CN116284370A - 一种多聚体糖化血红蛋白单克隆抗体及制备方法 - Google Patents

一种多聚体糖化血红蛋白单克隆抗体及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及糖化血红蛋白技术领域，尤其是一种多聚体糖化血红蛋白单克隆抗体及制备方法，该单克隆抗体的序列如SEQ ID NO：1所示，其轻链可变区和重链可变区序列分别如SEQ ID NO：2‑3所示。其制备方法包括：1)免疫动物；2)细胞融合；3)选择性培养；4)杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化；5)单克隆抗体纯化；6)单克隆抗体交联。采用本发明方法制备的多聚体单克隆抗体可用于标准品的制备，特异性较强、对免疫原的要求不纯的免疫原也能得到高纯度的抗体、易于标准化，批次间差异小、识别仅检测抗原上的一个表位、交叉反应不易、与不会其它蛋白发生交叉反应沉淀和凝集反应，有利于各厂家和实验室的结果比较及质量控制。

Description

一种多聚体糖化血红蛋白单克隆抗体及制备方法
技术领域
本发明涉及糖化血红蛋白技术领域，具体领域为一种多聚体糖化血红蛋白单克隆抗体及制备方法。
背景技术
糖化血红蛋白是衡量血糖控制的金标准，也是诊断和管理糖尿病的重要手段。在糖尿病治疗中，糖化血红蛋白水平对评价血糖总体控制、发现治疗中存在的问题以及指导治疗方案均有重要的临床意义。
正常人有三种血红蛋白：HbA、HbF、HbA2，而成人红细胞中主要含有HbA。在用层析法分离血红蛋白时，可洗脱出3种含糖成分即：HbA1a、HbA1b、HbA1c，合称为糖化血红蛋白。HbA1c是葡萄糖化血红蛋白，另两种是其他糖形成的糖化血红蛋白。
糖化血红蛋白由HbA在代谢过程中与葡萄糖结合形成，因而它可准确地反映血中葡萄糖水平。糖化血红蛋白是人体血液中红细胞内的血红蛋白与血糖结合的产物。血糖和血红蛋白的结合生成糖化血红蛋白是不可逆反应，并与血糖浓度成正比，且保持120天左右，所以可以观测到120天之前的血糖浓度。糖化血红蛋白测试通常可以反映患者近8～12周的血糖控制情况。
糖化血红蛋白的免疫法测定是目前临床常用方法之一，其原理是采用能识别糖化血红蛋白β-链氨基末端几个糖基化氨基酸的特异性抗体与HbA1c反应，形成抗原抗体复合物来进行检测。该类方法快速、简便，可在自动化仪器上检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多聚体糖化血红蛋白单克隆抗体及制备方法。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种多聚体糖化血红蛋白单克隆抗体，其序列如SEQ ID NO：1所示。其中，轻链可变区序列如SEQ ID NO：2所示。重链可变区序列如SEQ ID NO：3所示。
本发明所述的多聚体糖化血红蛋白单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
(1)免疫动物
选用6-8周龄雌性BALB/c小鼠，免疫注射，抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞；
(2)细胞融合
采用CO2气体处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液；将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇；在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞；
(3)选择性培养
采用HAT选择性培养基筛选融合的杂交瘤细胞；
(4)杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化
采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养；筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增；经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存；
(5)单克隆抗体纯化
使用硫酸铵盐析法和G蛋白层析法对小鼠腹水进行纯化；
(6)单克隆抗体交联。
其中，所述步骤(1)具体为：
初次免疫，Ag50ug/只，加福氏完全佐剂皮下多点注射，一般1.5mL，间隔3周；
