CN104010655A

CN104010655A - 普通烟草中产生的包含血凝素的流感病毒样颗粒(vlp)

Info

Publication number: CN104010655A
Application number: CN201280064385.7A
Authority: CN
Inventors: R·卡布雷拉; K·大石; L·佩雷斯; F·塔拉莫
Original assignee: Philip Morris Products SA
Current assignee: Philip Morris Products SA
Priority date: 2011-11-11
Filing date: 2012-11-12
Publication date: 2014-08-27
Anticipated expiration: 2032-11-12
Also published as: JP2014533253A; JP6390846B2; CA2855252C; EP2776063A1; WO2013068593A1; EP2776063B1; CA2855252A1; BR112014011345A2; US20140302158A1; CN104010655B

Abstract

本发明涉及展示流感病毒抗原和糖的双层脂质小泡的一种组合物或多种组合物，及其在普通烟草植物中的产生。本文中还公开了用于治疗或预防病毒性感染的包含所述脂质小泡的药物组合物。

Description

普通烟草中产生的包含血凝素的流感病毒样颗粒(VLP)

本发明涉及展示蛋白质抗原和糖的脂质小泡的组合物或制品及其在植物细胞中的产生。所述组合物中的脂质小泡具有双层结构、约40nm至250nm范围内的尺寸分布和这样的量的抗原和糖，所述量有效刺激针对该抗原的免疫反应。

具体而言，本发明涉及在普通烟草植物中产生病毒样颗粒(‘VLP’)和分离具有赋予VLP有利免疫原性特性的尺寸分布、抗原/糖比率和脂质组成的VLP。

病毒结构蛋白可以自装配成有组织的大分子结构以产生称作病毒样颗粒(‘VLP’)的空壳。病毒样颗粒无感染性，因为它们缺少病毒核酸并且可以作为抗原呈递的载体使用。它可以潜在地增加本身并不有效刺激免疫系统的肽抗原的免疫原性，并增强针对所述抗原的保护性抗体产生。先前已经报道可以在不同的原核和真核异源表达系统例如，基于细菌、基于酵母和基于哺乳动物的系统中产生并装配出VLP。最近，还已经报道在几种植物-马铃薯、羽扇豆、莴苣(lettuce)、番茄、大豆和本生烟草(Nicotiana bentaminiana)中产生VLP。VLP潜在地可用作疫苗的安全替代物，所述疫苗基于减毒的活病毒或灭活的死病毒。

本发明现在提供在普通烟草植物中产生的具有有利免疫原性特性的VLP。

在一个实施方案中，本发明涉及一种病毒样颗粒(‘VLP’)组合物，所述病毒样颗粒组合物从普通烟草(Nicotiana tabacum)植物获得并且包含展示一种或多种流感抗原的VLP，其中所述VLP具有直径在40nm和250nm、40nm和200nm、50nm和250nm之间、特别在50nm和200nm之间的平均粒度分布。在本发明的一个实施方案中，上文限定的组合物中的VLP由包含脂肪酸和固醇的脂质双层组成，其中，在一个实施方案中，脂肪酸:固醇比率>1。

在一个实施方案中，本发明涉及一种病毒样颗粒(‘VLP’)组合物，所述病毒样颗粒组合物从普通烟植物获得并且包含展示一种或多种流感抗原的VLP，其中所述VLP具有直径在80nm和140nm之间的、特别在90nm和130nm之间、特别在80nm和120nm之间、特别在90nm和120nm之间范围内的代表最丰富群体的峰顶(peaktop)。在一个实施方案中，当根据GC-MS或LC-MS测定时，在普通烟草产生的病毒样颗粒含有低浓度的单不饱和脂肪酸，特别是C₁₈单不饱和脂肪酸，例如，油酸，所述单不饱和脂肪酸在脂质双层中以小于0.4μg/mL、小于0.5μg/mL、小于1.0μg/mL或小于1.5μg/mL的浓度存在。

另外，当根据GC-MS或LC-MS测定时，在多种实施方案中根据本发明和如本文中公开的普通烟草产生的病毒样颗粒含有增加浓度的多不饱和脂肪酸，特别是C₁₈多不饱和脂肪酸，例如，亚油酸和/或亚麻酸，所述多不饱和脂肪酸在脂质双层中以3.0μg/mL和5.0μg/mL之间的浓度存在。

