CN1392798A - 载脂蛋白b-100表位的模拟肽、其多联体和修饰肽,以及含有这些肽的疫苗组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用来治疗肥胖的疫苗组合物。更具体地说,本发明涉及载脂蛋白B-100表位的模拟肽、其多联体和修饰肽,以及包含这些肽的疫苗组合物。
Description
技术领域
本发明涉及一种治疗肥胖的疫苗组合物。更具体地说,本发明涉及一种包含载脂蛋白B-100的模拟肽表位、其多联体和修饰肽的疫苗组合物。
背景技术
血清脂质由胆固醇、甘油三酯(TG)、游离脂肪酸、磷脂等组成,其在血流中以脂质与载脂蛋白的复合物—脂蛋白形式存在。
在这些脂蛋白中,低密度脂蛋白(LDL)是TG和胆固醇的主要载体。由于饮食生活或其它因素的变化,由血液中LDL-胆固醇水平升高引起的动脉硬化、冠状动脉疾病或心肌梗塞的患者数量已有显著增加。
因此,现已进行各种研究来降低LDL-胆固醇的水平和显示上述疾病的病因,以治疗患有上述疾病的患者。
LDL-胆固醇是与脂质有关的成年疾病的主要病因,它可由巨噬细胞转变成高密度脂蛋白(HDL)的形式。另外,在肝脏中,LDL-胆固醇也可转变成其它物质或转变成胆汁酸形式(Brown,M.S.和Goldstein,J.L.,1983,Annu.Rev.Biochem.,52:223-261)。
载脂蛋白B-100是LDL中的主要蛋白部分,它也存在于非常低密度的脂蛋白(VLDL)和乳麇微粒中。当血液中通过识别载脂蛋白B-100诱导产生抗体时,血中的LDL-胆固醇可通过巨噬细胞的吞噬作用来除去,因为载脂蛋白B-100介导LDL颗粒与显露在细胞表面上的LDL-受体结合(Dalum I.,等人.,1997,Mol.Immunol.,34(16-17):1113-20)。
当诸如抗体等大分子已经和LDL表面上的载脂蛋白B-100结合时,由于与载脂蛋白B-100结合的大分子引起的空间位阻,诸如脂蛋白脂肪酶等脂肪酶不能水解TG等。因此,可利用结合载脂蛋白B-100的抗体来抑制肥胖的主要因素—游离脂肪酸的形成。
最近,已经在诸如小鼠和家兔等各种动物模型中进行了几个用疫苗来降低LDL-胆固醇水平和抑制动脉硬化发生的研究。例如,C.R.Alving报道说,胆固醇可通过代谢或氧化来修饰,经修饰的胆固醇在某些情况下是强的抗原决定簇(Alving,C.R.,等人,1989,Biochem.Soc.Trans.,17(4):637-9;Alving,C.R.,等人,1996,J.Lab.Clin.Med.,127:40-49;Alving,C.R.,等人,1996,Curr.Top.Microbiol.Immunol.,210:181-6)。
另外,已经报道血清中存在胆固醇的内源性抗体(Wu,J.T.,L.L.,1997,Clin.Lab.Med.,17(3):595-604,综述)。还有报道说,通过喂食含胆固醇的食物在家兔体内诱导动脉硬化和高胆固醇血症的实验中,通过注射含胆固醇的脂质体而免疫的家兔体内的高胆固醇血症和动脉硬化与对照组相比受到遏制或显著降低。
胆固醇疫苗诱导的这些抗体是结合VLDL、中密度脂蛋白(IDL)和LDL的免疫球蛋白M(IgM)。根据上述内容,据信可以用疫苗来治疗或预防高水平胆固醇引起的高脂血症或动脉硬化(Bailey,J.M.,1994,Science,264:1067-1068;Palinski,W.等人,1995,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,92(3):821-5;Wu,R.et al,1999,Hypertension,33(1):53-9)。
本发明者已经发现载脂蛋白B-100的模拟肽表位可有效预防肥胖,基于上述发现,本发明者开发出了用来治疗肥胖的疫苗组合物。
发明揭示
因此,本发明的目的是提供载脂蛋白B-100表位的模拟肽,其多联体和修饰肽。
本发明的另一目的是提供一种制备上述载脂蛋白B-100表位的模拟肽及其多联体和修饰肽的方法。
本发明还有一个目的是提供一种治疗或预防肥胖的药物组合物,该组合物含有上述载脂蛋白B-100表位的模拟肽及其多联体和修饰肽。
本发明的目的可通过提供载脂蛋白B-100表位的模拟肽及其多联体和修饰肽来实现。
为了筛选单克隆抗体(MabB23)结合的人载脂蛋白B-100的表位,在本发明中采用噬菌体的肽文库系统。上述筛选出的肽是在结构上与可被抗体识别的抗原决定簇相似的模拟肽,这些模拟肽可根据所筛选的肽的氨基酸序列来合成。
肽文库系统是一种搜寻抗原决定簇的三维形式的方法。即,将编码随机序列的肽的DNA片段插入编码噬菌体次要外壳蛋白的DNA中,然后将上述DNA插入读框(RF)DNA中,转化大肠杆菌,以使它们表达。为了筛选在结构上与抗原决定簇相似的肽,使大肠杆菌表面上表达的肽与抗原反应。
为了制备抗血清,导入上述模拟肽来免疫小鼠。经确认,如此获得的抗血清同时识别最初的载脂蛋白B-100、模拟肽和LDL(“用噬菌体展示的随机肽文库鉴定针对载脂蛋白A-1和载脂蛋白B-100的鼠单克隆抗体的抗原决定簇”,Chi-Hoon Kim,Hanyang Univ.,1997)。
本发明的载脂蛋白B-100表位的模拟肽可以是选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3的肽或是其混合物。
