LT4989B - Apolipoproteino b-100 epitopo mimeziniai peptidai, jų konkatemerai ir modifikuotieji peptidai, ir juos turinti vakcinos kompozicija - Google Patents
Apolipoproteino b-100 epitopo mimeziniai peptidai, jų konkatemerai ir modifikuotieji peptidai, ir juos turinti vakcinos kompozicija Download PDFInfo
- Publication number
- LT4989B LT4989B LT2002051A LT2002051A LT4989B LT 4989 B LT4989 B LT 4989B LT 2002051 A LT2002051 A LT 2002051A LT 2002051 A LT2002051 A LT 2002051A LT 4989 B LT4989 B LT 4989B
- Authority
- LT
- Lithuania
- Prior art keywords
- peptide
- mimetic
- concatemer
- peptides
- apoliprotein
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 126
- 108091028732 Concatemer Proteins 0.000 title claims abstract description 35
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 34
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 31
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 30
- 108091005601 modified peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 20
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 claims abstract description 22
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 claims abstract description 22
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 40
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 23
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 23
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 13
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 12
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 7
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 4
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 claims description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 3
- 239000001828 Gelatine Substances 0.000 claims description 2
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 claims description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 claims description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 claims description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 claims description 2
- 239000006187 pill Substances 0.000 claims description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 2
- 239000006188 syrup Substances 0.000 claims description 2
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000003826 tablet Substances 0.000 claims description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims 1
- 102000006991 Apolipoprotein B-100 Human genes 0.000 abstract 1
- 108010008150 Apolipoprotein B-100 Proteins 0.000 abstract 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 34
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 33
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 24
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 23
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 22
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 20
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 19
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 18
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 17
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 17
- XHVAWZZCDCWGBK-WYRLRVFGSA-M Aurothioglucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](S[Au])[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O XHVAWZZCDCWGBK-WYRLRVFGSA-M 0.000 description 16
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 15
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 15
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 13
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 13
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 108010007622 LDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 11
- 102000007330 LDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 11
- 108010028554 LDL Cholesterol Proteins 0.000 description 10
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 10
- 101100189471 Mus musculus Pbx1 gene Proteins 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 9
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 8
- 238000008214 LDL Cholesterol Methods 0.000 description 8
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 8
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 8
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 8
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 8
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 7
- 241001596967 Escherichia coli M15 Species 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 6
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 6
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 6
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 108010023302 HDL Cholesterol Proteins 0.000 description 5
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 5
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 229940083575 sodium dodecyl sulfate Drugs 0.000 description 5
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 4
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 description 4
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010067902 Peptide Library Proteins 0.000 description 4
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091006054 His-tagged proteins Proteins 0.000 description 3
- 208000035150 Hypercholesterolemia Diseases 0.000 description 3
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 3
- 108010062497 VLDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 3
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 3
- AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N alumane Chemical class [AlH3] AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 238000013116 obese mouse model Methods 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP(O)(=O)O)=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 102000000853 LDL receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010001831 LDL receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 2
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 2
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 2
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- -1 cachets Substances 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 235000021588 free fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 229940023041 peptide vaccine Drugs 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003656 tris buffered saline Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IHUKVJKKTBLTEE-QMMMGPOBSA-N (2s)-2-acetamido-5-[[amino-(methylcarbamoylamino)methylidene]amino]-n-methylpentanamide Chemical compound CNC(=O)NC(N)=NCCC[C@H](NC(C)=O)C(=O)NC IHUKVJKKTBLTEE-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- HSINOMROUCMIEA-FGVHQWLLSA-N (2s,4r)-4-[(3r,5s,6r,7r,8s,9s,10s,13r,14s,17r)-6-ethyl-3,7-dihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]-2-methylpentanoic acid Chemical compound C([C@@]12C)C[C@@H](O)C[C@H]1[C@@H](CC)[C@@H](O)[C@@H]1[C@@H]2CC[C@]2(C)[C@@H]([C@H](C)C[C@H](C)C(O)=O)CC[C@H]21 HSINOMROUCMIEA-FGVHQWLLSA-N 0.000 description 1
- ASWBNKHCZGQVJV-UHFFFAOYSA-N (3-hexadecanoyloxy-2-hydroxypropyl) 2-(trimethylazaniumyl)ethyl phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C ASWBNKHCZGQVJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-L (5-bromo-4-chloro-1h-indol-3-yl) phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP([O-])(=O)[O-])=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- WURBVZBTWMNKQT-UHFFFAOYSA-N 1-(4-chlorophenoxy)-3,3-dimethyl-1-(1,2,4-triazol-1-yl)butan-2-one Chemical compound C1=NC=NN1C(C(=O)C(C)(C)C)OC1=CC=C(Cl)C=C1 WURBVZBTWMNKQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PRBJTPCAKUBWAO-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;pentanedial Chemical compound NCC(O)=O.O=CCCCC=O PRBJTPCAKUBWAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WBTFUMUXXHWTLD-UHFFFAOYSA-N 4-phenoxybutan-2-ol Chemical compound CC(O)CCOC1=CC=CC=C1 WBTFUMUXXHWTLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 206010003210 Arteriosclerosis Diseases 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010004103 Chylomicrons Proteins 0.000 description 1
- 241000037164 Collema parvum Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010010234 HDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000015779 HDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 208000031226 Hyperlipidaemia Diseases 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 208000015580 Increased body weight Diseases 0.000 description 1
- 229920001202 Inulin Polymers 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 108010013563 Lipoprotein Lipase Proteins 0.000 description 1
- 102100022119 Lipoprotein lipase Human genes 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 239000004909 Moisturizer Substances 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 101150103639 PB1 gene Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-4-[(2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hy Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1CC[C@]2(C)[C@H]3CC=C4[C@@]([C@@]3(CC[C@H]2[C@@]1(C=O)C)C)(C)CC(O)[C@]1(CCC(CC14)(C)C)C(=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O[C@H]4[C@@H]([C@@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N acrylic acid group Chemical group C(C=C)(=O)O NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000000181 anti-adherent effect Effects 0.000 description 1
- 230000002421 anti-septic effect Effects 0.000 description 1
- 208000011775 arteriosclerosis disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000005784 autoimmunity Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000003613 bile acid Substances 0.000 description 1
- 239000007844 bleaching agent Substances 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000378 calcium silicate Substances 0.000 description 1
- 229910052918 calcium silicate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012241 calcium silicate Nutrition 0.000 description 1
- OYACROKNLOSFPA-UHFFFAOYSA-N calcium;dioxido(oxo)silane Chemical compound [Ca+2].[O-][Si]([O-])=O OYACROKNLOSFPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 235000020974 cholesterol intake Nutrition 0.000 description 1
- 150000001841 cholesterols Chemical class 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000000701 coagulant Substances 0.000 description 1
- 238000007398 colorimetric assay Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 235000008504 concentrate Nutrition 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 1
- 235000013345 egg yolk Nutrition 0.000 description 1
- 210000002969 egg yolk Anatomy 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000002267 hypothalamic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003016 hypothalamus Anatomy 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 210000004201 immune sera Anatomy 0.000 description 1
- 229940042743 immune sera Drugs 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- JYJIGFIDKWBXDU-MNNPPOADSA-N inulin Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)OC[C@]1(OC[C@]2(OC[C@]3(OC[C@]4(OC[C@]5(OC[C@]6(OC[C@]7(OC[C@]8(OC[C@]9(OC[C@]%10(OC[C@]%11(OC[C@]%12(OC[C@]%13(OC[C@]%14(OC[C@]%15(OC[C@]%16(OC[C@]%17(OC[C@]%18(OC[C@]%19(OC[C@]%20(OC[C@]%21(OC[C@]%22(OC[C@]%23(OC[C@]%24(OC[C@]%25(OC[C@]%26(OC[C@]%27(OC[C@]%28(OC[C@]%29(OC[C@]%30(OC[C@]%31(OC[C@]%32(OC[C@]%33(OC[C@]%34(OC[C@]%35(OC[C@]%36(O[C@@H]%37[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O%37)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%36)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%35)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%34)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%33)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%32)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%31)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%30)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%29)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%28)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%27)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%26)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%25)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%24)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%23)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%22)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%21)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%20)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%19)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%18)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%17)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%16)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%15)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%14)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%13)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%12)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%11)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%10)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O9)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O8)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O7)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O6)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 JYJIGFIDKWBXDU-MNNPPOADSA-N 0.000 description 1
- 229940029339 inulin Drugs 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 230000037356 lipid metabolism Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000001333 moisturizer Effects 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- IUJLOAKJZQBENM-UHFFFAOYSA-N n-(1,3-benzothiazol-2-ylsulfanyl)-2-methylpropan-2-amine Chemical compound C1=CC=C2SC(SNC(C)(C)C)=NC2=C1 IUJLOAKJZQBENM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FSVCQIDHPKZJSO-UHFFFAOYSA-L nitro blue tetrazolium dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].COC1=CC(C=2C=C(OC)C(=CC=2)[N+]=2N(N=C(N=2)C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC(=CC=2)[N+]([O-])=O)=CC=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 FSVCQIDHPKZJSO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000014207 opsonization Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000016446 peptide cross-linking Effects 0.000 description 1
- 239000002304 perfume Substances 0.000 description 1
- 108700010839 phage proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010014366 phagocytosis-inhibitory factor Proteins 0.000 description 1
- 230000004526 pharmaceutical effect Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- CMPQUABWPXYYSH-UHFFFAOYSA-N phenyl phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=CC=C1 CMPQUABWPXYYSH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 1
- NCYCYZXNIZJOKI-OVSJKPMPSA-N retinal group Chemical group C\C(=C/C=O)\C=C\C=C(\C=C\C1=C(CCCC1(C)C)C)/C NCYCYZXNIZJOKI-OVSJKPMPSA-N 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000008159 sesame oil Substances 0.000 description 1
- 235000011803 sesame oil Nutrition 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/775—Apolipopeptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/06—Antihyperlipidemics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Child & Adolescent Psychology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
Šis išradimas susijęs su vakcinos kompozicija, skirta gydyti nutukimą. Konkrečiau, šis išradimas apima apoliproteino B-100 epitopo mimezinius peptidus, jų konkatemerus ir modifikuotus peptidus, o taip pat juos turinčią vakcinos kompoziciją.ą
Description
Šis išradimas liečia vakcinos kompoziciją, skirtą nutukimo gydymui. Tiksliau, šis išradimas nukreiptas [vakcinos kompoziciją, kuri apima apoliproteino B-100 epitopo mimezinį peptidą, jo konkatemerus arba modifikuotus peptidus.
Žinomas technikos lygis
Kraujo serumo lipidai yra sudaryti iš cholesterolio, trigliceridų (TG), laisvųjų riebalų rūgščių, fosfolipidų ir kt., ir kraujotakoje egzistuoja lipoproteino formoje, kuri yra lipido ir apoliproteino komplesas.
