殖；
(ii)处理将所述的检测样品到足以从检测样品中存在的任意微生物中释放一种或多种核心寡糖的程度；
(iii)将所述的检测样品暴露于至少一种结合物，所述结合物对感兴趣的微生物的核心寡糖有结合特异性；以及
(iv)检测至少一种结合物与感兴趣的微生物的核心寡糖的任意结合。
本检测方法可以是直接的或者间接的。在直接结合或者非竞争性分析中(直接的或者间接的)，也称作“三明治检测”，核心寡糖优选地结合于表面和结合物，例如抗体与感兴趣的微生物的任意核心寡糖反应。优选地所述结合物为经标记的结合物。随后测定表面上的所述经标记的结合物。
直接检测方法的结果一般来说与样品核心寡糖的浓度直接成比例。如果样品中不存在核心寡糖，很显然经标记的结合物不会结合。
在竞争性检测中，检测样品中的核心寡糖在与结合物的结合中，与经标记的核心寡糖竞争。随后测量经标记的结合于结合物的核心寡糖的量。在这个方法中，响应与样品中核心寡糖的浓度成反比。这是由于响应越大，在“未知”的或者检测样品中能与经标记的核心寡糖竞争的核心寡糖越少。
不管该检测是直接的或者间接的，核心寡糖或者经标记的核心寡糖都优选地分别结合在检测表面上。
所述核心寡糖(或者多种寡糖)所结合的表面可以是现有技术中已知的材料，例如有机聚合物如塑料、玻璃、陶瓷等等。特定的有机聚合物包括聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯、聚乙烯、纤维素和硝酸纤维素。优选的聚合物为聚苯乙烯，以及更具体地γ-射线辐照的聚苯乙烯。所述的表面其自身或者其一部分可以为片、微板块或者微量滴定板，板子、膜、孔、小丸、棒、棍、管、珠子等等。
在特定的实施方案中，将LPS或者包括所述核心寡糖的单体固定于没有任何修饰的表面上。例如该分子的疏水脂类A部分可以通过非共价的疏水相互作用结合于表面上，所述表面如γ-射线辐照的聚苯乙烯表面。该结合使核心寡糖区易与结合物如抗体相互作用。
在可选的实施方案中，通过使用中间的结合物，将LPS和/或核心寡糖结合到表面上，所述的中间的结合物如抗体、缀合物或者其他的连接物。在第WO03/36419号国际专利申请公开中，公开了使用的替代物。
该方法的第一步包括将检测样品在培养介质中进行培养，所述的培养介质使得感兴趣的微生物能够增殖。
在特定的实施方案中，所述方法用于检测食物或者食物产品中的微生物蛋白或者片段。在进一步的实施方案中，所述的样品是环境样品、农业样品、医学样品或者制造业样品。所述的检测样品可能为食品产品如肉、肉制品，其包括肉末、蛋、奶酪、牛奶、蔬菜、巧克力、花生酱等等，其包括经处理的、经干燥的、经冷冻的或者经冷藏的食品产品。可选地所述检测样品可以为临床上的样品，如活组织检查样品、排泄物、唾液、保湿液、营养液、血液、血液产品、组织提取物、疫苗、麻醉剂、药学上有活性的药剂、成像药剂、或者尿样等等。所述的检测样品还可以包括棉签，如皮肤-、盲囊-、排泄物的、排泄腔的、或者直肠的棉签，或者表面的棉签，如地板、门和墙，或者得自食品产品的棉签，包括经屠宰的动物躯体的棉签等等。所述的检测样品还可以包括化妆品样品如基础化妆品、唇膏、洗液、乳霜、香波等等。
优选地，将所述检测样品在根据本发明第一个方面的培养介质中进行培养。
在具体的实施方案中，将所述的检测样品在培养介质中在约30℃到约44℃中进行培养，具体地约37℃到42℃，更具体地约37℃。所述的检测样品可以在培养介质中培养约4-15个小时，更具体地约4-8个小时，以及再更具体地4-6小时。在其他的实施方案中，可以将所述的检测样品在培养介质中培养30分钟到约4个小时，优选地约1、1.5、2、2.5或者3小时。
所述方法的第二步包括将检测样品处理到足以从检测样品中存在的任何微生物中释放一种或多种核心寡糖的程度。
可以将所述检测样品以任意适用的方法进行处理，所述方法导致从微生物的细胞膜中释放细菌LPS和/或核心寡糖。优选地，将所述检测样品根据本发明的第二个方面进行处理。
现有技术中有其他适用但是可能效率较低的提取方法，并且也可能使用，其包括超声降解法、使用高压、使用酶、“珠磨”等等。然而，当处理致病性细菌如沙门氏菌时，在高温下(如煮沸或者前面所讨论的)使用洗涤剂是尤其地有效的，由于高温能确保所有的细菌被杀死。更具体地，当所述的检测是直接结合检测时，优选地使用SDS，然而当分析为竞争形式时，使用SDS来制备涂布抗原的板，同时将吐温20、吐温40、吐温60或者吐温80，优选吐温20用在步骤中剩下的部分。在前文第一个方面中给出了适用的加热/处理时间间隔。很明显，感兴趣的微生物可能不存在于检测样品中，在这种情况下该感兴趣的微生物的LPSs和核心寡糖也将不存在。
在该方法的第三步中，将所述的检测样品暴露于至少一种结合物，所述结合物对感兴趣的微生物的核心多糖具有结合特异性。
在具体的实施方案中，在步骤(iii)之前，将经处理的检测样品中的核心寡糖、LPS或者单体固定在表面上，暴露于至少一种结合物，所述结合物对感兴趣的微生物的核心多糖具有结合特异性。在该实施方案中，可以通过将经处理的检测样品与表面接触，并温育和/或保持接触约10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟到约60分钟将在样品中的所述核心寡糖、LPS或者单体进行固定。
在其他的实施方案中，例如在竞争性检测中，将所述的检测样品施加到，或者接触到表面上，所述表面上已经固定了已知的或标准量的核心寡糖、LPS或者单体。来自已知的或者标准物的核心寡糖、LPS或者单体与检测样品的核心寡糖、LPS或者单体竞争结合于至少一种结合物上。
可以将核心寡糖、LPS或者单体直接地固定在所述的表面上，其通过例如非共价的疏水相互作用或者如前所述地间接的方法。
