TW201812298A - 甲狀腺球蛋白之測定方法及測定試藥 - Google Patents
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Abstract
本發明係揭示：不受抗甲狀腺球蛋白抗體干擾的影響，利用單獨檢查便可測定正確甲狀腺球蛋白量的甲狀腺球蛋白之測定方法及測定試藥。甲狀腺球蛋白之測定方法係，利用免疫分析測定從活體中分離出的樣本中之甲狀腺球蛋白，包括有：將從活體中分離出的樣本、與含有界面活性劑及酸化劑中之任一者或雙方的前處理液予以混合之前處理步驟。甲狀腺球蛋白之免疫分析用試藥，係具備含有界面活性劑及酸化劑中之任一者或雙方的前處理液。
Description
本發明係關於甲狀腺球蛋白(thyroglobulin)之測定方法及測定試藥。
甲狀腺球蛋白(Tg)係僅由甲狀腺濾泡細胞(follicle cell)製成，分子量66萬的醣蛋白。生合成Tg被釋放至濾泡腔(follicular antrum)。在過程中，利用過氧化酶的作用，碘分子會鍵結於Tg分子中的酪胺醯基，而執行甲狀腺激素的合成。濾泡腔的Tg再度被取入於濾泡細胞，並在濾泡細胞內被分解，而引發甲狀腺激素釋放。又，此過程係利用促甲狀腺激素(TSH)的作用而活化。所以，在正常時，僅些微引發Tg朝血中的釋放，而Tg的血中釋放係表示甲狀腺有何異常。故，Tg的器官特異性高，屬於對甲狀腺疾病極具有用的標記。特別係血中Tg被使用為甲狀腺分化癌的手術評估、以及獲知手術後有無再發或轉移的標記。此外，對葛瑞夫茲氏症的治療效果/緩解指標，先天性甲狀腺低能症的疾病型態決定/鑑定、治療監測等亦有效。又，亦暗示藉由與影像診斷的組合，便有做為結節性甲狀腺腫的手術前診斷、以及鑑定良性甲狀腺疾病與惡性腫瘤之可能性。
但是，當受測者係抗甲狀腺球蛋白抗體(TgAb)陽性時，實際上即便Tg高值，但因測定上的問題亦會有呈低值的情況。 例如甲狀腺癌而言，因為20~30%患者呈TgAb陽性，因而在測定Tg之同時，亦必需測定TgAb。又，若TgAb陽性的橋本氏病而言，頗難正確測定Tg量，同樣被觀察到TgAb陽性的其他自體免疫病(葛瑞夫茲氏症)，亦會有無法正確測定出Tg量的可能性。
非專利文獻1：Spencer CA, Takeuchi M and Kazarosyan M: Current status and performance goals for serum thyroglobulin assays., Clin Chem, 42, 164-173(1996)
若即便如上述的TgAb陽性患者，仍可正確測定Tg量，便有可廣泛利用於甲狀腺疾病的治療監測之可能性。本發明目的在於提供：不會受到抗甲狀腺球蛋白抗體的干擾影響，利用單獨檢查便可測定正確甲狀腺球蛋白量的甲狀腺球蛋白之測定方法及測定試藥。
本發明者等為達成上述目的經深入鑽研，結果發現在測定活體樣本中的甲狀腺球蛋白時，在於將上述活體樣本提供進行免疫反應之前，藉由經由與含有界面活性劑及酸化劑(acidulating agent)中之任一者或雙方的前處理液，進行混合之前處理步驟，便可在不受抗甲狀腺球蛋白抗體影響情況下，獲得更正確的甲狀腺球蛋白測定值，遂完成本發明。
本發明的構成係如下。
(1)一種方法，係利用免疫分析測定從活體中分離出的樣本中之甲狀腺球蛋白，包括有：將從活體中分離出的樣本、與含有界面活性劑及酸化劑中之任一者或雙方的前處理液予以混合之前處理步驟。
(2)如(1)所記載的方法，其中，上述前處理液係含有酸化劑，前處理步驟中的酸化劑之最終濃度係超過0.05N且0.5N以下。
(3)如(1)所記載的方法，其中，上述前處理液係含有界面活性劑，該界面活性劑係陰離子性界面活性劑。
(4)如(3)所記載的方法，其中，上述前處理步驟係在加熱條件下實施。
(5)一種甲狀腺球蛋白之免疫分析用試藥，係具備含有界面活性劑及酸化劑中之任一者或雙方的前處理液。
根據本發明，可提供即便含有抗甲狀腺球蛋白抗體(TgAb)的活體樣本中，藉由使甲狀腺球蛋白(Tg)從TgAb中游離，而降低相互作用影響，便可更正確測得樣本中所含Tg量的Tg之測定方法及測定試藥。
圖1係酸性化前處理樣品與未處理樣品的Tg測定結果比較圖。
