CN103520713B - 一种ApoB100酵母重组疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种ApoB100酵母重组疫苗及其制备方法和应用，该酵母重组疫苗以酵母作为宿主细胞，转染包含ApoB100基因片段的真核表达载体；所述的ApoB100基因片段的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，所述的真核表达载体为JMB88-HA-OVA-hApoB100。该酵母重组疫苗通过口服的方式饲喂，能够在酵母中被硫酸铜诱导下表达OVA-hApoB融合蛋白，并在体内被裂解释放，经过抗原呈递引起集体的体液和细胞免疫反应，达到缓解和治疗动脉粥样硬化的目的，可应用于动脉粥样硬化的药物的制备。

Description

一种ApoB100酵母重组疫苗及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种ApoB100酵母重组疫苗及其制备方法和应用。

背景技术

在21世纪，心脑血管疾病已经成为人类健康的第一杀手，动脉粥样硬化(atheroma)是一组称为动脉硬化的血管病中常见的最重要的一种，多由脂肪代谢紊乱、神经血管功能失调引起，是由遗传、环境等多因素导致的老年多发性疾病，常导致血栓形成、供血障碍等，近年来有逐渐年轻化和上升趋势。在众多的发病因素中，脂质代谢紊乱，尤其是高胆固醇血症与其关系最为密切。

脂蛋白在人类动脉粥样硬化(As)形成及进展过程中起主要作用，它是由脂质及载脂蛋白(Apo)构成。载脂蛋白在脂蛋白的代谢过程中起关键作用，主要分为A、B、C、D、E五类。载脂蛋白E是血浆脂蛋白的重要成分，它的主要机能是作为乳糜微粒(cM)残粒受体和低密度脂蛋白(LDL)受体的配体，在脂质残粒的代谢中起重要作用，对脂质的运输和代谢发挥主要作用。有研究表明，载脂蛋白E（ApoE）基因缺陷小鼠无论正常或者高脂饮食均可形成严重的高血脂症及AS，其病变的发展同人类极其相似，故常被用于研究AS发病机制以及抗AS病理学研究。载脂蛋白B（ApoB）为人体主要的载脂蛋白，为乳糜微粒（CM）、及低密度脂蛋白（VLDL）、中间密度脂蛋白、低密度脂蛋白（LDL）的构成成分，在脂类转运和代谢过程中起着极其重要的作用。人体含有两型ApoB分子，ApoB100参与VLDL的装配与分泌。在血液中，VLDL可代谢转化为富含胆固醇的LDL。每个LDL颗粒上仅含一分子ApoB100，是唯一的蛋白成分，同时也介导80%的LDL与受体结合使之被清除体外。ApoB48为CM合成和分泌所必需，参与外源性脂质的消化、吸收和运输。目前ApoB已被锁定为促使动脉粥样硬化（AS）与冠心病（CAD）的危险因子。

已研究发现免疫反应与动脉粥样硬化的发病相关,因此使用免疫抑制以及接种疫苗成为治疗动脉粥样硬化的新方法。许多研究证实,大部分免疫抑制药物对心血管的危险因素(包括血脂异常、高血压病、糖尿病)均有负面作用。因此,限制了该类药物在抗动脉粥样硬化上的应用。免疫接种常用的方法就是通过接种疫苗,暴露抗原诱导机体免疫反应,产生抗体。最近,临床上正在尝试使用免疫接种疫苗的方法治疗非感染性疾病,包括风湿性关节炎、I型糖尿病和Alzheimer’s病等。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种ApoB100酵母重组疫苗及其制备方法和应用，通过基因工程发酵酵母疫苗递呈抗原ApoB100，诱导机体产生特异性抗体，有助于动脉粥样等慢性炎症性疾病的防治。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种ApoB100酵母重组疫苗，该酵母重组疫苗以酵母作为宿主细胞，转染包含ApoB100基因片段的真核表达载体。