第二次免疫，剂量途径同上，加福氏不完全佐剂，间隔3周；
第三次免疫，剂量同上，不加佐剂，腹腔注射，7天后采血测其效价，检测免疫效果，间隔3周；
加强免疫，剂量50μg，腹腔注射；3天后，取脾融合。
其中，所述步骤(2)具体包括：
1)饲养细胞的制备
用6-10周龄的BALB/c小鼠；拉颈处死，浸泡于75％的酒精，消毒3min，用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜；用吸管注入6mL培养液，反复冲洗，吸出冲洗液；放入10mL离心管，1200rpm离心5min；
用20％小牛血清的培养液混悬，调整细胞数为1×105/mL；加入96孔板，100μL/孔；放入37℃孵箱培养；
2)骨髓瘤细胞的准备
于融合前48-36小时，将骨髓瘤细胞扩大培养；融合当天，用弯头滴管将细胞从瓶壁轻轻吹下，收集于50m离心管或融合管内；1000r/min离心5-10分钟，弃去上清；加入30mL不完全培养基，离心洗涤一次；然后将细胞重悬浮于10mL不完全培养基，混匀；取骨髓瘤细胞悬液，加0.4％台酚蓝染液作活细胞计数后备用；
3)脾细胞的准备
取已经免疫的BALB/c小鼠，摘除眼球采血，并分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清；同时通过颈脱位致死小鼠，浸泡于75％酒精中5分钟，于培养皿上固定后掀开左侧腹部皮肤，看到脾脏，换眼科剪镊，在超净台中用无菌手术剪开腹膜，取出脾脏置于已盛有10mL不完全培养基的平皿中，轻轻洗涤，并细心剥去周围结缔组织；置平皿中不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数，使脾细胞进入平皿中的不完全培养基；用吸管吹打数次，制成单细胞悬液；通常每只小鼠1×108-2.5×108个脾细胞；
4)细胞融合
将1×108脾细胞与1×107骨髓瘤细胞SP2/0混合于一支50mL融合管中，补加不完全培养基至30mL，充分混匀；1000r/min离心5-10分钟，将上清尽量吸净；在手掌上轻击融合管底，使沉淀细胞松散均匀；
用1mL吸管在30s内加入预热的50％ PEG1 mL，边加边轻轻搅拌；吸入吸管静置1min；加入预热的不完全培养液，终止PEG作用，连续每2min内分别加入1mL，2mL，3mL，4mL，5mL，10mL；800rpm离心，5分钟；弃去上清；
加入5mL完全培养基，轻轻吹吸沉淀细胞，使其悬浮并混匀，然后补加完全培养基至40-50mL；分装96孔细胞培养板，每孔100μL，然后将培养板置37℃，5％ CO2培养箱内培养；6h后补加选择培养基；每孔50μL，3天后用选择培养基半换液；
观察杂交瘤细胞生长情况，待其长至孔底面积1/10以上时吸出上清供抗体检测。
其中，所述步骤(3)具体为，抗原用包被液稀释至10ug/mL；以100μL/孔量加入酶标板孔中，置4℃过夜或37℃吸附2小时；弃去孔内的液体，同时用洗涤液洗3次，每次3分钟，拍干；每孔加100μL封闭液37℃封闭1小时；洗涤液洗3次；
每孔加100μL待检杂交瘤细胞培养上清，同时设立阳性、阴性对照和空白对照；37℃孵育1小时；洗涤，拍干；
加酶标第二抗体，每孔100μL，37℃孵育1小时，洗涤，拍干；
加底物液，每孔加新鲜配制的底物使用液100μL，37℃20分钟；
以2mol/L H2SO4终止反应，在酶联免疫阅读仪上读取OD值；
结果判定：以P/N≧2.1，或P≧N+3SD为阳性；若阴性对照孔无色或接近无色，阳性对照孔明确显色，则可直接用肉眼观察结果。
其中，所述步骤(4)具体为，制备小鼠脾细胞为饲养细胞；制备待克隆的杂交瘤细胞悬液，用含20％血清的HT培养基稀释至每毫升含5、10和20个细胞3种不同的稀释度；
按每毫升加入5×104-1×105细胞的比例，在上述杂交瘤细胞悬液中分别加入腹腔巨噬细胞；每种杂交瘤细胞分装96孔板一块，每孔量为100μL；
37℃、5％ CO2培养6天，出现肉眼可见的克隆即可检测抗体；在倒置显微镜下观察，标出只有单个克隆生长的孔，取上清作抗体检测；
取抗体检测阳性孔的细胞扩大培养，并冻存。
其中，所述步骤(5)具体为，采用亲和纯化法，用葡萄球菌A蛋白或抗小鼠球蛋白抗体与载体交联，制备亲和层析柱将抗体结合后洗脱。
其中，所述步骤(6)中，糖化血红蛋白单抗偶联的反应体系为：
抗体，浓度2mg/mL，5mL；
戊二醛，质量浓度0.25％，200μL；
200rpm离心，25℃，5h；