为了改进其抗原决定簇,本发明的模拟肽可以多联体形式使用。作为本发明的一个实施方案,两个或多个肽可相互连接。由3-15个肽组成的多联体是所希望的。更佳的,本发明的多联体包含四个SEQ ID NO:1的肽。
本发明的上述模拟肽的“多联体”指一种聚合物,其中上述模拟肽的末端相互连接。
本发明的上述模拟肽的“修饰肽”指可被载脂蛋白B-100的单克隆或多克隆抗体识别的模拟肽变体。这些变体包括对本发明的模拟肽中的一个或多个氨基酸进行置换、缺失、插入和化学取代。
本发明另一目的是提供一种制备模拟肽及其多联体和修饰肽的方法,该方法包括下列步骤:i)将编码上述模拟肽及其多联体和修饰肽的DNA插入载体内,ii)用上述载体转化宿主细胞,然后培养这些宿主细胞,iii)从上述宿主细胞中分离出上述模拟肽及其多联体或修饰肽。
疫苗组合物制剂可从本发明的模拟肽、其多联体或修饰肽通过任何常规方法来制得。在制备上述制剂的方法,组合物(其中活性化合物与免疫佐剂、增强免疫力的药物、载体、赋形剂和稀释剂混合)宜选自片剂、丸剂、颗粒剂、粉末剂、扁囊剂、悬浮剂、乳剂、液体、糖浆、气溶胶、软或硬的明胶胶囊、注射用无菌液体、无菌粉末等形式。
可用于本发明组合物的免疫佐剂是一种含有T细胞表位的蛋白质(例如乙型肝炎病毒的表面蛋白),诸如铝盐、膨润土、乳液、丙烯酸颗粒等的惰性载体;疏水性抗原(如脂质)、水包油和油包水乳剂、贮存脂肪形成物(如多糖)、T细胞激活剂如PPD、聚腺嘌呤、聚尿嘧啶等;B细胞激活剂(如B细胞促分裂素)、表面活性剂如皂素、溶血卵磷脂、视黄醛、quil A、脂质体等;增强巨噬细胞活性的材料;和补体旁路途径激活剂如胰岛素、酵母多糖、内毒素、左旋咪唑、C.parvum等。
本发明的“载体蛋白”指药学上可接受的能将本发明的模拟肽及其多联体和修饰肽输送通过血液的物质,如蛋白质或铝盐。
铝盐、苯氧乙基乙醇、水、生理盐水、乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖、甘露糖、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、无定形纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油可用作本发明组合物中的合适的载体、赋形剂或稀释剂。
另外,本发明组合物还可包含填充剂、抗粘合剂、润滑剂、润湿剂、香料、乳化剂和抗菌剂。
本发明的组合物可用本领域熟知的常规方法来配制,通过一次或多次接种在哺乳动物体内诱导产生免疫应答。
本发明的用来治疗肥胖的疫苗组合物可通过诸如口服、皮肤、皮内、静脉或肌肉等各种途径(较佳的是皮内给药)来给药。
本发明的疫苗组合物的有效剂量为0.1-10微克(活性肽)千克体重,较佳的为0.5-1.0微克/千克体重。然而,疫苗组合物的活性组分的实际剂量可根据免疫力状况、给药途径、患者状况、年龄、性别、体重等几个因素来决定。因此,所述剂量范围不以任何方式局限于本发明的范围。
本发明的疫苗组合物的主要药效是预防或治疗肥胖,其机理是由模拟肽或其多联体或修饰肽诱导产生的人抗体结合在LDL表面上载脂蛋白B-100的表位上,从而在空间上阻碍并抑制脂肪酶产生脂肪酸(肥胖的主要病因)。
另外,本发明的疫苗组合物还有抑制高脂血症的效果,其机理是模拟肽、其多联体或修饰肽诱导的偶联于LDL表面上载脂蛋白B-100表位上的人抗体引起调理作用,通过该调理作用,LDL很容易被检测到并被巨噬细胞除去。
本发明组合物的另一药物效果是通过抑制胆固醇和游离脂肪酸等脂质在细胞内的累积来预防或治疗肥胖,其机理是本发明的模拟肽、多联体或修饰肽诱导的人抗体与LDL表面上的载脂蛋白B-100表位结合,从而抑制LDL与外露在细胞表面上的LDL受体特异性结合。
附图简述
通过参照附图详细描述其较佳实施方案,本发明的上述目的和其它优点将更为明了,在附图中:
图1a至1d表示用来表达本发明模拟肽的载体的结构和组成。图1a表示前导盒的结构,图1b表示LB盒的结构,图1c表示BL盒的结构,图1 d表示pBX4表达载体的结构。
图2表示制备用于表达本发明模拟肽的pBX1和pBX4载体的步骤。
图3表示鉴定LB盒的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)的结果。
图4表示用于鉴定插入质粒pBlue-BL的BL盒的PAGE结果。
图5表示用来确认插入质粒pBX1和pBX3的DNA的方向和拷贝数的PAGE结果。
图6表示用来鉴定所表达的PB14肽的Western印迹结果。
图7表示用来确认纯化的PB14肽的十二烷基硫酸钠(SDS)PAGE的结果。
图8表示用来确认所纯化的PB14肽对抗PB14血清的反应性的Western印迹结果。
图9表示用来测定PB14肽诱导的小鼠抗体的亲和力的ELISA的结果。
图10的图表描述了PB14对小鼠体重增加的抑制效果。
图11a和11b描述了小鼠体重变化取决于在注射破坏下丘脑的药物后20周内是否给予本发明的PB14疫苗。
图12的图表表示PB14疫苗的注射对血清中脂质浓度的影响。
实施发明的最佳方式
下面将更详细地描述本发明。然而,下面描述的本发明仅仅是为了说明本发明的实施方案,而不是限制本发明的范围。
