CN110514850B - 一种血型抗体复合物、制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种血型抗体复合物,结构为血型抗体Ⅰ‑桥联二抗‑血型抗体Ⅱ。本发明还提供一种制备如上所述的血型抗体复合物的方法,包括如下步骤:S1、选择两个来源于同一生物种属的抗体,即血型抗体Ⅰ和血型抗体Ⅱ;S2、根据血型抗体Ⅰ和血型抗体Ⅱ的种属来源,选择能够同时与血型抗体Ⅰ和血型抗体Ⅱ发生特异性结合的桥联二抗;S3、将血型抗体Ⅰ、血型抗体Ⅱ、桥联二抗按克分子当量数1:1:1混合均匀,室温放置15‑30分钟,制得结构为血型抗体Ⅰ‑桥联二抗‑血型抗体Ⅱ的复合物。本发明所提供的血型抗体复合物的制备方法,利用抗体和其特异性抗体之间特异识别性,可以增加血型抗体的特异性或提高血型抗体的亲合性、效价,操作简单,快捷,应用广泛。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,尤其涉及一种提一种血型抗体复合物及制备方法。
背景技术
抗体的免疫反应能力包括三个方面:抗体效价、抗体亲合性、抗体特异性。“抗体效价”是生物学名词,是用抗体的物理状态及其在体内的滞留时间,以其与抗原反应的多少来表示其免疫效果的一种反应,通俗讲表示抗体可以被检测出来的最大稀释倍数。“抗体亲合性”指抗体分子与整个抗原之间的结合程度。“抗体特异性”是指抗体对于抗原的特定表位的选择性识别。
血型抗体要应用于临床血型检测工作中,其效价和亲合性是非常重要的指标。要提高血型抗体的效价和亲合性,通常采用的方法是筛选分泌高效价高亲合性抗体的细胞株,或者添加杂交瘤诱生的小鼠腹水。筛选分泌高效价高亲合性抗体的细胞株需要采用淋巴细胞杂交瘤技术,不断地重复融合、克隆和筛选过程,这种方法费时费力,效率很低,但是得到的细胞株比较稳定,抗体生物活性较好。而用杂交瘤诱生的小鼠腹水,虽然其效价很高,但是由于其成份复杂,小鼠体内的自然抗体可能与人ABO系统存在交叉反应,用其检查血型时会导致假阳性,再者应用小鼠腹水时,成本大,产量和质量不稳定,不适于大量生产。此外,由于抗D目前只有人源的,尚没有用杂交瘤技术研制出来鼠源单克隆抗D,其人源的本质限制了很难筛选分泌高效价高亲合性抗体的细胞株,也无法制备小鼠腹水。
在检测疑难样本的时候,例如正反定型不相符,怀疑存在弱A或者弱B抗原,或者检测新生儿血型时由于新生儿的红细胞上抗原性很弱,单用抗A或抗B不容易检测到,需要结合用到抗AB抗体。但是抗AB抗体较难得到,一般是通过淋巴细胞杂交瘤技术,通过融合、克隆和筛选得到和A型、B型、AB型红细胞反应,和O型红细胞不反应的抗AB抗体。但是这种方法随机性较大,费时费力,效率很低。
发明内容
为了克服现有技术的不足,本发明的一个目的是提供一种血型抗体复合物,所述血型抗体复合物的结构为血型抗体Ⅰ-桥联二抗-血型抗体Ⅱ。当血型抗体Ⅰ和血型抗体Ⅱ为不同的抗体时,结构为血型抗体Ⅰ-桥联二抗-血型抗体Ⅱ的复合物相对于血型抗体Ⅰ或血型抗体Ⅱ而言,既具有血型抗体Ⅰ的特异性,又具有血型抗体Ⅱ的特异性,特异性增加。当血型抗体Ⅰ和血型抗体Ⅱ为相同的抗体时,结构为血型抗体Ⅰ-桥联二抗-血型抗体Ⅱ的复合物相对于血型抗体Ⅰ/血型抗体Ⅱ而言,复合物抗体的效价和亲合性高于血型抗体Ⅰ/血型抗体Ⅱ。
为了实现上述目的,本发明通过以下技术方案实现。
本发明提供的一种血型抗体复合物,所述血型抗体复合物的结构为血型抗体Ⅰ-桥联二抗-血型抗体Ⅱ;其中,所述血型抗体Ⅰ和所述血型抗体Ⅱ来源于同一生物种属。
优选地,所述生物包括但不限于鼠、鸡、兔、人、羊驼生物。
优选地,所述血型抗体Ⅰ和血型抗体Ⅱ包括但不限于鼠源单抗、鸡源寡抗、兔源单抗、人源单抗、羊驼源单抗。
优选地,所述桥联二抗的种属来源与血型抗体Ⅰ和血型抗体Ⅱ的种属来源不同。
