CN111172291B - 用于鉴定罗布麻绿肖叶甲的核苷酸序列及鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供用于鉴定罗布麻绿肖叶甲的核苷酸序列，所述核苷酸序列为罗布麻绿肖叶甲线粒体CO1基因组序列。本发明还提供相应的罗布麻绿肖叶甲的鉴定方法。本发明方法能对罗布麻绿肖叶甲成虫以及幼虫或残缺个体进行鉴定，具有准确、迅速、便捷和费用低的特点，相比传统的形态特征鉴定方法，即节省时间又降低费用。本发明方法对使用的仪器设备要求较低，一般的分子生物学实验室均可进行，比传统的形态学鉴别更准确可靠。本发明第一次获得罗布麻绿肖叶甲的CO1序列，从根本上解决了当前罗布麻绿肖叶甲在防治过程中较难进行准确鉴定，幼虫易与其他鞘翅目幼虫混淆等难题，填补了行业空白，具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及罗布麻主要害虫罗布麻绿肖叶甲的鉴定方法。
背景技术
罗布麻属夹竹桃科(Apocynaceae)多年生宿根性草本植物或半灌木，主要分布在中亚地区，我国主要分布在长江以北的广大盐碱沙荒地区。随着相关科学研究的逐步深入，发现罗布麻具有喜光、抗风蚀、耐贫瘠、盐碱、干旱、酷暑寒冷等特点，是保持水土、涵养水分、防风固沙的理想荒漠植物之一。罗布麻叶片可用于制茶和制药，辅助治疗与肝脏、肾脏和心脑血管有关的疾病，其韧皮纤维可与棉、麻等混纺，制作高档纺织面料。由于其兼具生态及经济双重功能，正引起社会各界广泛关注与利用。
罗布麻绿肖叶甲(Chrysochares punctatus)是鞘翅目(Coleoptera)肖叶甲科(Eumolpidae)绿肖叶甲属(Chrysochares)的一种昆虫。该虫主要分布于新疆、甘肃、哈萨克斯坦、塔吉克斯坦和乌兹别克斯坦等。在新疆阿勒泰地区，其主要寄主为罗布红麻(Apocynum venetum)、大叶白麻(Poacynum hendersonii)、白麻(Poacynum pictum)，是罗布麻田主要的害虫之一，该虫主要以成虫为害，常10余头聚集于一株罗布麻顶端啃食罗布麻嫩叶。一般从罗布麻嫩叶的边缘开始啃食，造成叶片畸形，严重时只留下叶脉。一般在6月份开始大量爆发，持续到8月份，年发生1-2代，以幼虫于土壤、植物根际、植物残体下面等地方越冬。该虫的大规模爆发使罗布麻大规模减产，尤其对罗布麻产茶业造成严重的经济损失。
传统的物种鉴别手段主要依赖于昆虫形态等特征，存在较大的局限性，不仅费时费力，而且易受主观因素干扰，极易混淆出错。其次，新疆阿勒泰地区罗布麻田鞘翅目昆虫较多，鞘翅目幼虫多为蛴螬型，由于罗布麻绿肖叶甲的卵、幼虫和蛹与其他鞘翅目昆虫相似，生存在地下，危害罗布麻的地下部分，传统的鉴别方法难以展开针对幼虫或残缺个体的鉴别，而使用分子生物学手段可以快速，准确的鉴别处罗布麻绿肖叶甲成虫及幼虫。
快速准确的物种鉴定手段是科学防治田间害虫的重要前提与基础。现如今有关罗布麻绿肖叶甲的研究几乎空白，仅《动物志》中记载了其成虫的形态特征。因此有必要寻找一种快捷、准确鉴别的分子生物学方法，从而应用于检疫及有效地控制其给田间生产带来的危害。
自DNA条形码(DNA barcode)技术问世至今，已受到分子生物学领域的广泛关注。DNA条形码是指生物体内能够代表该物种的、标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。当存在某种未知物种需要鉴定时，可获取其DNA条形码，然后与数据库中的其他条形码进行比对，若与某已知物种相匹配，则可成功鉴定未知物种。该技术可以快速准确的对物种进行分类鉴定，弥补了传统形态学鉴定的很多不足，因此广泛的用于动植物的分类鉴定。但目前国内外尚无利用DNA条形码作为分子标记手段进行鉴别罗布麻绿肖叶甲的相关研究及报道。
发明内容
本发明针对现有技术中罗布麻绿肖叶甲的形态鉴定困难的问题，提供了一种快速简便准确的分子生物学鉴定方法，该方法主要是提取罗布麻绿肖叶甲的总DNA，利用DNA条形码通用引物扩增其线粒体CO1基因序列作为标记并进行物种鉴别的序列特征比对，从而进行物种鉴定。
本发明首次通过DNA条形码技术，即扩增线粒体CO1基因组序列，利用相关软件进行数据处理分析，实现快速准确的对罗布麻绿肖叶甲进行物种鉴定。本发明首次获得罗布麻绿肖叶甲的CO1基因组序列，为及时有效的控制治理罗布麻绿肖叶甲的田间危害，提高罗布麻产量，降低经济损失提供必要的前提及基础。
为实现上述技术目的，本发明采取的技术方案为：
本发明提供用于鉴定罗布麻绿肖叶甲的核苷酸序列，所述核苷酸序列为罗布麻绿肖叶甲线粒体CO1基因组序列。
作为优选，所述核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.1。
本发明提供罗布麻绿肖叶甲的鉴定方法，包括以下步骤：
(1)提取待测昆虫的总DNA；
(2)利用节肢动物通用条形码线粒体COI基因引物对步骤(1)得到的总DNA进行PCR扩增和测序；
(3)对步骤(2)获得的核苷酸序列进行比对，进行物种鉴别：如果获得的其他序列与序列表中SEQ ID No.1比对后的相似性小于99％，则证明不是罗布麻绿肖叶甲，如果相似性高于99％，则就是罗布麻绿肖叶甲。
作为优选，步骤(1)中，所述待测昆虫为幼虫或成虫。
作为优选，步骤(2)中，所述节肢动物通用条形码线粒体COI基因引物为：