实施例1:寡核苷酸的合成和退火
寡核苷酸由Genemed Synthesis Inc.(San Francisco,CA,USA)根据本发明者要求的序列来进行化学合成。为了使寡核苷酸5′端磷酸化,使50微升100皮摩尔/微升寡核苷酸与10微升10mM ATP、3微升10U/微升T4多核苷酸激酶Takara,Otsu,Japan)以及7微升10X激酶缓冲液37℃培育2小时。
混合每10微升等份的上述磷酸化寡核苷酸,80℃加热5分钟,然后非常缓慢地冷却至室温,在互补链之间退火成特异性的配对。
实施例2:连接
混合1微升载体DNA、5微升插入物DNA、1微升T4 DNA连接酶(NEB,Beverly,MA,USA)、1微升10X酶反应缓冲液(NEB,Beverly,MA)和2微升蒸馏水,制得混合物,然后在16℃培育过夜,然后进行培育。
实施例3:用来表达载脂蛋白B-100的模拟肽的pBX表达载体的构建
步骤1:载体的设计
用来表达模拟肽的质粒载体通常包含前导盒和一个或多个PB1肽基因。如图1所示,将前导盒(图1a)克隆到pQE30质粒(Qiagen,Hilden,Germany)的多克隆位点内,制得含有一个PB1的质粒pBX1。用HindIII和SalI消化所得质粒,用LB盒(图1b)代替小片段,得到便于插入多个BL盒(图1c)的质粒pBX1。
同时,用SalI和XhoI切割质粒pBluescript II SK+,与随机发生一个或多个BL盒插入的BL盒连接。选择并切出质粒pBlue-BL,亚克隆到pBX1(图1d)中。
步骤2:表达PB1单肽的载体的制备
使通过实施例1和2相同方法合成的SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11寡核苷酸退火,制得前导盒。然后,将经SalI和BamHI切割的pQE30载体(Qiagen,Hilden,Germany)与上述连接盒连接,制得pQE前导质粒。由于上述pQE30载体的表达,为使蛋白容易纯化,在表达的蛋白质N端额外插入6个组氨酸残基。设计上述前导盒,使其包含肠激酶的识别位点(DDDDKI;SEQ ID NO:12),以将额外的氨基酸减少至最小值。
根据实施例1的方法,合成4个寡核苷酸(其序列用SEQ ID NO:4-7表示),使它们磷酸化,然后分别与互补的寡核苷酸退火,以便合成图1b的LB盒(SEQ ID NO:13和14)。将40微升退火的寡核苷酸与3微升1U/微升T4 DNA连接酶、5微升10X酶缓冲液以及2微升蒸馏水一起混合,制得连接混合物。然后,培育连接混合物过夜,使寡核苷酸相互连接。
反应完成后,将反应混合物加载到20%聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳。用溴化乙锭(EtBr)给凝胶染色,鉴定LB盒(52bp寡核苷酸)。
在图3中,泳道M是20bp DNA梯序列标记,泳道1是反应溶液。用QIAEX II凝胶抽提试剂盒(Qiagen,Hilden,Germany)从凝胶获得LB盒。
用Hind III和SalI切割上述pQE-前导序列,然后按照实施例2与上述LB盒连接,制得PB1模拟肽的表达载体。制得的表达载体命名为pBX1,载体表达的肽命名为PB11肽(参见图2)。
步骤3:PB11肽多联体的表达载体的制备
根据实施例1的方法,合成具有SEQ ID NO:4、5、8和9所示序列的四个寡核苷酸并磷酸化,然后分别与互补的寡核苷酸退火,以合成图1c所示的BL盒(SEQ IDNO:15和16)。随后,象步骤2那样,使这些寡核苷酸相互连接,然后加样到20%聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳。通过溴化乙锭凝胶染色,鉴定出55bp的寡核苷酸(前导盒)。用QIAEX II凝胶抽提盒从凝胶获得BL盒,然后用SalI和XhoI切割。
同时,用SalI和XhoI切割pBluescript II SK(Stratagene,La Jolla,CA,USA)。载体在0.8%琼脂糖凝胶上电泳,然后用QIAEX II凝胶抽提盒(Qiagen,Hilden,Germany)来获得。
用5微升BL盒DNA和1微升上述切割载体DNA进行与实施例2相同的连接反应,获得pBlue-BL质粒。
用SalI和XhoI切割pBlue-BL,抽提该BL盒。将该BL盒插入步骤2中制得的pBX1载体的SalI位点内,制得质粒pBX2。另外,将插入pBX1载体的SalI位点的BL盒数目从2改为3(参见图2),制得pBX3和pBX4。
pBX2、pBX3和pBX4载体表达的肽是有2-4个PB1肽的多联体。它们分别命名为PB12、PB13和PB14。
步骤4:插入物的鉴定
用pBlue-BL质粒转化宿主细胞(大肠杆菌M15[pREP4];Qiagen,Hilden,Germany),然后涂在1%琼脂板上,37℃培育16小时,使大肠杆菌菌落形成。将琼脂板上形成的一个菌落接种在10毫升LB培养基中,37℃摇瓶培育16小时,然后用DNA纯化系统(Wizard PLUS SV DNA miniprep DNA纯化系统;Pormega,Madison,W1,USA)分离质粒。将从转化的大肠杆菌收获的质粒与SalI和XhoI限制酶一起培育,使其在37℃受切割1小时,然后用20%PAGE分析(图4)。在图4中,泳道M表示20bpDNA梯序列,泳道1表示步骤3获得的寡核苷酸产物,泳道2表示通过20%PAGE从步骤3分离的BL盒DNA,泳道3表示经限制酶处理的重组pBlue-BL质粒。如图4所示,确认pBlue-BL质粒含有BL盒。