优选地,所述桥联二抗包括但不限于抗鼠多抗、抗鸡多抗、抗兔多抗、抗人多抗、抗羊驼多抗。
优选地,血型抗体Ⅰ和血型抗体Ⅱ为来源于同一生物种属的不同的血型抗体。
优选地,血型抗体Ⅰ和血型抗体Ⅱ为来源于同一生物种属的相同的血型抗体。
优选地,所述血型抗体Ⅰ和所述血型抗体Ⅱ包括但不限于抗A血型单抗、抗B血型单抗、抗RhD血型单抗和多抗。
本发明的第二个目的提供一种制备如上所述的血型抗体复合物的方法,选择来源于同一生物种属的不同抗体或相同抗体,即血型抗体Ⅰ和血型抗体Ⅱ,根据血型抗体Ⅰ和血型抗体Ⅱ的种属来源(如鼠源)确定所需的二抗(如羊抗鼠或兔抗鼠等);将血型抗体Ⅰ、血型抗体Ⅱ和二抗按克分子当量数1:1:1混匀;室温15-30分钟,制得结构为血型抗体Ⅰ-桥联二抗-血型抗体Ⅱ的复合物。
本发明所提供的一种制备如上所述的血型抗体复合物的方法,包括如下步骤:
S1、选择两个来源于同一生物种属的血型抗体,即血型抗体Ⅰ和血型抗体Ⅱ;
S2、根据血型抗体Ⅰ和血型抗体Ⅱ的种属来源,选择不同于血型抗体Ⅰ和血型抗体Ⅱ的种属来源且能够同时与血型抗体Ⅰ和血型抗体Ⅱ发生特异性结合的桥联二抗;
S3、将血型抗体Ⅰ、血型抗体Ⅱ、桥联二抗按当量数1:1:1混合均匀,室温放置15-30分钟,制得如权利要求1所述的结构为血型抗体Ⅰ-桥联二抗-血型抗体Ⅱ的血型抗体复合物。
相比现有技术,本发明的有益效果在于:跟传统的筛选高质量细胞株或者添加小鼠腹水等方法相比,本发明的血型抗体复合物制备方法的原理是抗原抗体反应,利用抗体和其特异性抗体之间具有特异识别性制备得到,操作简单,成本低,生物活性好。当本发明中的血型抗体Ⅰ和血型抗体Ⅱ为不同抗体时,所制得的双特异性抗体可以针对两个不同的抗原结合位点;当本发明中的血型抗体Ⅰ和血型抗体Ⅱ为同一抗体时,所制得的抗体具有两个血型抗体Ⅰ/Ⅱ,从而达到提高血型抗体Ⅰ/Ⅱ的效价和亲合性。
上述说明仅是本发明技术方案的概述,为了能够更清楚了解本发明的技术手段,并可依照说明书的内容予以实施,以下以一些实施例来详细说明。本发明的具体实施方式由以下实施例详细给出。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解,构成本申请的一部分,本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明,并不构成对本发明的不当限定。在附图中:
图1为本发明所述制备方法的工艺流程图;
图2为本发明血型抗体复合物的结构示意图;
图3为本发明所制得的结构为鼠抗A血型单抗-羊抗鼠多抗-鼠抗B血型单抗的血型抗体复合物的表征效果图;
图4为本发明一实施例中对照组和实验组的效价对比图;
图5为本发明的另一实施例中对照组和实验组的效价对比图;
其中:1、血型抗体Ⅰ;2、血型抗体Ⅱ;3、桥联二抗
具体实施方式
为了可以更充分地理解本文描述的发明,阐述以下实施例。应当理解这些实施例仅用于说明性目的并且不应被理解为以任何方式限制本发明。
对本文以下属于进行解释。
本文中所述的“克分子当量”指抗体的分子数量。
本文中所述“桥联二抗”,也称之免疫球蛋白,其特异性是针对血型抗体Ⅰ和血型抗体Ⅱ产生的种属抗体,也称之异种抗体。“桥联二抗”是血型抗体Ⅰ和血型抗体Ⅱ同种型抗原表位的抗体,能同时与血型抗体Ⅰ和血型抗体Ⅱ发生特异性结合。
实施例1
制备结构为鼠抗A血型单抗-羊抗鼠多抗-鼠抗B血型单抗的血型抗体复合物,如图1所示,步骤如下:
S1、选择鼠抗A血型单抗、鼠抗B血型单抗分别作为血型抗体Ⅰ和血型抗体Ⅱ;
S2、选择能够同时与鼠抗A血型单抗、鼠抗B血型单抗发生特异性结合的羊抗鼠多抗,作为桥联二抗;
S3、将鼠抗A血型单抗、鼠抗B血型单抗、羊抗鼠多抗按克分子当量数1:1:1混合均匀,室温放置15-30分钟,制得如图2所示的结构为鼠抗A血型单抗-羊抗鼠多抗-鼠抗B血型单抗的血型抗体复合物。
