CN111763743A - 一种罗布麻蚜dna条形码标准检测序列及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种罗布麻蚜的DNA条形码标准检测序列，其序列如SEQ ID NO.1所示，以及基于该标准序列的分子鉴定方法。本发明采用可靠的DNA分子鉴定技术，针对罗布麻田主要害虫罗布麻蚜进行快速鉴定，具有准确、迅速、便捷和费用低的特点，相比传统的形态特征鉴定方法，即节省时间又降低费用。本方法对使用的仪器设备要求较低，一般的分子生物学实验室均可进行，比传统的形态学鉴别更准确可靠，本方法第一次获得罗布麻蚜的CO1序列，从根本上解决了当前罗布麻蚜在防治过程中较难进行准确鉴定，易与棉蚜混淆等难题,填补了行业空白，具有重要意义。

Description

一种罗布麻蚜DNA条形码标准检测序列及其应用
技术领域
本发明属于物种鉴定技术领域，具体涉及一种罗布麻蚜DNA条形码标准检测序列及其在物种鉴定中的应用。
背景技术
罗布麻蚜是同翅目蚜科蚜属的物种，罗布麻蚜具有多型性，田间常见的类型为无翅胎生雌蚜与有翅胎生雌蚜。体长2mm宽1-1.2mm，常见颜色为黄绿色与墨绿色，死亡后颜色变深，多为深绿色。四月底五月初，罗布麻蚜田间初发，发育峰值约在七月中旬至七月末，八月底九月初时，罗布麻蚜逐渐死亡。主要分布在罗布麻植株顶端1-30厘米处垂直集中危害，初发时的罗布麻蚜多聚集在罗布麻一二级枝条顶端的幼嫩部分，从一二级分枝的节间处向叶片扩散危害，常见的天敌：条斑赤蜻、草皮逍遥蛛、大灰优食蚜蝇、七星瓢虫、九星瓢虫等。
快速准确的物种鉴定手段是科学防治田间害虫的重要前提与基础。由于罗布麻蚜体积较小，常与棉蚜混合危害，传统的形态学鉴定无法准确鉴别罗布麻蚜与棉蚜，存在较大的局限性，不仅费时费力，而且易受主观因素干扰，极易混淆出错。传统的鉴别方法难以展开针对幼虫或残缺个体的鉴别，使用分子生物学手段可以快速，准确的鉴别处罗布麻蚜成虫及幼虫。因此有必要寻找一种快捷、准确鉴别的分子生物学方法，从而应用于检疫及有效地控制其给田间生产带来的危害。
自DNA条形码(DNAbarcode)技术问世至今，已受到分子生物学领域的广泛关注。DNA条形码是指生物体内能够代表该物种的、标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。当存在某种未知物种需要鉴定时，可获取其DNA条形码，然后与数据库中的其他条形码进行比对，若与某已知物种相匹配，则可成功鉴定未知物种。该技术可以快速准确的对物种进行分类鉴定，弥补了传统形态学鉴定的很多不足，因此广泛的用于动植物的分类鉴定。但目前国内外尚无利用DNA条形码作为分子标记手段进行鉴别罗布麻蚜的相关研究及报道。
目前尚未公开罗布麻蚜DNA条形码鉴定方法，本发明首次通过DNA条形码技术，即扩增线粒体CO1基因组序列，利用相关软件进行数据处理分析，实现快速准确的对罗布麻蚜进行物种鉴定。本发明首次获得罗布麻蚜的CO1基因组序列，为缩短物种鉴定时间，及时有效的控制治理罗布麻蚜的田间危害，提高罗布麻产量，降低经济损失提供必要的前提及基础。
发明内容
本发明的目的为提供一种罗布麻蚜DNA条形码标准检测序列及其在物种鉴定中的应用，能弥补目前以形态学鉴定蚜虫中存在的技术缺陷，针对罗布麻蚜的物种鉴定困难的问题，提供一种快速简便准确的分子生物学鉴定方法。
为实现上述目的，本发明提供了一种罗布麻蚜DNA条形码标准检测序列，所述条形码标准检测序列为COI基因，其序列如SEQ ID NO.1所示：
AACTTTATATTTTTTATTTGGTATTTGATCAGGTATAATTGGCTCTTCTCTAAGAATTTTAATCCGATTAGAATTAAGTCAAATTAATTCAATTATTAATAATAATCAATTATATAATGTAATTGTTACAATTCATGCTTTTATTATAATTTTTTTTATAACTATACCAATCGTTATTGGAGGTTTTGGAAATTGATTAATTCCTATAATAATAGGATGTCCAGATATATCTTTTCCACGACTAAATAATATTAGATTCTGATTATTACCACCTTCATTAATAATAATAATTTGCAGATTTATAATTAATAATGGAACAGGAACAGGATGAACTATTTATCCACCTTTATCAAATAACATTGCTCATAACAATATTTCAGTAGACTTAACTATTTTTTCTCTACATTTAGCAGGTATTTCATCAATTTTAGGAGCAATTAACTTCATCTGCACTATTTTAAATATAATACCTAATAATATAAAATTAAATCAAATCCCTTTATTTCCATGATCAATTTTAATTACAGCTATATTATTAATTTTATCCTTACCTGTATTAGCTGGTGCTATTACTATATTATTAACAGATCGAAATTTAAATACATCATTTTTTGATCCAGCAGGTGGAGGAGACCCTATTCTTTATCAACATTTATTT。
本发明同时提供一种鉴定罗布麻蚜的分子生物学方法，包括以下步骤：
(1)提取罗布麻蚜总DNA；
(2)利用节肢动物通用条形码线粒体COI基因引物进行PCR扩增和测序；
(3)依据获得的核苷酸序列通过比对进行物种鉴别。
进一步的，步骤(1)中，所述提供罗布麻蚜总DNA的个体为成虫及幼虫。
进一步的，步骤(2)中，所述通用引物序列为：
LCO1490：GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG
HCO2198：TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA。
进一步的，所述PCR反应体系为25uL，其中模板DNA为2uL，Mix酶12.5uL，正反向引物各1.5uL，加7.5uL去离子水(ddH2O)调至终体积25uL；
PCR反应条件如下：94℃预变性3分钟，94℃变性20秒，48℃复性30秒，72℃延伸1分钟，35个循环后，72℃再延伸10分钟，4℃保存。
本发明的优点为：
(1)本发明方法能对罗布麻蚜成虫以及幼虫或残缺个体进行鉴定，具有准确、迅速、便捷和费用低的特点，相比传统的形态特征鉴定方法，即节省时间又降低费用。
(2)本发明方法对使用的仪器设备要求较低，一般的分子生物学实验室均可进行，比传统的形态学鉴别更准确可靠。
(3)本发明提供了一种罗布麻蚜DNA条形码标准检测序列，从根本上解决了当前罗布麻蚜在防治过程中较难进行准确鉴定的难题,填补了行业空白，具有重要意义。
具体实施方式
1.罗布麻蚜总DNA提取
(1)采用SDS法提取其DNA。将单头昆虫在研钵中加入液氮进行充分研磨，然后加入500μL的DNA提取液(500ml ddh20,100ml 1M ph8.0 Tris-Hcl,100ml 0.5M ph8.0 EDTA,100ml 5M Nacl,200ml 10％SDS)，并全部转入2ml离心管。
(2)用150μLDNA提取液清洗研钵，移入同一离心管，充分摇匀后置于水浴锅65℃水浴30min(中途摇匀2-3次)。
(3)放置室温后加195μL醋酸钾，冰浴5min(-20℃)；加600μL氯仿/异戊醇(v:v＝24:1)，混合均匀；室温12000r/min，离心10min。
(4)吸取360μL上清液至新的1.5ml尖头离心管中，加36μL 3M Nacl和240μL异丙醇混合均匀，室温放置10min；取出后，于12000r/min，离心10min，小心弃去上清液，再次离心30s，用10μL移液抢将残液吸出。
(5)加500μL 75％的乙醇，将沉淀弹起，室温12000r/min，离心5min，小心弃去上清液，后离心30s，用10μL移液抢将残液吸出。
(6)在通风橱中将残留乙醇彻底挥发后加入20μL ddH2O充分溶解，于-20℃保存备用。
2.PCR扩增测序
(1)以所采集的昆虫样本提取的DNA为模板，采用节肢动物通用条形码线粒体COI基因的引物进行PCR扩增，引物序列为：
LCO1490：GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG
HCO2198：TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA
(2)PCR反应体系为25uL，其中模板DNA为2uL，Mix酶12.5uL，正反向引物各1.5uL，加7.5uL去离子水(ddH2O)调至终体积25uL；PCR反应条件如下：94℃预变性3分钟，94℃变性20秒，48℃复性30秒，72℃延伸1分钟，35个循环后，72℃再延伸10分钟，4℃保存。