应该将检测样品暴露于至少一种结合物足够的时间，从而使核心寡糖、LPS或者单体结合于至少一种结合物形成复合物，例如核心寡糖/结合物复合物。合适的时间包括从约1分钟到约4小时，具体地从约30分钟到约2小时，具体地约45分钟、1小时和1.5小时。在特定的实施方案中，在所述方法的可选的步骤中，将所述的复合物暴露于对至少一种结合物具有结合特异性得第二种结合物足够的时间，从而使第二种结合物形成次级复合物，例如核心寡糖/结合物/第二结合物的复合物。
优选地，所述的结合物为抗体，更优选地为亲和纯化的抗体，以及再更优选地为单克隆抗体。
用于本发明的检测的抗体可以为多克隆的、单克隆的、双特异性的、人源化的或者嵌合的抗体。该抗体可包括单个的链，但优选地包括至少轻链或者重链，但为了结合与抗体具有结合特异性的靶如核心寡糖或者微生物污染物，最好有至少一个互补决定区(CDR)。
制备抗体的方法是本领域中已知的。例如如果想要多克隆抗体，可以将所选择的抗原，如细菌内毒素免疫接种于所选择的哺乳动物中，所述的哺乳动物如鼠、兔、山羊或者马。收集经免疫的动物的血清并进行处理从而得到抗体，所述的处理如通过免疫亲和层析。
可以通过现有技术中已知的方法制备单克隆抗体，并且这是一般来说优选的。利用杂种瘤技术制备单克隆抗体的一般方法是公知的(参见例如Kohler，G和Milstein，C，Nature 256：495-497(1975)；Kozbor等人，I mmunology Today 4：72(1983)；Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy第77-96页，Alan R.Liss，Inc.(1985))。
如本文所述的抗原应该包括如CDR的表位结合区域。所述的抗体可以为任意适用的种类，包括IgE、IgM、IgD、IgA以及特别地，IgG。也预期了这些抗体不同的亚类。如在此所使用的，术语“抗体结合片段”具体地指抗体的片段，来自抗体保留抗体的结合特异性的多肽。该片段包括但不限于抗体片段，如Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv，其全部都能够结合于表位。
术语“抗体”还延伸到能得到的任意各种天然的和人工的抗体，以及可用的抗体衍生蛋白质，和它们的衍生物，例如，包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化的抗体、人类抗体、单功能域抗体、完整的抗体、抗体的片段如F(ab′)2和F(ab)的片段、Fv片段(非共价的杂合二聚体)、单链的抗体如单链的Fv分子(scFv)、微抗体、特异性寡配体、二聚体或者三聚体抗体片段或者结构等等。术语“抗体”不暗示任意的具体来源，并且包括通过非传统的过程得到的抗体，所述非传统的过程如噬菌体表面展示。本发明的抗体可以为任意的亚型(如IgA、IgG、IgM也即α、γ或者μ重链)并可以具有κ(kappa)或者λ(lambda)轻链。
本发明因此延伸到抗体以及抗体衍生的结合片段的应用，所述的结合片段对本发明所使用的核心寡糖具有结合特异性。
术语“特异地结合”或者“结合特异性”指抗体或者其片段结合靶微生物病原体的能力，所述的结合与其结合非靶表位相比具有更强的亲和性。例如，抗体与靶表位的结合的亲和力比非靶表位亲和力的大至少10、50、100、250、500或者1000倍。在特定的实施方案中，亲和力通过亲和ELISA检测进行测定。在可选的实施方案中，亲和性通过大分子相互作用检测进行测定。可选地，亲和力可以通过动力学方法进行测定。
在特定的实施方案中，结合物如抗体可以固定在表面上，在可选的洗涤步骤之后，将可能含有感兴趣的核心寡糖或者微生物污染物的检测样品暴露于表面结合抗体足够的时间，从而使结合发生，以及使表面结合第一结合物-核心复合物形成。该检测可以随后包括将包括表面结合第一结合物-核心复合物的与第二结合物接触，所述第二结合物如抗体，其可以是共价结合态的并能发射光，例如为吖啶酯。在该情况下，第二结合物对存在于第一结合物上或者在核心寡糖上或者微生物污染物上的表位具有结合特异性，从而所产生的信号的量与第一或者第二结合物所结合的核心寡糖或者微生物污染物的量相对应。
典型地，将抗体纯化从而避免聚集。
在特定的实施方案中，所述的表面为常规设计的微滴定板，然而在使用改性的表面的时候具有优点，例如具有涂黑的壁以及白色或者透明的部分(如在底部)。这在测量的时候加强了所产生的任意信号，并减少了背景光。白色的部分使得光线反射，从而增强所产生的信号。因此，在具体的实施方案中，表面是具有多个孔的多孔板，其中各个孔的底部是透明的或者大体上透明的，而孔的壁是不透明的，或者涂黑的从而避免光透过，或者染色的，从而与允许光线通过的孔的底部进行对比。
再更具体地，所述的抗体是物种特异性的单克隆抗体。
术语“物种特异性的”意图表示该抗体能够区分例如沙门氏菌、志贺氏菌和李斯特菌，而只有很少或者没有交叉反应。
在具体的实施方案中，所述的结合物与LPS核心寡糖的该表位相互作用及结合：
Figure BPA00001350567700111
该表位是物种特异性的，将沙门氏菌与其他的细菌区分开来，其他的细菌例如，作为非限制性的实例，志贺氏菌、李斯特菌、大肠杆菌。在具体的实施方案中，所述的检测方法是用于定量检测沙门氏菌的方法。所述的检测方法也可以用于检测沙门氏菌的存在或者不存在。在具体的实施方案中，所述的结合物为经标记的结合物，其通过缀合到化学发光或者荧光化合物进行标记。
然而，毫无疑问的是本发明的方法能用于多种靶微生物污染物的鉴定和定量。本发明的检测方法涉及分析样品中微生物污染物的存在或者量。应该理解并非所有使用本发明的方法进行检测的样品都含有微生物污染物。在特定的实施方案中，所述的微生物污染物是得自致病性微生物的蛋白质或者蛋白质片段。在特定的进一步的实施方案中，所述的微生物污染物可以至少属于并限于下面的组：细胞壁碎片、肽聚糖、糖蛋白、脂蛋白、糖脂蛋白、小肽、糖的序列和脂类的序列。本发明的方法尤其地适用于检测微生物的蛋白质，包括来自细菌、病毒和真菌的结构蛋白和/或毒素。