圖2係酸性化前處理樣品與未處理樣品的Tg測定結果比較圖。
圖3係針對由酸性化前處理樣品與未處理樣品所獲得Tg測定結果有出現乖離的血清檢體，將經酸性化的樣品與未處理的樣品提 供給凝膠過濾管柱的色層分析圖。
圖4係針對於由酸性化前處理樣品與未處理樣品所獲得Tg測定結果，並沒有出現差異的血清檢體，將經酸性化的樣品與未處理的樣品提供給凝膠過濾管柱的色層分析圖。
圖5係酸性化前處理液的酸濃度、與檢體Tg測定值的相關圖。
圖6係SDS前處理樣品與未處理樣品的Tg測定結果比較圖。
圖7係SDS前處理樣品與未處理樣品的Tg測定結果比較圖。
本說明書中所記載的「%」濃度，在無特別聲明前提下，係表示重量/體積(w/v)濃度。
本發明所測定的甲狀腺球蛋白(Tg)，係源自任意動物的Tg，較佳係源自哺乳動物(例如：人類、猴子、黑猩猩等靈長類；小鼠、大鼠、兔子等囓齒類；狗、貓等寵物動物；豬、牛等家畜；馬、羊等役用動物)的Tg，更佳係源自靈長類的Tg，特佳係源自人類的Tg。
1.前處理步驟
本發明方法係利用使活體樣本與抗體進行反應的免疫反應，而測定活體樣本中所存在Tg的方法，特徵在於包括有：在免疫反應(反應步驟)之前，施行將活體樣本與前處理液予以混合的前處理步驟。藉由前處理步驟，便可使Tg呈現從自體抗體(TgAb)等之中游離的狀態。前處理液係可含有界面活性劑或酸化劑中之任一者、亦 可雙方均含有。較佳前處理液係含有界面活性劑或酸化劑中任一者。
上述前處理步驟中進行混合的活體樣本與前處理液之體積比較佳係1：10~10：1、更佳係1：5~5：1、特佳係1：3~3：1。本發明所使用的活體樣本係在能獲得含有Tg的樣本前提下，其餘並無特別的限定，可例如：血清、血漿、全血、尿、糞便、口腔黏膜、咽黏膜、腸黏膜及活組織樣本(例如：甲狀腺穿刺吸引細胞學檢查(Fine needle aspiration：FNA)樣本、腸管樣本、肝臟樣本)。較佳的活體樣本係血清或血漿。
上述前處理液中所含的界面活性劑係可使用例如：陰離子性界面活性劑、陽離子性界面活性劑、兩性離子性界面活性劑、非離子性界面活性劑中之任一者，特別較佳係陰離子性界面活性劑。陰離子性界面活性劑較佳係可使用例如：十二烷基硫酸鈉(SDS)、N-月桂醯基肌胺酸、十二烷基硫酸鋰、十二烷基苯磺酸鈉、去氧膽酸(deoxycholic acid)等，特別較佳係可使用SDS。界面活性劑的濃度必需設為能使Tg從TgAb等之中游離的充分濃度。使用SDS時，則與活體樣本進行混合的混合液，在前處理時的濃度較佳係0.1~12.5%、更佳係0.25~10%、特佳係0.5~7.5%。藉由將SDS濃度設為0.1~10%，便可達使Tg充分游離、且不易發生SDS析出等情形的效果。
當將前處理液中所含的主要界面活性劑設為陰離子性界面活性劑時，則在前處理後，為減輕被夾帶入反應系統中的陰離子界面活性劑所造成影響，亦可單獨添加陽離子性界面活性劑、兩性離子性界面活性劑、非離子性界面活性劑，或添加含有該等複 數種的中和液。
上述前處理液中所含的酸化劑係可適當使用鹽酸、硫酸、醋酸等。當有使用酸化劑時，前處理液的酸當量濃度係前處理時的濃度較佳設為超過0.05N且0.5N以下、更佳係0.1N以上且0.4N以下。藉由酸的當量濃度設為超過0.05N且0.5N以下，便可充分獲得前處理的效果，且可將對後段反應步驟的影響最小化。
當前處理有使用酸化劑時，為能再與活體樣本進行混合時不會發生沈澱情形，最好添加陽離子性界面活性劑。陽離子性界面活性劑較佳係同分子中具有碳數10個以上之單鏈烷基、與三級胺或四級銨鹽的陽離子性界面活性劑。此種界面活性劑例係可舉例如：氯化癸基三甲銨、氯化十二烷基三甲銨、氯化十四烷基三甲銨、氯化十六烷基三甲銨(C16TAC)、溴化癸基三甲銨、溴化十二烷基三甲銨、溴化十四烷基三甲銨、溴化十六烷基三甲銨(CTAB)、氯化月桂基吡啶鎓、氯化十四烷基吡啶鎓、氯化鯨蠟吡啶(cetylpyridinium chloride，CPC)等。陽離子界面活性劑的添加量，係與檢體混合時的濃度較佳設為0.1%以上且15%以下、更佳係0.5%~10%。
在含有酸化劑的前處理液中，除添加上述陽離子性界面活性劑之外，尚亦可含有非離子性界面活性劑等其他界面活性劑。藉由其他界面活性劑的添加，便可更高感度地檢測Tg。