5mg/mL硼氢化钠终止。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明通过采用杂交瘤技术制备糖化血红蛋白免疫胶乳比浊提供特异性材料，所制备的多聚体糖化血红蛋白单克隆抗体具有较强的特异性，经腹水效价测定和竞争ELISA法试验，结果表明本发明制备筛选出的HbA1c多聚体单克隆抗体具有较好的特异性和敏感性。
(2)采用本发明方法制备的多聚体单克隆抗体可用于标准品的制备，特异性较强、对免疫原的要求不纯的免疫原也能得到高纯度的抗体、易于标准化，批次间差异小、识别仅检测抗原上的一个表位、交叉反应不易、与不会其它蛋白发生交叉反应沉淀和凝集反应，有利于各厂家和实验室的结果比较及质量控制。
(3)本发明方法制备的单克隆抗体，也可以作为酶联免疫吸附实验(ELISA)的包被多聚体单克隆抗体，检测抗原效价。
附图说明
图1为本发明单克隆抗体的制备流程图。
图2为SDS-PAGE电泳图；其中，M：蛋白marker；1：裂解样；2-4：流出样；5-13：清洗样；14：洗脱样。
图3为校准曲线图。
图4为线性关系图。
图5为稳定性分析结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
结合图1所示，一种多聚体糖化血红蛋白单克隆抗体制备方法，包括以下步骤：
(1)免疫动物
免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的过程。一般选用6-8周龄雌性BALB/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞。
具体操作步骤如下：
根据抗原的特性选择免疫方案，对于可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂。常用佐剂为福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂。要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状。
初次免疫，Ag50ug/只，加福氏完全佐剂皮下多点注射，一般1.5mL，间隔3周。
第二次免疫，剂量途径同上，加福氏不完全佐剂，间隔3周。
第三次免疫，剂量同上，不加佐剂，腹腔注射，7天后采血测其效价，检测免疫效果，间隔3周。加强免疫，剂量50ug，腹腔注射。3天后，取脾融合。
(2)细胞融合
采用CO2气体处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。
具体操作步骤如下：
1)饲养细胞的制备
在细胞融合后选择性培养过程中，由于大量骨髓瘤细胞和脾细胞相继死亡，此时单个或少数分散的杂交瘤细胞多半不易存活，通常必须加入其他活细胞使之繁殖，这种被加入的活细胞称为饲养细胞。
小鼠腹腔巨噬细胞的准备：
用6-10周龄的BALB/c小鼠，拉颈处死，浸泡于75％的酒精，消毒3min，用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜。用吸管注入6mL培养液，反复冲洗，吸出冲洗液。放入10mL离心管，1200rpm离心5min。
用20％小牛血清的培养液混悬，调整细胞数为1×105/mL；加入96孔板，100μL/孔。放入37℃孵箱培养。
2)骨髓瘤细胞的准备
于融合前48-36小时，将骨髓瘤细胞扩大培养。融合当天，用弯头滴管将细胞从瓶壁轻轻吹下，收集于50mL离心管或融合管内。
1000r/min离心5-10分钟，弃去上清。
加入30mL不完全培养基，离心洗涤一次。然后将细胞重悬浮于10mL不完全培养基，混匀。
取骨髓瘤细胞悬液，加0.4％台酚蓝染液作活细胞计数后备用。
3)脾细胞的准备
取已经免疫的BALB/c小鼠，摘除眼球采血，并分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清。同时通过颈脱位致死小鼠，浸泡于75％酒精中5分钟，于培养皿上固定后掀开左侧腹部皮肤，可看到脾脏，换眼科剪镊，在超净台中用无菌手术剪开腹膜，取出脾脏置于已盛有10mL不完全培养基的平皿中，轻轻洗涤，并细心剥去周围结缔组织。置平皿中不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数。使脾细胞进入平皿中的不完全培养基。用吸管吹打数次，制成单细胞悬液。通常每只小鼠1×108-2.5×108个脾细胞。
4)细胞融合
将1×108脾细胞与1×107骨髓瘤细胞SP2/0混合于一支50mL融合管中，补加不完全培养基至30mL，充分混匀。