所述的方法第四步包括检测至少一种结合物与感兴趣的微生物的核心寡糖或者微生物污染物的任意结合。
所述的检测方法可以是现有技术中已知的任意适用的方法，例如通过荧光测量、色度测量、流式细胞仪、化学发光等等。在优选的实施方案中，结合的检测是通过冷光信号的测量/检测进行的，例如化学发光化合物所产生的化学发光。适用的化学发光的化合物包括吖啶酯类，吖啶磺胺类，phenanthridiniums，1，2-二氧杂环丁烷类，鲁米诺或催化化学发光底物的酶，等等。
在特定的实施方案中，所述的结合物可以直接地连接到发光团。在特定的实施方案中，所述的结合物连接到作为冷光标签的吖啶化合物或者其衍生物上，如吖啶酯分子，或者吖啶硫胺化物上。在抗体或者结合片段结合于吖啶酯或者吖啶硫胺化物的实施方案中，该检测方法可以进一步包括将AMPPD加入检测样品的步骤。
AMPPD也命名为3-(2’-螺金刚烷)-4-甲氧基-(3”-磷酰基)苯基-1，2-二氧杂环丁烷；3’-(4-甲氧基螺(1，2-二氧杂环丁烷-3，2’-三环(3.3.1.1(3，7)癸烷)-4-基)苯基磷酸酯；4-甲氧基-4-(3-磷酸酯苯基)螺(1，2-二氧杂环丁烷)-3，2’-金刚烷。
在特定的进一步的实施方案中，所述的抗体可以间接地与发光团相连，例如吖啶酯分子可以与能结合第一个抗体的第二个抗体连接。在特定的实施方案中，可以将一种或者多种发光团或者荧光团连接于抗生物素蛋白或者抗生蛋白链菌素，其则可依次结合到与抗体化学连接的生物素上。在特定的进一步实施方案中，也已将外源凝集素(蛋白质A/G/L)连接到可连接到抗体上或者其他蛋白质缀合物上发光或者荧光分子上。
产生可检测的信号的促进因素可以是光例如特定波长的光如紫外线或者可以为一些其他的促进因素，所述的其他促进因素如电的或者放射性的促进因素，化学或者酶-底物的反应。
优选地，所述的检测方法能在高达10,000cfu的其他微生物如大肠杆菌中，或者起始样品为一根棉签等等当中检测/区分1个聚落形成单位(cfu)的沙门氏菌、志贺氏菌或者李斯特菌。具体的检测限为每单位样品大小(mg、g等等)或者体积(ml、L等等)约1000cfu，具体地约500cfu，再更具体地从约250cfu、200cfu、150cfu、100cfu、50cfu、10cfu和约1cfu。对于液体培养物而言，具体的检测限约为500cfu/ml。
在其他的实施方案中，可以将所述的抗体间接地连接于发光团，例如吖啶酯分子可以连接到第二个结合物，所述的第二个结合物能够结合到第一个结合物。
检测方法可以是定性的或者定量的，并且可以使用标准对照将所产生的平均信号和确定量的如核心寡糖联系起来。
在特定的实施方案中，该方法可能用于测定具有多种核心寡糖或者微生物污染物的样品，这一点通过提供多种结合物如抗体来实现，每种结合物对不同的表位或者微生物污染物具有结合特异性。在特定的实施方案中，可以使用双特异性的抗体。
很明显的是，在该方法的各个阶段之间或者在各个阶段中，可包括可选的洗涤、干燥和/或温育步骤。在该方法的一个或者多个步骤之间可选地包括“封闭步骤”，其中向如微滴定板的所有池中加入浓缩的非相互作用蛋白质，如牛血清蛋白(BSA)或者酪蛋白。具体的封闭试剂还包括奶粉的溶液等等。该蛋白质封闭其他蛋白质在板上非特异性的吸附，并且在减少可能影响检测的灵敏性的“背景”假象中是有利的。
根据本发明的第五个方面，提供了对核心寡糖具有结合特异性的结合物的在选自沙门氏菌、志贺氏菌和李斯特菌的微生物的特定检测中用途。
根据本发明的第六个方面，提供了根据本发明的第一、第二、第三、第四和/或第五个方面实施本发明的试剂盒。该试剂盒可以包括液体的培养介质(即用的或者用于稀释的浓缩的)或者干燥的(例如，粉末、小丸、片等等)的形式、洗涤剂或者洗涤剂溶液、洗涤缓冲液、稀释剂、预先制备的板、管或者珠子、一种或者多种抗体(即第一种的，第二种的)、检测剂、手套、吸液管头、说明书等等。预先制备的板的池或者管可以预先涂布已知的或者标准量的核心寡糖、LPS或者单体或者结合物如抗体。该预先制备的表面可以经过冻干。
附图的简要说明
图1(a)和(b)是直接的结合检测的示意图，其中◆代表了细菌如沙门氏菌的核心寡糖、LPS或者单体。图1(a)显示了直接的免疫测试，图(b)显示了间接的免疫测试。
图2(a)和(b)是竞争性结合测试的示意图，其中◆代表了细菌如沙门氏菌的核心寡糖、LPS或者单体。图2(a)显示了直接的竞争性免疫测试，图(b)显示了间接的竞争性免疫测试。
图3是显示连四硫酸盐对沙门氏菌的阳性生长效果，然而其他细菌的生长受抑制的图。
图4是显示煌绿对沙门氏菌、志贺氏菌、大肠杆菌和葡萄球菌的生长的影响的图。该图例证了对沙门氏菌的生长最适宜的，同时抑制竞争性细菌的煌绿浓度范围，，尤其地在0.15mg/l水平下的煌绿。
图5是显示柠檬酸铁铵对沙门氏菌、志贺氏菌、大肠杆菌和葡萄球菌生长的影响的图。该图例证对志贺氏菌的生长的最适宜的柠檬酸铁铵的浓度范围，尤其地在0.25g/l水平下的柠檬酸铁铵。在0.25g/l以上的水平下，沙门氏菌的生长未受影响。
图6是显示柠檬酸钠对沙门氏菌、志贺氏菌、大肠杆菌和葡萄球菌生长的影响的图。在沙门氏菌和志贺氏菌的加快生长的同时，竞争性细菌的生长被抑制。
图7是显示革兰氏阴性肉汤中细菌生长的图。
图8是显示脱氧胆盐柠檬酸盐乳糖蔗糖肉汤中细菌生长的图。
图9是显示蛋白胨肉汤中细菌生长的图。
图10是显示改良的胰蛋白酶大豆肉汤中细菌生长的图。沙门氏均和志贺氏菌的生长均加快，显示出～30分钟的倍增时间。
图11是显示李斯特菌高速生长的图。在本发明的肉汤中竞争性的细菌的抑制。