LCO1490：GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG
HCO2198：TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA。
作为优选，步骤(2)中，所述PCR扩增时的反应体系为25μL，其中模板DNA为2μL，Mix酶12.5μL，正反向引物各1.5μL，加7.5μL去离子水调至终体积25μL。
作为优选，步骤(2)中，所述PCR扩增时的反应条件为：94℃预变性3分钟，94℃变性20秒，48℃复性30秒，72℃延伸1分钟，35个循环后，72℃再延伸10分钟。
本发明的有益效果为：
(1)本发明方法能对罗布麻绿肖叶甲成虫以及幼虫或残缺个体进行鉴定，具有准确、迅速、便捷和费用低的特点，相比传统的形态特征鉴定方法，即节省时间又降低费用。
(2)本发明方法对使用的仪器设备要求较低，一般的分子生物学实验室均可进行，比传统的形态学鉴别更准确可靠。
(3)本发明第一次获得罗布麻绿肖叶甲的CO1序列，从根本上解决了当前罗布麻绿肖叶甲在防治过程中较难进行准确鉴定，幼虫易与其他鞘翅目幼虫混淆等难题，填补了行业空白，具有重要意义。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均购自常规生化试剂公司。
实施例1
1.罗布麻绿肖叶甲总DNA提取
(1)采用SDS法提取其DNA。将单头昆虫在研钵中加入液氮进行充分研磨，然后加入500μL的DNA提取液(500ml ddH2O，100ml 1M pH8.0 Tris-HCl，100ml 0.5M pH8.0EDTA，100ml 5M NaCl，200ml 10％SDS)，并全部转入2ml离心管。
(2)用150μL DNA提取液清洗研钵，移入同一离心管，充分摇匀后置于水浴锅65℃水浴30min(中途摇匀2-3次)。
(3)放置室温后加195μL醋酸钾，冰浴5min(-20℃)；加600μL氯仿和异戊醇混合物，其中氯仿与异戊醇的体积比为24:1)，混合均匀；室温12000r/min，离心10min。
(4)吸取360μL上清液至新的1.5ml尖头离心管中，加36μL 3M NaCl和240μL异丙醇混合均匀，室温放置10min；取出后，于12000r/min，离心10min，小心弃去上清液，再次离心30s，用10μL移液枪将残液吸出。
(5)加500μL 75％的乙醇，将沉淀弹起，室温12000r/min，离心5min，小心弃去上清液，后离心30s，用10μL移液枪将残液吸出。
(6)在通风橱中将残留乙醇彻底挥发后加入20μL ddH2O充分溶解，于-20℃保存备用。
2.PCR扩增测序
(1)以所采集的昆虫样本提取的DNA为模板，采用节肢动物通用条形码线粒体COI基因的引物进行PCR扩增，引物序列为：
LCO1490：GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG
HCO2198：TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA
(2)PCR反应体系为25μL，其中模板DNA为2μL，Mix酶12.5μL，正反向引物各1.5μL，加7.5μL去离子水(ddH2O)调至终体积25μL；PCR反应条件如下：94℃预变性3分钟，94℃变性20秒，48℃复性30秒，72℃延伸1分钟，35个循环后，72℃再延伸10分钟，4℃保存。
(3)将步骤(2)获得的线粒体COI基因PCR扩增的扩增产物取2.5μL进行检测，以Markers(DL2,000，TaKaRa)作为分子量标记在含有荧光染色剂(GoldView二代)的1.5％的琼脂糖凝胶电泳上进行电泳检测，135V电压下电泳35分钟后，用凝胶成像仪观察电泳条带并进行拍照记录。将成功扩增的PCR产物，送至测序公司进行双向测序，所用测序引物与PCR扩增的引物相同。
(4)将正反向测序获得的序列通过拼接获得长度为658bp的最终序列，并在数据库中进行比对。拼接获得的CO1序列如下：
AACTTTATACTTTATTTTTGGAGCTTGATCCGGAATACTAGGGACCTCGTTAAGAATTATTATTCGGGTTGAATTAGGAAACCCAGGAACATTAATTGGAAATGATCAAATTTACAATTCAGTTGTGACAGCCCATGCATTTATCATAATTTTTTTTATAGTTATACCAATCATAATTGGCGGATTTGGAAATTGACTTGTACCTTTAATATTGGGAGCACCTGATATAGCATTTCCTCGTCTTAATAATATAAGATTTTGACTTCTGCCCCCGTCATTAAATCTTTTAGTTATAAGAAGTGTTGTAGAAAGAGGTGTAGGTACAGGATGGACGGTTTACCCTCCACTTTCTTCTAATGTTACTCATAGAGGTTCATCCGTAGATTTAGCAATTTTTAGTTTACATTTAGCTGGAATTTCCTCTATTTTAGGAGCAATCAACTTTATTTCCACAGTAATTAATATACGTCCCCAAGGAATATTTATAGATCAAACCCCCTTATTTGTGTGAGCTGTTTTAATTACAGCCATTTTGCTTTTGTTATCTTTACCTGTCCTAGCCGGAGCAATCACAATATTATTAACTGATCGAAATCTAAATACATCATTTTTTGACCCCACAGGAGGGGGAGACCCTATTCTCTACCAACATTTATTT