所述的ApoB100基因片段的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

所述的真核表达载体为JMB88-HA-OVA-hApoB100，是将ApoB100基因片段克隆到JMB88-HA-OVA-MCS载体中的OVA的下游而得到的；

所述的酵母为酵母JMY1。

该酵母重组疫苗能够表达OVA-ApoB100融合蛋白，并将表达的ApoB100肽递呈给抗原递呈细胞，诱导免疫反应，产生针对ApoB100的抗体。

该酵母重组疫苗能够表达ApoB100肽，并将表达的ApoB100肽递呈给抗原递呈细胞，诱导免疫反应，产生针对ApoB100的抗体。

一种真核表达载体，该真核表达载体为JMB88-HA-OVA-hApoB100，是将ApoB100基因片段克隆到JMB88-HA-OVA-MCS载体中而得到的。

一种ApoB100酵母重组疫苗的制备方法，包括以下操作：

1）以人基因组为模板克隆ApoB100基因片段，并将ApoB100基因克隆到真核表达载体JMB88-HA-OVA-MCS当中，构建真核表达载体JMB88-OVA-hApoB100；

2）将真核表达载体JMB88-OVA-hApoB100转染到酵母菌株当中，并筛选阳性克隆；

3）将阳性克隆接种到液体SD培养基中，当细胞最佳密度达到OD₆₀₀=0.5时加入0.5mM的硫酸铜溶液进行诱导表达；

4）诱导表达后离心收集酵母细胞并进行洗涤，然后将酵母细胞在56℃灭活1h，得到ApoB100酵母重组疫苗。

所述的真核表达载体JMB88-OVA-hApoB100的构建包括：

以人基因组DNA为模板，以上游引物hApoB-F、下游引物hApoB-R为引物对扩增ApoB100基因片段，Bgl Ⅱ/Xho Ⅰ双酶切得到的ApoB100基因片段，并与经同样双酶切后的酵母真核表达载体JMB88-HA-OVA-MCS连接，16℃连接过夜，构建质粒JMB88-HA-OVA-hApoB100。

所述的真核表达载体JMB88-OVA-hApoB100是通过LiAc/ssDNA的方法转染到酵母菌株JMY1当中，然后将转染后的菌体均匀涂布并在基本SD固体培养基上进行筛选。

所述的ApoB100酵母重组疫苗在制备防治冠心病、动脉粥样硬化的药物中的应用。

所述的ApoB100酵母重组疫苗在制备降低低密度脂蛋白胆固醇、提高高密度脂蛋白胆固醇药物中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

1、本所述基因工程发酵酵母含有真核基因表达盒（如CUP1-ApoB100)：真核基因表达盒可以整合在酵母基因组或者作为酵母质粒随酵母细胞进行复制。应用该基因工程酵母饲喂买7周龄雄性ApoE基因缺陷型（ApoE-/-）小鼠，免疫12周后能够在小鼠血清中检测到特异性抗体的产生。本发明应用基因工程酵母作为表达和运输外援蛋白的载体，靶向调控机体体液和细胞免疫反应，能够应用于治疗自身免疫疾病和新型口服疫苗开发和生产，并且能够终生保护机体对抗特的定病理反应。

2、本发明构建含有真核启动子的酵母表达载体的JMB88-HA-OVA-hApoB100，并将该载体转化到酿酒酵母中。通过口服的方式饲喂小鼠，由于载体具有真核表达系统，能够在酵母中被硫酸铜诱导下表达OVA-hApoB100融合蛋白（其中OVA为鸡卵清蛋白，表达后能提高抗原的免疫原性，用于增加抗原蛋白的刺激机体产生抗体的能力），并在体内被裂解释放，经过抗原呈递引起集体的体液和细胞免疫反应，达到缓解和治疗动脉粥样硬化的目的，可应用于动脉粥样硬化的药物的制备。