图12(a)表明了感兴趣的某细菌的LPS的一般结构(O-抗原、核心多糖(寡糖)、脂类A)。图12(b)是沙门氏菌LPS单体的详细说明，所述的单体包括物种特异性的抗体结合表位。
发明详述
本发明的检测优选地用于鉴定在给定的样品中细菌LPS的核心寡糖存在或者不存在。本发明的检测能够鉴定含有细菌或者受细菌污染的样品，所述的细菌如沙门氏菌、志贺氏菌或者李斯特菌，其在LPS的核心寡糖区域具有物种特异性的表位。通过引用下文的用作说明本发明的方法说明和实例，可以更好地理解本发明。
图1a说明了利用经标记的第一抗体进行直接结合检测的步骤。图1b说明了使用为标记的第一抗体及经标记的第二抗体进行直接结合的检测。用于在经屠宰的动物躯体上以及在食品中检测沙门氏菌的，直接结合的(直接的或者间接抗体连接的)基于化学发光的免疫吸收检测可以按照下文所描述地进行。
根据本发明的第一个方面，将25g的食品样品加入到225ml的培养介质中。
根据本发明第一方面，可选地，来自动物尸体的10×10cm面积上的表面拭子，在2-5ml的培养介质中进行培养。具体地所述的培养介质包括1％的蛋白胨，8g/L的连四硫酸钠和0.15mg/L的煌绿。该样品在37℃下培养5小时。
在培养5小时之后，吸出2ml样品并加入SDS直到其最终浓度为0.5％(w/v)。将所述的样品加热到100℃，在100℃持续5分钟，然后使其冷却。将一百微升的各个检测样品加入全白色的96孔高结合性微滴定板的孔中(Greiner Bio One)，并在37℃下温育30分钟。在温育过程中，LPS的脂类A部分通过非共价的疏水相互作用结合到板的表面上(图1a(1)、图1b(1))。在温育之后将板倾空，并且将孔使用洗涤缓冲液洗涤三次，所述的洗涤缓冲液包括0.01M磷酸钠缓冲液，pH为7.4，含有0.147M的NaCl和0.05(v/v)的吐温20。
将一百微升浓度为500ng/ml抗-沙门氏菌抗体缀合物的磷酸盐缓冲液加入到各个孔中，所述的磷酸盐缓冲液为，pH 7.4，含有0.147M NaCl的0.01M的磷酸盐缓冲液。每个孔中的抗体最终浓度为50ng。将板结合的样品(沙门氏菌LPS/核心寡糖)和抗体在有覆盖的孔中在37℃下温育30分钟。在温育之后，将板使用洗涤缓冲液洗涤三次并在检测之前拍干(图1a(2)，图1b(2))
如果抗沙门氏菌直接使用吖啶酯标记，将板放置于照度计中。将30μl的引发溶液A和60μl的引发溶液B加入到微滴定板的各个孔中，从而引发缀合的吖啶酯的光输出(图1a(3))。照度计的设置如下所示：
延迟注入P(对于溶液A)-1.6秒
测量时间间隔1-0.0秒
延迟注入M(对于溶液B)-0.0秒
测量时间间隔2-1.0秒
引发溶液A包括：63μl 70％(w/w)HNO3、165μl 30％(v/v)H2O2和蒸馏水，总体积10ml。引发溶液B为：0.1g NaOH和75mg CTAC溶解在10ml蒸馏水中。
羊抗鼠的lgG2b与吖啶的缀合物的加入(如果抗沙门氏菌单克隆抗体未缀合)。
如果抗沙门氏菌抗体是未标记的，使用第二种结合物，羊抗鼠的IgG2b缀合物。用含有3％(w/v)脱脂奶粉和0.05％(v/v)吐温20的稀释液按1∶100稀释柱后IgG2b，，将100μL此溶液加入到板的各个孔中(图1b(3))。随后在37℃下温育60分钟，将板在洗涤缓冲液中洗涤四次，干燥并如前文进行读数(图1b(4))。
可以按照下文所述地进行竞争性(直接的或者间接的)的化学发光相关的免疫吸收检测，检测食品中的沙门氏菌。按照下文制备肠炎沙门氏菌LPS涂布的微滴定板。将肠炎沙门氏菌在并非根据本发明的第一个方面的标准肉汤培养基(2％(w/v)缓冲蛋白胨水-Oxoid)中培养18个小时。确定聚落形成单元的数量，并将约108cfu/ml的置于加盖的但是不密封的含有终浓度10mM NaEDTA和0.5％(w/v)SDS的聚丙烯蒸发管中。将培养物在100℃下煮沸2分钟，从而杀死细菌(并且消除任何相关的生物危害)，同时还将细菌的LPS核心寡糖或者单体表位暴露(参见如图12b)。将经煮沸的储备液用含有2％的缓冲蛋白胨水的稀释液进一步稀释到106cfu/ml(BPW)。
将一百微升经稀释的煮沸的储存液加到全白的96孔高结合微滴定板(Greiner Bio One)的各个孔中，并在37℃下温育60分钟。在温育过程中，LPS的脂类A部分通过非共价的疏水相互作用结合到板的表面上。在温育之后将板倾空，并且将孔使用洗涤缓冲液洗涤三次，所述的洗涤缓冲液为含有0.147M的NaCl和0.05(v/v)的吐温20的pH为7.4的0.01M磷酸钠缓冲液，。经洗涤的包被的板或者立刻使用，或者冻干储存(图2a(1)，图2b(1))。
根据本发明第一个方面的，将25g的检测样品加入200ml的培养介质中，所述的检测样品是加入10cfu的沙门氏菌的肉末。具体地，所述的培养介质包括1％的蛋白胨，8g/L的连四硫酸钠和15mg/L的煌绿。样品在37℃下培育5小时。在培育5小时之后，吸出5mL的样品，并且加入吐温20至最终浓度为2％(v/v)。将样品加热到100℃，在100℃维持2分钟，然后使其冷却。将80μL等份的经煮沸的样品加入到包被的微滴定板的各个孔中。
将二十微升浓度为500ng/ml抗-沙门氏菌抗体缀合物的磷酸盐缓冲液加入到各个孔中，所述的磷酸盐缓冲液为pH 7.4，含有0.147M NaCl的0.01M的磷酸盐缓冲液。(图2a(2)，图2b(2))。各个孔中抗体最终的浓度为25ng/mL。将竞争性样品LPS/核心寡糖及抗体在有覆盖的孔中于37下温育60分钟。在温育之后，将板在洗涤缓冲液中洗涤三次，并在检测之前拍干(图2a(3)，图2b(3))。
如果抗沙门氏菌是直接标记了吖啶酯的，将板放置在照度计中。将30μl的引发溶液A和60μl的引发溶液B加入到微滴定板的各个孔中，从而引发缀合的吖啶酯的光输出(图2a(4))。照度计的设置如下所示：
