CN111826450A - 一种咖啡果小蠹的特异性ss-coi引物对、鉴定试剂盒和快速鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种咖啡果小蠹的特异性SS‑COI引物对、鉴定试剂盒和快速鉴定方法。该特异性SS‑COI引物对由SEQ ID NO：1所示的上游引物和SEQ ID NO：2所示的下游引物组成。本发明特异性SS‑COI引物和方法实现了对咖啡果小蠹的快速分子鉴定，方法简单，便于操作，耗时短；鉴定范围广、灵敏度高。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种咖啡果小蠹的特异性SS-COI引物对、鉴定试剂盒和快速鉴定方法。
背景技术
咖啡果小蠹Hypothenemus hampei Ferrari，属鞘翅目(Coleoptera)、小蠹科(Scolytidae)、咪小蠹属(Hypothenemus Westwood)，是全球咖啡产业的头号害虫，已于2007年被列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》。其雌成虫在果实端部开始钻蛀，向内啃食形成不规则的坑道到达胚乳并产卵，整个历期不再飞出果实，终生与后代相伴；幼虫孵出后取食果肉和种子胚乳，待其羽化为成虫后可以同胞之间近亲交配生殖，随后雌成虫飞出坑道寻找新的果实钻蛀产卵。另外，该虫除为害咖啡外，还存在其他交替寄主，其中小部分交替寄主可为该虫提供完成整个生命周期的营养。因此，咖啡果小蠹钻蛀为害且存在交替寄主的特性造成防治十分困难，其每年给咖啡产业造成的损失为25％～80％。
2019年6月，中国热带农业科学院香料饮料研究所科技人员首次在我国海南省万宁市兴隆地区咖啡种植园中发现咖啡果小蠹入侵，现该虫已迅速蔓延至琼中县、白沙县和澄迈县等海南主要咖啡种植区。目前，除尼泊尔外，咖啡果小蠹已入侵全球所有咖啡主产国。
传统上，主要依靠外部形态学特征对咖啡果小蠹进行种类鉴定，由于同一生境中经常出现近缘种，需要昆虫分类专业人员和显微设备才能鉴别，存在鉴别难度大、耗时长等问题，不利于掌握该虫入侵扩散动态；而对于卵、幼虫、蛹及特征脱落的残体等样本，无法通过形态学特征进行鉴定。因此在检疫和监测过程中，传统形态学鉴定方法已不能满足实际工作需求。
近年来，随着分子生物学技术的发展及广泛应用，基于线粒体DNA细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(mtDNA COⅠ)标记的分子鉴定技术已用于多种昆虫的种类鉴定，但该方法需要对PCR产物进行碱基序列测序以及系统发育分析，存在耗时、耗财、工作量大的问题。另外，限制性片段长度多态性(RFLP)和单链构象多态性(SSCP)等技术也常被用于昆虫种类鉴定，但其过程复杂，需要酶切、PCR、聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染等步骤，也存在耗时费力等问题。因此，为了解决目前咖啡果小蠹缺乏快速鉴定技术的问题，需要提供一种咖啡果小蠹特异性SS-COI引物及快速分子鉴定方法。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种咖啡果小蠹的特异性SS-COI引物对、鉴定试剂盒和快速鉴定方法。该特异性SS-COI引物和方法实现了对咖啡果小蠹的快速分子鉴定，方法简单，便于操作，耗时短；鉴定范围广、灵敏度高。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种咖啡果小蠹的特异性SS-COI引物对，由SEQ ID NO：1所示的上游引物和SEQ ID NO：2所示的下游引物组成。
本发明还提供了该特异性SS-COI引物对在制备鉴定咖啡果小蠹的试剂盒中的应用。
本发明还提供了一种鉴定咖啡果小蠹的试剂盒，包括上述特异性SS-COI引物对、Taq PCRMasterMixⅡ和ddH2O。
本发明还提供了一种快速鉴定咖啡果小蠹的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测样品的DNA；
(2)以待测样品的DNA为模板，采用上述试剂盒对DNA模板进行扩增；
(3)根据步骤(2)中扩增的结果判定待测样品中DNA模板是否来源于咖啡果小蠹；
若扩增出453bp的序列片段，则DNA模板来源于咖啡果小蠹；
若未扩增出453bp的序列片段，则DNA模板来源于其它物种。
作为优选，扩增的体系如下：
优选地，扩增的体系如下：
作为优选，DNA模板的浓度不小于203pg/μL。
作为优选，上游引物或下游引物在扩增体系中的浓度为0.04～0.4pmol/μL。
在本发明提供的实施例中，上游引物或下游引物在扩增体系中的浓度为0.2pmol/μL。
作为优选，扩增的程序为：93～95℃预变性3.0～5.0min；93～95℃变性25～35s，56～60℃退火30～50s，72℃延伸40～60s，30～40个循环；72℃延伸5～10min。