在前處理液中亦可更進一步使用還原劑。還原劑係可使用2-(二乙胺基)乙硫醇鹽酸鹽(DEAET)、三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)、二硫蘇糖醇(DTT)、2-巰基乙醇等現有還原劑之任一者，就從在溶液中的安定性理由，較佳係可使用DEAET、TCEP。還原 劑的濃度，就與活體樣本混合的混合液最終濃度較佳係0.5~100mM、更佳係1.0~50mM、特佳係2.0~20mM。
在前處理液中，視需要亦可含有脲、硫脲等其他的蛋白質改質劑。改質劑的濃度，較佳係處理時濃度達0.1M以上、更佳係0.5M以上且未滿4M。又，在前處理液中，為增強處理效果，亦可添加單醣類、雙醣、檸檬酸及檸檬酸鹽類中之任一者、或該等的組合。又，在前處理液中亦可含有EDTA等螯合劑。
前處理步驟最好在將活體樣本與前處理液進行混合後，更進一步施行加熱。特別係當前處理液有使用界面活性劑時，為能提高其效果，最好施行加熱。加熱溫度較佳係設為35~95℃、更佳係50~90℃、特佳係70~85℃。又，加熱時間較佳係設為1分鐘以上、更佳係3分鐘以上、特佳係5分鐘以上。加熱時間的上限並無特別存在，通常設為60分鐘以下、較佳係30分鐘以下的加熱時間。
2.反應步驟
依照本發明方法的上述前處理步驟所獲得活體樣本混合液，將提供給接著進行的免疫分析之反應步驟。在反應步驟中，使活體樣本混合液與緩衝液進行混合，便使混合液中的抗原對Tg的抗體進行反應。另外，Tg的免疫分析自體已知有各種方法，舉凡能定量Tg的任何免疫分析均可採用。
上述緩衝液係可舉例如以MES緩衝液、磷酸緩衝液、Tris緩衝液、碳酸緩衝液為基質者，特別較佳係可使用以磷酸緩衝液為基質者。當前處理液係使用含有界面活性劑者的情況，為 能吸收未反應的界面活性劑，較佳係使用例如：BSA、聚乙烯吡咯啶酮(PVP)、聚乙烯醇(PVA)葡聚糖硫酸鈉等水溶性高分子，在與經前處理後的混合液進行混合時，含有最終濃度0.01~10.0%、較佳係0.05~5.0%左右的緩衝液。又，當前處理液係使用含有酸化劑者的情況，最好使用含有鹼劑、或具有能緩和前處理液酸影響之緩衝能力的緩衝液。前處理步驟的混合液與緩衝液之混合，依體積比計，較佳係1：10~10：1、更佳係1：5~5：1、特佳係1：3~3：1。
本發明方法所使用Tg的抗體係將Tg的胺基酸排列中之至少其中一部分，辨識為抗原決定位的抗體。Tg的抗體並無特別的限定，可任意使用已知辨識抗原決定位的抗體，較佳的Tg之抗體係辨識Tg特異性抗原決定位(特別係人類Tg特異性抗原決定位)的抗體。
Tg的抗體係可任意使用多株抗體或單株抗體。Tg的抗體亦可為免疫球蛋白(例如：IgG、IgM、IgA、IgD、IgE、IgY)的任一同型(isotype)。Tg的抗體尚亦可為全長抗體(full length antibody)。所謂「全長抗體」係指具備分別含有可變區與恆定區的重鏈及輕鏈之抗體(例如含有2個Fab部分與Fc部分的抗體)。Tg的抗體尚亦可為由此種全長抗體所衍生的抗體片段。抗體片段係全長抗體的其中一部分，例如恆定區缺失抗體(例如：F(ab')2、Fab'、Fab、Fv)。Tg的抗體尚亦可為單鏈抗體等修飾抗體。
Tg的抗體係可使用習知的公知方法製作。例如Tg的抗體係可將上述抗原決定位使用為抗原進行製作。又，因為如上述辨識抗原決定位的Tg之多數抗體已有市售，因而亦可使用此種市售物。
Tg的抗體係可固相化為固相。本說明書中，亦將經固相化為固相的抗體簡稱為「固相化抗體」。固相係可例如能收容或搭載液相的固相(例如：培養盤、透膜、試驗管等支撐體；以及孔培養盤、微通道、玻璃毛細管、奈米柱、整體管柱(monolithic column)等容器)、以及可懸浮或分散於液相中的固相(例如：粒子等固相載體)。固相的材料係可例如：玻璃、塑膠、金屬及碳。固相的材料尚亦可使用非磁性材料或磁性材料，就從操作簡便性等觀點，較佳係磁性材料。固相較佳係固相載體、更佳係磁性固相載體、特佳係磁性粒子。抗體的固相化方法係可利用習知的公知方法。此種方法係可例如：物理性吸附法、共價鍵法、利用親和性物質(例如生物素、鏈親和素)的方法及離子鍵法。就特定實施形態而言，Tg的抗體係經固相化為固相的抗體、較佳係經固相化為磁性固相的抗體、更佳係經固相化為磁性粒子的抗體。