附图说明

图1为人ApoB100基因片段的PCR扩增电泳图；

图2为JMB88-HA-OVA-MCS载体的质粒图谱；

图3为JMB88-OVA-hApoB酵母表达载体的质粒图谱；

图4为真核表达载体JMB88-HA-OVA-hApoB100的双酶切鉴定图；

图5酵母菌株JMY1中HA-OVA-hApoB100、HA-OVA融合蛋白表达的Western blot检测结果图；

图6为Western blot检测各组小鼠血清中的ApoB100抗体的结果图；

图7为Western blot检测hApoB100特异性抗体与apoE基因缺陷小鼠、昆白小鼠自身ApoB100之间的特异性免疫反应；

图8为ELISA检测各组小鼠血清ApoB100特异性抗体的滴度；

图9为测定各组小鼠血清中TC、TG、HDL-C和LDL-C的浓度结果图；

图10为分离成功的心脏样本示意图；

图11为小鼠动脉瓣膜冰冻切片油红O染色结果图。

具体实施方式

免疫反应与动脉粥样硬化的发病相关,因此使用免疫抑制以及接种疫苗成为治疗动脉粥样硬化的新方法。然而许多研究证实,大部分免疫抑制药物对心血管的危险因素(包括血脂异常、高血压病、糖尿病)均有负面作用。因此,限制了该类药物在抗动脉粥样硬化上的应用。

鉴于ApoB已被锁定为促使动脉粥样硬化（AS）与冠心病（CAD）的危险因子，且根据文献报道用ApoB100的p143和p210肽段免疫高脂饲喂的ApoE基因缺陷型小鼠，它们能够抑制降主动脉上动脉粥样硬化病变。故本发明了一种针对ApoB100p210肽段的新型重组酵母疫苗，验证重组酵母ApoB100p210作为降低主动脉粥样硬化病变的可能性。利用酵母本身具有佐剂的作用和易于表达抗原蛋白并递呈抗原的特性，将表达的外源ApoB100p210肽段递呈给机体的抗原递呈细胞（APC）---树突状细胞（DCs），从而诱导机体有效的保护性免疫反应，产生针对ApoB100的抗体。结果表明将本发明所制备的酵母疫苗口服免疫的方法让小鼠产生针对外源蛋白ApoB100的特异性抗体，从而调节小鼠本身的ApoB100水平，以达到治疗或者预防动脉粥样样硬化的疾病的目的。

为使本发明的技术方案便于理解，以下结合人基因组ApoB100基因的具体试验例对本发明由口服基因工程发酵酵母表达外源基因的方法(即通过口服基因工程发酵酵母向小鼠体内靶向运送功能基因片段的方法)作进一步的说明。下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

1、酵母真核表达载体JMB88-HA-OVA-hApoB100的构建

首先利用PCR体外扩增人基因组外显子上的一个859bp的片段，包含CVX-210-H肽段。

1）引物设计与合成

以人基因组DNA为模板，利用Clone ManagerV7软件进行引物设计，设计能够特异扩增p210肽段的引物hApoB-F和hApoB-R，并在上游引物hApoB-F中引入Bgl Ⅱ酶切位点，下游引物hApoB-R中引入Xho Ⅰ酶切位点。序列设计如下：

hApoB-F：GGGAGATCTATAGACTTCCTGAATAACTATGCA；

hApoB-R：GGGCTCGAGTTGGTATTCAGTGTGATGACACTTG；

其中：hApoB-F引物序列中下划线部分为Bgl Ⅱ酶切位点；hApoB-R引物序列中下划线部分为Xho Ⅰ酶切位点。

2、PCR扩增人基因ApoB100目的片段

以人基因组DNA为模板，hApoB-F和hApoB-R为引物，PCR扩增人ApoB100基因片段，PCR反应体系为如表2所述，反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸50s，30个循环；最后72℃延伸10min。

表2ApoB100PCR体系

Component	volume
		人基因组DNA	1μL
hApoB-F	1μL
		hApoB-R	1μL
10*Taq Buffer	5μL
		2.5mmol/L dNTPs	4μL
Taq：pfu=4：1	0.5μL
		H2O	37.5μL

PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测片段大小正确结果如图1所示，其中。泳道1为Trans2K Plus DNA Marker;泳道2,3为人ApoB100基因片段的PCR扩增产物。