应当解释的,抗A血型单抗表示能够与A血型红细胞的A抗原发生特异性结合的抗体,抗B血型单抗表示能够与B血型红细胞的B抗原发生特异性结合的抗体。
实施例2
制备结构为鼠抗B-1血型单抗-羊抗鼠多抗-鼠抗B-2血型单抗的血型抗体复合物,如图1所示,步骤如下:
S1、选择两株不同细胞株分泌的相同效价的鼠抗B-1血型单抗、鼠抗B-2血型单抗分别作为血型抗体Ⅰ和血型抗体Ⅱ;
S2、选择能够同时与鼠抗B-1血型单抗、鼠抗B-2血型单抗发生特异性结合的羊抗鼠多抗,作为桥联二抗;
S3、将鼠抗B-1血型单抗、鼠抗B-2血型单抗、羊抗鼠多抗按克分子当量数1:1:1混合均匀,室温放置15-30分钟,制得如图2所示的结构为鼠抗B-1血型单抗-羊抗鼠多抗-鼠抗B-2血型单抗的血型抗体复合物。
以下以具体实施例来进行具体阐述。
1)取B型红细胞用生理盐水稀释至2%备用;
2)取两株不同细胞株分泌的相同效价的鼠抗B-1血型单抗、鼠抗B-2血型单抗;
3)取羊抗鼠多抗,用含1%BSA的生理盐水将羊抗鼠多抗、步骤2)中的抗B-1血型单抗、抗B-2血型单抗分别分别从1:2倍比稀释至1:1024;即稀释比例为1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512、1:1024;
4)取20支试管,对照组的10支试管中分别加入2滴稀释比例分别为1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512、1:1024的抗B-1血型单抗,实验组的10支试管中分别加入各1滴的稀释比例分别为1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512、1:1024的鼠抗B-1血型单抗、鼠抗B-2血型单抗、羊抗鼠多抗,混匀,室温放置15-30分钟;
5)每管加入1滴步骤1)中所准备的用生理盐水稀释至2%的B型红细胞;
6)1000rpm离心1min,观察凝集,比较对照组抗B-1血型单抗和实验组的结构为鼠抗B-1血型单抗-羊抗鼠多抗-鼠抗B-2血型单抗的复合物的效价。
结果如图4所示,对照组中鼠抗B-1血型单抗原效价为256,实验组中结构为鼠抗B-1血型单抗-羊抗鼠多抗-鼠抗B-2血型单抗的血型抗体复合物的效价为512。结果表明,该方法能有效提高抗B血型单抗的效价。
应当解释的,鼠抗B-1血型单抗、鼠抗B-2血型单抗的效价相同。
实施例3
制备结构为鼠抗A-1血型单抗-羊抗鼠多抗-鼠抗A-2血型单抗的血型抗体复合物的方法与实施例2一样。选择两株不同细胞株分泌的相同效价的鼠抗A-1血型单抗、鼠抗A-2血型单抗分别作为血型抗体Ⅰ和血型抗体Ⅱ。所制得的结构为鼠抗A-1血型单抗-羊抗鼠多抗-鼠抗A-2血型单抗的血型抗体复合物的效价高于抗A-1单抗或抗A-2单抗。
实施例4
制备结构为人抗D-1血型单抗-鸡抗人多抗-人抗D-2血型单抗的血型抗体复合物的方法,如图1所示,步骤如下:
S1、选择两株不同细胞株分泌的相同效价的人抗D-1血型单抗、人抗D-2血型单抗分别作为血型抗体Ⅰ和血型抗体Ⅱ;
S2、选择能够同时与人抗D-1血型单抗、人抗D-2血型单抗发生特异性结合的鸡抗人多抗,作为桥联二抗;
S3、将人抗D-1血型单抗、人抗D-2血型单抗、鸡抗人多抗按克分子当量数1:1:1混合均匀,室温放置15-30分钟,制得如图2所示的结构为人抗D-1血型单抗-鸡抗人多抗-人抗D-2血型单抗的血型抗体复合物。
以下以具体实施例进行阐述。
1)取O型RhD+红细胞用生理盐水稀释至2%备用;
2)取两株不同细胞株分泌的相同效价的人抗D-1血型单抗、人抗D-2血型单抗;