反應步驟係可在使前處理步驟的混合液與緩衝液進行混合後，才接觸經固相化的抗體，又亦可預先在緩衝液中加入例如經固相化呈粒子狀的抗體而形成粒子液，然後再使上述混合液與粒子液進行混合。反應步驟係可僅利用如免疫凝聚法、競爭法之類的一次反應步驟實施，亦可設計如三明治法之類的二次反應步驟。另外，設計二次反應步驟的情況，亦可在一次反應步驟與二次反應步驟之間，設計為除去未反應成分用的洗淨步驟。
Tg的抗體係可利用標記物質施行標記化。本說明書中，經歷用標記物質施行標記化的抗體，亦簡稱「標記化抗體」。標記物質係可舉例如：酵素(例如：過氧化酶、鹼性磷酸酶、螢光素酶、β-半乳糖苷酶)、親和性物質(例如：鏈親和素、生物素)、 螢光物質或蛋白質(例如：螢光黃、螢光異硫氰酸鹽(fluorescein isothiocyanate，FITC)、玫瑰紅、綠色螢光蛋白質、紅色螢光蛋白質)、發光或吸光物質(例如：螢光素、水母素(aequorin)、阿地溴銨(aclidinium)、釕)、放射性物質(例如：3H、14C、32P、35S、125I)。又，當本發明方法有設計二次反應的情況，二次反應中所使用的抗體亦可利用此種標記物質施行標記化。
就特定的實施形態而言，本發明方法在二次反應中所使用的抗體，係包括有辨識不同於Tg抗體之抗原決定位的Tg其他抗體。辨識此種其他抗體的抗原決定位詳細內容，係同上述相關Tg的抗體所詳述抗原決定位(但，併用的情況，抗原決定位種類不同)。利用Tg的抗體辨識的抗原決定位、與利用Tg其他抗體辨識的抗原決定位之組合，並無特別的限定。此種其他抗體的使用較佳係例如利用三明治法的情況。
3.檢測步驟
當一級抗體或二級抗體有使用標記的情況，利用適於所使用標記的方法(例如使用酵素標記的情況，便添加酵素基質)，便可進行檢測。例如當將鹼性磷酸酶(ALP)使用為標記抗體時，便可設為將3-(2'-螺金剛烷)-4-甲氧基-4-(3'-磷氧醯)苯基-1,2-二氧烷‧2鈉鹽(AMPPD)，使用為酵素基質的化學發光酵素免疫分析法(CLEIA)系統。
本發明方法係使用Tg的抗體之免疫分析。此種免疫分析係可例如：直接競爭法、間接競爭法及三明治法。又，此種免疫分析係可舉例如：化學發光酵素免疫分析法(CLEIA)、化學發光 免疫分析(CLIA)、免疫比濁法(TIA)、酵素免疫分析法(EIA)(例如：直接競爭型ELISA、間接競爭型ELISA及三明治ELISA)、放射性免疫分析(RIA)、乳膠凝聚反應法、螢光免疫分析(FIA)及免疫層析試紙分析法。該等免疫分析自體已為周知，此處雖無詳述的必要，但分別簡單說明。
直接競爭法係將待測定標靶抗原(本發明為Tg)的抗體，施行固相化為固相(相關固相及固相化，如上述)，經施行防止非特異吸附的阻斷處理(利用血清白蛋白等蛋白質溶液處理固相)後，使該抗體、與含有上述標靶抗原(target antigen)的受檢樣本(本發明係如上述，經施行前處理步驟的活體樣本)、以及一定量經標記的抗原(標記係如上述)進行反應，經洗淨後，在將結合於固相的標記施行定量之方法。因為受檢樣本中的抗原與標記抗原係競爭性結合於抗體，受檢樣本中的抗原量越多，則固相所結合的標記量越少。製作各種已知濃度的抗原標準液，分別固定化為固相，再測定標記量(配合標記性質的吸光度、發光強度、螢光強度等，以下亦同)，製作橫軸為抗原濃度、縱軸為標記量的檢量線。針對未知的受檢樣本測定標記量，藉由所測得標記量擬合於檢量線，便可測定未知受檢樣本中的抗原量。直接競爭法自體在此領域中已屬周知，例如US 20150166678 A1所記載。