用pBX1或pBX3质粒转化大肠杆菌(M15[pREP4]),如上所述分离质粒DNA,以确认DNA盒插入物的数目和方向。分离的质粒用SalI和HindIII限制酶切割,用20%PAGE分析(图5)。在图5中,泳道M表示20bp DNA梯序列,泳道1和3表示含有LB但不是BL盒的pBX1质粒,泳道2表示具有一个LB和两个BL盒(具有正确方向)的质粒。另一方面,泳道4表示了具有一个LB和两个BL盒(但有相反的方向)的质粒。如图5所示,限制酶图谱能鉴定有多少B盒(BL或LB盒)插入以及它们以何方向插入pBX载体。
另外,从转化的大肠杆菌收获的质粒中所插入的B盒的DNA序列经确认与设计的序列相同。质粒用Wizard PLUS DNA miniprep试剂盒来制备,用Sequennase(2.1版)DNA测序试剂盒(Amersham,Cleveland,UK)来测序。
实施例4:PB14肽在大肠杆菌中的表达及其纯化
步骤1:PB14肽表达的确认
为了确认PB14肽的表达,在含有氨苄青霉素和卡那霉素的LB琼脂肉汤上培育三种转化的大肠杆菌M15[pREP4]。一种大肠杆菌M15[pREP4]用质粒pBX4转化,另一种用pQE30作模拟转化,还有一种是未转化的大肠杆菌M15[pREP4]。将从固体培养物形成的每个菌落分别接种到含有100微升/毫升氨苄青霉素和25微升/毫升卡那霉素的液体LB培养基中,培育过夜。37℃振摇培育该培养物1小时,直至600nm下的O.D值达到0.5-0.7。随后,将1mM异丙基-硫代-β-半乳糖吡喃糖苷(IPTG)加入培养基中,以实现重组蛋白的表达,然后再在37℃下培育5小时。取1毫升培养基,14000rpm下离心2分钟,使细菌细胞沉淀。将细胞沉淀悬于50微升2X SDS溶液[100mM Tris-ClpH6.8,20%甘油(w/v),4%SDS(w/v),2%2-巯基乙醇,0.001%溴苯蓝]中,用于SDS-PAGE中。将悬浮的溶液加热至95℃,加热5分钟,然后将10微升溶液加样到浇注凝胶孔上,在20mA下电泳5小时(Mighty Small II,Hoefer,USA)。浓缩胶和分离胶的丙烯酰胺浓度分别采用5%和15%,用预先染色的标准品SeeBlue(250Kda至4kDa;NOVEX,San Diego,CA,USA)或范围宽的标准品Mark12(200kDa至2.5kDa)作为标准分子标记蛋白。电泳后,用考马斯亮蓝R-250染色1小时,染料用脱色液(5%甲醇和7%乙酸)脱色10小时。
为了确认所表达的蛋白质是PB14肽,用抗PB1家兔抗体对电泳凝胶中的蛋白质进行Western印迹(图6)。用Bio-Synthesis,Inc.(Lewisville,TX,USA)化学合成的PB1肽偶联的卵白蛋白进行免疫,产生抗血清。在图6中,泳道M表示预先染色的标准品SeeBlue标记,泳道1表示用来培育未转化的大肠杆菌M15[pREP4]的培养基,泳道2表示用来培育经pQE30载体转化的大肠杆菌M15[pREP4]的培养基,泳道3表示用来培育经pBX4载体转化的大肠杆菌M15[pREP4]的培养基。
如图6所示,只有经pBX4转化的大肠杆菌表达的重组PB14肽表现出与抗PB1小鼠血清有特异性免疫力。
步骤2:表达的肽的溶解度的鉴别
用与步骤1相同的方法培育经pBX4载体转化的大肠杆菌M15[pREP4]。取10毫升培养基,离心收获细胞。将细胞沉淀悬浮于5毫升细胞裂解液(300mM NaCl,50mM NaH2PO4,10mM咪唑,pH8.0)中,从细胞获得天然蛋白。冷却后,用超声波对沉淀悬浮的溶液进行20轮超声处理,以使细胞裂解。4℃、10000rpm下离心30分钟,取上清液。将相同体积的2X SDS溶液与该溶液混合,如步骤1中同一方法那样进行SDS-PAGE。每一溶液在95℃沸腾5分钟后,SDS-PAGE确认从可溶的抽提物A中能分离纯化得到PB14肽,因为它被包含不溶性粗抽提物B中。
步骤3:PB14肽的纯化
步骤3-1:亲和层析
用纯化His-加尾的蛋白质的Ni-NTA树脂来纯化步骤1中的重组肽。利用树脂中的饱和的Ni+和所表达的蛋白质末端的组氨酸残基之间的吸引力的亲和层析是方便地纯化所述蛋白的熟知方法。
首先将经pBX4转化的大肠杆菌M15[pREP4]接种到1升LB培养基中,37℃培育至600nm OD值超过0.6。LB培养基与pBX4载体之比为50∶1。加入IPTG至最终浓度为1mM,再次培育5小时。培育后,6000xg下离心培养基30分钟,获得细胞沉淀,将沉淀保藏于-70℃下过夜。使沉淀在冰中溶解,悬浮于溶解溶液(300mM NaCl,50mM NaH2PO4,10mM咪唑,pH8.0)中,其中每1克沉淀采用5毫升溶解溶液。用步骤2的方法通过超声处理使细胞裂解,然后在室温下、10000Xg下离心30分钟。加入与沉淀体积相同的缓冲液(8M尿,0.1M NaH2PO4,0.01M Tris-HCl pH8.0),使细胞碎片重新悬浮,并使其中的蛋白质变性,用简单的超声波处理沉淀悬浮的溶液,使更多的蛋白质溶解在缓冲液中。悬浮液于8000rpm下离心30分钟,以除去未溶解在8M脲中的细胞碎片。在4毫升上述上清液中,加入4℃的1毫升Ni-NTA树脂,200rpm下振摇2小时,以捕获含有His-尾的蛋白质。