在数据库中进行物种鉴别的序列特征比对的过程和结果为：
在NCBI数据库中选择BLAST选项，在新的页面选择Nucleotide Blast选项，在Enter Query Sequence窗口提交上述获得的CO1序列，进行BLAST比对，获得比对的结果。如果获得的其他序列与本序列比对后的相似性小于99％，则证明不是罗布麻绿肖叶甲，如果相似性高于99％，则就是罗布麻绿肖叶甲。
实施例2
本发明的方法的验证实验
选择五头未知鞘翅目甲虫，通过形态学鉴定后得知其为罗布麻绿肖叶甲，进一步使用上述实验方法获得其COI序列，在MEGA软件中利用K2P model计算出遗传距离，均小于1％，证实五头甲虫确实为罗布麻绿肖叶甲。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 兰州大学
<120> 用于鉴定罗布麻绿肖叶甲的核苷酸序列及鉴定方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 658
<212> DNA
<213> 罗布麻绿肖叶甲(Chrysochares punctatus)
<400> 1
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agttgtgaca gcccatgcat ttatcataat tttttttata gttataccaa tcataattgg 180
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tcttaataat ataagatttt gacttctgcc cccgtcatta aatcttttag ttataagaag 300
tgttgtagaa agaggtgtag gtacaggatg gacggtttac cctccacttt cttctaatgt 360
tactcataga ggttcatccg tagatttagc aatttttagt ttacatttag ctggaatttc 420
ctctatttta ggagcaatca actttatttc cacagtaatt aatatacgtc cccaaggaat 480
atttatagat caaaccccct tatttgtgtg agctgtttta attacagcca ttttgctttt 540
gttatcttta cctgtcctag ccggagcaat cacaatatta ttaactgatc gaaatctaaa 600
tacatcattt tttgacccca caggaggggg agaccctatt ctctaccaac atttattt 658
Claims (6)
1.罗布麻绿肖叶甲线粒体CO1基因组序列在鉴定罗布麻绿肖叶甲中的应用；所述核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.1。
2.罗布麻绿肖叶甲的鉴定方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)提取待测昆虫的总DNA；
(2)利用节肢动物通用条形码线粒体COI基因引物对步骤(1)得到的总DNA进行PCR扩增和测序；
(3)对步骤(2)获得的核苷酸序列进行比对，进行物种鉴别：如果获得的其他序列与序列表中SEQ ID No.1比对后的相似性小于99％，则证明不是罗布麻绿肖叶甲，如果相似性高于99％，则就是罗布麻绿肖叶甲。
3.根据权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于：步骤(1)中，所述待测昆虫为幼虫或成虫。
4.根据权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于：步骤(2)中，所述节肢动物通用条形码线粒体COI基因引物为：
LCO1490：GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG
HCO2198：TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA。
5.根据权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于：步骤(2)中，所述PCR扩增时的反应体系为25μL，其中模板DNA为2μL，Mix酶12.5μL，正反向引物各1.5μL，加7.5μL去离子水调至终体积25μL。
6.根据权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于：步骤(2)中，所述PCR扩增时的反应条件为：94℃预变性3分钟，94℃变性20秒，48℃复性30秒，72℃延伸1分钟，35个循环后，72℃再延伸10分钟。
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