間接競爭法係將標靶抗原(本發明中為Tg)施行固相化為固相(相關固相及固相化，係同上述)。接著，經施行固相的阻斷處理後，再將含標靶抗原的受檢樣本(本發明中，如上述係經施行前處理步驟過的活體樣本)、以及一定量的抗靶抗原抗體予以混合，再與上述固相化抗原進行反應。經洗淨後，再將結合於固相上 的上述抗靶抗原抗體施行定量。此係藉由使對上述抗靶抗原抗體標記過的二級抗體(secondary antibody)(標記係如上述)進行反應，經洗淨後，再測定標記量便可實施。製作各種已知濃度的抗原標準液，分別施行固定化為固相，再測定標記量，便製成檢量線。相關未知的受檢樣本，測定標記量，藉由將所測得標記量擬合於檢量線，便可測定未知受檢樣本中的抗原量。另外，亦可未使用標記二級抗體，而是使用經標記過的一級抗體(primary antibody)。間接競爭法自體在此領域中已屬周知，例如上述US 20150166678 A1所記載。
三明治法係將抗靶抗原抗體固相化成固相(相關固相及固相化，係如上述)，經阻斷處理後，使含有標靶抗原的受檢樣本(本發明係如上述，經施行前處理步驟過的活體樣本)進行反應，經洗淨後，再使對標靶抗原標記的二級抗體(標記係如上述)進行反應，經洗淨後，再將固相上所結合的標記進行定量之方法。製作各種已知濃度的抗原標準液，分別測定經固定化為固相的標記量，而製成檢量線。相關未知的受檢樣本，測定標記量，藉由將所測得標記量擬合於檢量線，便可測定未知受檢樣本中的抗原量。三明治法自體在此領域中已屬周知，例如US 20150309016 A1所記載。
上述各種免疫分析中，化學發光酵素免疫分析法(CLEIA)、化學發光免疫分析(CLIA)、酵素免疫分析法(EIA)、放射性免疫分析(RIA)、螢光免疫分析(FIA)係屬於根據施行上述直接競爭法、間接競爭法、三明治法等之時所使用的標記種類，進行分類之免疫分析。化學發光酵素免疫分析法(CLEIA)係標記使用酵素(例如上述鹼性磷酸酶)、而基質係使用生成化學發光性化合物的基質 (例如上述的AMPPD)之免疫分析。酵素免疫分析法(EIA)係標記使用酵素(例如上述的過氧化酶、鹼性磷酸酶、螢光素酶、β-半乳糖苷酶等)之免疫分析。各酵素的基質係使用利用吸光度測定等便可定量的化合物。例如過氧化酶的情況，便使用1,2-苯二胺(OPD)、3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)等；當鹼性磷酸酶的情況，便使用p-硝化苯基磷酸鹽(pNPP)等；當β-半乳糖苷酶的情況，便使用MG：4-甲基繖形基半乳糖苷(4-methyl umbelliferyl galactoside)、NG：硝化苯基半乳糖苷等；當螢光素酶的情況，便使用螢光素(luciferin)等。放射免疫分析(radioimmunoassay，RIA)係標記使用放射性物質的方法，而放射性物質係如上述，可例如：3H、14C、32P、35S、125I等放射性元素。螢光免疫分析(FIA)係標記使用螢光物質或螢光蛋白質(fluorescent protein)的方法，而螢光物質或螢光蛋白質係如上述，可例如：螢光黃、螢光異硫氰酸鹽、玫瑰紅、綠色螢光蛋白質、紅色螢光蛋白質等。使用該等標記的免疫分析自體在此領域中已屬周知，例如US 8039223 B、US 20150309016 A1所記載。
免疫比濁法(TIA)係利用由待測定標靶抗原(本發明為Tg)、與該抗原的抗體之抗原抗體反應，所生成的抗原抗體複合物會增加濁度之現象的免疫分析。在抗靶抗原抗體溶液中添加各種已知濃度的抗原，分別測定濁度而製成檢量線。針對未知的受檢樣本，同樣地測定濁度，藉由將所測得濁度擬合於檢量線，便可測定未知受檢樣本中的抗原量。免疫比濁法自體已屬周知，例如US 20140186238 A1所記載。乳膠凝聚法係類似免疫比濁法，只是取代免疫比濁法中的抗體溶液，改為使用表面經固定化有抗靶抗原抗體的乳膠粒子浮游液之方法。免疫比濁法及乳膠凝聚法自體在此領域 中已屬周知，例如US 820,398 B所記載。