3、构建酵母表达载体JMB88-OVA-hApoB100

Bgl Ⅱ/Xho Ⅰ双酶切胶回收得到的目的片段（酶切体系如表3所示）与经同样双酶切后的酵母真核表达载体JMB88-HA-OVA-MCS连接，酶切体系如表4），连接体系如表5，16℃连接过夜，构建质粒JMB88-HA-OVA-hApoB100，然后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂LB/Amp平板，挑取单克隆并在LB/Amp液体培养基中37℃培养8h。

JMB88-HA-OVA-MCS载体的质粒图谱如图2所示，包括amp、TRP1、CUP1-P及OVA，其中OVA为鸡卵清蛋白的CDS序列，表达后能提高抗原的免疫原性，用于增加抗原蛋白的刺激机体产生抗体的能力；其核苷酸的序列如SEQ.ID.NO.2所示。

所构建的JMB88-OVA-hApoB酵母表达载体的质粒图谱如图3所示，可以看到该酵母表达载体是CUP1启动子，ApoB100插入到OVA的下游，含有真核基因表达盒CUP1-ApoB100，能够表达OVA-hApoB融合蛋白，真核基因表达盒可以整合在酵母基因组或者作为酵母质粒随酵母细胞进行复制。

所构建的JMB88-OVA-hApoB酵母表达载体能够在酵母中被硫酸铜诱导下表达OVA-hApoB融合蛋白，并在体内被裂解释放，经过抗原呈递引起集体的体液和细胞免疫反应。

提取质粒JMB88-HA-OVA-hApoB100，并经Bgl Ⅱ/Xho Ⅰ双酶切鉴定，结果如图4所示，其中泳道1为DNA Marker;泳道为2,3,4.JMB88-HA-OVA-hApoB100经BglII/Xho Ⅰ双酶切的产物。送阳性质粒到Invitrogen公司进行测序分析，其中hApoB100的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，保存测序正确的质粒备用。

表3hApoB100Bgl Ⅱ和Xho Ⅰ双酶切反应体系

Component	volume
		hApoB100	30μL
Bgl Ⅱ	1μL
		Xho Ⅰ	1μL
NEB Buffer3	5μL
		100μg/mL BSA	0.5μL
H2O	12.5μL

表4JMB88-HA-OVA-MCS Bgl Ⅱ和XhoI双酶切反应体系为

Component	volume
		JMB88-HA-OVA-MCS	5μL
Bgl Ⅱ	1μL
		Xho Ⅰ	1μL
NEB Buffer3	5μL
		100μg/mL BSA	0.5μL

表5JMB88-HA-OVA-MCS和hApoB100连接反应体系

Component	volume
		JMB88-HA-OVA-MCS	1μL
hApoB100	5μL
		Ligase	0.5μL
Ligase Buffer	1μL
		H2O	2.5μL

二、ApoB100的酵母真核表达

本发明选择酵母作为宿主细胞以便于ApoB100的表达，这是因为完整表达外源蛋白的重组酿酒酵母免疫动物，能引起动物体产生抗原特异性的细胞和体液免疫，这就表明酵母可以作为一种有效地佐剂用来传递抗原，进而激起强烈的免疫反应。酿酒酵母自身不仅具有佐剂作用，而且还能在疫苗设计中加入T细胞的生长因子从而打破机体对一些疫苗的低反应性，特别是针对有严重感染性疾病和恶性肿瘤等的自身免疫力低下的患者具有良好疗效，同时酿酒酵母作为无免疫原性和无数致病性载体，安全系数很高。