Iš tokių lipoproteinų, mažo tankio lipoproteinas (LDL) yra pagrindinis TG ir cholesterolio nešiklis. Skaičius pacientų, kenčiančių nuo arteriosklerozės, koronarų arterijų ligos arba širdies infarkto, atsiradusių dėl pakilusio LDL-cholesterolio lygio kraujyje, žymiai padidėjo dėl mitybos režimo arba kitų faktorių pasikeitimo.
Taigi, gydymui pacientų, kenčiančių nuo aukščiau minėtų ligų, naudojami įvairūs tyrimai, skirti LDL-cholesterolio lygio sumažinimui ir aukščiau minėtų ligų priežasčių parodymui.
LDL-cholesterolis, kaip pagrindinis suaugusiųjų ligų, surištų su lipidų metabolizmu etiologinis faktorius, gali būti makrofagu paverstas į didelio tankio lipoproteiną (HLD). Priedo, LDL-cholesterolis taip pat gali būti paverstas į kitą medžiagą arba kepenyse konvertuotas į tulžies rūgštį. (Brovvn, M.S. and Goldstein, J. L., 1983, Annu. Rev. Biochem., 52:223-261).
Apoliproteinas B-100 yra pagrindinė LDL baltymo dalis ir taip pat egzistuoja labai mažo tankio lipoproteine (VLDL) ir chilomikrone. Kraujo LDL-cholesterolis gali būti pašalintas per makrofagų fagocitozę tokiu atveju, jeigu antikūnas kraujotakoje stimuliuotas apoliproteino B-100 atpažinimu, kadangi apoliproteinas B-100 indukuoja LDL daleles prisirišti ant LDL-receptorių, esančių ant ląstelės paviršiaus (Dalum I., et al., 1997, Mol. Immunol., 34 (16-17): 1113-20).
Tokiu atveju, makromolekulė, tokia kaip antikūnas, surišta su apoliproteinu
B-100, kuris egzistuoja ant LDL paviršiaus, tai lipazė, tokia kaip lipoproteino lipazė, negali hldolizuoti TG ir panašių medžiagų dėl sferinių trukdžių, sudaromų makromolekulės, prisirišusios prie apoliproteino B-100. Vadinasi, laisvųjų riebalų rūgščių, kaip pagrindinio nutukimo faktoriaus, susidarymas gali būti sustabdytas antikūnu, kuris gali susirišti su apoliproteinu B-100.
Šiuo metu, eilėje tyrimų, skirtų LDL-cholesterolio lygio sumažinimui ir aterosklerozės staigaus kilimo sustabdymui vartojant vakciną, bandoma įvairiuose gyvūnų modeliuose, tokiuose kaip pelės ir triušiai. Pavyzdžiui, C. R. Alvingas pranešė, kad cholesterolis gali būti modifikuotas metabolitais arba jo oksidacija, ir kad modifikuotas cholesterolis kai kuriais atvejais gali būti stipria antigenine determinante (Alving, C.R., et ai., 1989, Biochem. Soc. Trans., 17(4): 637-9; Alving, C.R., et ai., 1996, J. Lab. Clin. Med., 127:40-49; Alving, C.R., etai., 1996, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 210:181-6).
Be to, paskelbta, kad kraujo serume egzistuoja endogeninis antikūnas cholesteroliui (Wu, J.T., L.L., 1977, Clin. Lab. Med., 17(3):595-604, Apžvalga). Taip pat paskelbta, kad eksperimento sąlygomis, kuriose aterosklerozė ir hipercholesterolemija atsiranda triušiuose, kai jie maitinami cholesterolį turinčiu maistu, o hipercholesterolemijos ir aterosklerozės lygis triušiuose, imunizuotuose suleidus cholesterolio turinčią liposomą, žymiai nuslopinamas arba sumažinamas, palyginus su tais, kurie stebėti kontrolinėje grupėje.
Tokiu antikūnu, stimuliuotu cholesterolio vakcina, yra imunoglobulinas M (IgM), kuris rišasi su VLDL, vidutinio tankio lipoproteinu (IDL) ir LDL. Remiantis tuo, kas pasakyta aukščiau, tikėtina, kad galima gauti vakciną, skirtą gydyti arba apsaugoti nuo hiperlipodemijos arba aterosklerozės, atsirandančių dėl aukšto cholesterolio lygio (Bailey, J. M., 1994, Science, 264:1067-1068; Palinski, W. et ai., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 92(3): 821-5; Wu R. et. ai., 1999, Hypertension, 33(1):53-9).
Šio išradimo autoriai atrado, kad nuo nutukimo galima efektyviai apsisaugoti apoliproteino B-100 epitopo mimeziniu peptidu, ir remdamiesi tuo, kas pasakyta anksčiau, išrado vakcinos kompoziciją, skirtą gydyti nutukimą.
Išradimo esmės atskleidimas
Taigi, šio išradimo tikslu yra apoliproteino B-100 epitopo mimezinio peptido, jo susijungusių ir modifikuotų peptidų pateikimas.
Kitu išradimo tikslu yra apoliproteino B-100 epitopo mimezinio peptido, jo konkatemerų ir modifikuotų peptidų gavimo būdo pateikimas.
Dar kitu šio išradimo tikslu yra vakcinos kompozicijos, skirtos gydyti arba apsaugoti nuo nutukimo, kuri apima aukščiau minėtą apoliproteino B-100 epitopo mimezinį peptidą, jo konkatemerų ir modifikuotų peptidų, pateikimas.
Šio išradimo tikslas pasiekiamas pateikiant apoliproteino B-100 epitopo mimezinį peptidą, jo konkatemerus ir modifikuotus peptidus.
Šiame išradimo panaudota fago peptido bibliotekos sistema tam, kad atrinktų žmogaus apoliproteino B-100 epitopą, surištą monokloniniu antikūnu (MabB23). Aukščiau minėti atrinkti peptidai buvo mimeziniai peptidai, struktūriškai tapatūs antigeninei determinantei, kuri gali būti antikūno atpažinta, o šie mimeziniai peptidai susintetinti pagal atrinkto peptido aminorūgščių seką.
Peptido bibliotekos sistema yra viena iš būdo rūšių, skirtų surasti antigeninės determinantės trimatę formą. Tai yra DNR fragmentai, kurie koduoja atsitiktines peptidų sekas, įterpiami į DNR, kuri koduoja fago baltymo mažąjį apvalkalą, o tada aukščiau minėtos DNR įterpiamos į DNR skaitymo rėmelį (RF) ir jų ekspresijai transformuojamos į E. coli. Peptidai, ekspresuoti ant E. coli paviršiaus, reaguoja su antigenu tam, kad atrinktų peptidus, struktūriškai tapačius antigeninei determinantei.
Tam, kad pagamintų imuninį serumą, pelės buvo imunizuotos įvedant aukščiau minėtus mimezinius peptidus. Buvo patvirtinta, kad taip gautas imuninis serumas, tuo pačiu metu atpažįsta tikrąjį apoliproteiną B-100, mimezinius peptidus ir LDL (Identification of Antigenic Determinants for the Murinę Monoclonal Antibodies Against Apoliprotein A-1 and Apoliprotein B-100 by Using Phagedisplayed Random Peptide Library, [Antigeninių determinančių identifikavimas pelės monokloniniams antikūnams prieš apoliproteiną-1 ir apoliproteiną B-100 naudojant fagu atpažintą atsitiktinę peptidų biblioteką) Chi-Hoon Kim, Hanyang Univ., 1997).
Šio išradimo apoliproteino B-100 epitopo mimeziniai peptidai gali būti parinkti iš peptidų sekų SEQ. ID. Nr.1, SEQ. ID. Nr.2, SEQ. ID. Nr.3 arba jų mišinių.
Šio išradimo apoliproteino B-100 mimeziniai peptidai gali būti naudojami konkatemerų pavidalu tam, kad pagerintų jų antigenines determinantes. Kaip šio išradimo įgyvendinimo pavyzdys, gali būti sujungti vienas su kitu du arba daugiau mimezinių peptidų. Pirmenybė teikiama konkatemerui, sudarytam iš nuo trijų (3) iki penkiolikos (15) peptidų. Pageidautina, kad šio išradimo konkatemeras turėtų sekos SEQ. ID. Nr.1 keturis (4) peptidus.
Šio išradimo aukščiau minėto mimezinio peptido konkatemeras reiškia polimerą, kuriame aukščiau mintų mimezinių peptidų galai susijungę vienas su kitu.
Šio išradimo aukščiau minėto mimezinio peptido modifikuotas peptidas reiškia mimezinių peptidų variantus, kurie gali būti atpažinti monokloniniu arba polikloniniu antikūnu, skirtu apoliproteinui B-100. Variantai apima pakeitimą, deleciją, prijungimą ir šio išradimo mimezinių peptidų vienos arba daugiau aminorūgščių cheminę pakaitų reakciją.
Kitu šio išradimo tikslu yra apoliproteino B-100 epitopo mimezinio peptido, jo konkatemero ir modifikuotųjų peptidų gavimo būdo pateikimas, kuris apima tokias pakopas: i) DNR, kurios koduoja aukščiau minėtą mimezinį peptidą, jo susijungusius ir modifikuotus peptidus, įterpimą į vektorių, ii) minėto vektoriaus transformavimą į šeimininko ląstelę, o po to jos inkubavimą ir iii) aukščiau minėto mimezinio peptido, jo konkatemero arba jo modifikuotų peptidų išskyrimą iš aukščiau minėtų ląstelių šeimininkių.
Šio išradimo vakcinos kompozicijos vaisto forma gali būti pagaminta bet kuriuo įprastu būdu, tinkamu mimeziniam peptidui, jo konkatemerui arba jo modifikuotiems peptidams. Aukščiau minėta vaisto forma, pageidautina, kad kompozicijoje, kurios gamyboje aktyvusis junginys būtų sumaišytas arba praskiestas su imuniniu adjuvantu, vaistu, sustiprinančiu imuninę sistemą, nešikliu, užpildu ir skiedikliu, parinkta iš grupės, susidedančios iš tabletės, piliulės, granulės, miltelių, oblatės, suspensijos, emulsijos, skysčio, sirupo, aerozolio, minkštos arba kietos želatinos kapsulės, sterilizuoto injekcijų skysčio, sterilizuotų miltelių ir pan.