免疫層析試紙分析法係在例如：濾紙、纖維素透膜、玻璃纖維、不織布等由多孔性材料所形成的基體(亦稱「間質」或「試條」(strip))上，施行上述三明治法、競爭法的方法。例如當利用三明治法施行免疫層析試紙分析法時，在上述基體上設計將抗靶抗原抗體固定化的檢測區，在基體中添加含有標靶抗原的受檢樣本(本發明中，如上述，經施行前處理步驟過的活體樣本)，從上游側流入展開液，使標靶抗原移動至檢測區，而固定化於檢測區。將經固定化的標靶抗原，利用經標記的二級抗體形成三明治，藉由檢測檢測區中之經固定化的標記，而檢測受檢樣本中的標靶抗原。藉由在較檢測區更靠上游側形成含有標記二級抗體的標記區，便可將標靶抗原與標記二級抗體的結合體固定化於檢測區。當標記係酵素的情況，在較檢測區更靠上游側亦設計含有酵素基質的基質區。競爭法的情況，例如將標靶抗原固定化於檢測區，便可使受檢樣本中的標靶抗原、與檢測區中固定化的標靶抗原進行競爭。在較檢測區更靠上游側設計標記抗體區，使受檢樣本中的標靶抗原與標記抗體進行反應，而將未反應的標記抗體固定化於檢測區，並檢測(或定量)標記，便可檢測(或定量)受檢樣本中的標靶抗原。免疫層析試紙分析法自體在此領域中已屬周知，例如US 6210898 B所記載。
本發明Tg之測定試藥，係能實現上述Tg之測定方法的測定試藥。本發明之測定試藥係除通常免疫分析時所使用構成之外，特徵在所含有構成成分係含有界面活性劑及酸化劑中之任一者或雙方 的前處理液。
本發明的試藥係依相互隔離的形態或組成物形態含有各構成成分。具體而言，各構成成分係可依分別收容於不同容器(例如：試管、培養盤)的形態提供，亦可其中一部分構成成分係依組成物形態(例如同一溶液中)提供。或者，本發明的試藥亦可依裝置形態提供。具體而言，構成成分全部可依收容於裝置中的形態提供。或者，構成成分其中一部分依收容於裝置中的形態提供，而其餘部分則依未收容於裝置中的形態(例如：收容於不同容器的形態)提供。此情況，未被收容於裝置中的構成成分亦可藉由在進行標的物質測定時注入於裝置中而使用。
較佳實施形態，本發明的試藥亦可具有配合待採用免疫分析種類的構成。例如採用三明治法的情況，本發明試藥的必要構成成分係可含有：i)前處理液、ii)Tg的抗體、iii)緩衝液，以及任意構成成分的iv)Tg的其他抗體、v)標記物質、vi)稀釋液及視需要的vii)與標記物質產生反應的基質。ii)與iii)的構成成分亦可含於同一溶液中。iv)的構成成分亦可利用v)標記物質進行標記化。較佳Tg的抗體亦可被固相化為磁性粒子。
(1)抗甲狀腺球蛋白抗體培養盤之製作
在聚苯乙烯製96孔微孔培養盤(Nunc公司製)中，依100μL/孔分注入含有抗Tg小鼠抗體5F9(AbD Serotec公司製)5μg/mL的抗體稀釋液(0.1M碳酸氫鈉、0.1M氯化鈉、pH9.6)，在4℃下施行一夜 培養。微孔培養盤利用PBS洗淨3次，接著依200μL/孔分注入阻斷液(含1.0% BSA、3%蔗糖、0.05% ProClin(註冊商標)300的PBS)，在室溫下施行2小時培養。經除去阻斷液後，培養盤經真空乾燥，便成為抗Tg抗體培養盤。
(2)檢體前處理
針對45例甲狀腺相關疾病的患者血清檢體，分別各50μL與酸性化前處理液(2.5M脲、0.42M鹽酸、0.08M檸檬酸水合物、2.5%麥芽糖、10.0% CTAB、4.9% Triton X-100(商品名))50μL進行混合，依37℃加熱6分鐘。接著，添加緩衝液(500mM Tris-HCl、200mM NaCl、EDTA3Na、10.0% BSA、50μg/mL小鼠IgG、pH9.2)100μL，成為酸性化前處理樣品。
針對相同檢體，另外將各50μL添加於由酸性化前處理液50μL與緩衝液100μL混合的混合液(中和液)150μL中，成為未處理樣品。
已知濃度的精製人類Tg(BBI solutions公司製)利用TgAb陰性血清稀釋，製備成0、10、50、200、400ng/mL的標準液。針對各標準液亦是依照上述同樣方法製備酸性化前處理樣品與未處理樣品。
(3)檢體中的Tg測定
將各酸性化前處理樣品與各未處理樣品，各150μL分注入抗Tg抗體培養盤中，在室溫下施行1小時培養(一次反應)。利用洗淨液(0.05% Tween20/PBS)洗淨5次後，分注入100μL/孔的二級抗體 液[其係由生物素化抗Tg抗體5E6(AbD Serotec公司製)，經利用二次反應液(24mM磷酸二氫鉀、76mM磷酸氫二鉀、1.0% BSA、1.0% PVP、0.05%酪蛋白鈉、0.05% Tween20、0.05%氯化鈉、20mM EDTA2Na、0.1% ProClin300(註冊商標)、pH7.0)稀釋成2μg/mL的二級抗體液]，在室溫下進行1小時反應(二次反應)。利用洗淨液洗淨5次後，依100μ/孔分注入經利用二次反應液稀釋10000倍的HRP標記鏈親和素(Roche公司製)液，在室溫下進行30分鐘反應。利用洗淨液施行5次洗淨後，再依100μL/孔分注入TMB基質液(Nacalai Tesque公司製)，在室溫中靜置於昏暗地方15分鐘。分注1N硫酸100μL/孔而使反應停止，測定各孔的450nm/630nm吸光度。各檢體的Tg測定值係根據分別使用酸性化前處理標準液、未處理標準液製成的檢量線計算出。呈現較0ng/mL標準液更低吸光度的檢體全部均設為0ng/mL。