将含有蛋白质/Ni-NTA复合物的该上清液仔细导入层析柱(大小为2厘米(内径)×2.7厘米(高))中。在树脂沉降后,打开塞帽,使过量缓冲液滤干。用20毫升中性pH缓冲液(8M脲,0.1M NaH2PO4 0.1M Tris-HCl pH6.3)洗柱,随后用20毫升另一缓冲液(8M脲,0.1M NaH2PO4 0.01M Tris-HCl pH6.3)洗柱,以洗去与Ni-NTA树脂非特异性结合的蛋白质。倒入5毫升低pH缓冲液(8M脲,0.1M NaH2PO4 0.1M Tris-HClpH5.9)两次,随后倒入5毫升强酸缓冲液(8M脲,0.1M NaH2PO4 0.1M Tris-HCl pH4.5)4次,洗脱出含有His-尾的目标蛋白,然后用SDS-PAGE,用15%丙烯酰胺凝胶(图7)来确认洗脱的目标蛋白。在图7中,泳道M表示预先染色的SeeBlue分子大小标记物,泳道1表示纯化的PB14肽。
使上述纯化的蛋白质对PBS(8克/升氯化钠,0.2克/升氯化钾,1.44克/升NaH2PO4和0.24克/升KH2PO4)透析,以重新获得它们最初的构型。所用的透析管的分子量截留大小为3500Da。在透析期间,前5小时先用3升含2M脲的PBS,然后用5升没有脲的PBS两次,过夜。
步骤3-2:疏水层析
为了提高步骤3-1所得PB14肽的纯度,进行疏水层析。在步骤3-1中从Ni-NTA洗脱的含PB14肽的溶液中逐量加入硫酸铵至最终浓度为20%,然后调节至pH7.0。在10%的硫酸铵完全溶化后使溶液静置3小时以上,然后将溶液加样到苯基sepharose柱[填料:苯基sepharose Fast Flow树脂(Phamacia,Sweden);柱体积为1厘米(内径)×3厘米(高度)]中。
在从10%到0%的硫酸铵的反向梯度下,以0.5毫升/分钟将洗脱液(8M脲,0.1MNaH2PO4 0.01M Tris-HCl pH6.3)倒入柱内,洗脱出各组分,将各组分加样在凝胶上进行SDS-PAGE。收集含有PB14肽的组分,在待脱盐的缓冲液中透析,同时除去用作变性剂的脲。
步骤3-3:His-尾的除去
在适合用来除去纯化的His-尾蛋白中的变性剂和咪唑等物质以及用来激活肠激酶的缓冲液(50mM NaCl,20mM Tris-HCl,2mM CaCl2 pH7.4)中加入2M脲。用上述含脲缓冲液使PB14肽脱盐,对步骤3-2获得的透析的PB14肽再次进行透析,在此期间,通过对不含脲的缓冲液进行反复透析来逐渐降低脲浓度。将3U/毫升肠激酶加入含PB14肽的溶液中,用所述第二缓冲液与该缓冲液交换,并在23℃下培育。每小鼠取溶液进行SDS-PAGE分析,以检查有His-尾的PB1(PB14 +his)肽中His-尾的除去量。
步骤3-4:离子交换层析
用离子交换层析除去肠激酶处理后产生的不需要的蛋白质和肽。
在透析缓冲液(2M脲,0.1M NaH2PO4,0.01M Tris-HCl,pH7.0)中对步骤3-3获得的含PB14 -his肽的溶液进行透析,充分交换缓冲液。将经过透析的溶液加样到DEAEsepharose树脂(Phamacia,uppsala,Sweden)上。随后,用平衡缓冲液(50mM磷酸钠缓冲液,2M脲,pH7.0)使该柱平衡,用另一缓冲液(50mM磷酸钠缓冲液,2M脲,1M氯化钠)在氯化钠浓度梯度0-1M下进行洗脱(流速为0.5毫升/分钟)。回收每一组分,然后合并含有目标蛋白的组分。在浓缩各区室后,用SDS-PAGE确认PB14 -his肽的存在。
步骤4:PB14的定量分析
用micro BCA试剂(Pierce,Rockford,USA)通过比色分析来定量分析用步骤3相同方法获得的纯化的PB14肽。
步骤5:重组PB14肽的特性确认
用ECL(Amersham,Cleveland,UK)进行Western印迹试验,确认步骤3中纯化的PB14肽的纯度,以及它们对用合成的PB14肽作为抗原获得的抗血清的免疫原性。在SDS-PAGE(实施例2,步骤1)后,使凝胶与PVDF膜一起在缓冲液(0.3%Tris,1.5%甘氨酸,20%甲醇)中在60V恒定电压下培育3小时,以使凝胶中的蛋白质转移到PVDF膜上。然后,使带印迹的膜与5毫升封闭液(TBS pH7.5,5%脱脂奶粉(w/v),0.02%吐温20)培育1.5小时,然后用TTBS(含有0.1%吐温20的Tris缓冲的盐溶液)分别洗涤三次各15分钟、5分钟和5分钟。用TTBS溶液以1∶5000的比例稀释抗肽PB1(指实施例2的步骤1)的抗血清,然后和膜一起培育1.5小时,以确认PB14肽,抗PB14肽的抗血清的纯度(实施例3)。在用TTBS依次洗涤凝胶三次(15分钟,5分钟和5分钟),使膜在室温下与一溶液一起培育1.5小时,该溶液中碱性磷酸酶-F(ab)′2-山羊抗小鼠IgG(H+L)(Zymed,San Fransisco,CA)用TTBS溶液以1∶1000的比例稀释。再次用TTBS洗涤该膜三次,然后加入BCIP/NBT(5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐/氮蓝四唑(Sigma))。染色后,用TTBS溶液除去BCIP/NBT溶液。Western印迹分析的结果是,所表达的PB14肽能被抗PB14血清识别。