1000r/min离心5-10分钟，将上清尽量吸净。
在手掌上轻击融合管底，使沉淀细胞松散均匀；
用1mL吸管在30s内加入预热的50％ PEG1 mL，边加边轻轻搅拌。
吸入吸管静置1min。
加入预热的不完全培养液，终止PEG作用，连续每2min内分别加入1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、10mL。800rpm，5分钟；弃去上清。
加入5mL完全培养基，轻轻吹吸沉淀细胞，使其悬浮并混匀，然后补加完全培养基至40-50mL。分装96孔细胞培养板，每孔100μL，然后将培养板置37℃，5％ CO2培养箱内培养。
6h后补加选择培养基。每孔50μL。3天后用选择培养基半换液。
经常观察杂交瘤细胞生长情况，待其长至孔底面积1/10以上时吸出上清供抗体检测。
(3)选择性培养
选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，一般采用HAT选择性培养基。在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成DNA而死亡。未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖。
具体操作步骤如下：
抗原用包被液稀释至10ug/mL。
以100μL/孔量加入酶标板孔中，置4℃过夜或37℃吸附2小时。
弃去孔内的液体，同时用洗涤液洗3次，每次3分钟，拍干。
每孔加100μL封闭液37℃封闭1小时；
洗涤液洗3次；
每孔加100μL待检杂交瘤细胞培养上清，同时设立阳性、阴性对照和空白对照；37℃孵育1小时；洗涤，拍干。
加酶标第二抗体，每孔100μL，37℃孵育1小时，洗涤，拍干。
加底物液，每孔加新鲜配制的底物使用液100μL，37℃20分钟。
以2mol/L H2SO4终止反应，在酶联免疫阅读仪上读取OD值。
结果判定：以P/N≧2.1，或P≧N+3SD为阳性。若阴性对照孔无色或接近无色，阳性对照孔明确显色，则可直接用肉眼观察结果。
(4)杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化
在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。采用灵敏、快速、特异的免疫学方法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存。
具体操作步骤如下：
制备小鼠脾细胞为饲养细胞。
制备待克隆的杂交瘤细胞悬液，用含20％血清的HT培养基稀释至每毫升含5、10和20个细胞3种不同的稀释度。按每毫升加入5×104-1×105细胞的比例，在上述杂交瘤细胞悬液中分别加入腹腔巨噬细胞。
每种杂交瘤细胞分装96孔板一块，每孔量为100μL。37℃、5％ CO2培养6天，出现肉眼可见的克隆即可检测抗体；在倒置显微镜下观察，标出只有单个克隆生长的孔，取上清作抗体检测。
取抗体检测阳性孔的细胞扩大培养，并冻存。
(5)单克隆抗体纯化
单克隆抗体的纯化方法同多克隆抗体的纯化，腹水特异性抗体的浓度较抗血清中的多克隆抗体高，纯化效果好。按所要求的纯度不同采用相应的纯化方法。一般采用盐析、凝胶过滤和离子交换层析等步骤达到纯化目的，也有采用较简单的酸沉淀方法。目前最有效的单克隆抗体纯化方法为亲和纯化法，采用葡萄球菌A蛋白或抗小鼠球蛋白抗体与载体(常用Sepharose)交联，制备亲和层析柱将抗体结合后洗脱，回收率可达90％以上。蛋白可与IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3结合，同时还结合少量的IgM。洗脱液中的抗体浓度可用紫外光吸收法粗测，小鼠IgG单克隆抗体溶液在A280nm时，1.44(吸光单位)相当于1mg/mL。经低pH洗脱后在收集管内预置中和液或速加中和液对保持纯化抗体的活性至关重要。SDS-PAGE电泳图如图2所示。
抗体序列如SEQ ID NO：1所示。其中，轻链可变区序列如SEQ ID NO：2所示。重链可变区序列如SEQ ID NO：3所示。
(6)单克隆抗体交联
化学交联试剂中有一类在交联之后具有稳定交联桥，一般情况下是不可切断的。这类试剂中通常采是戊二醛。这种试剂具有两个反应性活性醛基可与蛋白质分子中氨基酸残基侧链上，与氨基发生作用从而形成交联。
糖化血红蛋白单抗偶联反应体系：
抗体，浓度2mg/mL，5mL；
戊二醛(0.25％)，200μL
200rpm，25℃，5h；