Imuniniu adjuvantu, kuris gali būti naudojamas šio išradimo kompozicijoje, yra savotiška baltymų rūšis, kuri turi T-ląstelių epitopą (pvz., Hepatito B viruso paviršiaus baltymas), inertinis nešiklis, toks kaip aliuminio druska, bentoninas, lateksas, akrilinės dalelės ir pan., hidrofobinis antigenas, (pvz., lipidas), vandens aliejuje ir aliejaus vandenyje emulsijos, depo sudarytojas (pvz., polisacharidas), T5 ląstelių aktyvatorius, toks kaip PPD, poliadeninas, poliuracilas ir pan.; B-ląstelių. aktyvatorius (pvz., B-ląstelės mitogenas), paviršinio aktyvumo medžiaga, tokia kaip saponinas, lizolecitinas, retinalis, kvil A, liposoma ir pan.; medžiaga, sustiprinanti makrofago aktyvumą; ir alternatyvus kelias, papildantis aktyvatoriais, tokiais kaip inulinas, zimosanas, endotozinas, lebamizolis, C. parvum ir pan.
Šiame išradime baltymas nešiklis reiškia farmaciškai leidžiamą medžiagą, tokią kaip proteinas arba aliuminio druska, kurie gali nešti kraujotaka šio išradimo mimezinį peptidą, jo konkatemerą ir jo modifikuotus peptidus.
Aliuminio druska, fenoksietiletanolis, vanduo, fiziologinis druskos tirpalas, laktozė, dekstrozė, sacharozė, sorbitolis, manitolis, kalcio silikatas, celiuliozė, metilceliuliozė, amorfinė celiuliozė, polivinilpirolidonas, metilhidroksibenzoatas, propilhidroksibenzoatas, talkas, magnio stearatas ir mineralinė alyva gali būti panaudoti kaip tinkami šio išradimo kompozicijos nešikliai, užpildai ir skiedikliai.
Priedo, šio išradimo kompozicija dar gali turėti užpildą, agentą nuo sukibimo, tepalą, drėkiklį, kvapiąją medžiagą, emulsiklį ir antiseptiką.
Šio išradimo kompozicija gali būti pagaminta įprastu būdu, gerai žinomu patyrusiems šios srities specialistams, kad sukeltų imuninį atsaką žinduoliams per vieną (1) kartą arba daugiau vakcinacijų.
Šio išradimo vakcinos kompozicija, skirta nutukimo gydymui, gali būti vartojama įvairiais būdais, tokiais kaip peroraliniu, dermaliniu, interdermaliniu, įšvirškiant į veną arba į raumenis, bet, geriausiai, intrakutaniniu būdu.
Šio išradimo vakcinos kompozicijos efektyvi dozė yra nuo 0,1 iki 10 pg (aktyviojo peptido) kilogramui kūno masės, geriau, kai nuo 0,5 iki 1,0 pg/kg. Tačiau vakcinos kompozicijos aktyviojo prado tikroji dozė gali būti nustatyta atsižvelgiant į eilę faktorių, tokių kaip imuninės sistemos būsena, vartojimo būdas, paciento būklė, amžius, lytis, kūno masė ir pan. Todėl minėtos dozės kiekio ribos jokiu būdu nelimituoja šio išradimo apimties.
Šio išradimo vakcinos kompozicijos pirmasis farmacinis efektas yra sustabdyti arba gydyti nutukimą per mechanizmą, kai žmogaus antikūnas sustiprintas mimeziniu peptidu, jo konkatemeru arba jo modifikuotais peptidais, susiriša su apoliproteino B-100 epitopu ant LDL paviršiaus, ir tokiu būdu lipaze erdviniai trukdo ir stabdo gamybą riebalų rūgščių, kaip pagrindinį etiologinį nutukimo faktorių.
Priedo, šio išradimo vakcinos kompozicija taip pat veikia malšindama hiperlipodemiją per mechanizmą, kuriame LDL yra aptinkama ir lengvai pašalinama makrofago pagalba dėka opsonizacijos, iššauktos žmogaus antikūnu, sustiprintu mimeziniu peptidu, jo konkatemeru arba jo modifikuotais peptidais ir konjuguotą su apoliproteino B-100 epitopu ant LDL paviršiaus, ir tokiu būdu sutrukdo LDL specifiškai prisitvirtinti ant LDL receptorių, esančių ant ląstelės paviršiaus.
Trumpas brėžinių aprašymas
Šio išradimo minėti tikslai ir kiti pasiekimai taps aiškesni detaliai aprašant jų pageidaujamus šio išradimo įgyvendinimo pavyzdžius su nuorodomis į pridedamus brėžinius, kuriuose:
nuo Fig.1 a iki 1d pateiktos vektoriaus, ekspresuojančio šio išradimo mimezinį peptidą struktūros ir sudedamosios. Fig 1a parodo vyraujančios (lyderio) kasetės struktūrą, Fig. 1b parodo LB kastės stuktūrą, Fig. 1c parodo BL kastės stuktūrą, o Fig. 1d parodo pBX4 ekspresijos vektoriaus struktūrą.
Fig. 2 parodo vektorių pBX1 ir pBX4, ekspesuojančių šio išradimo mimezinį peptidą, gavimo būdą.
Fig. 3 parodo elektroforezės (PAGE) poliakrilamido gelyje LB kastės indentifikavimo rezultatą.
Fig. 4 parodo PAGE LB kastės, įterptos į pBlue-BL plazmidę, identifikavimo rezultatą.
Fig. 5 parodo PAGE rezultatą, patvirtintį DNR, įterptos į pazmides pBX1 ir pBX3, kryptį ir kopijų skaičių.
Fig. 6 parodo vestern-blotingo rezultatą ekspresuoto PB14 peptido identifikacijai.
Fig. 7 parodo natrio dodecilsulfato (SDS) PAGE rezultatą, patvirtinantį PB14 peptido išgryninimą
Fig. 8 parodo vestern-blotingo rezultatą, patvirtinantį išgrynintoto PB14 peptido reaktyvumą prieš anti-PB14 serumą.
Fig. 9 parodo pelės, indukuotos PB14 peptidu antikūno avidiškuo matavimo rezultatus, atliktus ELISA.
Fig, 10 yra grafikas, kuris iliustruoja PB14 peptido efektą, stabdant didėjančią pelės kūno masę.
Fig. 11a ir 11b yra grafikas, kuris iliustruoja pelių kūno masės pasikeitimo priklausomybę nuo šio išradimo PB14 vakcinos įvedimo po 20 savaičių po vaisto injekcijos, kuris gali sunaikinti hipotalamą.
Fig. 12 yra grafikas, kuris parodo poveikį į lipido koncentraciją kraujo serume, priklausomai nuo PB14 vakcinos injekcijos.
Geriausi išradimo įgyvendinimo pavyzdžiai
Toliau, šis išradimas bus aprašytas detaliau. Tačiau, šis išradimas, paaiškintas žemiau, duotas tik šio išradimo Įgyvendinimo paaiškinimais ir neketina limituoti šio išradimo apimties.
pavyzdys: oligonukleotido sintezė ir hibridinimas
Pagal šio išradimo išradėjo prašymą oligonukleotidai cheminiu būdu buvo susintetinti Genemed Synthesis, Ine. (San Francisco, CA, JAV) firmoje. Tam, kad sufosforolintų oligonukleotidų 5' galą, .50 μΙ 100 pmol/μΙ oligonukleotido inkubuota dvi (2) valandas su 10 μΙ 10 mM ATP, 3 μΙ 10 TV/μΙ T4 polinukleotido kinazės (Takara, Otsu, Japonija) ir 7 μΙ 10Χ kinazės buferio 37 °C temperatūroje.
Kiekviena po 10 μΙ fosforilintų oligonukleotidų alikvotinė dalis sumaišytos kartu, pašildytos iki 80 °C 5 minutes, o po to labai lėtai aušinamos iki kambario temperatūros, taip suhibridizuojant iki komplementariųjų vijų specifinio suporavimo.
pavyzdys: susiuvimas
Susiuvimo mišinys paruoštas sumaišant 1 μΙ DNR vektoriaus, 5 μΙ DNR intarpo, 1 μΙ DNR ligazės T4 (NEB, Beverly, MA, JAV), 1 μΙ 10Χ fermentinės reakcijos buferio tirpalo (NEB, Beverly, MA, JAV) ir 2 μΙ distiliuoto vandens, o po to inkubuota per naktį 16 °C temperatūroje.
pavyzdys: pBX ekspresijos vektoriaus, skirto apoliproteino B-100 mimezinio peptido ekspresijai, konstravimas pakopa: vektoriaus konstravimas
Mimezinio peptido ekspresijos plazmidės vektorius kaip taisyklė apima vyraujančios sekos (lyderio) kasetę ir vieną arba daugiau PB1 peptido genų. Kaip pavaizduota Fig.1, plazmidė pBX1, kuri apima vieną (1) PB1 geną, gauta klonuojant lyderio kasetę (Fig. 1a) plazmidės pQE30 daugiakloninėje srityje (Qiagen, Hilden, Vokietija). Susidariusi plazmidė hidrolizuota Hindlll ir Sali pagalba, o mažieji fragmentai, pakeisti LB kasete (Fig. 1b), duoda pBX1 plazmidę, kuri tinkama lengvai įterpti didelį skaičių BL kasečių (Fig. 1c).
Tuo tarpu plazmidė pBluescript II SK+ buvo perkirpta su Sali ir Xho\ ir susiūta su BL kasetėmis, kuriose pavieniai įntarpai iš daugybinės kasetės BL kasetės vyko atsitiktinai. Laukiami pasikartojimai PB1 peptido genų plazmidėje pBlue-BL atrinkti, suskaldyti ir subklonuoti įpBX1 (Fig. 1d).
pakopa: PB1 monopeptido ekspresijos vektoriaus gavimas
Lyderio kasetė pagaminta hibridizuojant SEQ. ID. Nr.10 ir SEQ. ID. Nr. 11 oligonukleotidus, susintetintus tokiu pat būdu kaip ir 1 ir 2 pavyzdžiuose. Po to, pQE30 vektorius (Qiagen, Hilden, Vokietija), kuris buvo asimiliuotas su Sali ir BamHl, susiūtas su minėta lyderio kasete, duoda pQE-lyderio plazmidę. Minėto pQE30 vektoriaus ekspresijos rezultate, šešios histidino liekanos buvo papildomai įterptos į ekspresuoto baltymo N-galus tam, kad baltymas būtų lengvai išgryninamas. Minėta lyderio kasetė buvo sukonstruota apimti enterokinazės atpažinimo sritis (DDDDKI; SEQ. ID. Nr.12) tam, kad sumažintų papildomas aminorūgštis iki minimumo.
Pagal 1 pavyzdžio būdą, keturi oligonukleotidai, kurių sekos pateiktos SEQ. ID. Nr. nuo 4 iki 7, susintetinti, fosforilinti, o po to hibridizuoti su atitinkamais komplementariaisiais oligonukleotidais tam, kad susintetintų Fig. 1b (SEQ. ID. Nr.13 ir 14) LB kasetę. Susiuvimo mišinys pagamintas iš 40 μΙ hibridizuotų oligonukleotidų, sumaišytų su 3 μΙ 1 TV/ μΙ T4 DNR ligazės, 5 μΙ 10Χ fermentinio buferio ir 2 μΙ distiliuoto vandens. Po to, susiuvimo mišinys inkubuojamas per naktį, susiuva oligonukleotidus vieną su kitu.