在ECL情况下,采用PVDF膜(Gelman Science,BioTraceR)代替硝酸纤维素膜。另外,第一抗体所用比例为1∶10000,用HRP偶联的家兔抗小鼠IgG(Pierce,Rockford,IL,USA)作为第二抗体,其比例为1∶10000。在颜色反应中采用每25毫升溶液B有1毫升的ECL+Plus Western印迹试剂溶液A(Amersham)。当产生足够的颜色后,将膜插入胶片盒中在胶片上分别曝光5、10、20和30秒,使凝胶上的条带被检测到(图8)。在图8中,泳道M表示ECL检测标记(Gibco BRL),泳道1表示PB14肽。从图8的结果来看,表达的PB14肽能被抗PB14血清识别。
另外,用Protein G柱(Bio-Rad,USA)从家兔血清中分离出的多克隆抗体对PB14肽进行Western印迹分析,获得了相同的结果。
实施例5:抗PB14肽小鼠抗体的制备
本文所用的PB14肽是实施例2步骤3-3中除去了His-尾的PB14 -his肽。
步骤1:PB14肽和OVA之间的连接
卵白蛋白(OVA)作为载体蛋白以1∶10的摩尔比加入实施例2步骤2中的纯化的PB14肽中,4℃下培育1小时。在PB14肽的卵白蛋白溶液中加入相同体积的2%(v/v)戊二醛,连续振摇并培育1小时。然后,在反应混合物中加入甘氨酸直至最终浓度为0.2M才终止其中进行的反应。
反应后,用MWCO 12000-14000透析膜(SpectrumR,Dominguez,CA,USA)透析除去反应混合物中的其余的戊二醛-甘氨酸。
步骤2:对小鼠进行免疫
浓缩步骤1中与OVA相连的肽,用来免疫小鼠。待注入小鼠的抗原量为5微克,这是PB14肽在与OVA相连之前的量。用相同量的佐剂乳化抗原,以0.2毫升的用量注入小鼠的腹腔内。
用完全弗氏佐剂(CFA)作为第一次注射的佐剂,不完全的弗氏佐剂(IFA)作为加强免疫的佐剂,每隔两周免疫两次。在对照小鼠中,注入BSA(牛血清白蛋白)。
在最后一次注射的5天后,用心脏穿刺从小鼠取1毫升血,37℃下凝血30分钟。然后,在4℃、2500xg下离心血液30分钟,除去血中的凝块。对于待完全浓缩的其余的凝血剂,4℃下培育上清液(血清)过夜,10000xg离心20分钟。将所得上清液等份分到几个管内。待用于实验的血清4℃保存,而其余的血清-20℃保存。
步骤3:用间接ELISA测定抗PB14肽抗体的亲和力
用步骤2获得的血清来测定抗体的亲和力。将100微升PB14肽分配到96孔微量滴定板(Flacon:预结合)的每个孔内,4℃下静置6小时或更长时间,然后用TTBS(Tris缓冲盐溶液,含有0.05%吐温20)洗涤3次。在每个孔内加入200微升封闭液(含1%BSA的TTBS),37℃下培育1小时,然后用TTBS洗涤3次。经封闭液以1∶102-1∶105比例稀释的100微升分离血清加入反应溶液中,37℃培育1小时,然后用200微升TTBS洗涤3次。将经封闭液1∶103稀释的100微升HRP相连的山羊抗家兔IgG抗体(Pierce,Rockford,IL)加入反应溶液中,37℃培育1小时,用200微升TTBS洗涤3次。将HRP底物试剂盒(Bio-Rad)的溶液A与其溶液B以9∶1的比例混合。将100微升的所得混合物加入反应溶液中,显色30分钟,然后用ELISA leader(EL312e,Bio-Tek Ins.)(图9)测定反应混合物在405nm下的吸光度。在图9中,确认对PB14肽特异性的小鼠抗体可以1000倍的稀释度(图中的X轴的3.0)用于Western印迹和ELISA分析。
实施例6:利用小鼠模型的PB14疫苗的抗肥胖效果
步骤1:在小鼠中诱导肥胖
这里采用5周龄ICR小鼠(Korea Center for Animal Experiment Ltd.,Seoul,Korea)。小鼠喂养于饲养场,温度保持在17℃至25℃,喂以混合饲料(Sam Yang Feed Ltd.,Seoul,Korea,[组分:水11.8%以上,蛋白质20.0%以上,粗制脂质10.0%以上,粗纤维10.0%以上,粗制灰10.0%以上,钙0.6%以下和磷0.4%以上])。给予小鼠Goldthioglucose(GTG)以诱导肥胖。GTG在诱导腹侧正中下丘脑核(VMH)脱敏方面有一定作用。因此,给予GTG的小鼠不感到饱,并始终有进食的欲望。这里所用的GTG是非常不稳定的化合物,它很容易在水中或湿气中降解。因此,用1毫升芝麻油(SigmaInc.)稀释100毫克GTG(Sigma,Inc.),并采用Brecher等人(Brechere G.和Waxler,S.H.Proc.Soc.Exp.Biol.Med.,70:498-501(1949))的相同方法来给予适量的GTG。
将小鼠分成测试组(20只小鼠)和对照组(4只小鼠),将25毫升GTG注射入测试组,而对照组不注射。
在实验前测定测试组小鼠的体重,选出体重偏差不明显的小鼠用来进行实验。注射GTG后1周测得的小鼠体重在26.5至29.5克范围内。
注射GTG组的7只小鼠被诱发肥胖,而其余的小鼠则没有变胖。给没有诱发变胖的小鼠再次注射GTG,然后所有的小鼠被诱发变胖。