另外，各檢體的TgAb值係使用「LUMIPULSE(註冊商標)TgAb」(富士麗比歐公司製)測定。
(4)結果
各檢體與標準液的酸性化前處理樣品及未處理樣品之測定結果，如表1所示。又，酸性化前處理檢體與未處理檢體的測定值全體相關性，如圖1所示，特別係低吸光度區域的相關性係如圖2所示。特別係TgAb高值的未處理檢體雖有出現低於0ng/mL吸光度的傾向，但利用前處理便會提升吸光度。截至此暗示著針對原本無法進行Tg測定的檢體已變成可測定。
針對實施例1經利用前處理而增加測定值的No.6檢體、與利用前處理但測定值沒有變化的No.13檢體，製備未處理樣品、酸性化前處理樣品，施行凝膠過濾色層分析(GFC)。
未處理樣品係將各檢體100μL與中和液300μL混合而製備。酸性化前處理樣品係將各檢體100μL與酸性化前處理液100μL混合，依37℃加熱6分鐘後，添加緩衝液200μL而製備。該等樣品利用0.45μm孔的過濾器施行過濾後，使250μL通過凝膠過濾管柱。
分離條件
管柱：Superose6 10/30(商品名)
分離緩衝液：PBS,0.08% CHAPS,0.05% Tween20(商品名)，1mM EDTA2Na,pH7.4
流速：0.5mL/分
回收範圍：4mL~24mL(0.5mL/分層)
針對所回收的各分層，在未再度施行前處理情況下，依照與實施例1同樣的ELISA法施行Tg測定。
順便亦針對蛋白質分子量標記(GE公司製、含甲狀腺球蛋白)，依照相同的條件提供進行凝膠過濾，並測定UV吸收。
No.6檢體的各分層測定結果如圖3所示，No.13檢體的各分層測定結果如圖4所示。相關No.6檢體，針對未處理樣品係在較Tg更高分子區域有出現微量的Tg測定值尖峰，相對於此，酸性化前處理樣品則在與Tg相同分子量區域有出現Tg測定值尖峰。另一方面，相關No.13檢體，未處理樣品與酸性化前處理樣品均係在與Tg相同分子量區域有出現Tg測定值尖峰。酸性化處理樣品可認為受酸的影響而導致訊號降低。由該等結果暗示：利用前處理而導致測定值增加的No.6檢體之未處理樣品，甲狀腺球蛋白將會與TgAb等形成複合體而高分子化，導致在Tg測定系統中的反應性降低，相對的，利用酸性化前處理導致Tg從複合體中游離，造成在Tg測定系統中的反應性亦獲提升。
針對酸性化前處理時所使用酸化劑的最佳濃度進行研究。針對TgAb陽性且對Tg測定值的TgAb影響(干擾)較弱之No.13、No.16檢體，以及TgAb陽性且TgAb干擾較強的No.19、No.44檢體，及TgAb陰性的No.25、No.30之檢體等合計6個檢體，分別各50μL，與除所含鹽酸設為2N、1N、0.8N、0.6N、0.4N、0.2N、0.1N、0.05N、 0.025N、0N以外，其餘均依照與實施例1的酸性化前處理液同樣方法所製備的酸性化前處理液50μL進行混合，依37℃加熱6分鐘。接著，添加與上述鹽酸等量的氫氧化鈉溶液100μL而中和。在經中和後的溶液中添加與實施例1同樣的二次反應液200μL，成為酸性化前處理樣品。針對各酸性化前處理樣品提供進行與實施例1同樣的ELISA法，獲得450nm/630nm吸光度數據。
各樣品的吸光度數據係如表2與圖5所示。TgAb陰性檢體與TgAb競爭較弱的檢體，有出現隨前處理液的酸化劑濃度提高，則吸光度降低的傾向。此現象可認為受酸影響而導致出現Tg改質，以及受中和時所生成鹽的影響導致抑制抗原抗體反應的要因所致。但是，針對TgAb競爭較強的2個檢體，雖在酸化劑濃度較高的區域呈現吸光度降低，但在酸化劑濃度0.1N條件下，吸光度較沒有酸化劑的狀態更獲提升。又，在酸化劑濃度超過0.05N的條件下，呈現與TgAb影響較小的其他檢體同等吸光度，且隨酸性化濃度上升，將與其他檢體同樣的出現吸光度降低。另一方面，若酸化劑濃度超過0.5N，則吸光度會降低至空白附近，全體陷於Tg測定困難狀態。