Po to, kai reakcija užsibaigia, reakcijos mišinys išpilamas ant 20 % poliakrilamido gelio ir vykdoma elektroforeze. LB kasetė (52 bazių porų (bp) oligonukleotidai) (Fig.3) identifikuota panardinant į gelį su etidžio bromidu (EtBr).
Fig.3 juostoje M yra DNR 20 bp laiptų dėmė, o juostoje 1 yra reakcijos tirpalas. LB kasetė gauta iš gelio ekstrakcijos rinkinio (Qiagen, Hilden, Vokietija) QIAEX II gelio pagalba.
Minėtas pQE-lyderis suskaldytas su Hidlll ir Sa1\, o po to susiūtas su minėta LB kasete pagal 2 pavyzdį kad gautų PB1 mimezinio peptido ekspresijos vektorių. Gautas ekspresijos vektorius pavadintas pBX1, o peptidas, ekspresuotas vektoriaus, buvo pavadintas PB1 peptidu (nuoroda į Fig.2).
pakopa: PB1 konkatemero ekspresijos vektoriaus gamyba
Keturi oligonukleotidai, kurių sekos parodytos SEQ ID. Nr. 4, 5, 8 ir 9, pagal 1 pavyzdžio metodiką buvo susintetinti, sufosforilinti, o po to subibridinti su atitinkamais komplementariaisiais oligonukleotidais tam, kad susintetintų Fig. 1c (SEQ. ID. Nr. 15 ir 16) LB kasetę. Vėliau tokie oligonukleotidai susiūti vienas su kitu pagal 2 pavyzdžio metodiką, o po to elektroforezei patalpinti ant 20 % poliakrilamido gelio. Nudažant EtBr, buvo identifikuotos penkiasdešimt penkios nukleotidų bp (lyderio kasetė). LB kasetė gauta iš gelio per QIAEX II gelio ekstrakcijos rinkinį ir suskaldyta su Sali irXriol.
Tuo tarpu, pBluescript II SK (Stratagene, La Jolla, CA, JAV) suskaldyta su Sali irXhol. Vektorius paveiktas elektroforeze ant 0,8 % agarozės gelio, ir gautas iš gelio ekstrakcijos rinkinio (Qiagen, Hilden, Vokietija) QIAEX II gelio pagalba.
Pagal 2 pavyzdį buvo atliktos kelios susiuvimo reakcijos ir gauta pBlue-BL plazmidė naudojant 5 μΙ BL kasetės DNR ir 1 μΙ minėtos DNR su suskaldytu vektoriumi.
pBlue-BL suskaldyta su Sa1\ ir Xho\, o BL kasetė išekstrahuota. pBX2 plazmidė pagaminta įterpiant tokią BL kasetę į pagamintą pagal 2 pakopą vektoriaus pBX1 Sali sritį. Priedo, pBX3 ir pBX4 vektoriai pagaminti keičiant BL kasetės skaičių nuo dviejų (2) iki trijų (3), kurie įterpiami į pBX1 vektoriaus Sa1\ sritį (nuoroda [Fig. 2).
Peptidai, ekspresuoti iš pBX2, pBX3 ir pBX4 vektorių, buvo konkatemerai, kurie turi nuo dviejų (2) iki keturių (4) PB1 peptidų. Jie pavadinti atitinkamai PB12, PB13 ir PB14.
pakopa: įterpimo identifikavimas
Ląstelė šeimininkė (E. coli M15 [pREP4j; Qiagen, Hilden, Vokietija) buvo transformuota su pBlue-BL plazmidė ir išpurkšta ant 1 % agaro plokštelės, o po to 16 valandų inkubuota 37 °C temperatūroje taip, kad galėtų susidaryti E. coli kolonijos. Viena iš kolonijų, kuri susidarė ant agaro plokštelės, paskiepyta 10-tyje ml LB terpės ir inkubuota purtant 37 °C temperatūroje šešiolika (16) valandų, o po to plazmidė išskirta per DNR gryninimo sistemą (Wizard PLŪS SV DNR minipreparatyvinė DNR gryninimo sistema; Promega, Madison, Wl, JAV). Plazmidė, išgauta iš transformuotos E. coli, buvo inkubuota vieną (1) vai. su Sali ir Xho\ restrikcijos fermentu tam, kad skaldytų 37 °C temperatūroje, ir išanalizuota naudojant 20 % PAGE (Fig. 4). Fig. 4 juosta M parodo 20 bp lyderinę DNR, 1 juosta parodo oligonukleotido produktą, gautą 3 pakopoje, 2 juosta parodo DNR BL kasetę, išskirtą naudojant 20 % PAGE, gautą 3 pakopoje, o 3 juosta reiškia rekombinantinę pBlue-BL plazmidę, paveiktą restrikcijos fermentu. Kaip rodo Fig. 4, tai patvirtina, kad pBlue-BL plazmidė turi BL kasetę.
E. coli (M15 [pREP4]) transformuota su pBX1 arba pBX3 plazmidė, o DNR plazmidė išskirta taip, kaip paaiškinta aukščiau tam, kad patvirtintų DNR kasetės įterpimų skaičių ir orientaciją. Išskirta plazmidė suskaldyta su Sali ir Hind\\\ restrikcijos fermentu, ir išanalizuota naudojant 20 % PAGE (Fig. 5). Fig 5 juosta M parodo 20 bp lyderinę DNR, 1 ir 3 juostos parodo pBX1 plazmidę, turinčią LB, bet ne BL kasetę, o 2 juosta parodo plazmidę, turinčią teisingos krypties vieną LB ir dvi BL kasetes. Iš kitos pusės, 4 juosta parodo plazmidę, turinčią vieną LB ir dvi BL kasetes, tačiau priešingos orientacijos. Kaip rodo Fig. 5, kiek B kasečių (BL ar LB kasetė) buvo įterpta ir kokia kryptimi jos buvo įterptos į pBX vektorių, galima identifikuoti restrikcijos fermento žymėjimą.
Priedo, B kasečių DNR seka, įterpta į plazmidę, kuri gali būti gauta iš transformuotos E. coli, patvirtinta, kad ji identiška pažymėtoms sekoms. Plazmidės pagamintos naudojantis VVizard'o PLŪS DNR minipreparatyviniu rinkiniu ir buvo sekvenuotos naudojant Seęuennase (Ver. 2.1) DNR sekvenavimo rinkinį (Amersham, Clevelend, UK).
pavyzdys: PBI4 peptido ekspresija i E. coli ir jo gryninimas.
pakopa: PBI4 peptido ekspresijos patvirtinimas
PBI4 peptido ekspresijos patvirtinimui buvo kultivuojamos trijų rūšių transformuotos E. coli M15[pREP4] ant LB agaro buljono, turinčio ampicilino ir kanamicino. Viena E. coli M15[pREP4] transformuota plazmidė pBX4, antra kopija transformuota pQE30, o dar kita buvo netransformuota E. coli M15[pREP4], Kiekviena iš kolonijų, gautų iš kietųjų kultūrų, buvo atitinkamai inokuliuota skystoje LB kultūros terpėje, kuri turėjo 100 μΙ/ml ampicilino ir 25 μΙ/ml kanamicino, o po to inkubuotos per naktį. Kultūra buvo inkubuota purtant 37 °C temperatūroje vieną (1) i
valandą iki O. D reikšmės, pasiektos nuo 0,5 iki 0,7 intervale prie 600 nm. Po to į kultūros terpę pridėta 1 mM izopropil-tio-p-galaktopiranozido (IPTG), kad palengvintų rekombinantinio baltymo ekspresiją, o po to papildomai kultivuota 37 °C temperatūroje dar penkias (5) valandas. Paimtas 1 ml kultūros terpės ir centrifuguotas 14 000 apsisukimų/per minutę dviejų (2) minučių laikotarpyje, kad nusodintų bakterines ląsteles. Ląstelių gumuliukas suspeduotas 50-tyje μΙ 2X SDS tirpale [100 mM Tris-CI pH 6,8, 20 % (masės/tūryje) glicerolio, 4 % (masės/tūryje) SDS, 2 % 2-merkaptoetanolio, 0,001 % bromfenolio mėlynojo] kad pateiktų į SDSPAGE. Suspenduotas tirpalas šildytas 95 °C temperatūroje penkias (5) minutes, o po to 10 μΙ tirpalo patalpinama ant gerai išlieto gelio ir vykdoma elektroforezė 20 mA srovėje penkias (5) valandas (Mighty Small II, Hoefer, JAV). Panaudotų pakrautojo gelio ir skiriamojo gelio akrilamidų koncentracijos atitinkamai buvo 5 % ir 15 % , o iš anksto nudažytas standartinis SeeBlue (nuo 250 Kda iki 4 kDa; NOVEX, San Diego, CA, JAV) arba plačiai naudojamas standartinis Marki 2 (nuo 200 kDa iki 2,5 kDa) buvo panaudoti kaip standartinių dydžių pažymėti baltymai. Po elektroforezės gelis nudažytas vienai (1) valandai kūmasio briliantiniu mėlynuoju R-250, o dažas per dešimt (10) valandų išblukintas blukinančiu tirpalu (5 % metanolio ir 7 % acto rūgšties).
Patvirtinimui, kad ekspresuotas baltymas yra PB14 peptidas, baltymams elektroforezės gelyje įvykdytas vestern-blotingas naudojant triušio anti-PB1 antikūną (Fig. 6). Imuninis serumas pagamintas imunizuojant konjuguotu ovalbuminu, kuris buvo PB1 peptidas, cheminiu būdu susintetintas firmoje BioSynthesis, Ine. (Levvisville, TX, JAV). Fig. 6 juosta M parodo iš anksto nudažytą standarto SeeBlue žymę, juosta 1 parodo terpę, naudotą E. coli M15 [pREP4] inkubacijai, kuri buvo netransformuota, juosta 2 parodo terpę, naudotą E. coli M15 [pREP4] inkubacijai, kuri buvo transformuota vektoriumi pQE30, juosta 3 reiškia terpę, naudotą F. co//M15 [pREP4] inkubacijai, kuri buvo transformuota vektoriumi pBX4.