3)用含1%BSA的生理盐水将鸡抗人多抗、步骤2)中的人抗D-1血型单抗、人抗D-2血型单抗分别分别从1:2倍比稀释至1:1024;即稀释比例为1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512、1:1024;
4)取20支试管,对照组的10支试管中分别加入2滴稀释比例分别为1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512、1:1024的人抗D-1血型单抗,实验组的10支试管中分别加入各1滴的稀释比例分别为1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512、1:1024的人抗D-1血型单抗、人抗D-2血型单抗、鸡抗人多抗,混匀,室温放置15-30分钟;
5)每管加入1滴步骤1)所准备的用生理盐水稀释至2%的O型RhD+红细胞;
6)1000rpm离心1min,观察凝集,比较对照组人抗D-1血型单抗和实验组结构为人抗D-1血型单抗-鸡抗人多抗-人抗D-2血型单抗的血型抗体复合物的效价。
结果如图5所示,对照组中抗D-1的效价为128,实验组中的制备得到的人抗D-1血型单抗-鸡抗人多抗-人抗D-2血型单抗的复合物效价可达到256。结果表明,该方法能有效提高抗D血型单抗的效价。
应当解释的,人抗D-1血型单抗、人抗D-2血型单抗的效价相同。
实施例5
验证结构为人抗D-1血型单抗-鸡抗人多抗-人抗D-2血型单抗的血型抗体复合物的亲合性高于人抗D-1血型单抗或人抗D-2血型单抗
以下以具体实施例进行阐述。
1)取O型RhD+红细胞用生理盐水稀释至30%~50%备用;
2)取两株不同细胞株分泌的相同效价的人抗D-1血型单抗、人抗D-2血型单抗;
3)对照组加1滴人抗D-1血型单抗和1滴人抗D-2血型单抗,实验组加1滴人抗D-1血型单抗、1滴人抗D-2血型单抗和1滴鸡抗人多抗,混匀,室温15-30分钟;
4)取两块干净的玻片,对照组的玻片一端加2滴混匀后的对照组的人抗D-1血型单抗和1滴人抗D-2血型单抗的混合物,另一端加2滴红细胞;实验组的玻片一端加2滴混匀后的实验组的结构为人抗D-1血型单抗-鸡抗人多抗-人抗D-2血型单抗的血型抗体复合物,另一端加2滴红细胞。对照组和实验组分别用牙签混匀,从抗体与红细胞开始接触时开始计时,记录出现凝集的时间和凝集块达到1mm2以上的时间。
对照组和实验组的开始出现凝胶和凝胶块达到1mm2的耗时情况参表一。
表一
如表一所示,结果对照组开始出现凝胶耗时和凝胶块达到1mm2的耗时均高于实验组,由此可知,实验组通过将克分子当量数1:1:1人抗D-1血型单抗、1滴人抗D-2血型单抗和1滴鸡抗人多抗的混合,室温放置15-30分钟后,所得到的人抗D-1血型单抗-鸡抗人多抗-人抗D-2血型单抗的血型抗体复合物的亲合性高于人抗D血型单抗。
实施例6
纯化并验证实施例1所得结构为鼠抗A血型单抗-羊抗鼠多抗-鼠抗B血型单抗的血型抗体复合物
1)取2mL A型洗涤红细胞与3mL实施例1制备得到的结构为鼠抗A血型单抗-羊抗鼠多抗-鼠抗B血型单抗的复合物体充分混合,4℃孵育,不时轻轻摇动试管,观察到出现较多凝集但未溶血时取出;
2)1800rpm离心3分钟,去除上清;
3)用生理盐水洗涤8次,以去除上清中的游离抗体;
4)在压积红细胞中加入2mL生理盐水,混匀,56℃水浴10分钟,不时轻轻摇动试管;
5)1800rpm离心3分钟,立即将上清转移到另一个干净的试管中,即得到吸收放散后的抗AB抗体;
6)将吸收放散后的抗AB抗体分别与A型、B型、O型和AB型红细胞混合,1000rpm离心1min,观察凝集。