延迟注入P(对于溶液A)-1.6秒
测量时间间隔1-0.0秒
延迟注入M(对于溶液B)-0.0秒
测量时间间隔2-1.0秒
引发溶液A包括：63μl 70％(w/w)HNO3、165μl 30％(v/v)H2O2和蒸馏水，总体积10ml。引发溶液B为：0.1g NaOH和75mg CTAC溶解在10ml蒸馏水中。
羊抗鼠的lgG2b与吖啶的缀合物的加入(如果抗沙门氏菌单克隆抗体是未缀合)。
如果抗沙门氏菌抗体是未标记的，使用第二种结合物，羊抗鼠的IgG2b的缀合物。用含有3％(w/v)脱脂奶粉和0.05％(v/v)吐温20的稀释液按1∶100稀释柱后IgG2b，，将100μL此溶液加入到板的各个孔中(图2b(4))。随后在37℃下温育60分钟，将板在洗涤缓冲液中洗涤四次，干燥并如前文进行读数(图2b(5))。
实施例
实施例1用于沙门氏菌生长的培养介质的制备
图3显示了连四硫酸钠在0到16g/L的浓度下对于阿伯丁沙门氏菌、弗累克斯讷氏杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌生长的影响。在装有胰蛋白酶大豆肉汤的100ml锥形烧瓶中加入0.1ml的接种物(103个细胞/ml)，所述的大豆肉汤含有0到16g/L的连四硫酸钠。将烧瓶在37℃下温育18个小时。在此时间之后，测量其A620。各个数值代表了三次独立的实验的平均值±SD。*表示p＜0.05。在2到16g/L之间的水平，志贺氏菌、葡萄球菌和大肠杆菌的生长与沙门氏菌相比受到抑制，而后者不受影响或者受促进。
Figure BPA00001350567700171
连四硫酸盐不仅在＞4g/升的浓度下抑制大肠杆菌的生长，在8g/升下其对沙门氏菌N.B的生长具有明显的促进效果。A620测量浊度，因此数值越高，细菌生长得越多。在高于16g/L的水平下，沙门氏菌的生长受到抑制。
图4显示了细菌生长对煌绿的响应。在装有胰蛋白酶大豆肉汤的100ml锥形烧瓶中加入0.1ml的接种物(103个细胞/ml)，所述的大豆肉汤含有0.05g到5g/L的煌绿。将烧瓶在37℃下温育18个小时。在此时间之后，测量其A620。各个数值代表了三次独立的实验的平均值±SD。*表示p＜0.05，* *表示p＜0.01。
在浊度分析法中，A620用作细菌数的量度。*由于煌绿的吸收的高吸光度值；在这些浓度下分光计无法针对煌绿溶液置零。在煌绿为0.3mg/L或者更高的水平下，沙门氏菌和大肠杆菌的生长受限制，但是在0.15mg/L下其对于大肠杆菌具有抑制效果但是对沙门氏菌没有。
实施例2-用于志贺氏菌的生长介质的制备
图5显示了细菌对柠檬酸铁铵的生长响应。在装有胰蛋白酶大豆肉汤的100ml锥形烧瓶中加入0.1ml的接种物(103个细胞/ml)，所述的大豆肉汤含有0.25到1.5g/L的柠檬酸铁铵。将烧瓶在37℃下温育18个小时。在此时间之后，测量其A620。各个数值代表了三次独立的实验的平均值±SD。*表示p＜0.05。在0.25g/L或者更高的柠檬酸铁铵水平下，葡萄球菌和大肠杆菌的生长被限制。
图6显示了细菌对柠檬酸钠的生长响应。在装有胰蛋白酶大豆肉汤的100ml锥形烧瓶中加入0.1ml的接种物(103个细胞/ml)，所述的大豆肉汤含有5到25g/L的柠檬酸钠。将烧瓶在37℃下温育18个小时。在此时间之后，测量其A620。各个数值代表了三次独立的实验的平均值±SD。*表示p＜0.05。在5g/L或者更高的柠檬酸钠水平下，葡萄球菌和大肠杆菌的生长均受限制。在15g/L的水平下，与葡萄球菌和大肠杆菌相比，志贺氏菌的生长响应显著地增强。
实施例3-蛋白胨、胰蛋白酶大豆肉汤和改良的胰蛋白酶大豆肉汤中不同细菌的世代研究
将志贺氏菌和其他包括阿伯丁沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在内的细菌的三个株在传统肉汤培养物中生长，从而研究世代时间。在装有蛋白胨(图7)、胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)(图8)，改良的胰蛋白酶大豆肉汤(mTSB)(图9)或者革兰氏阴性的肉汤(图10)的100mL锥形烧瓶中加入0.1ml的接种物(103个细胞/ml)。
将每个烧瓶在37℃下温育18个小时。在此时间之后，在营养平板上用液滴平板菌落计数技术测定活细胞数。括号中的值是世代时间。各个数值代表了三次独立的实验的平均值±SD。*表示p＜0.05。研究在蛋白胨、胰蛋白酶大豆肉汤及改良的胰蛋白酶大豆肉汤中的倍增时间。在革兰氏阴性的肉汤中生长的弗累克斯讷氏杆菌、阿伯丁沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的世代时间分别为36、57、41和44分钟。
在TSB中所有细菌的生长速度都增加了。因此，TSB与其他传统的可选试剂单独地或选择性组合地结合用作基础生长介质，使志贺氏菌的生长更好。在TSB中，弗累克斯讷氏杆菌、阿伯丁沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的倍增时间是48、46、28和33分钟。在mTSB中，弗累克斯讷氏杆菌和阿伯丁沙门氏菌的生长显著地更好(p＜0.01)，然而在这种基础肉汤中大肠杆菌和金黄色葡萄球菌需要更长时间来繁殖。当在改良的TSB中生长时，大肠杆菌的生长速率可能延缓到68分钟。在改良的TSB中，弗累克斯讷氏杆菌的发生时间可能缩短到46分钟。
实施例4-用于李斯特菌生长的培养介质的制备