硼氢化钠终止(5mg/mL)。
将上述方法分离纯化得到的产品性能进行测试，具体如下：
(1)校准曲线
样品中总血红蛋白和糖化血红蛋白与胶乳微球有相同的非特异性吸附而固相化，当加入制备特异性单克隆抗体后，形成胶乳–糖化血红蛋白–鼠抗人HbA1C多聚单克隆抗体的复合物，此复合物由于羊抗鼠IgG抗体而形成凝集，凝集量因胶乳微球表面固相化的糖化血红蛋白量的不同而不同。通过测定吸光度并与HbA1C百分浓度的标准曲线比较后，可求出样品中HbA1C占总Hb的百分含量。线性范围：2-14％，相关系数R2>0.99，如图3所示。
(2)线性关系
将HbA1C高值全血样本倍比稀释，用自制的HbA1C胶乳比浊试剂进行检测，实测样本浓度与稀释后浓度相关性0.99，如图4。
(3)精密度
将HbA1C低值和高值全血样本，用胶乳比浊试剂分别平行测10次，变异系数CV都在3％以内，说明多聚单克隆抗体可用于胶乳比浊试剂且精密度很好。结果如表1。
表1
Figure SMS_1
(4)稳定性分析
将HbA1C单抗分别置于-20℃、2-8℃和37℃，隔3-4天用单抗制备成胶乳试剂，检测不同浓度的HbA1C校准品，结果如图5，结果表明该抗体在37℃稳定性很好。
通过上述实验结果可以明显看出，本发明制备的多聚体糖化血红蛋白单克隆抗体具有纯度高、相关性高、稳定性好、精密度好、稳定性分析等特点。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一种多聚体糖化血红蛋白单克隆抗体，其特征在于：其序列如SEQ ID NO：1所示。
2.根据权利要求1所述的多聚体糖化血红蛋白单克隆抗体，其特征在于：轻链可变区序列如SEQ ID NO：2所示。
3.根据权利要求1所述的多聚体糖化血红蛋白单克隆抗体，其特征在于：重链可变区序列如SEQ ID NO：3所示。
4.根据权利要求1-3任一所述的多聚体糖化血红蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)免疫动物
选用6-8周龄雌性BALB/c小鼠，免疫注射，抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞；
(2)细胞融合
采用CO2气体处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液；将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇；在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞；
(3)选择性培养
采用HAT选择性培养基筛选融合的杂交瘤细胞；
(4)杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化
采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养；筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增；经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存；
(5)单克隆抗体纯化
使用硫酸铵盐析法和G蛋白层析法对小鼠腹水进行纯化；
(6)单克隆抗体交联。
5.根据权利要求4所述的多聚体糖化血红蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)具体为：
初次免疫，Ag50ug/只，加福氏完全佐剂皮下多点注射，1.5mL，间隔3周；
第二次免疫，剂量途径同上，加福氏不完全佐剂，间隔3周；
第三次免疫，剂量同上，不加佐剂，腹腔注射，7天后采血测其效价，检测免疫效果，间隔3周；
加强免疫，剂量50ug，腹腔注射；3天后，取脾融合。
6.根据权利要求5所述的多聚体糖化血红蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)具体包括：
1)饲养细胞的制备
用6-10周龄的BALB/c小鼠；拉颈处死，浸泡于75％的酒精，消毒3min，用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜；用吸管注入6mL培养液，反复冲洗，吸出冲洗液；放入10mL离心管，1200rpm离心5min；
用20％小牛血清的培养液混悬，调整细胞数为1×105/mL；加入96孔板，100μL/孔；放入37℃孵箱培养；