如图3所示,通过实施例1所提供的一种制备血型抗体复合物的方法来将抗A血型单抗和抗B血型单抗分别结合到桥联二抗上,得到结构如图3所示的鼠抗A血型单抗-羊抗鼠多抗-鼠抗B血型单抗的血型抗体复合物,所得鼠抗A单抗-羊抗鼠多抗-鼠抗B单抗的血型抗体复合物与A型、B型和AB型红细胞均反应,与O型红细胞不反应,由此可知,本实施例方法所得的鼠抗A血型单抗-羊抗鼠多抗-鼠抗B血型单抗的血型抗体复合物既具有对于A抗原的特异性,又具有对于B抗原的特异性,所识别的表位可以与单抗原(A抗原或B抗原)或同时与两种抗原(A抗原和B抗原)缔合,即通过本实施例所提供的方法所制得的结构为鼠抗A血型单抗-羊抗鼠多抗-鼠抗B血型单抗的血型抗体复合物的免疫反应能力(特异性)增强。
本发明所提供的的一种制备如上所述的血型抗体复合物的方法,选择两个来源于同一生物种属的血型抗体,即血型抗体Ⅰ和血型抗体Ⅱ,通过血型抗体的生物种属来源,选择与血型抗体Ⅰ和血型抗体Ⅱ的生物种属来源不同且能够同时与血型抗体Ⅰ和血型抗体Ⅱ发生特异性结合的桥联二抗,将血型抗体Ⅰ、血型抗体Ⅱ、桥联二抗按克分子当量数1:1:1混合均匀,室温放置15-30分钟,制得结构为血型抗体Ⅰ-桥联二抗-血型抗体Ⅱ的血型抗体复合物。
所述桥联二抗的一个Fab端与血型抗体Ⅰ的Fc端特异性结合,所述桥联二抗的另一个Fab端与血型抗体Ⅱ的Fc端特异性结合,从而将血型抗体Ⅰ和血型抗体Ⅱ同时结合到所述桥联二抗上。当血型抗体Ⅰ和血型抗体Ⅱ为源于同一生物种属的不同抗体时,得到的结构为血型抗体Ⅰ-桥联二抗-血型抗体Ⅱ的复合物既具有血型抗体Ⅰ的特异性,又具有血型抗体Ⅱ特异性,可以针对两个不同的抗原结合位点,达到增加血型抗体特异性的目的。当本发明中的血型抗体Ⅰ和血型抗体Ⅱ为同一抗体时,所制得的抗体具有两个血型抗体Ⅰ/Ⅱ,从而达到提高血型抗体Ⅰ/Ⅱ的效价和亲合性的目的。
尽管本发明的实施方案已公开如上,但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用,它完全可以被适用于各种适合本发明的领域,对于熟悉本领域的人员而言,可容易地实现另外的修改,因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下,本发明并不限于特定的细节和这里示出的实施例。
Claims (6)
1.一种血型抗体复合物,其特征在于,所述血型抗体复合物的结构为血型抗体Ⅰ-桥联二抗-血型抗体Ⅱ;其中,所述血型抗体Ⅰ和所述血型抗体Ⅱ来源于同一生物种属;
所述桥联二抗的种属来源与血型抗体Ⅰ和血型抗体Ⅱ的种属来源不同。
2.根据权利要求1所述的血型抗体复合物,其特征在于,所述生物包括鼠、鸡、兔、人、羊驼。
3.根据权利要求1所述的血型抗体复合物,其特征在于,所述血型抗体Ⅰ和血型抗体Ⅱ均包括鼠源单抗、鸡源寡抗、兔源单抗、人源单抗、羊驼源单抗。
4.根据权利要求1所述的血型抗体复合物,其特征在于,所述桥联二抗包括抗鼠多抗和单抗、抗鸡多抗、抗兔多抗、抗人多抗、抗羊驼源多抗。
5.根据权利要求1-4任意一项所述的血型抗体复合物,其特征在于,所述血型抗体Ⅰ为和所述血型抗体Ⅱ均包括抗A血型单抗、抗B血型单抗、抗RhD血型单抗和多抗。
6.一种制备如权利要求1-5中任意一项所述的血型抗体复合物的方法,其特征在于,包括如下步骤:
S1、选择两个来源于同一生物种属的血型抗体,即血型抗体Ⅰ和血型抗体Ⅱ;
S2、根据血型抗体Ⅰ和血型抗体Ⅱ的种属来源,选择不同于血型抗体Ⅰ和血型抗体Ⅱ的种属来源且能够同时与血型抗体Ⅰ和血型抗体Ⅱ发生特异性结合的桥联二抗;
S3、将血型抗体Ⅰ、血型抗体Ⅱ、桥联二抗按克分子当量数1:1:1混合均匀,室温放置15-30分钟,制得结构为血型抗体Ⅰ-桥联二抗-血型抗体Ⅱ的血型复合物。
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