优选地，扩增的程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s，57℃退火50s，72℃延伸1min，40个循环；72℃延伸10min。
本发明提供了一种咖啡果小蠹的特异性SS-COI引物对、鉴定试剂盒和快速鉴定方法。该特异性SS-COI引物对由SEQ ID NO：1所示的上游引物和SEQ ID NO：2所示的下游引物组成。
本发明有益效果如下：
(1)与现有技术相比，本发明提供了一种特异性SS-COI引物和方法，实现了对咖啡果小蠹的快速分子鉴定，方法简单，便于操作，耗时短；
(2)本发明提供的特异性SS-COI引物和方法鉴定范围广、灵敏度高，可以鉴定咖啡果小蠹不同龄期和残体组织样本，最低检出浓度203.13pg/μL，相当于1/512头咖啡果小蠹成虫。
附图说明
图1通用引物S1718/A2237对13种小蠹的PCR扩增片段；
注：M：DNA 2000Marker；1-13：咖啡果小蠹Hypothenemus hampei,Hypothenemuseruditus,Hypothenemus cf.birmanus,Xyleborus affinis,Xyleborus glabratus,Xylosandrus crassiusculus,Xylosandrus mancus,Cnestus aterrimus,Cryphlausdilutus,Xyleborinus artestriatus,Xylosandrus compactus,Euwallacea fornicatus,Ambrosiodmus osumiensis；NC：阴性对照(模板为ddH2O)；
图2特异性引物HHTYF1/HHTYR3对13种小蠹的PCR扩增片段；标注同图1；
图3特异性引物HHTYF1/HHTYR3对咖啡果小蠹不同组织和龄期样本的PCR扩增片段；注：M：DNA 2000Marker；1-7：卵、幼虫、蛹、头、胸、腹、翅；NC：阴性对照(模板为ddH2O)；
图4特异性引物HHTYF1/HHTYR3对咖啡果小蠹的检测阈值范围；
注：M：DNA 2000Marker；1-11：52.00ng/μL,26.00ng/μL,13.00ng/μL,6.50ng/μL,3.25ng/μL,1.63ng/μL,812.50pg/μL,406.25pg/μL,203.13pg/μL,101.56pg/μL,50.78pg/μL；NC：阴性对照(模板为ddH2O)；
图5对比引物HHTYF1/HHTYR1对13种小蠹的PCR扩增片段；注：M：DNA 2000plusMarker，其余标注同图1；
图6对比引物HHTYF1/HHTYR2对13种小蠹的PCR扩增片段；标注同图1；
图7对比引物HHTYF2/HHTYR1对13种小蠹的PCR扩增片段；注：M：DNA 2000plusMarker，其余标注同图1；
图8对比引物HHTYF2/HHTYR2对13种小蠹的PCR扩增片段；注：M：DNA 2000plusMarker，其余标注同图1；
图9对比引物HHTYF2/HHTYR3对13种小蠹的PCR扩增片段；标注同图1。
具体实施方式
本发明公开了一种咖啡果小蠹的特异性SS-COI引物对、鉴定试剂盒和快速鉴定方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明在现有技术基础上，提供了一种咖啡果小蠹特异性SS-COI引物和快速鉴定方法，首先，通过COI通用引物S1718/A2237对包括咖啡果小蠹在内的13种小蠹进行PCR扩增并测序，经NCBI中Blast序列比对后验证各小蠹种类；其次，13条序列经过多重序列比对后，设计针对咖啡果小蠹COI的特异性引物HHTYF1/HHTYR3。最后，对特异性SS-COI引物HHTYF1/HHTYR3进行特异性检测、不同组织和龄期样本检测、灵敏度检测，确认该引物的特异性、可检测样本范围、灵敏性等指标。
本发明提供的咖啡果小蠹的特异性SS-COI引物对、鉴定试剂盒和快速鉴定方法中所用试剂或仪器均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：昆虫基因组DNA提取
基因组DNA提取采用生工生物工程股份有限公司的Ezup柱式动物基因组DNA抽提试剂盒，具体操作步骤如下：
(1)将单头小蠹用无水乙醇清洗5s后，再用无菌水清洗5次，置于灭菌滤纸上晾干；
(2)将晾干的小蠹放入1.5mL的离心管中，加入180μL BufferACL，用电动研磨器将样品充分研磨，再加入20μL Proteinnase K溶液，震荡混匀，56℃水浴1h至细胞完全裂解；
(3)加入200μL Buffer CL，充分颠倒混匀；
(4)加入200μL无水乙醇，充分颠倒混匀；
(5)将吸附柱放入收集管中，用移液器将溶液和半透明纤维状悬浮物全部加入吸附柱中，静置2min，再10,000rpm室温离心1min，倒掉收集管中废液；