制备了含有氯化锂和萘啶酸的组合的李斯特菌生长介质。将0.1ml的接种物(103个细胞/ml)加入100ml的锥形烧瓶中，所述的锥形烧瓶含有根据如下方法制备的培养介质：TSBYE-含有0.5％酵母提取物的3.3％的胰蛋白酶大豆肉汤，，2g/l LiCI，2mg/l萘啶酸和250mg/l柠檬酸铁铵。将烧瓶在37℃下温育20个小时。在此时间之后，测量其A620(图11)。各个数值代表了三次独立的实验的平均值±SD。单核增生性李斯特菌及威尔斯李斯特菌菌能在该介质中生长。大肠杆菌、嗜酸乳杆菌和英诺克李斯特氏菌均显著地受抑制。
实施例5-用于沙门氏菌、志贺氏菌或者李斯特菌选择性生长的培养介质的制备
使用上述的数据，根据以下的配方制备选择性的培养基：
沙门氏菌1
2％蛋白胨
0.15mg/l煌绿
4-8g/l连四硫酸盐(所有的类型)
沙门氏菌2
3.3％(w/v)mTSB
0.15mg/l BG
1g/l柠檬酸铁铵
志贺氏菌1
3.3％mTSB
0.1mg/l煌绿
250mg/l柠檬酸铁铵
15g/l柠檬酸三钠盐
李斯特菌1
TSBYE-含有0.5％酵母提取物的3.3％胰蛋白酶大豆肉汤
2g/l LiCl
2mg/l萘啶酸
250mg/l柠檬酸铁铵
实施例6-用于免疫测定中和吖啶酯结合的抗体和抗体片段的制备
改良的制备抗体的方法是通过蛋白质A层析从腹水中制备纯IgG，随后可选的裂解IgG从而产生Fab片段的步骤，并将该片段或者整个抗体连接到酯上，并随后纯化。可选地，可以使用未经纯化的其他亚类或者亚型抗体。蛋白质A/G的分离
(i)缓冲液和溶液
PBS：0.1M的磷酸盐缓冲液，pH 8，含有0.15M NaCl。
0.1M柠檬酸缓冲液，pH为6，以及pH为4.5：将29g干燥的柠檬酸钠溶解于800ml的蒸馏水中，加入1M的柠檬酸溶液(210g/l)，直到得到pH分别地为6和4.5。定容到1升。
pH 3的缓冲溶液，含有0.15M NaCl的0.1M乙酸，在800ml蒸馏水中加入100ml 1M乙酸和100ml 1.5M NaCl。
含有3M NaCl的1.5M甘氨酸缓冲液，pH 8.9，：将112g甘氨酸和174gNaCl加至700ml蒸馏水中。使用5M的氢氧化钠将pH调节到8.9并用蒸馏水定容到1升。
(ii)步骤
将1.5g的蛋白质A-琼脂糖(CL-4B，Pharmacia)(也可使用蛋白质G)在pH 8的0.1M磷酸盐缓冲液中溶胀30分钟(1.5g的珠子产生5ml凝胶)；填充20×2cm的柱子，并使用起始缓冲液淋洗。在使用起始缓冲液透析之后，在柱上加载1ml脱脂腹水，所述的脱脂腹水此前使用40％(v/v)饱和的硫酸铵沉淀。如果使用脱脂腹水的话，腹水的脱脂通过100,000g下离心45分钟来进行。弃去所形成的任何颗粒或者悬浮的“脂类”。使用pH为8的0.1M磷酸盐缓冲液洗涤柱子，直到A280为＜0.050。加入pH为6的柠檬酸缓冲液，并洗涤直到A280为＜0.050。以同样的方式通过连续地使用pH 4.5和pH 3的缓冲液洗脱免疫球蛋白。使用pH为8，含有0.02％叠氮化钠的磷酸盐缓冲液进行中和，并将蛋白质A-琼脂糖储存于此缓冲液中。在洗脱之后，将抗体使用数滴pH为8的1M磷酸盐缓冲液进行中和，并用PBS透析。
(iii)Fab片段的制备
由于酶切不会结束，除了Fab和Fc片段之外，木瓜蛋白酶对IgG的作用产生10％的未切割的IgG，其具有相同的分子量，因此难以分离。用蛋白质A来简化其分离。在第一步中，使用木瓜蛋白酶来处理抗体，并使该混合物通过蛋白质A，从而将IgG与Fab分离。随后通过交联葡萄糖或者蛋白质A-葡聚糖过滤，将Fab片段与未消化的IgG分离。
材料
色谱柱(2.5cm×80cm)
木瓜蛋白酶：Boehringer
L-半胱氨酸盐酸盐：Merck
EDTA：乙二胺四乙酸：Merck
碘乙酰胺：Merck
缓冲液和溶液
磷酸盐缓冲液-PBS
0.1M磷酸盐缓冲液，pH 7.4
由商业储备液制得的1mg/ml木瓜蛋白酶溶液
0.2M L-半胱氨酸：35mg/ml的0.1M磷酸盐缓冲液，pH 7.4。
0.1M EDTA：3.6g EDTA溶于100ml 0.2M NaOH中。由于EDTA仅在pH约为8的时候明显溶解，必须加入几滴1M的NaOH，从而使得EDTA完全溶解。
0.4M的碘乙酰胺：74mg/ml碘乙酰胺的的0.1M磷酸盐缓冲液，pH 7.4。
步骤
通过使用40％(v/v)饱和的硫酸铵沉淀，从抗血清中制备免疫球蛋白组分。将免疫球蛋白用pH 7.4的磷酸盐缓冲液透析。对蛋白质的浓度进行大致的测定(1mg/ml的IgG溶液1.4A280)。
将IgG的浓度调节到30mg/ml并且计算出蛋白浓度为20mg/ml时的最终体积(V)。对于亲和纯化的抗体而言，使用2.5mg/ml的最终浓度。加入体积为V/20的0.04M的EDTA(最终浓度：0.002M)。随后加入体积为V/20的0.2M的L-半胱氨酸溶液(最终浓度为0.01M)。加入相当于给每100mg的球蛋白提供1mg的木瓜蛋白酶的量的1mg/1ml的木瓜蛋白酶溶液。用pH为7.4的0.1M磷酸盐缓冲液调节体积到V ml。在37℃下使该反应进行2小时。加入体积为V/10的0.4M碘乙酰胺溶液(最终浓度为0.04M)。放置30分钟，随后+4℃下此制备物在PBS中透析过夜。
通过蛋白质A色谱分离结合于GIcNAc-GIc-GaI表位的IgG(图12)和Fab片段。将混合物在葡聚糖凝胶G-100柱子上分离(2.5cm×80cm)，并使用PBS进行平衡。第一个峰对应于IgG，以及第二个峰对应于Fab片段。将Fab峰浓缩到5mg/ml。
实施例7-抗体或者抗体片段吖啶酯与缀合
a)制备
i)吖啶酯如(4-(2-琥珀酰亚氨基氧羰基乙基)苯基-10-二甲基吖啶-9-羧酸酯氟代硫酸盐在干净，干燥的硼玻璃管中称重。加入干燥的二甲基甲酰胺(体积取决于可用的吖啶酯的量)并且将该溶液按通常地每个试管5mg的等份置于管中。
ii)将抗体溶解在pH 8.0，0.2M的磷酸钠缓冲液中，浓度为0.5mg IgG/ml.