Kaip parodyta Fig. 6, tik vektoriumi pBX4 transformuota E. coli ekspresavo rekombinantinį PB14 peptidą ir parodė specifinį imunitetą su pelės anti-PB1 serumu.
pakopa: ekspresuoto peptido tirpumo nustatymas
E coli M15 [pREP4], kuri buvo pakeista vektoriumi pBX4, inkubuota tokiu pat būdu, kaip ir 1 pakopoje. Ląstelių auginimui paimta 10 ml kultūros terpės ir nucentrifuguota, kad būtų gauta ląstelių. Ląstelių gumuliukai suspenduoti 5-se ml ląstelių lizvimo tirpale (300 mM NaCi, 50 mM NaH2PO4, 10 mM imidazolo, pH 8,0), kad gautų iš ląstelių gryną baltymą. Atšaldžius, gmuliukų suspensijos tirpalas per 20 ciklų veikiamas ultragarsu viršgarsine banga, kad gautų lizuotas ląsteles. Supernatantas paimtas centrifuguojant 4 °C temperatūroje 10000 apsisukimų per minutę greičiu 30 minučių laikotarpyje. Toks pat tūris 2X SDS tirpalo sumaišytas su tirpalu, o SDS-PAGE taip pat vykdomas kaip aprašyta 1 pakopoje. Po to kiekvieną tirpalą šildė 95 °C temperatūroje 5 minutes. SDS-PAGE rezultatas patvirtina, kad PB14 peptidas gali būti išskirtas ir išgrynintas iš tirpaus ekstrakto A, kuriame jis laikytas netirpiame nevalytame ekstrakte B.
pakopa: PB14 peptido gryninimas
3-1 pakopa: afininė chromatografija
Ni-NTA derva, kuri naudojama išgryninti His-pažymėtus baltymus, panaudota išgryninti 1 pakopos rekombinantinį peptidą. Afininė chromatografija, reikalaujanti įspūdingos jėgos tarp Ni+ prisotintos dervos ir histidino liekanos ekspresuoto baltymo gale, yra gerai žinomas būdas lengvai išgryninti reikiamą baltymą.
Pirmiausiai, E coli M15 [pREP4], kuri buvo transformuota vektoriumi pBX4, inokuliuota 1-me I LB kultūros terpės ir inkubuota 37 °C temperatūroje iki tiek, kad O.D. reikšmė prie 600 nm būtų virš 0,6. Santykis tarp LB kultūros terpės ir pBX4 vektoriaus buvo penkiasdešimt (50) su vienu (1). į galutinės koncentracijos tirpalą pridėta 1 mM IPTG ir vėl inkubuota penkias (5) valandas. Po inkubavimo kultūros terpė centrifuguota apie 30 min. prie 6,000 apsisukimų per minutę, o ląstelių gumuliukai laikyti -70 °C temperatūroje per naktį. Ląstelių gumuliukai panardinti į ledą, o po to suspenduojami tirpinimo tirpale (300 mM NaCi, 50 mM NaH2PO4, 10 mM imidazolo, pH 8,0), panaudojant 5 ml tirpinimo tirpalo 1 g gumuliukų. Ląstelės lizuojamos ardant ultragarsu pagal 2 pakopos metodiką, o po to centrifuguotos 30 min. kambario temperatūroje esant 10000 Xg. Toks pat tūris buferio (8 M karbamido, 0,1 M NaH2PO4, 0,01 M Tris-HCI, pH 8,0) kaip ir gumuliukų pridėtas pakartotinam suirusios ląstelės suspendavimui ir čia esančių baltymų
J denatūravimui, o suspenduotas tirpalas paveiktas trumpai ultragarso banga taip, kad buferyje būtų ištirpinta kuo daugiau baltymų. Suspensija centrifuguota 8000 apsisukimų per minutę greičiu 30 minučių, kad būtų pašalintos suirusios ląstelės, kurios nesoliubilizuotos 8 M karbamide. į 4 ml minėto supernatanto 4 °C temperatūroje pridėta 1 ml Ni-NTA dervos ir purtyta 2 valandas prie 200 apsisukimų per minutę greičiu tam, kad baltymai, turintys His-tag būtų pagauti.
Toks supernatąntas, turintis baltymo/Ni-NTA kompleksą, rūpestingai supiltas į chromatografinę kolonėlę (2 cm pločio x 2,7 cm aukščio). Buferio perteklius išleistas atidarius kranelį, esantį po derva. Kolonėlė perplauta 20 -čia ml vidutinio pH buferio (8 M karbamido, 0,1 M NaH2PO4, 0,01 M Tris-HCI, pH 8,0) ir po to 20-čia ml kito buferio (8 M karbamido, 0,1 M NaH2PO4, 0,01 M Tris-HCI, pH 6,3), kad būtų išplauti baltymai, kurie nespecifiškai surišti su Ni-NTA derva. Baltymai-taikiniai, turintys žymėtąjį His, eliuoti plaunant du (2) kartus 5-iais ml žemo pH buferiu (8 M karbamido, 0,1 M NaH2PO4, 0,01 M Tris-HCI, pH 5,9), po to keturis (4) kartus 5 -jais ml stiprios rūgšties buferiu (8 M karbamido, 0,1 M NaH2PO4l 0,01 M Tris-HCI, pH 4,5), o po to naudota SDS-PAGE, kad patvirtintų eliuotus baltymus-taikinius naudojant 15 % akrilamido gelį (fig. 7). Fig. 7 juosta M parodo iš anksto dažytą SeeBlue žymę, o juosta 1 parodo išgrynintą B14 peptidą.
Aukščiau minėti išgryninti baltymai dializuoti ant PBS (8 g/l NaCi, 0,2 g/l KCI, 1,44 g/l Na2HPO4 ir 0,24 g/l KH2PO4) tam, kad būtų gautos jų pirminės konformacijos. Naudojamas dializės vamzdelis yra 3500 Da pagal žemutinę molekulinės masės ribą. Dializės metu pirmas penkias (5) valandas sunaudota 3 I PBS, turinčio 2 M karbamido, o po to per naktį du (2) kartus 5 I PBS be karbamido.
3-2 pakopa: hidrofobinė chromatografija
Hidrofobinė chromatografija atliekama tam, kad padidintų PB14 peptido, gauto 3-1 pakopoje, grynumą.
Amonio sulfatas dedamas pamažu iki galutinės 20 % koncentracijos į tirpalą, turintį PB14 peptido, eliuoto nuo Ni-NTA dervos 3-1 pakopoje, o po to pH sureguliuojamas iki 7,0. Po to, kai amonio sulfato ištirpo pilnai iki 10 %, tirpalas paliekamas trims arba daugiau valandų, o po to tirpalas patalpinamas į fenilsefarozės kolonėlę [užpildas: greitosios srovės fenilsefarozės derva (Pharmacia, Švedija); kolonėlės dydis: 1 cm (plotis) x 3 cm (aukštis)].
Kiekviena frakcija, kuri eliuota iš kolonėlės pilant eliuavimo tirpalą (8 M. karbamido, 0,1 M NaH2PO4, 0,01 M Tris-HCI, pH 6,3) į kolonėlę esant tekėjimo greičiui 0,5 ml/min prie amonio sulfato atvirkštinio gradiento nuo 10 % iki 0 %, patalpinta ant SDS-PAGE gelio. Frakcija, turinti PB14 peptidą, surinkta ir dializuota buferio tirpale, kad taptų gėlinta, o karbamidas, kuris vartojamas kaip denatūravimo agentas, pašalintas tuo pačiu metu.
3-3 pakopa: His žymės pašalinimas
Į buferio tirpalą (50 ml NaCI, 20 mM Tris-HCI, 2 mM CaCI2, pH 7,4), kuris tinka pašalinti denatūravimo agentą ir imidazolą iš išgryninto His-žymėtojo baltymo, o taip pat suaktyvinti enterokinazę, pridėta 2 m karbamido. Dializuotas PB14 peptidas, kuris gautas 3-2 pakopoje, dar kartą dializuojamas naudojant aukščiau minėtą buferį, turintį karbamido, kad gėlintų PB14 peptidą, kurio metu karbamido koncentracija pamažu sumažėja vis kartojant dializę iki karbamidu nuskurdinto buferio. 3 TV/ml enterokinazės pridėta į PB14 peptidą, turintį tirpalą, kurio buferis pakeistas minėtu antruoju buferiu, ir inkubuota 23 °C temperatūroje. Tirpalas, kuris paimamas kas valandą, analizuojamas SDS-PAGE būdu tam, kad patikrintų His žymių kiekį, pašalintų iš His-žymėtųjų PB1 (PB 14 +hls) peptidų.
3-4 pakopa: jonu mainu chromatografija
Nepageidaujami baltymai ir peptidai, kurie pasigamino paveikus enterokinazę, pašalinti jonų mainų chromatografija.
Tirpalas, turintis PB14'hls peptidą, gautą 3-3 pakopoje, dializuotas dializės buferyje (2 M karbamido, 0,1 M NaH2PC>4, 0,01 M Tris-HCI, pH 7,0), ir buferio kiekis buvo žymiai pakeistas. Dializuojamas tirpalas patalpintas ant DEAE sefarozės dervos (Pharmacia, Upsala, Švedija). Po to kolonėlė supusiausvirinta su pusiausvirinimo buferiu (50 ml natrio fosfato buferio, 2 M karbamido, pH 7,0) ir peptidas eliuotas pagal NaCI koncentracijos gradientą nuo 0 iki 1 M naudojant kitą buferį (50 ml natrio fosfato buferio, 2 M karbamido, 1M NaCI) (srovės greitis: 0,5 ml/min.). Kiekviena frakcija regeneruota ir norimą baltymą turinčios frakcijos sukaupiamos. Sukoncentravus dalis, PB14'hls peptido buvimas patvirtintas SDSPAGE.
pakopa: PBĮąkiekybinė analizė
Išgrynintas PB14 peptidas, kuris gautas pagal 3 pakopos metodiką, kiekybiškai išanalizuotas kolorimetinės analizės metodu naudojant mikro BCA reagentą (Pierce, Rokfordas, JAV).
pakopa: rekombinantinio PB14 peptido charakteristikų patvirtinimas
PBI4 peptidų, kurie išgryninti 3 pakopoje, grynumas ir imuninio serumo, kuris gautas naudojant sintetinį PB14 peptidą kaip antigeną, imunogeniškumas patvirtinti wetern-bloto analize naudojant ECL (Amersham, Cleveland, UK). Atlikus SDS-PAGE (2 pavyzdys, 1 pakopa), gelis inkubuotas kartu su PVDF membrana buferyje (0,3 % Tris, 1,5 % glicinas, 20 % metanolis) pastovioje 60 V įtampoje tris (3) valandas tam, kad baltymas gelyje būtų perneštas į PVDF membraną. Po to [gertoji membrana inkubuota 1,5 valandos su 5 ml blokavimo tirpalo (TBS, pH 7,5, 5 % (masės/tūryje) nugriebto pieno miltelių, 0,02 % Tvino 20), o dar po to tris kartus plauta su TTBS (Tris-buferintas fiziologinio tirpalo tirpalas, turintis 0,1 % Tvino 20) atitinkamai 15, 5 ir 5 minutes. Imuninis serumas prieš PB1 peptidą (nuoroda į 2 pavyzdžio 1 pakopą) praskiestas TTBS tirpalu santykiu vienas (1) su penkiais tūkstančiais (5000), o po to 1,5 valandos inkubuotas su membrana tam, kad būtų patvirtintas PB14 peptido ir imuninio serumo prieš PB14 peptidą grynumas (3 pavyzdys). Po gelio plovimo su TBBS paeiliui tris kartus 15, 5 ir dar 5 minutes, membrana inkubuota 1,5 valandos kambario temperatūroje su tirpalu, kuriame šarminis fosfatazės-F(ab)'2-ožkos anti-pelės IgG (H+L) (Zymed, San Francisko, CA) praskiestas su TTBS tirpalu santykiu vienas (1) su tūkstančiu (1000). Membrana vėl plauta su TTBS tris kartus, o po to nudažyta pridedant BCIP/NBT (5-brom-4-chlor-3-indolilfosfatas/tetrazoliumo nitro mėlynasis (Sigma)). Po nudažymo, BCIP/NBT tirpalas pašalintas TTBS tirpalu. Kaip vestem-blotingo rezultatas, ekspresuotas PB14 peptidas gali būti atpažintas anti-PB14 serumu.