(6)将吸附柱放回收集管中，向吸附柱中加入500μL CW1 Solution，10,000rpm离心30s，倒掉收集管废液；
(7)将吸附柱放回收集管中，向吸附柱中加入500μL CW2 Solution，10,000rpm离心30s，倒掉收集管废液后，将吸附柱重新放回收集管中，12,000rpm室温离心2min，离去残留的CW2 Solution(可将吸附柱盖子打开，室温放置数分钟，彻底晾干)；
(8)取出吸附柱，放入一个新的1.5mL离心管中，加入50μL CE Buffer静置3min，12,000rpm室温离心2min，收集DNA溶液，-20℃保存。
实施例2：小蠹类昆虫COI基因的PCR扩增
根据Jordal等(2011)报道，选用S1718/A2237作为小蠹类昆虫COI基因扩增的通用引物：
S1718：5’-GGAGGATTTGGAAATTGATTAGTTCC-3’
A2237：5’-CCGAATGCTTCTTTTTTACCTCTTTCTTG-3’
采用天根2×Taq PCR MasterMixⅡ试剂盒进行PCR扩增反应，总反应体系25μL，包括：
扩增条件：94℃预变性4min；94℃变性30s，46℃退火50s，72℃延伸1min，40个循环；72℃延伸10min。
取5μL PCR产物，在含有Gel stain染色剂的1.2％琼脂糖凝胶上电泳分离20min(140V)，以凝胶成像系统检测结果，并拍照。
结果表明：本研究共扩增出咖啡果小蠹等13种小蠹类昆虫的COI基因片段，片段大小约520bp，将13种PCR产物直接送生工生物工程股份有限公司进行双向碱基序列测定(图1)。
实施例3：咖啡果小蠹COI基因特异性引物设计
将本研究获得的13种小蠹类昆虫COI序列(包括咖啡果小蠹)在NCBI中进行Blast序列比对验证，结果显示利用通用引物S1718/A2237成功扩增13种小蠹COI片段。再将13个COI进行多重序列比对分析，利用DNASTAR中的PrimerSelect软件设计咖啡果小蠹的COI特异性引物1对(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2)：
HHTYF1：AAGGTGTTGATATAGGATTGGGTCC
HHTYR3：CCACTAATACTAGGCGCACCTG
实施例4：咖啡果小蠹SS-COI引物种特异性检验
分别以咖啡果小蠹及我国南方地区12种常见小蠹共13种小蠹类昆虫DNA为模板，检测HHTYF1/HHTYR3引物对的特异性，反应体系同实施例2。优化后的扩增条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，57℃退火50s，72℃延伸1min，40个循环；72℃延伸10min。
结果显示，仅咖啡果小蠹成功扩增出453bp的COI序列片段，经NCBI中Blast比对，该片段与已报到咖啡果小蠹COI基因序列一致性为100％。其余12种小蠹类昆虫均未扩增出目的片段，表明HHTYF1/HHTYR3引物对具有种特异性(图2)。
实施例5：咖啡果小蠹SS-COI引物对组织和龄期样本的检测
以咖啡果小蠹不同龄期(卵、幼虫、蛹)和不同组织(头、胸、腹、翅)的DNA为模板，检测HHTYF1/HHTYR3对组织和龄期样本的扩增能力。反应体系和扩增条件同实施例4。
结果显示，上述样本均能成功扩增出453bp的COI序列片段，表明HHTYF1/HHTYR3引物对可以鉴定咖啡果小蠹不同龄期和残体组织样本(图3)。
实施例6：咖啡果小蠹SS-COI引物的灵敏度检测
利用NanoDrop 2000C微量分光光度计(Thermo Scientific)检测咖啡果小蠹DNA模板浓度，随后依次2倍梯度稀释，分别配制成52.00ng/μL、26.00ng/μL、13.00ng/μL、6.50ng/μL、3.25ng/μL、1.63ng/μL、812.50pg/μL、406.25pg/μL、203.13pg/μL、101.56pg/μL、50.78pg/μL等浓度。以不同浓度的DNA样品作为模板进行特异性SS-COI引物灵敏度PCR扩增，无菌水作为阴性对照。
结果表明，特异性引物对HHTYF1/HHTYR3对咖啡果小蠹的最低检出浓度为203.13pg/μL，相当于1/512头咖啡果小蠹成虫，灵敏度高(图4)。
对比例1
本对比例5对特异性引物分别为：HHTYF1/HHTYR1(391bp)、HHTYF1/HHTYR2(328bp)、HHTYF2/HHTYR1(413bp)、HHTYF2/HHTYR2(350bp)、HHTYF2/HHTYR3(475bp)。各引物对序列及扩增结果如下：
一、对比序列1(HHTYF1/HHTYR1)
HHTYF1：AAGGTGTTGATATAGGATTGGGTCC
HHTYR1：TCTACCCCCATCACTAATATTTCTTATT
由图5可知，使用设计的特异性引物HHTYF1/HHTYR1进行PCR扩增，13种小蠹样本在391bp处均出现条带，部分小蠹样本还出现双条带，表明HHTYF1/HHTYR1引物对咖啡果小蠹不具特异性。