利用表达载体JMB88-HA-OVA-hApoB100中带有的HA标签，插入的外源基因片段能与之融合表达，然后用HA标签抗体检测目的蛋白的表达情况。

将测序正确的酵母表达载体JMB88-HA-OVA-hApoB100和空载体JMB88-HA-OVA（作为对照）通过LiAc的方法分别转化酵母菌株JMY1中：

将JMY1单克隆接种于3mLYPD培养基中30℃250rpm/min过夜摇菌；第二天1:50接种30℃250rpm/min摇至OD=0.5左右；3000rpm/min离心收集菌体用灭菌水重悬洗两次后，加入900uL水和100uL1M LiAC（Sigma公司购买）颠倒混匀后30℃放置5min后离心收集菌体；用50uL体积的待转染的质粒溶液（质量约为1ug）轻轻重悬菌体后加入36uL1M LiAC和25uL94℃变性处理10min冰上放置的ssDNA（Salmon Sperm DNA sigma公司，货号：31149-10G-F），混匀后加入240uL50%的PEG600，适当涡旋混匀；42℃热击45min离心收集菌体用1mL YPD30℃200rpm/min孵育1-2h；离心收集菌体均匀涂布并在基本SD固体培养基（Yeast Synthetic Drop-out MediumSupplements Sigma公司货号Y2001-20G,葡萄糖西陇化工股份有限公司货号14527，YNB（Yeast Nitrogen Base W/O Amino acids）Solarbio公司货号Y8040-100，琼脂Solarbio公司货号A8190）上进行筛选。将筛选到的阳性克隆接种到液体SD培养基中，当细胞最佳密度（OD₆₀₀）达到0.5时加入0.5mM的硫酸铜溶液进行诱导表达10h。硫酸铜诱导表达过后，在4℃，8000rpm/min条件下离心收集酵母细胞，并用PBS溶液洗涤三次。获得的酵母细胞在56℃灭活1h，然后置于-70℃冰箱中备用。

检测硫酸铜诱导后的酵母是否表达目的蛋白。离心收集1.5ml在YPD中培养至稳定期（OD600=1.0）的酵母细胞，向沉淀中加入100μl2.0M LiAc预处理细胞，室温放置5min；12000rpm离心5min，收集细胞沉淀，然后向沉淀中加入100μl0.4M NaOH，室温放置5min；12000rpm离心5min收集细胞沉淀；加入100μl SDS-PAGE上样缓冲液以悬浮沉淀，然后煮沸5min。12000rpm离心5min以去除细胞碎片。SDS-PAGE分离酵母蛋白提取物，SDS-PAGE上层浓缩胶浓度为5%，下层分离胶浓度为6%，蛋白上样量为30uL，先用80V跑30min后用100V跑60min，之后转到硝酸纤维素膜（先用甲醇浸泡30min）上。转膜后用5%的脱脂奶粉室温封闭1h；加入一抗（HA标签抗体1:2000）室温孵育1h，TBST洗涤3次，每次10min；加入二抗（羊抗鼠IgG1:5000）室温孵育40min，用TBST在室温下脱色摇床上洗3次，每次10min；然后加入化学发光底物显像。

转化了JMB88-HA-OVA-hApoB100质粒的酵母表达的融合蛋白HA-OVA-hApoB100大约83KD，而转化了JMB88-HA-OVA的酵母均经诱导后表达的融合蛋白HA-OVA大约53KD，如图5所示。其中，泳道1为未诱导的转化JMB88-HA-OVA-hApoB100的酵母菌破碎液；泳道2为硫酸铜诱导的转化了JMB88-HA-OVA-hApoB100的酵母菌破碎液；泳道3为western blot用easy See蛋白marker（购自全式金公司）泳道4为未诱导的转化JMB88-HA-OVA的酵母菌破碎液；泳道5为硫酸铜诱导的转化了JMB88-HA-OVA的酵母菌破碎液。

三、小鼠饲养实验

ApoE基因缺陷鼠具有典型的AS病变特征，是研究AS等心血管疾病较好的实验动物模型（康爱君2006）。从北京大学医学部购买18只7周龄雄性ApoE基因缺陷型（ApoE^-/-）小鼠，平均分成3个实验组，每组6只，分组情况见表6。

JMB88-HA-OVA-hApoB100组小鼠每次口服免疫10⁸个表达HA-OVA-hApoB蛋白的酵母细胞，JMB88-HA-OVA组小鼠每次口服免疫10⁸个表达HA-OVA蛋白的酵母细胞，PBS组小鼠作为空白对照组，每次灌喂与前两组等体积的PBS溶液，整个免疫过程持续12周。实验后期采集各组小鼠全血，并分离各组小鼠血清，将血清存放在-70℃冰箱中以备后续westernblot检测，检测血清中是否有针对融合蛋白产生的特异性抗体。