依上述，得知為使TgAb干擾較強的檢體，能與其他檢體同樣地進行測定，則酸性化前處理液的酸化劑較佳係前處理時濃度設為超過0.05N且0.5N以下、更佳係0.1N以上且0.4N以下。
針對51例甲狀腺相關疾病的患者血清檢體，分別將各50μL與SDS前處理液(347mM SDS、2mM EDTA2Na、10mM Tris-HCl、pH7.2)100μL混合，在1000rpm震盪條件下，依80℃加熱5分鐘。接著，利用中和液(1.2% C16TAC、4% CHAPS、2.9% Tween20(商品名))稀釋4倍，在室溫中進行30分鐘培養後，於15℃、12000rpm條件下施行15分鐘離心分離，將所獲得上澄液當作SDS前處理樣品。同時，針對相同檢體，除取代前處理液，改為使用PBS100μL，且未施行加熱之外，其餘施行與上述SDS前處理同樣的處理，將所獲得樣品當作未處理樣品。已知濃度的精製人類Tg(BBI solutions公司製)利用TgAb陰性血清稀釋，製備成0、6、30、60、300、600、2400、4800ng/mL的標準液。針對各標準液亦是依照與上述同樣的方法製備SDS前處理樣品與未處理樣品。
SDS前處理樣品及未處理檢體各100μL，分別與緩衝 液(50mM Tris、150mM NaCl、1mM EDTA2Na、6.0% BSA、0.05% ProClin300(註冊商標)、pH7.2)100μL混合後，各150μL分注入依照與實施例1同樣的方法所製備的抗Tg抗體培養盤中。在室溫下進行2小時培養。利用洗淨液(0.05% Tween20(商品名)/PBS)洗淨5次後，分注入100μL/孔的二級抗體液[其係生物素化抗Tg抗體5E6(AbD Serotec公司製)，經利用二次反應液(24mM磷酸二氫鉀、76mM磷酸氫二鉀、1.0% BSA、1.0% PVP、0.05%酪蛋白鈉、0.05% Tween20(商品名)、0.05%氯化鈉、20mM EDTA2Na、0.1% ProClin300(註冊商標)、pH7.0)稀釋為2μg/mL的二級抗體液]，在室溫中進行1小時反應(二次反應)。利用洗淨液施行5次洗淨後，分注100μL/孔之經二次反應液稀釋10000倍的HRP標記鏈親和素(Roche公司製)液，在室溫中進行30分鐘反應。利用洗淨液施行5次洗淨後，分注100μL/孔的TMB基質液(Nacalai Tesque公司製)，在室溫中，於昏暗地方靜置15分鐘。100μL/孔分注1N硫酸而使反應停止，測定各孔的450nm/630nm吸光度。各檢體的Tg測定值係根據分別使用酸性化前處理標準液、未處理標準液所製成的檢量線計算出。呈現較0ng/mL標準液更低吸光度的檢體全部均設為0ng/mL。
另外，各檢體的TgAb值係使用「LUMIPULSE(註冊商標)TgAb」(富士麗比歐公司製)測定。
各檢體及標準液的SDS前處理樣品與未處理樣品之測定結果，如表3所示。又，酸性化前處理檢體與未處理檢體的測定值全體相關性如圖6所示，特別係低吸光度區域的相關性係如圖7所示。特別係TgAb高值的未處理檢體雖呈現0ng/mL附近吸光度 的檢體較多，但利用前處理便使該等吸光度上升，暗示假低值獲改善。
Claims (5)
- 一種方法，係利用免疫分析測定從活體中分離出的樣本中之甲狀腺球蛋白，包括有：將從活體中分離出的樣本、與含有界面活性劑及酸化劑中之任一者或雙方的前處理液予以混合之前處理步驟。
- 如請求項1之方法，其中，上述前處理液係含有酸化劑，前處理步驟中的酸化劑之最終濃度係超過0.05N且0.5N以下。
- 如請求項1之方法，其中，上述前處理液係含有界面活性劑，該界面活性劑係陰離子性界面活性劑。
- 如請求項3之方法，其中，上述前處理步驟係在加熱條件下實施。
- 一種甲狀腺球蛋白之免疫分析用試藥，係具備含有界面活性劑及酸化劑中之任一者或雙方的前處理液。
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