ECL atveju, vietoje nitroceliuliozės membranos naudota PVDF membrana (Gelman Science, BioTrace®). Priedo, pirmasis antikūnas naudotas santykiu vienas (1) su dešimt tūkstančiu (10000) ir HRP-konjuguoti triušio anti-pelės IgG (Pierce, Rokfordas, IL, JAV) buvo panaudoti kaip antrasis antikūnas santykiu vienas (1) su dešimt tūkstančiu (10000). Spalvinėje reakcijoje naudotas 1 ml A tirpalo ECL+vestern-blot agento (Amersham) 25-iuose ml B tirpalo. Kai spalva buvo pakankamai generuota, membrana buvo įterpta [kasetės plėvelę, atitinkamai
5, 10, 20 ir 30 sekundžių, kad eksponuotų ant plėvelės taip, kad ruoželiai ant gelio galėtų būti aptikti (Fig. 8). Fig. 8 juosta M reiškia ECL aptikimo žymę (Gibco BRL), o juosta 1 reiškia PB14 peptidą. Iš Fig. 8 matyti, kad ekspresuotas PB14 peptidas gali būti atpažintas anti-PB14 serumu.
Priedo, vestern-blotingo analizė, kurioje PB14 peptidas, naudojantis polikloninį antikūną, išskirtą iš triušio serumo, panaudojant Protein G kolonėlę (Bio-Rad, JAV), duoda tokį pat rezultatą.
pavyzdys: Anti-PBU peptido pelės antikūno gamyba
Čia naudotas PB14 peptidas yra PBl4_hls peptidas, iš kurio pašalinta jo Hisžymė pagal 2 pavyzdžio 3-3 pakopą.
pakopa: PBI4 peptido susiuvimas su OVA
Ovalbuminas (OVA), kaip baltymas nešiklis, pridėtas į išgrynintą PB14 peptidą pagal 2 pavyzdžio 3 pakopą moliniu santykiu vienas (1) su dešimt (10) ir inkubuotas vieną (1) valandą 4 °C temperatūroje. į PBI4 -peptido-ovalbumino tirpalą tokiu pat tūriu pridėta 2 tūrio % glutaraldehido ir inkubuota vieną (1) valandą pastoviai purtant. Po to į reakcijos mišinį pridėta glicino, o kai galutinė koncentracija tampa 0,2 M, reakcija sustabdoma.
Reakcijai įvykus, likęs reakcijos mišinyje glutaraldehidas-glicinas pašalinami dialize naudojant MWC0 12000-14000 dializės membraną (Spectrum®, Dominguez, CA, JAV).
pakopa: pelės imunizvimas
Peptidas, su kuriuo buvo sujungtas OVA 1 pakopoje, sukoncentruotas ir panaudotas pelės imunizavimui. Antigeno kiekis, suleistas pelei buvo 5 pg ir tai buvo PB14-peptido kiekis prieš sujungiant su OVA. Antigenas, kuris emulguotas su tokiu pat kiekiu adjuvanto, įvestas pelei į pilvo ertmę 0,2 ml kiekiu.
Pirmai injekcijai panaudotas pilnas Freundo adjuvanto komplektas (CFA), o nepilnas Freundo adjuvanto komplektas (iFA) panaudotas kaip adjuvantas pakartotiniam imunizavimui du (2) kartus dviejų (2) savaičių intervalu. Kontrolinei pelei suleistas BSA (jaučio serumo albuminas).
Po penkių (5) dienų nuo paskutinės injekcijos punktuojant širdį iš pelės paimamas kraujas, kuriam leidžiama krešėti 30 minučių 37 °C temperatūroje. Po to kraujas nucentrifuguotas per 30 minučių 4 °C temperatūroje 2500 apsisukimų per minutę greičiu, ir krešuliai pašalinti iš kraujo. Supernatantas (t. y., kraujo serumas) inkubuotas per naktį 4 °C temperatūroje, kad likę kraujo koaguliantai būtų visiškai sukoncentruoti, ir nucentrifuguotas per 20 minučių 10000 apsisukimų per minutę greičiu. Susidaręs supernatantas išpilstytas į keletą mėgintuvėlių. Kraujo serumas, kuris turi būti panaudotas eksperimente, laikytas 4 °C temperatūroje, o liekanos laikytos - 20 °C temperatūroje.
pakopa: anti-PB14-antikūno avidiškumo matavimas netiesioginiu ELISA metodu
Antikūno avidiškumas išmatuotas naudojant kraujo serumą, gautą 2 pakopoje. 100 μΙ PB14-peptido paskirstyta į kiekvieną iš 96 mikrotitravimo plokštelės (Flakonas: pro-surišimas) duobutę ir palikta stovėti 4 °C temperatūroje 6 valandoms arba daugiau, o po to plauta tris (3) kartus TTBS buferiu (Tris fiziologinio tirpalo buferis, turintis 0,05 % Tvino 20). 200 μΙ blokuojančio tirpalo (1 % BSA, esantis TTBS) pridedama į kiekvieną duobutę ir inkubuojamas 37 °C temperatūroje vieną (1) valandą, o po to plauta tris (3) kartus su TTBS. 100 μΙ išskirto serumo, kuris praskiestas su blokuojančiu tirpalu santykiu vienas (1) su nuo 102 iki 105 pridedami į reakcijos tirpalą ir inkubuojama 37 °C temperatūroje vieną (1) valandą, o po to plauta tris (3) kartus su 200 μΙ TTBS. 100 μΙ HPRprijungto ožkos anti-triušio IgG antikūnas (Pierce, Rockford, IL), praskiestas su blokuojančiu tirpalu santykiu vienas (1) su 103, pridedamas į reakcijos tirpalą ir inkubuojamas 37 °C temperatūroje vieną (1) valandą, o po to plautas tris (3) kartus su 200 μΙ TTBS. HPR substrato rinkinio tirpalas A (Bio-Rad) sumaišytas su šio rinkinio tirpalu B santykiu devyni (9) su vienu (1). 100 μΙ susidariusio mišinio pridėta į reakcijos tirpalą ir dažyta trisdešimt (30) minučių, o po to reakcijos mišinio optinė sugertis išmatuota prie 405 nm naudojant ELISA lyderį (EL312e, Bio-Tek lns.)(Fig. 9). Fig 9 patvirtina, kad pelės antikūnas, specifinis PB14-peptidui, gali būti panaudotas vestern-blot ir ELISA metodų analizei, esant vienam (1) tūkstančiui klosčių (figūroje X ašies 3,0).
pavyzdys: PB14-vakcinos efektas prieš nutukimą naudojant pelės modeli pakopa: nutukimo sukėlimas pelei
Čia panaudotos 5 savaičių amžiaus ICR pelės (Korea Center for Animal Experiment [Korėjos eksperimentinių gyvūnų centras], Ltd., Seulas, Korėja). Pelės augintos vivariume, kuriame temperatūra palaikoma nuo 17 iki 25 °C, ir maitintos pašaro mišiniu (Sam Yang Feed Ltd., Seulas, Korėja [ingredientai: vanduo 11,8 %. arba daugiau, baltymai 20,0 % arba daugiau, nevalyti lipidai 3,0 % arba daugiau, ląstelienos žaliava 10,0 % arba mažiau, nevalyti pelenai 10,0 % arba mažiau, kalcis 0,6 % arba mažiau, ir fosforas 0,4 % arba daugiau]). Pelėms duota aukso tiogliukozė (GTG), kad sukeltų nutukimą. GTG turi savybę sukelti venteromedialinio hipotalaminio branduolio (VMH) jautrumo sumažėjimą.. Todėl pelės, gavusios GTG nejaučia sotumo ir pastoviai nori ėsti. Čia naudotas GTG yra labai nestabilus junginys, kuris lengvai suskyla vandenyje arba nuo drėgmės. Todėl 100 mg GTG (Sigma, Ine.) praskiestas su 1 ml sezamo aliejaus (Sigma, Ine.) ir buvo naudotas tokiu pat būdu kaip ir Brecherio su bendraautoriumi (Brechere G.,Waxler, S. H., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 70: 498-501 (1949)) tam, kad būtų pateiktas patikimas GTG kiekis.
Pelės padalintos, kad būtų suformuota tiriama grupė (dvidešimt (20) pelių) ir kontrolinė grupė (keturios 4) grupės), 25 ml GTG suleista bandomai grupei, o kontrolinei grupei nesuleista nieko.
Tiriamos grupės pelių kūno masė išmatuota prieš eksperimentą ir pelės, kurių kūno masės nukrypimas buvo nežymus, buvo atrinktos ir panaudotos eksperimentui. Pelių kūno masė, išmatuota po vienos (1) savaitės po GTG suleidimo buvo nuo 26,5 iki 29,5 gramo.
Septynių GTG injekuotų pelių grupė buvo su sukeltu nutukimu, tuo tarpu likusios - nebuvo. Pelėms, kurioms nutukimas nebuvo sukeltas, buvo vėl injekuotos GTG, po to nutukimas buvo sukeltas visoms pelėms.