iii)在200ml抗体溶液中加入5mg的吖啶酯溶液，并混均匀。
iv)在室温下温育15分钟，并且该反应通过加入100ml 10％(w/v)赖氨酸单盐酸盐终止，随后在室温下黑暗中放置5分钟。
v)根据下文的b)进行纯化。
b)缀合物的纯化。
(i)可使用凝胶过滤柱子来纯化该缀合物。
将1.6×100cm的葡聚糖凝胶G200(Pharmacia)使用pH 7.4的0.1M磷酸盐缓冲液进行平衡，所述的缓冲液含有0.147M NaCl和0.5％(w/v)牛血清白蛋白(Sigma)。将多达1.5ml的缀合物加于柱子上以9ml/h的流速下分离18小时。将洗脱液在A280下进行监测，并且收集对应于45-55k道尔顿的峰得到Fab片段，或者140-170k道尔顿的峰得到整个抗体-这是所述的缀合物，其在使用之前应该稀释到工作用的强度。
(ii)优选的步骤采取FPLC。将缀合物在Pharmacia Superdex 200HR10/30柱子上进行纯化。将50ml 0.007g/ml的牛血清白蛋白(BSA)加入到缀合物中(将缀合物中BSA的浓度提高到洗脱缓冲液中的水平)。
在施加样品之前，用两倍柱体积(50ml)的洗脱缓冲液平衡柱子。将该缀合物溶液随后在10,000g下离心10分钟，从而除去任何的颗粒物质，并施加到FPLC柱上。将抗体从柱子上洗脱到洗脱液中，储存缓冲液的流速为0.5ml/min。在最初5ml流过柱子之后，按每0.5ml进行收集。
通过紫外(UV)监测，检测抗体的存在，并且收集形成抗体峰的组分并检测发冷光的活性(通常是组分16-21)。
检查冷光活性
将抗体在生理盐水中按照1∶500进行稀释，并将各次的5μl样品点样到分析板的孔中。将各次通过与活化试剂1和2反应-先向样品孔中加入15ul的活化试剂1然后加入30ul的活化试剂2，来分析其发冷光的活性。通常通过照度计中的自动进样来完成，随后照度计启动读取待考查的孔中的光发射。将每个样品的结果重复记录。具有高水平冷光活性的样品可以随后在微生物分析中加以确定，在这个实施例中，沙门氏菌分析试验。
实施例8AMPPD与碱性磷酸酶缀合的抗沙门氏菌抗体一起使用
为了得到符合要求的冷光信号，可以将抗体与碱性磷酸酶缀合，并且在该免疫分析中使用底物AMPPD(AMPPD为3-(2’-螺金刚烷)-4-甲氧基-(3”-磷酰基)苯基-1，2-二氧杂环丁烷；3’-(4-甲氧基螺(1，2-二氧杂环丁烷-3，2’-三环(3.3.1.1(3，7)癸烷)-4-基)苯基磷酸酯)。用于此底物的稀释剂为在100ml蒸馏水中含有0.9g的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)，1.9ml的AMP(2-氨基-2-甲基-1-丙醇)，14.5mg的六水合氯化镁，1mM，pH 9.6。
试剂
洗涤缓冲液
0.2M Tris(24.228g/升)0.2M NaCl(11.688g/升)+0.05％(v/v)吐温(0.5ml/升).
将24.228g of Tris和11.688g of NaCl溶于900ml的dH2O。加入0.5ml的吐温20。使用HCl将pH调节到7.4，定容到1升并储存于室温下。
10×洗涤缓冲液浓度(含有防腐剂，叠氮化钠)
2M Tris(24.228g/100ml)2M NaCl(11.688g/100ml)+0.5％吐温(0.5mls/100ml).
将24.228g Tris和11.688g的NaCl溶于80ml的蒸馏水中。加入0.5ml的吐温20，并使用浓盐酸将pH调节到7.4。使用蒸馏水定容到100ml，并在室温下储存。为再制成洗涤缓冲液，将100ml浓缩液加入900ml的蒸馏水中并在室温下储存。
洗脱和储存缓冲液
pH 6.3的0.1M磷酸钠缓冲液，含有0.15M NaCl，0.1％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)0.05％NaN3.
用含有0.1％w/v BSA的0.15M NaCl的0.1M NaH2PO4溶液(A)和含有0.1％w/v BSA(B)的0.15M NaCl的0.1M Na2HPO4溶液B配制一个溶液。将100ml A加入到50ml B中。加入0.05％NaN3，使用0.22mM的滤器过滤并在4℃下储存。
检测缓冲液
0.01M NaH2PO4(1.2g/升)0.15M NaCl(8.75g/升)，含有0.1％w/v NaN3和0.25％w/v BSA.
将1.2g的NaH2PO4和8.75g的NaCl溶于900ml蒸馏水中。加入1.0gNaN3和2.5g BSA。将其完全溶解，并使用1.0M NaOH将其pH调节到7.4。使用蒸馏水定容到1000ml。通过0.22μM滤器进行过滤并在4℃下储存。
洗涤剂溶液。
20％(w/v)SDS溶液：将5g的SDS溶于25ml的dH2O中，在室温下储存。
生长促进剂
将8g连四硫酸钠和0.15mg煌绿加入到1升的无菌蛋白胨肉汤中。温和地混合直到均匀分布。
活化试剂1(1升)
6.3ml的70％硝酸；16.5ml的30％双氧水；977ml蒸馏水
活化试剂2(1升)
10.0g NaOH；7.5ml十六烷基三甲基氯化铵；983ml蒸馏水
检测沙门氏菌结合的成分
检测板使用标准浓度的细菌在37℃下包被1小时。这些标准浓度为106，105，5x104，2.5x104，104和5x103，并且空白的孔含有106大肠杆菌。用检测缓冲液按照1∶100稀释将所测量的组分使，并在各个孔中加入50ml，并在37℃下温育20分钟。将这些孔随后在照度计上如前所述地读数。这些成分证明了在此检测中，得到了良好的结合并且确定了所收集的缀合物的优化的稀释——通常地1∶100到1∶1000。
洗涤剂对于直接结合沙门氏菌检测的影响。
使用洗涤剂，十二烷基硫酸钠(SDS)，在管照度计(Berthold LB 9509)上对新型的黑白板(Wallac)进行读数。
缀合物按1∶50稀释
缀合物按1∶100稀释
Figure BPA00001350567700261
缀合物按1∶150稀释
Figure BPA00001350567700262
结果按照平均值±标准偏差；n＝7
白板(Wallac)，在Lucy I Plate Luminometer上读数(1∶100缀合物稀释)
Figure BPA00001350567700271
SDS的不同水平对使用黑白板直接结合沙门氏菌检测的影响(1∶100缀 合物稀释)
Figure BPA00001350567700281
Figure BPA00001350567700282
不同水平的吐温20对使用黑白板的竞争性结合沙门氏菌检测的影响 (1∶100缀合物稀释)
Figure BPA00001350567700283
(平均值±标准偏差，相对光单位)
抗沙门氏菌mAB与1∶100的抗2b缀合物的温育时间的影响
将单克隆抗体(按1∶100稀释)与沙门氏菌或者李斯特菌一起温育，从而确定优化的温育时间：
  30分钟   40分钟   60分钟
  106阿伯丁沙门氏菌   598080   609383   593741
  105阿伯丁沙门氏菌   716821   644854   629340