表6饲养分组

1）小鼠血清中特异性ApoB100抗体的检测

取在Rosseta（DE3）菌株中用IPTG诱导表达的ApoB100蛋白跑SDS-PAGE胶，然后转到硝酸纤维素膜（PVDF膜）上，以各组小鼠的血清作为一抗，辣根过氧化物酶（HPR）标记的羊抗鼠IgG作为二抗检测小鼠血清中是否有特异性ApoB100抗体存在，检测结果如图6所示，其中1为Western Marker；2为PBS组小鼠血清；3为HA-OVA组小鼠血清；4为HA-OVA-hApoB100组小鼠血清；结果表明在JMB88-HA-OVA-hApoB100组小鼠的血清中检测到了针对ApoB100特异性的抗体，而在PBS和JMB88-HA-OVA组小鼠的血清中均未检测到ApoB100特异性抗体，这说明了口服表达HA-OVA-hApoB融合蛋白的酵母能够引起机体对ApoB100的特异性体液免疫反应。

2）Western blot检测小鼠血清中ApoB100抗体与小鼠本身ApoB100的特异性免疫反应

将JMB88-HA-OVA-hApoB100组小鼠的血清和未做任何处理的昆明小白鼠血清用SDS-PAGE电泳分离，SDS-PAGE上层浓缩胶浓度为5%，下层分离胶浓度为6%。经过多次试验确定电泳条件使Marker最大的条带270KD刚好处于PAGE胶的最下端边缘上，然后利用转膜装置将PAGE胶上的条带完全转移到一块足够大的PVDF膜上，转膜条件为60V，3个小时。5%的脱脂奶粉室温条件下封闭1个小时后加入一抗，此时的一抗为JMB88-HA-OVA-hApoB100组小鼠的血清（1:500）。室温孵育1个小时后用TBST缓冲液洗膜3次，每次5min，然后加入羊抗鼠二抗（1:2000）室温孵育1个小时，TBST缓冲液清洗3次后，ECL显示检测结果，结果如图7所示，其中泳道1,3为HA-OVA-hApoB100组小鼠免疫之前的血清；泳道2,4为昆明小鼠血清。结果表明在JMB88-HA-OVA-hApoB100组小鼠体内产生的ApoB100抗体能够与该组小鼠本身和昆明小鼠自身的ApoB100蛋白发生特异性免疫反应。

四、血清中抗体滴度、细胞免疫因子、血脂四项的测定

1）血清中的抗体滴度

IPTG诱导表达后的菌体经超声波破碎后用PBS溶液重新悬起，然后用配制好的包被缓冲液稀释其至10μg/ml，加到酶标板的小孔中，每孔加入100μl,置于4℃过夜。同时将包被液稀释的BSA溶液作为阴性对照,而只加包被液的孔作为空白对照。次日倒掉反应孔中的包被液后用TBST洗涤缓冲液洗涤三次。然后加适当稀释的待检小鼠血清（1:500）100μl于上面已包被的反应孔中，放置室温孵育1个小时后再次用TBST洗涤三次，每次大约8min。在所有的反应孔中加入新鲜稀释（1:2000）的辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠二抗100μl，室温下孵育1个小时后再次用TBST缓冲液洗涤三次。于各反应孔中加入临时配置好的TMB底物溶液100μl，室温下在摇床上温育15min。15min后立刻在各孔中加入2M硫酸50μl终止反应。各个反应孔中加入终止液终止反应后，应立即把酶标板置于ELISA检测仪上，于450nm处，以空白对照孔作为对照调零后测得各个反应孔的OD值。比较分析各个反应孔的OD值，得出JMB88-HA-OVA-hApoB100组小鼠血清中ApoB抗体的滴度。得到结果如图8，其中，横坐标从左到右依次为免疫前小鼠的血清、PBS组小鼠血清、JMB88-HA-OVA组小鼠血清、JMB88-HA-OVA-hApoB100组小鼠血清,各组小鼠血清中均不存在与BSA发生特异性免疫反应的抗体，此外PBS组、JMB88-HA-OVA组小鼠，以及免疫进行前小鼠的血清中ApoB特异性抗体的含量几乎为零，而JMB88-HA-OVA-hApoB100组小鼠血清中ApoB100抗体含量很高。