Visos pelės su sukeltu nutukimu buvo padalintos į tris (3) grupes. Po savaitės, kai GTG buvo suleistas antrą kartą, pirmai tiriamai grupei, susidedančiai iš septynių (7) pelių buvo suleistas PB14-peptidas pagal 3 pavyzdžio 2 pakopą. Priedo, pelėms kitos grupės iš trijų (tiriamos 2 grupės, susidedančios iš septynių (7) pelių) vietoje PB14-peptido buvo suleistas ovalbuminas kaip tariamas eksperimentas, o vakcina nebuvo suleista kitai grupei (tiriamai 3 grupei, turinčiai šešias (6) peles), kad sukeltų nutukimą. Iš kitos pusės, 0,2 ml PBS buvo suleista kontrolinei grupei, kad sulygintų su tiriamomis grupėmis, kad patvirtintų šio išradimo vakcinos efektyvumą.
Priedo, čia vartojamas pašaras sumaišytas su kiaušinio tryniu ir džiovintas 50 °C temperatūroje, kad sukeltų cholesterolio suvartojimą taip, kad cholesterolio lygis galėtų pakilti pelės serume. Pašaras taip pat duotas pakankamu kiekiu, kad sukeltų ligas, susijusias su cholesterolio lygio padidėjimo sukeliamomis ligomis. Pelių kūno masė buvo matuojama kasdien.
Kaip parodyta Fig. 10, tiriamos 1 grupės (-A-A-) vakcina injekuotų pelių kūno masė per dvylika (12) savaičių nuo GTG injekcijos išaugo nuo 27 ± 0,4 g iki 52,2 ± 1,7 g. Duomenys patvirtina išvadą, kad nėra žymaus skirtumo išaugusios kūno masės tarp tiriamos 1 grupės ir kontrolinės grupės (-0-0 -). Tačiau pelių kūno masė tiriamoje 2 grupėje (- ·- · -), kurioje ovalbuminas įvestas po to, kai pelės nutuko, ir tiriamos grupės (- - -), kurioje po nutukimo vakcina nebuvo įvesta, kūno masė augo pastoviai nuo 28,3 ± 0,5 g iki 68,9 ± 2,8 g. Todėl buvo patvirtinta, kad nutukimas galėjo būti sustabdytas PBl4-peptido vakcinos injekcija.
Figūroje 10 G1 ir G2 reiškia GTG injekcijos laiką, o V1, V2 ir V3 reiškia PBl4-peptido vakcinos injekcijos laiką.
Figūroje 11 parodytas pelės su iššauktu nutukimu išorinis vaizdas. 20-ties savaičių pelė tiriamos 1 grupės (Fig. 11a: normalios pelės) palyginta su 20 savaičių pele tiriamos 3 grupės (fig. 11 b: nutukusios pelės). Kaip parodyta Fig 11, buvo patvirtinta, kad šio išradimo vakcina buvo efektyvi stabdant nutukimą.
pakopa: Cholesterolio lygio matavimas kraujyje
Po pirmosios GTG injekcijos kraujo cholesterolio lygis 12-kos savaičių kontrolinės grupės pelių palygintas su 12-kos savaičių GTG-injekuotomis tiriamų 1 ir 2 grupių pelėmis. Bendrojo cholesterolio, trigliceridų, HDL-cholesterolio ir LDLcholesterolio koncentracijos išmatuotos fermentiniu būdu naudojant Cholestezyme-V, Triglyzyme-V, HDL-C555 (Shin Yang Chemicals, Korėja) ir LDLEX rinkinį (Denka Bio-Research, Ltd., Tokijas, Japonija). Kiekviename eksperimente paruoštos kalibravimo kreivės O.D reikšmėms naudojant standartą Calibrater-D (Denka Bio-Research Ltd., Tokijas, Japonija), kad būtų sumažintos eksperimento paklaidos. O.D reikšmės dėl intereso buvo išskaičiuotos remiantis kalibravimo kreive, kad patvirtintų lipidų koncentraciją ir kiekį, o rezultati pateikti 1 lentelėje ir Fig. 12.
| Bendrasis cholesterolis | TG | HDL-C | ||
| Kontrolinė grupė | 79 ±3,7 | 180 ±26 | 59 ±3,4 | |
| Tiriama 1 grupė | 118 ± 3,6 | 217±47 | 92 ± 4,7 | 20 ±1,7 |
| Tiriamos 2 ir 3 grupės | 131 ±8,8 | 218 ±70 | 119±7,5 | 30 ±4,5 |
TG: trigliceridai;
HDL-C: HDL-cholesterolis; LDL-C: LDL-cholesterolis.
Kaip parodyta 1 lentelėje ir Fig. 12, kaip nutukimo sukėlimo rezultatas gautas patvirtinimas, kad abiejose tiriamose grupėse nėra jokio žymaus skirtumo cholesterolio kiekyje, o kontrolinėje grupėje cholesterolio kiekis nepadidėjo, nes bendra cholesterolio koncentracija kraujyje, o taip HDL-C ir LDL-C pakilo labai nežymiai (Fig. 12).
Pramoninis pritaikomumas
Šio išradimo vakcina, kuri turi apoliproteino B-100 epitopo mimezinį peptidą, jo konkatemerus ir modifikuotus peptidus, gali sustabyti atsiradusį nutukimą nesukeliant organizme autoimuniteto.
Todėl kraujotakos ligos, surištos su LDL gali būti gydomos šio išradimo vakcina efektyviau, palyginus su laikinu arba brangiai kainuojančiu įprastu būdu, kuriame inhibuojamas fermentas, surištas su cholesterolio metabolizmu.
Išradimas pateiktas aiškiai ir aprašytas su nuorodomis į jo specifinius pavyzdžius ir turi būti suprantamas šios srities specialistams, kad galimi įvairūs formos ir detalių pasikeitimai, kurie neišeina už išradimo esmės ir apimties ribų, pateikiamoje pridėtoje išradimo apibrėžtyje.
Claims (18)
- IŠRADIMO APIBRĖŽTIS1. Sekos SEQ. ID. Nr. 1 apoliproteino B-100 epitopo mimezinis peptidas ir jo konkatemeras.
- 2. Mimezinio peptido konkatemeras pagal 1 punktą, kuriame minėtas konkatemeras apima nuo vieno (1) iki penkiolikos (15) minėtųjų mimezinių peptidų.
- 3. Mimezinio peptido konkatemeras pagal 1 punktą, kuriame minėtas konkatemeras apima nuosekliai sujungtus keturis (4) minėtuosius peptidus.
- 4. Mimezinis peptidas ir jo konkatemeras pagal 1 punktą, kuriame minėtojo mimezinio peptido aminorūgščių seka modifikuota būdu, parinktu iš grupės, susidedančios iš prijungimo, delecijos ir cheminio pakeitimo reakcijų.
- 5. Sekos SEQ. ID. Nr. 2 apoliproteino B-100 epitopo mimezinis peptidas.
- 6. Mimezinis peptidas pagal 5 punktą, kuriame minėtas konkatemeras apima nuo vieno (1) iki penkiolikos (15) minėtųjų mimezinių peptidų.
- 7. Mimezinio peptido pagal 5 punktą konkatemeras, kuriame minėtas konkatemeras apima nuosekliai sujungtus keturis (4) minėtuosius peptidus.
- 8. Mimezinis peptidas pagal 5 punktą, kuriame minėtojo mimezinio peptido aminorūgščių seka modifikuota būdu, parinktu iš grupės, susidedančios iš prijungimo, delecijos ir cheminio pakeitimo reakcijų.
- 9. Sekos SEQ. ID. Nr. 3 apoliproteino B-100 epitopo mimezinis peptidas.
- 10. Mimezinio peptido pagal 9 punktą konkatemeras, kuriame minėtas konkatemeras apima nuo vieno (1) iki penkiolikos (15) minėtųjų mimezinių peptidų.
- 11: Mimezinio peptido pagal 9 punktą konkatemeras, kuriame minėtas konkatemeras apima nuosekliai sujungtus keturis (4) minėtuosius peptidus.
- 12. Mimezinis peptidas pagal 9 punktą, kuriame minėtojo mimezinio peptido aminorūgščių seka modifikuota būdu, parinktu iš grupės, susidedančios iš prijungimo, delecijos ir cheminio pakeitimo reakcijų.
- 13. Vakcinos kompozicija, skirta gydyti nutukimą, besiskirianti tuo, kad ji apima peptidą, parinktą iš grupės, susidedančios iš sekų SEQ. ID Nr. 1, SEQ. ID Nr. 2 ir SEQ. ID Nr. 3 apoliproteino B-100 epitopo mimezinių peptidų, jų konkatemerų, jų modifikuotųjų peptidų ir jų mišinių.
- 14. Vakcinos kompozicija pagal 13 punktą, besiskirianti tuo, kad minėta vakcinos kompozicija skiriama intrakutaniniu būdu.
- 15. Vakcinos kompozicija pagal 13 punktą, besiskirianti tuo, kad minėtos vakcinos kompozicijos tipas parinktas iš grupės, susidedančios iš tablečių, piliulių, granulių, oblečių, eliksyrų, suspensijų, emulsijų, tirpalų, sirupų, aerozolių, minkštųjų arba kietųjų želatinos kapsulių, sterilizuotųjų injekcinių tirpalų ir sterilizuotųjų miltelių.
- 16. Apoliproteino B-100 epitopo mimezinio peptido, jo konkatemero ir jo modifikuotojo peptido gavimo būdas, besiskiriantis tuo, kad jis apimai) pakopą, skirtą DNR, kuri koduoja sekų SEQ. ID Nr. 1, SEQ. ID Nr. 2 irSEQ. ID Nr. 3 apoliproteino B-100 epitopo mimezinių peptidų, jų konkatemerų, jų modifikuotųjų peptidų genetinę informaciją, įterpimui į vektorių;ii) pakopą, skirtą ląstelių-šeimininkių transformavimui su vektoriumi, gautu i) pakopoje ir jų inkubavimui;iii) pakopą, skirtą minėtojo apoliproteino B-100 epitopo mimezinio peptido, jo konkatemero ir jo modifikuotojo peptido išskyrimui iš ląstelių-šeiminikių.
- 17. DNR, koduojanti polipeptidą, sudarytą iš SEQ. ID Nr. 1 apoliproteino B100 epitopo keturių (4) nuosekliai sujungtų mimezinių peptidų.