(3)线粒体COI基因PCR扩增的扩增产物取2.5μL进行检测，以Markers(DL2,000，TaKaRa)作为分子量标记在含有荧光染色剂(Gold View二代)的1.5％的琼脂糖凝胶电泳上进行电泳检测，135V电压下电泳35min后，用凝胶成像仪观察电泳条带并进行拍照记录。将成功扩增的PCR产物，送至测序公司进行双向测序，所用测序引物与PCR扩增的引物相同。
(4)将正反向测序获得的序列通过拼接获得长度为658bp的最终序列，并在数据库中进行比对。拼接获得的CO1序列如下：
AACTTTATATTTTTTATTTGGTATTTGATCAGGTATAATTGGCTCTTCTCTAAGAATTTTAATCCGATTAGAATTAAGTCAAATTAATTCAATTATTAATAATAATCAATTATATAATGTAATTGTTACAATTCATGCTTTTATTATAATTTTTTTTATAACTATACCAATCGTTATTGGAGGTTTTGGAAATTGATTAATTCCTATAATAATAGGATGTCCAGATATATCTTTTCCACGACTAAATAATATTAGATTCTGATTATTACCACCTTCATTAATAATAATAATTTGCAGATTTATAATTAATAATGGAACAGGAACAGGATGAACTATTTATCCACCTTTATCAAATAACATTGCTCATAACAATATTTCAGTAGACTTAACTATTTTTTCTCTACATTTAGCAGGTATTTCATCAATTTTAGGAGCAATTAACTTCATCTGCACTATTTTAAATATAATACCTAATAATATAAAATTAAATCAAATCCCTTTATTTCCATGATCAATTTTAATTACAGCTATATTATTAATTTTATCCTTACCTGTATTAGCTGGTGCTATTACTATATTATTAACAGATCGAAATTTAAATACATCATTTTTTGATCCAGCAGGTGGAGGAGACCCTATTCTTTATCAACATTTATTT。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的的的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种罗布麻蚜DNA条形码标准检测序列，其特征在于，所述条形码标准检测序列为COI基因，其序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种鉴定罗布麻蚜的分子生物学方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取罗布麻蚜总DNA；
(2)利用节肢动物通用条形码线粒体COI基因引物进行PCR扩增和测序；
(3)依据获得的核苷酸序列特征变异位点进行物种鉴别。
3.根据权利要求2所述鉴定罗布麻蚜的分子生物学方法，其特征在于，步骤(1)中，所述提取罗布麻蚜总DNA的个体为成虫及幼虫。
4.根据权利要求2所述鉴定罗布麻蚜的分子生物学方法，其特征在于，步骤(2)中，所述通用引物序列为：
LCO1490：GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG
HCO2198：TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA。
5.根据权利要求2所述鉴定罗布麻蚜的分子生物学方法，其特征在于，步骤(2)中，所述PCR反应体系为25uL，其中模板DNA为2uL，Mix酶12.5uL，正反向引物各1.5uL，加7.5uL去离子水(ddH2O)调至终体积25uL；PCR反应条件如下：94℃预变性3分钟，94℃变性20秒，48℃复性30秒，72℃延伸1分钟，35个循环后，72℃再延伸10分钟，4℃保存。
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CN110656186A (zh) * 2019-10-31 2020-01-07 新疆农业科学院植物保护研究所 一种快速鉴定核桃黑斑蚜的试剂盒及方法

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