2、血脂四项（TC、TG、HDL-C、LDL-C）的测定

血清中血脂四项的测定均采用试剂盒的方法，所用试剂盒全部购自北京中生北空生物科技股份有限公司。其中总胆固醇（Total Cholesterol，TC）的测定应用COD-PAP法，甘油三酯（Triglyceride，TG）的测定利用的是GPO-PAP法，高密度脂蛋白胆固醇（High Density Lipoprotein Cholesterol，HDL-C）采用的是磷钨酸-镁沉淀法，而低密度脂蛋白胆固醇(Low Density LipoproteinCholesterol，LDL-C)的测定应用的是聚乙烯硫酸沉淀法。最后用紫外分光光度计在450nm的波长下测定出OD值计算小鼠血清中这四项血脂指标的浓度，通过数据比较分析显示出各组小鼠血清中血脂四项的变化。

JMB88-HA-OVA-hApoB100组处理对血脂四项均有显著的影响。对于总胆固醇（TC）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）而言，对照组PBS组显著高于其他两个组，并且JMB88-HA-OVA-hApoB100组小鼠血清中它们的含量最低。而JMB88-HA-OVA组小鼠的甘油三酯（TG）含量最高，JMB88-HA-OVA-hApoB100组中TG的含量最低。三个组之间高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）含量的变化趋势与TC的变化趋势刚好相反。具体结果如图9所示。

LDL-C常被称为“坏”胆固醇，血液中它的浓度升高，那么它将沉积在心脑等血管的动脉管壁内，形成动脉粥样硬化斑块，从而引起冠心病、动脉粥样硬化等疾病。而高密度脂蛋白主要负责将周围组织中的胆固醇运输到肝脏，在肝脏中转化为胆汁酸或者直接以胆汁的形式排出体外，所以HDL-C是一种“好”胆固醇，被称为“血管清道夫”。JMB88-HA-OVA-hApoB100组小鼠饲喂相应酵母3个月后，血清中的TC、TG、LDL-C的含量显著降低，而HDL-C的含量却显著增加，这与预期的实验结果相一致。

五、小鼠主动脉瓣的冰冻切片分析

饲养期实验结束后对全部小鼠执行安乐死，剖开小鼠胸腔，在小鼠心脏右心耳上用剪刀开个小口，迅速从小鼠心脏左心室开始缓慢注射中性甲醛固定液约20ml，此步的主要作用是将血管中的血液全部冲出并起到固定血管的作用。用镊子轻轻夹起心室并向上提起，在小鼠颈部处尽可能多的剪断血管。将附带着着血管的心脏连同周围的肺组织一起放在一个盛有PBS溶液的平皿中洗涤几次，然后用1.5ml的注射器的针头在体视显微镜下小心地剥离心脏周围的脂肪组织、肝脏组织、结缔组织、除主动脉之外的其他血管和附着的气管。分离成功的标志是一个完整的心脏上面仅仅连接着一条主动脉，如示意图10所示。

参考小鼠主动脉冰冻切片的方法对主动脉进行切片分析（张亮2011）。分离成功的样本进行脱水处理，首先放入10%的蔗糖溶液中过夜，然后放入20%的蔗糖溶液过夜。脱水完成的样本进行切片前的切割处理，先将心脏连接的主动脉在主动脉弓的地方横切，保证主动脉弓的长度在2mm左右，不宜太长，否则会造成后面的包埋过程很难控制、切片时修片过多的后果；然后同样横切左右心房，尽量使横切面与动脉弓的切面平行，这样就保证了切面与主动脉根部垂直，用滤纸吸干处理好的样本上面的残液备用。在样品托盘上先滴几滴OCT包埋剂，然后将准备好的样本心房组织朝下放置在托盘上，确保主动脉垂直向上，然后再次补充OCT包埋剂使整个样本完全包藏到OCT内，随后将样本连同样品盘迅速放在速冻台上冷冻。速冻10min后用莱卡冷冻切片机进行切片，设置参数为温度-20℃，切片厚度为10μm。将先期切下的切片贴到普通载玻片上，并在体视显微镜下观察，一旦观察到主动脉瓣即将出现后立即换用硅化的载玻片进行贴片，保留全部的硅化载玻片。