将所有诱导变胖的小鼠分成3组。第二次注射GTG后一周,用实施例3步骤2中的方法将PB14肽注射入由7只小鼠组成的测试组1的小鼠中。另外,在3组的另一组小鼠(测试组2,有7只小鼠)中注射卵白蛋白代替PB14肽作为模拟实验,还有一组(测试组3,有6只小鼠)不注射疫苗以诱导肥胖。另一方面,将0.2毫升PBS注射入对照组中,与测试组比较,以确认本发明疫苗的效果。
另外,将这里所用的饲料与蛋黄混合并在50℃下干燥,以诱导胆固醇的摄取,从而使小鼠血清中的胆固醇水平升高。提供足量的饲料,以引起与胆固醇水平相关的疾病。每日测定小鼠体重。
如图10所示,在注射GTG 12周后,测试组1(-▲-▲-)的注射疫苗的小鼠的体重从27.7±0.4克增加至52.2±1.7克。从该数据得出结论,测试组1与对照组(-○-○-)之间体重增加没有显著差别。然而,肥胖后注射了卵白蛋白的测试组2(-●-●-)和诱导肥胖后不注射疫苗的测试组(-■-■-)的小鼠体重从28.3±0.5克持续增加至68.9±2.8克。因此,确认通过注射PB14肽疫苗能抑制肥胖。
在图10中,G1和G2代表GTG注射的时间,V1,V2和V3代表PB14肽疫苗的注射时间。
图11显示了诱导产生肥胖的小鼠的外观。将测试组1的20周龄小鼠(图11a:正常小鼠)和测试组3的20周龄小鼠(图11b:肥胖的小鼠)相比较。如图11所示,确认本发明的疫苗可有效地抑制肥胖。
步骤2:测定血中胆固醇的水平
在第一次注射GTG后,将对照组的12周龄小鼠的血液胆固醇水平与测试组1和2的注射了GTG的12周龄小鼠的血液胆固醇水平比较。用Cholestezyme-V,Triglyzyme-V,HDL-C555(Shin Yang Chemicals,Seoul,Korea)和LDL-EX试剂盒(DenkaBio-Research,Ltd.,Tokyo,Japan),通过酶促方法测定总胆固醇、甘油三酯、HDL-胆固醇和LDL-胆固醇的浓度。在每个实验中,用标准的标定器-D(Denka Bio-Research,Ltd.,Tokyo,Japan)获得O.D值的标准曲线,以减少实验误差。根据标定曲线计算出感兴趣的O.D值,以确认脂质的浓度和含量,其结果显示在表1和图12中。
总胆固醇 | TG | HDL-C | ||
对照 | 79±3.7 | 180±26 | 59±3.4 | |
测试组1 | 118±3.6 | 217±47 | 92±4.7 | 20±1.7 |
测试组2和3 | 131±8.8 | 218±70 | 119±7.5 | 30±4.5 |
TG:甘油三酯,HDL-C:HDL-胆固醇LDL-C:LDL-胆固醇 |
如表1和图12所示,肥胖诱导的结果确证测试组的胆固醇含量没有显著差别,而总胆固醇、HDL-C以及LDL-C的总血液浓度少量增加(图12)。
工业实用性
本发明的含有载脂蛋白B-100表位的模拟肽、其多联体和修饰肽的疫苗组合物能抑制肥胖的发生而不引起生物体内的自身免疫。
因此,用本发明的疫苗能比暂时性的且成本高的抑制胆固醇代谢有关酶的常规方法更有效地治疗与LDL有关的循环疾病。
尽管本发明参照其具体实施例作了特别的说明和描述,但是本领域技术人员将会理解,在不脱离所附权利要求所确定的本发明宗旨和范围内可以有各种形式和细节上的变化。
序列表
序列表<110>金晓骏<120>载脂蛋白B-100表位的模拟肽、其多联体和修饰肽,以及含有这些肽的疫苗组合物<130>SJPA0103PCT<150>KR10-2000-0052055<151>2000-09-04<160>16<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>15<212>PRT<213>人工序列<220><223>载脂蛋白B-100的模拟肽<400>1Arg Asn Val Pro Pro Ile Phe Asn Asp Val Tyr Trp Ile Ala Phe1 5 10 15<210>2<211>15<212>PRT<213>人工序列<220><223>载脂蛋白B-100的模拟肽<400>2Arg Phe Arg Gly Leu Ile Ser Leu Ser Gln Val Tyr Leu Asp Pro1 5 10 15<210>3<211>15<212>PRT<213>人工序列<220><223>载脂蛋白B-100的模拟肽<400>3Ser Val Cys Gly Cys Pro Val Gly His His Asp Val Val Gly Leu1 5 10 15<210>4<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>构建BL或LB盒的寡核苷酸<400>4tcgaccgtaa tgttcctcct atc 23<210>5<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>构建BL或LB盒的寡核苷酸<400>5atcattgaag ataggaggaa cattacgg 28<210>6<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>构建LB盒的寡核苷酸<400>6ttcaatgatg