- 18. Ekspresijos vektorius, kuris apima DNR fragmentą, koduojantį polipeptidą, sudarytą iš SEQ. ID Nr. 1 apoliproteino B-100 epitopo keturių (4) nuosekliai sujungtų mimezinių peptidų.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR20000052055 | 2000-09-04 | ||
| KR10-2001-0054005A KR100472841B1 (ko) | 2000-09-04 | 2001-09-04 | 아포지단백질 비-100의 에피토프에 대한 모조 펩타이드,그들의 연쇄물 또는 변형체와 이들을 함유하는 백신 조성물 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| LT2002051A LT2002051A (lt) | 2002-09-25 |
| LT4989B true LT4989B (lt) | 2003-01-27 |
Family
ID=26638363
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| LT2002051A LT4989B (lt) | 2000-09-04 | 2002-04-29 | Apolipoproteino b-100 epitopo mimeziniai peptidai, jų konkatemerai ir modifikuotieji peptidai, ir juos turinti vakcinos kompozicija |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6825318B2 (lt) |
| EP (1) | EP1315517B1 (lt) |
| JP (1) | JP2004508029A (lt) |
| CN (1) | CN1231262C (lt) |
| AU (1) | AU8628601A (lt) |
| BG (1) | BG106655A (lt) |
| BR (1) | BR0107175A (lt) |
| CA (1) | CA2389739A1 (lt) |
| CZ (1) | CZ20021571A3 (lt) |
| EE (1) | EE200200238A (lt) |
| HU (1) | HUP0203251A2 (lt) |
| IL (1) | IL149379A0 (lt) |
| LT (1) | LT4989B (lt) |
| MX (1) | MXPA02004505A (lt) |
| NO (1) | NO20022147L (lt) |
| RU (1) | RU2313536C2 (lt) |
| SK (1) | SK6312002A3 (lt) |
| WO (1) | WO2002020040A1 (lt) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PL379196A1 (pl) * | 2003-06-11 | 2006-07-24 | Schering Aktiengesellschaft | Nowe zmodyfikowane cząsteczki koryny posiadające substytut sekwencji aktywacji i ich zastosowanie |
| KR100639397B1 (ko) * | 2004-03-18 | 2006-10-26 | (주)에스제이바이오메드 | 항비만용 면역원성 하이브리드 폴리펩타이드 및 이를포함하는 항비만 백신 조성물 |
| US20070054298A1 (en) * | 2005-08-12 | 2007-03-08 | Kent Kirshenbaum | Methods for enzyme-mediated coupling of oligomers |
| WO2007075335A2 (en) * | 2005-12-16 | 2007-07-05 | The Regents Of The University Of California | Modulation of in utero immune programming |
| US8961982B2 (en) * | 2005-12-16 | 2015-02-24 | The Regents Of The University Of California | Modulation of developmental immune programming and protection against cardiovascular disease, diabetes, infectious diseases, and cancer |
| RU2418005C2 (ru) * | 2006-09-25 | 2011-05-10 | ЭсДжей БАЙОМЕД ИНК. | Иммуногенные гибридные полипептиды против ожирения и композиция вакцин против ожирения, содержащая эти полипептиды |
| CN103520713B (zh) * | 2013-10-16 | 2015-10-28 | 西北农林科技大学 | 一种ApoB100酵母重组疫苗及其制备方法和应用 |
| EP3463416A1 (en) | 2016-05-31 | 2019-04-10 | CardioVax, LLC | Methods for diagnosing and treating systemic lupus erythematosus |
| US10858422B2 (en) | 2016-05-31 | 2020-12-08 | Abcentra, Llc | Methods for treating systemic lupus erythematosus with an anti-apolipoprotein B antibody |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3215310A1 (de) * | 1982-04-23 | 1983-10-27 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur bestimmung der low density lipoproteine (ldl) und reagenz zu seiner durchfuehrung |
| US6309853B1 (en) * | 1994-08-17 | 2001-10-30 | The Rockfeller University | Modulators of body weight, corresponding nucleic acids and proteins, and diagnostic and therapeutic uses thereof |
| CA2283474A1 (en) * | 1997-03-04 | 1998-09-11 | Bio-Technology General Corp. | Isolation of tissue specific peptide ligands and their use for targeting pharmaceuticals to organs |
| AU2801299A (en) * | 1998-03-04 | 1999-09-20 | Bio-Technology General Corporation | Isolation of tissue specific peptide ligands and their use for targeting pharmaceuticals to organs |
| EP1267908B1 (en) * | 2000-03-03 | 2004-05-06 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Vaccine for the treatment of atherosclerosis |
-
2001
- 2001-09-04 CN CNB018030572A patent/CN1231262C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2001-09-04 JP JP2002524523A patent/JP2004508029A/ja active Pending
- 2001-09-04 EP EP01965715A patent/EP1315517B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-09-04 EE EEP200200238A patent/EE200200238A/xx unknown
- 2001-09-04 HU HU0203251A patent/HUP0203251A2/hu unknown
- 2001-09-04 IL IL14937901A patent/IL149379A0/xx unknown
- 2001-09-04 AU AU86286/01A patent/AU8628601A/en not_active Abandoned
- 2001-09-04 RU RU2003109439/13A patent/RU2313536C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2001-09-04 CA CA002389739A patent/CA2389739A1/en not_active Abandoned
- 2001-09-04 CZ CZ20021571A patent/CZ20021571A3/cs unknown
- 2001-09-04 SK SK631-2002A patent/SK6312002A3/sk unknown
- 2001-09-04 BR BR0107175-0A patent/BR0107175A/pt not_active Application Discontinuation
- 2001-09-04 WO PCT/KR2001/001492 patent/WO2002020040A1/en not_active Ceased
- 2001-09-04 MX MXPA02004505A patent/MXPA02004505A/es unknown
-
2002
- 2002-04-25 BG BG106655A patent/BG106655A/bg unknown
- 2002-04-29 LT LT2002051A patent/LT4989B/lt not_active IP Right Cessation
- 2002-05-03 NO NO20022147A patent/NO20022147L/no not_active Application Discontinuation
-
2003
- 2003-03-04 US US10/378,707 patent/US6825318B2/en not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (8)
| Title |
|---|
| ALVING CR, WASSEF NM, POTTER M.: "Antibodies to cholesterol: biological implications of antibodies to lipids", CURR TOP MICROBIOL IMMUNOL., 1996, pages 181 - 186, XP002923267 |
| BRECHER G, WAXLER SH.: "Obesity in albino mice due to single injections of goldthioglucose", PROC SOC EXP BIOL MED., 1949, pages 498 - 501 |
| BROWN MS, GOLDSTEIN JL: "Lipoprotein metabolism in the macrophage: implications for cholesterol deposition in atherosclerosis", ANNU REV BIOCHEM., 1983, pages 223 - 261 |
| CARL R. ALVING ET AL.: "Immunization with cholesterol-rich liposomes induces anti-cholesterol antibodies and reduces diet-induced hypercholesterolemia and plaque formation", JOURNAL OF LABORATORY AND CLINICAL MEDICINE, 1996, pages 40 - 49, XP001095396, DOI: doi:10.1016/S0022-2143(96)90164-X |
| CARL R. ALVING ET AL.: "Naturally occurring autoantibodies to cholesterol in humans", BIOCHEMICAL SOCIETY TRANSACTIONS, 1989, pages 637 - 639 |
| DALUM I ET AL.: "Induction of cross-reactive antibodies against a self protein by immunization with a modified self protein containing a foreign T helper epitope", MOL IMMUNOL., 1997, pages 1113 - 1120, XP002920190, DOI: doi:10.1016/S0161-5890(97)00147-8 |
| JM BAILEY: "Cholesterol vaccines", SCIENCE, 1994, pages 1067 - 1068, XP002310090 |
| W PALINSKI ET AL.: "Immunization of low density lipoprotein (LDL) receptor-deficient rabbits with homologous malondialdehyde-modified LDL reduces atherogenesis", PROC NATL ACAD SCI USA., 1995, pages 821 - 825, XP002951783, DOI: doi:10.1073/pnas.92.3.821 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1315517B1 (en) | 2010-10-20 |
| CA2389739A1 (en) | 2002-03-14 |
| SK6312002A3 (en) | 2002-09-10 |
| JP2004508029A (ja) | 2004-03-18 |
| BR0107175A (pt) | 2002-07-02 |
| RU2003109439A (ru) | 2004-07-20 |
| BG106655A (bg) | 2004-08-31 |
| CN1392798A (zh) | 2003-01-22 |
| US6825318B2 (en) | 2004-11-30 |
| US20030211997A1 (en) | 2003-11-13 |
| MXPA02004505A (es) | 2004-09-10 |
| CZ20021571A3 (cs) | 2002-09-11 |
| IL149379A0 (en) | 2002-11-10 |
| WO2002020040A1 (en) | 2002-03-14 |
| EP1315517A1 (en) | 2003-06-04 |
| LT2002051A (lt) | 2002-09-25 |
| NO20022147D0 (no) | 2002-05-03 |
| AU8628601A (en) | 2002-03-22 |
| HUP0203251A2 (hu) | 2003-01-28 |
| NO20022147L (no) | 2002-05-03 |
| CN1231262C (zh) | 2005-12-14 |
| RU2313536C2 (ru) | 2007-12-27 |
| EE200200238A (et) | 2003-06-16 |
| EP1315517A4 (en) | 2005-02-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6410022B1 (en) | Modulation of cholesteryl ester transfer protein (CETP) activity | |
| US6699973B1 (en) | Antibodies to peptides that target GIT receptors and related methods | |
| LT4989B (lt) | Apolipoproteino b-100 epitopo mimeziniai peptidai, jų konkatemerai ir modifikuotieji peptidai, ir juos turinti vakcinos kompozicija | |
| EP0672136B1 (en) | Polypeptides, derived from endonexin 2, having hepatitis b virus receptor activity and their use in diagnostic and pharmaceutical compositions | |
| KR100956893B1 (ko) | 항비만용 면역원성 하이브리드 폴리펩타이드 및 이를포함하는 항비만 백신 조성물 | |
| TW200911282A (en) | Pharmaceutical compound | |
| AU2004262472A1 (en) | Targeted therapeutic vaccine against P-glycoprotein 170 for inhibiting multi-drug resistance in the treatment of cancers | |
| JP2010504094A5 (lt) | ||
| KR100639397B1 (ko) | 항비만용 면역원성 하이브리드 폴리펩타이드 및 이를포함하는 항비만 백신 조성물 | |
| KR100472841B1 (ko) | 아포지단백질 비-100의 에피토프에 대한 모조 펩타이드,그들의 연쇄물 또는 변형체와 이들을 함유하는 백신 조성물 | |
| JP2003511061A (ja) | 変更された化学結合体化特性を有するａｂ５毒素ｂサブユニット変異体 | |
| AU2007200834B2 (en) | Mimetic peptides for epitope of apolipoprotein B-100, concatemer and modified peptides thereof, and the vaccine composition comprising the same | |
| US5871739A (en) | Pharmaceutical composition | |
| HK1050857A (en) | Mimetic peptides for epitope of apolipoprotein b-100, concatemer and modified peptides thereof, and the vaccine composition comprising the same | |
| JP2000505645A (ja) | カルシウム結合プロテオリピド組成物および方法 | |
| HK1026119A (en) | Mammalian nonhuman transgenic animal having a constitutive or inducible expression of the human endonexin ii gene or its muteins or its fragments |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM9A | Lapsed patents |
Effective date: 20030904 |