2)骨髓瘤细胞的准备
于融合前48-36小时，将骨髓瘤细胞扩大培养；融合当天，用弯头滴管将细胞从瓶壁轻轻吹下，收集于50m离心管或融合管内；1000r/min离心5-10分钟，弃去上清；加入30mL不完全培养基，离心洗涤一次；然后将细胞重悬浮于10mL不完全培养基，混匀；取骨髓瘤细胞悬液，加0.4％台酚蓝染液作活细胞计数后备用；
3)脾细胞的准备
取已经免疫的BALB/c小鼠，摘除眼球采血，并分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清；同时通过颈脱位致死小鼠，浸泡于75％酒精中5分钟，于培养皿上固定后掀开左侧腹部皮肤，看到脾脏，换眼科剪镊，在超净台中用无菌手术剪开腹膜，取出脾脏置于已盛有10mL不完全培养基的平皿中，轻轻洗涤，并细心剥去周围结缔组织；置平皿中不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数，使脾细胞进入平皿中的不完全培养基；用吸管吹打数次，制成单细胞悬液；通常每只小鼠1×108-2.5×108个脾细胞；
4)细胞融合
将1×108脾细胞与1×107骨髓瘤细胞SP2/0混合于一支50mL融合管中，补加不完全培养基至30mL，充分混匀；1000r/min离心5-10分钟，将上清尽量吸净；在手掌上轻击融合管底，使沉淀细胞松散均匀；
用1mL吸管在30s内加入预热的50％PEG1 mL，边加边轻轻搅拌；吸入吸管静置1min；加入预热的不完全培养液，终止PEG作用，连续每2min内分别加入1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、10mL；800rpm离心，5分钟；弃去上清；
加入5mL完全培养基，轻轻吹吸沉淀细胞，使其悬浮并混匀，然后补加完全培养基至40-50mL；分装96孔细胞培养板，每孔100μL，然后将培养板置37℃，5％CO2培养箱内培养；6h后补加选择培养基；每孔50μL，3天后用选择培养基半换液；
观察杂交瘤细胞生长情况，待其长至孔底面积1/10以上时吸出上清供抗体检测。
7.根据权利要求6所述的多聚体糖化血红蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)具体为，抗原用包被液稀释至10ug/mL；以100μL/孔量加入酶标板孔中，置4℃过夜或37℃吸附2小时；弃去孔内的液体，同时用洗涤液洗3次，每次3分钟，拍干；每孔加100μL封闭液37℃封闭1小时；洗涤液洗3次；
每孔加100μL待检杂交瘤细胞培养上清，同时设立阳性、阴性对照和空白对照；37℃孵育1小时；洗涤，拍干；
加酶标第二抗体，每孔100μL，37℃孵育1小时，洗涤，拍干；
加底物液，每孔加新鲜配制的底物使用液100μL，37℃20分钟；
以2mol/L H2SO4终止反应，在酶联免疫阅读仪上读取OD值；
结果判定：以P/N≧2.1，或P≧N+3SD为阳性；若阴性对照孔无色或接近无色，阳性对照孔明确显色，则可直接用肉眼观察结果。
8.根据权利要求7所述的多聚体糖化血红蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)具体为，制备小鼠脾细胞为饲养细胞；制备待克隆的杂交瘤细胞悬液，用含20％血清的HT培养基稀释至每毫升含5、10和20个细胞3种不同的稀释度；
按每毫升加入5×104-1×105细胞的比例，在上述杂交瘤细胞悬液中分别加入腹腔巨噬细胞；每种杂交瘤细胞分装96孔板一块，每孔量为100μL；
37℃、5％CO2培养6天，出现肉眼可见的克隆即可检测抗体；在倒置显微镜下观察，标出只有单个克隆生长的孔，取上清作抗体检测；
取抗体检测阳性孔的细胞扩大培养，并冻存。
9.根据权利要求8所述的多聚体糖化血红蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤(5)具体为，采用亲和纯化法，用葡萄球菌A蛋白或抗小鼠球蛋白抗体与载体交联，制备亲和层析柱将抗体结合后洗脱。
10.根据权利要求9所述的多聚体糖化血红蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤(6)中，糖化血红蛋白单抗偶联的反应体系为：
抗体，浓度2mg/mL，5mL；
戊二醛，质量浓度0.25％，200μL；
200rpm离心，25℃，5h；
5mg/mL硼氢化钠终止。
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