  104阿伯丁沙门氏菌   276239   328483   371163
  103阿伯丁沙门氏菌   20117   19454   29194
  102阿伯丁沙门氏菌   5439   7204   17242
  106英诺克李斯特氏菌   6376   8909   12151
(在Lucy I Plate Luminometer上读数，结果按照相对光度单位显示)
抗沙门氏菌mAB与1∶200的抗2b缀合物的温育时间的影响
将单克隆抗体(按1∶200稀释)与沙门氏菌或者李斯特菌一起温育，从而确定优化的温育时间：
  30分钟   40分钟   60分钟
  106阿伯丁沙门氏菌   339224   340594   356500
  105阿伯丁沙门氏菌   344236   353391   372633
  104阿伯丁沙门氏菌   247657   243787   256889
  103阿伯丁沙门氏菌   14023   16848   22829
  102阿伯丁沙门氏菌   4869   6846   10817
  106英诺克李斯特氏菌   11395   7775   11455
(在Lucy I Plate Luminometer上读数，结果按照相对光度单位显示)
SDS浓度对食物培养物的影响
在Lucy 1照度计上对白板进行读数
Figure BPA00001350567700301
Figure BPA00001350567700302
Figure BPA00001350567700303
*所有的+ve(细菌阳性的)食物培养物受到10C.F.U阿伯丁沙门氏菌的污染并且在(25g在225ml中)蛋白胨肉汤+8g/l连四硫酸钠以及0.15mg/l煌绿中培养18个小时。细菌阴性的培养物(-ve)受到污染并且也培育18小时。在检测之前将所有食品样品各5ml(含有或者没有SDS)在沸水中加热20分钟。
不同的洗涤剂对于核心寡糖的释放和检测的影响
Figure BPA00001350567700304
(三组独立实验的平均值，相对光度单位)
SDS提供最为可靠的和可重复的将基于食品样本的沙门氏菌LPS解离成单体的结果。然而由于蛋白与其他洗涤剂的蛋白质-洗涤剂相互作用，仅吐温能用于竞争性检测中。
不同抗沙门氏菌抗体水平以竞争性检测方法对沙门氏菌检测的影响
  (cfu/ml)     50ng/ml     25ng/ml     10ng/ml     5ng/ml
  106     9490     7828     8676     8198
  105     23588     19974     14138     11554
  104     91779     70822     32551     23628
  103     149420     82361     42485     31153
  102     151012     99182     55797     35750
  101     151187     109799     71297     40671
  无竞争性的细菌     159874     125724     86091     45119
(三组独立实验的平均值，相对光度单位)
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Claims (21)

1.用于至少一种微生物的生长的培养介质，其本质上含有：
(i)基础肉汤，选自：蛋白胨、胰蛋白酶大豆肉汤、含有酵母的胰蛋白酶大豆肉汤以及改良的胰蛋白酶大豆肉汤；
(ii)至少一种生长抑制剂，选自：煌绿、萘啶酸和氯化锂；和
(iii)可选地，至少一种生长促进剂，选自：连四硫酸钠、柠檬酸铁铵和柠檬酸钠。
2.权利要求1中所述的培养介质，其中所述的生长抑制剂为用量为约0.05至0.25mg/L的煌绿。
3.权利要求1中所述的培养介质，其中所述的生长抑制剂为用量为约1至3mg/L的萘啶酸和约1至约3g/L的氯化锂。
4.权利要求1或者2中所述的培养介质，其包括生长促进剂，其中所述的生长促进剂是用量为约4至约12g/L的连四硫酸钠。
5.权利要求1至4中所述的培养介质，其包括生长促进剂，其中所述的生长促进剂是量为约200至300mg/L的柠檬酸铁铵。
6.权利要求7或者8中所述的培养介质，其还包括生长促进剂柠檬酸钠，所述柠檬酸钠的量为约10至20g/L，更具体地约为15g/L。
7.权利要求1、2或者4中任一项所述的培养介质，其中至少一种微生物是沙门氏菌属。
8.权利要求1、2、5或者6中任一项所述的培养介质，其中至少一种微生物是志贺氏菌属。
9.权利要求1、3或者5中任一项所述的培养介质，其中至少一种微生物是李斯特菌属。
10.一种用于检测待测样本中感兴趣的微生物存在或不存在的检验方法，所述的方法包括：
(i)将所述的待测样本在培养介质中培养，所述的培养介质允许感兴趣的微生物的增殖；
(ii)将所述的待测样本处理到足以从待测样本中存在的任意微生物中释放一种或多种核心寡糖的程度；
(iii)将所述的待测样本暴露于至少一种结合物，所述结合物对感兴趣的微生物的核心寡糖有结合特异性；和
(iv)检测至少一种结合物与感兴趣的微生物的核心寡糖的任意结合。
11.权利要求11所述的方法，其中步骤(ii)包括：
(a)在含有所述感兴趣的微生物的一个待测样本中加入洗涤剂，从而提供一个洗涤剂-培养物溶液；和
(b)将所述的洗涤剂-培养物溶液加热到足以释放所述的核心寡糖的温度。
12.权利要求11所述的方法，其中所述洗涤剂是十二烷基磺酸钠、吐温20、吐温40、吐温60或者吐温80。
13.权利要求10至12中任一项所述的方法，其中步骤(i)使用根据权利要求1至9中任一项的培养介质进行。
14.权利要求10或者13中任一项所述的方法，其中步骤(iv)通过检测冷光信号进行。
15.权利要求14所述的方法，其中所述的冷光信号由吖啶酯产生。
16.从微生物细胞中将核心寡糖单体释放出来的方法，其包括：
(i)在含有所述的微生物的至少一个待测样本中加入洗涤剂，从而提供洗涤剂-培养物溶液；和
(ii)将所述的洗涤剂-培养物溶液加热到足以释放所述的核心寡糖的温度。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述的洗涤剂是十二烷基磺酸钠、吐温20、吐温40、吐温60或者吐温80。
18.本质上含有十二烷基磺酸钠、吐温20、吐温40、吐温60或者吐温80的溶液在权利要求16所述的方法中的应用。
19.对核心寡糖具有结合特异性的结合物在微生物的特异性检测中的应用，所述微生物选自沙门氏菌、志贺氏菌和李斯特菌。
20.根据权利要求1至9中任一项的培养介质在至少一种细菌的生长中的应用，所述的细菌具体地为沙门氏菌、志贺氏菌或者李斯特菌。
21.权利要求10至17任一项所述的方法，其中所述的核心寡糖表位是：
Figure FPA00001350567600031
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