tttattggat tgcattcta 29<210>7<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>构建LB盒的寡核苷酸<400>7agcttagaat gcaatccaat aaac 24<210>8<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>构建BL盒的寡核苷酸<400>8ttcaatgatg tttattggat tgcattcc 28<210>9<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>构建BL盒的寡核苷酸<400>9tcgaggaatg caatccaata aac 23<210>10<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>前导盒的上链<400>10gatccgatga tgatgacaag atcg 24<210>11<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>前导盒的下链<400>11tcgacgatct tgtcatcatc atcg 24<210>12<211>6<212>PRT<213>人工序列<220><223>肠激酶切割位点<400>12Asp Asp Asp Asp Lys Ile1 5<210>13<211>52<212>DNA<213>人工序列<220><223>LB盒的上链<400>13tcgaccgtaa tgttcctcct atcttcaatg atgtttattg gattgcattc ta 52<210>14<211>52<212>DNA<213>人工序列<220><223>LB盒的下链<400>14agcttagaat gcaatccaat aaacatcatt gaagatagga ggaacattac gg 52<210>15<211>51<212>DNA<213>人工序列<220><223>BL盒的上链<400>15tcgaccgtaa tgttcctcct atcttcaatg atgtttattg gattgcattc c 51<210>16<211>51<212>DNA<213>人工序列<220><223>BL盒的下链<400>16tcgaggaatg caatccaata aacatcattg aagataggag gaacattacg g 51
Claims (18)
1.一种如SEQ ID NO:1所示的载脂蛋白B-100表位的模拟肽及其多联体。
2.根据权利要求1所述的模拟肽的多联体,其中所述多联体包含1-15个所述模拟肽。
3.根据权利要求1所述的模拟肽的多联体,其中所述多联体包含4个串联连接的所述模拟肽。
4.根据权利要求1所述的模拟肽及其多联体,其中所述模拟肽的氨基酸序列用选自增加、缺失和化学取代的方法来进行修饰。
5.一种如SEQ ID NO:2所示的载脂蛋白B-100表位的模拟肽。
6.根据权利要求5所述的模拟肽,其中所述多联体包含1-15个所述模拟肽。
7.根据权利要求5所述的模拟肽多联体,其中所述多联体包含4个串联连接的所述模拟肽。
8.根据权利要求5所述的模拟肽,其中所述模拟肽的氨基酸序列用选自增加、缺失和化学取代的方法来修饰。
9.一种如SEQ ID NO:3所示的载脂蛋白B-100表位的模拟肽。
10.根据权利要求9所述的模拟肽的多联体,其中所述多联体包含1-15个所述模拟肽。
11.根据权利要求9所述的模拟肽的多联体,其中所述多联体包含4个串联连接的所述模拟肽。
12.根据权利要求9所述的模拟肽,其中所述模拟肽的氨基酸序列用选自增加、缺失和化学取代的方法来进行修饰。
13.一种治疗肥胖的疫苗组合物,它包含选白SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的载脂蛋白B-100表位的模拟肽、其多联体和修饰肽的肽以及这些肽的混合物。
14.根据权利要求13所述的疫苗组合物,所述疫苗组合物用皮内注射来给药。
15.根据权利要求13所述的疫苗组合物,其中所述疫苗组合物的类型选自片剂、丸剂、颗粒剂、扁囊剂、酏剂、悬浮剂、乳剂、溶液、糖浆、气溶胶、软或硬的明胶胶囊、可注射的无菌液体和无菌粉末。
16.一种制备载脂蛋白B-100表位的模拟肽、其多联体和修饰肽的方法,该方法包括
i)将编码SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的载脂蛋白B-100表位的模拟肽、其多联体和修饰肽的遗传信息的DNA插入载体的步骤;
ii)用步骤i)所得载体转化宿主细胞并培育该宿主细胞的步骤;
iii)从宿主细胞中分离出所述载脂蛋白B-100表位的模拟肽、其多联体和修饰肽的步骤。
17.一种DNA,它编码由4个SEQ ID NO:1所示的载脂蛋白B-100表位的模拟肽串联连接组成的多肽。
18.一种表达载体,它包含编码由4个SEQ ID NO:1所示的载脂蛋白B-100表位的模拟肽串联连接组成的多肽的DNA片段。
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