待所有的硅化载玻片干燥后进行油红O染色：首先将载玻片置于60%的异丙醇溶液中10min；然后取出玻片吹干后放置于油红O工作液中染色10min；再次用60%的异丙醇分化10s至间质清晰；分化后的载玻片立刻用自来水清洗10min，取出后小心吸干上面残留的水分并用甘油明胶封片。将封好的玻片置于显微镜下观察并照相。

图11显示的是三个处理组小鼠的主动脉瓣冰冻切片经油红O染色后的典型图。从图中可以看到JMB88-HA-OVA-hApoB100组小鼠的主动脉瓣上脂肪的积累明显少于另外两个组，而PBS组和JMB88-HA-OVA组小鼠的动脉瓣膜上脂肪的累积差异不明显。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (9)

1.一种ApoB100酵母重组疫苗，其特征在于，该酵母重组疫苗以酵母作为宿主细胞，转染包含ApoB100基因片段的真核表达载体，诱导表达后将酵母细胞灭活，得到ApoB100酵母重组疫苗。

2.如权利要求1所述的ApoB100酵母重组疫苗，其特征在于，所述的ApoB100基因片段的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

3.如权利要求1或2所述的ApoB100酵母重组疫苗，其特征在于，所述的真核表达载体为JMB88-HA-OVA-hApoB100，是将ApoB100基因片段克隆到JMB88-HA-OVA-MCS载体中的OVA的下游而得到的；

所述的酵母为酵母JMY1。

4.如权利要求1所述的ApoB100酵母重组疫苗，其特征在于，该酵母重组疫苗能够表达ApoB100肽，并将表达的ApoB100肽递呈给抗原递呈细胞，诱导免疫反应，产生针对ApoB100的抗体。

5.一种真核表达载体，其特征在于，该真核表达载体为JMB88-HA-OVA-hApoB100，是将ApoB100基因片段克隆到JMB88-HA-OVA-MCS载体中而得到的。

6.一种ApoB100酵母重组疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下操作：

1)以人基因组为模板克隆ApoB100基因片段，并将ApoB100基因克隆到真核表达载体JMB88-HA-OVA-MCS当中，构建真核表达载体JMB88-OVA-hApoB；

2)将真核表达载体JMB88-OVA-hApoB100转染到酵母菌株当中，并筛选阳性克隆；

3)将阳性克隆接种到液体SD培养基中，当细胞最佳密度达到0.5时加入0.5mM的硫酸铜溶液进行诱导表达；

4)诱导表达后离心收集酵母细胞并进行洗涤，然后将酵母细胞在56℃灭活1h，得到ApoB100酵母重组疫苗。

7.如权利要求3所述的ApoB100酵母重组疫苗的制备方法，其特征在于，真核表达载体JMB88-OVA-hApoB100的构建包括：

以人基因组DNA为模板，以上游引物hApoB-F、下游引物hApoB-R为引物对扩增ApoB100基因片段，BglⅡ/XhoⅠ双酶切得到的ApoB100基因片段，并与经同样双酶切后的酵母真核表达载体JMB88-HA-OVA-MCS连接，16℃连接过夜，构建质粒JMB88-HA-OVA-hApoB100；

hApoB-F：GGGAGATCTATAGACTTCCTGAATAACTATGCA；

hApoB-R：GGGCTCGAGTTGGTATTCAGTGTGATGACACTTG。

8.如权利要求3所述的ApoB100酵母重组疫苗的制备方法，其特征在于，所述的真核表达载体JMB88-OVA-hApoB100是通过LiAc/ssDNA的方法转染到酵母菌株JMY1当中，然后将转染后的菌体均匀涂布并在基本SD固体培养基上进行筛选。

9.权利要求1所述的ApoB100酵母重组疫苗在制备治疗冠心病、动脉粥样硬化的药物中的应用。