二、对比序列2(HHTYF1/HHTYR2)
HHTYF1：AAGGTGTTGATATAGGATTGGGTCC
HHTYR2：GTGAACTGTGTATCCACCCCTCGCAAG
由图6可知，使用设计的特异性引物HHTYF1/HHTYR2进行PCR扩增，除咖啡果小蠹样本在328bp处产生条带外，其余12种小蠹均在328bp处产生条带，其中部分样本还产生多条带，表明HHTYF1/HHTYR2引物对咖啡果小蠹不具特异性。
三、对比序列3(HHTYF2/HHTYR1)
HHTYF2：CAGGGTGTCCAAAGAATCAAAAAAGG
HHTYR1：TCTACCCCCATCACTAATATTTCTTATT
由图7可知，使用设计的特异性引物HHTYF2/HHTYR1进行PCR扩增，13种小蠹样本在413bp处均出现条带，部分小蠹样本还出现多条带，表明HHTYF2/HHTYR1引物对咖啡果小蠹不具特异性。
四、对比序列4(HHTYF2/HHTYR2)
HHTYF2：CAGGGTGTCCAAAGAATCAAAAAAGG
HHTYR2：GTGAACTGTGTATCCACCCCTCGCAAG
由图8可知，使用设计的特异性引物HHTYF2/HHTYR2进行PCR扩增，13种小蠹样本在350bp处均出现条带，部分小蠹样本还出现多条带，表明HHTYF2/HHTYR2引物对咖啡果小蠹不具特异性。
五、对比序列5(HHTYF2/HHTYR3)
HHTYF2：CAGGGTGTCCAAAGAATCAAAAAAGG
HHTYR3：CCACTAATACTAGGCGCACCTG
由图9可知，使用设计的特异性引物HHTYF2/HHTYR3进行PCR扩增，除咖啡果小蠹样本在475bp处产生条带外，部分小蠹在475bp处也产生条带，同时其余小蠹样本还出现多条杂带，表明HHTYF2/HHTYR3引物对咖啡果小蠹不具特异性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国热带农业科学院香料饮料研究所
<120> 一种咖啡果小蠹的特异性SS-COI引物对、鉴定试剂盒和快速鉴定方法
<130> MP2021718
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aaggtgttga tataggattg ggtcc 25
<210> 2
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccactaatac taggcgcacc tg 22
Claims (10)
1.一种咖啡果小蠹的特异性SS-COI引物对，其特征在于，由SEQ ID NO：1所示的上游引物和SEQ ID NO：2所示的下游引物组成。
2.权利要求1所述的特异性SS-COI引物对在制备鉴定咖啡果小蠹的试剂盒中的应用。
3.一种鉴定咖啡果小蠹的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的特异性SS-COI引物对、TaqPCRMasterMixⅡ和ddH2O。
4.一种快速鉴定咖啡果小蠹的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取待测样品的DNA；
(2)以所述待测样品的DNA为模板，采用权利要求3所述的试剂盒对DNA模板进行扩增；
(3)根据步骤(2)中扩增的结果判定所述待测样品中DNA模板是否来源于咖啡果小蠹；
若扩增出453bp的序列片段，则DNA模板来源于咖啡果小蠹；
若未扩增出453bp的序列片段，则DNA模板来源于其它物种。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述扩增的体系如下：
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述扩增的体系如下：
7.根据权利要求4至6中任一项所述的方法，其特征在于，所述DNA模板的浓度不小于203pg/μL。
8.根据权利要求4至6中任一项所述的方法，其特征在于，所述上游引物或所述下游引物在扩增体系中的浓度为0.04～0.4pmol/μL。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述扩增的程序为：93～95℃预变性3.0～5.0min；93～95℃变性25～35s，56～60℃退火30～50s，72℃延伸40～60s，30～40个循环；72℃延伸5～10min。
10.根据权利要求4或9所述的方法，其特征在于，所述扩增的程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s，57℃退火50s，72℃延伸1min，40个循环；72℃延伸10min。
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