在另一个实施方案中，当根据GC-MS或LC-MS测定时，在多种实施方案中根据本发明和如本文中公开的普通烟草产生的病毒样颗粒含有增加浓度的饱和脂肪酸，特别是大于0.5μg/mL、大于0.75μg/mL、大于0.9μg/mL或大于1.0μg/mL的C₂₀饱和脂肪酸，如花生酸。

在一个实施方案中，在多种实施方案中根据本发明和如本文中公开的普通烟草产生的病毒样颗粒以如上文在前述段落中公开的浓度含有单不饱和脂肪酸(特别是C₁₈单不饱和脂肪酸如油酸)和多不饱和脂肪酸(特别是C₁₈-C₂₀多不饱和脂肪酸如亚油酸和/或亚麻酸)和/或C₂₀饱和脂肪酸(如花生酸)的组合。

在本发明的另一个实施方案中，当通过LC-APPCI-MS/MS测定时，前述任一个实施方案的VLP的脂质双层具有大于1、大于0.75、大于0.5和大于0.4的胆固醇对谷固醇比率(胆固醇:谷固醇)。

本发明构思进一步其他实施方案，其中前述实施方案的VLP显示出在0.30和0.45之间、大于0.35、大于0.4和特别在0.34和0.42之间的脂质(脂肪酸和固醇)对蛋白质的质量比。

在一个具体实施方案中，本发明涉及一种病毒样颗粒(‘VLP’)组合物，所述病毒样颗粒组合物从普通烟草植物获得并且包含展示一种或多种抗原、特别是一种或多种流感抗原的VLP，其中所述VLP具有直径在40nm和250nm之间、特别在50nm和200nm之间的平均粒度分布并且由包含脂肪酸和固醇组合的脂质双层组成。

在一个具体实施方案中，本发明涉及一种病毒样颗粒(‘VLP’)组合物，所述病毒样颗粒组合物从普通烟植物获得并且包含展示一种或多种流感抗原的VLP，其中所述VLP具有直径在80nm和140nm之间的、特别在90nm和130nm之间、特别在80nm和120nm之间、特别在90nm和120nm之间范围内的代表最丰富群体的峰顶。

在本发明的另一个具体实施方案中，提供一种病毒样颗粒(‘VLP’)的组合物，所述组合物从普通烟草植物获得并包含展示一种或多种抗原、特别是一种或多种流感抗原的VLP，其中所述VLP具有直径在40nm和250nm之间、特别在50nm和200nm之间的平均粒度分布并且VLP的脂质双层，具有根据GC-MS或LC-MS测定时小于0.5μg/mL的油酸含量和/或当根据GC-MS或LC-MS测定时大于0.75μg/mL的花生酸含量和/或根据GC-MS或LC-MS测定时在3.0μg/mL和5.0μg/mL之间的亚油酸和/或亚麻酸含量。

在本发明的另一个具体实施方案中，提供一种病毒样颗粒(‘VLP’)的组合物，所述病毒样颗粒组合物从普通烟植物获得并且包含展示一种或多种抗原、特别是一种或多种流感抗原的VLP，其中所述VLP具有直径在80nm和140nm之间、特别在90nm和130nm之间、特别在80nm和120nm之间、特别在90nm和120nm之间范围内的代表最丰富群体的峰顶。

在另一个具体实施方案中，根据本发明和如本文在多种实施方案中所述的从普通烟草植物获得的病毒样颗粒(‘VLP’)的组合物包含展示一种或多种流感抗原的VLP，其中所述VLP具有直径在40nm和250nm之间、特别在50nm和200nm之间的平均粒度分布并且通过LC-APPCI-MS/MS测定时，VLP的脂质双层具有>1的胆固醇:谷固醇比率。

在另一个具体实施方案中，根据本发明和如本文在多种实施方案中所述的从普通烟草植物获得的病毒样颗粒(‘VLP’)组合物包含展示一种或多种流感抗原的VLP，其中所述VLP具有直径在80nm和140nm之间的、特别在90nm和130nm之间、特别在80nm和120nm之间、特别在90nm和120nm之间范围内的代表最丰富群体的峰顶。

在仍另一个具体实施方案中，本发明涉及一种病毒样颗粒(‘VLP’)组合物，所述病毒样颗粒组合物从普通烟草植物获得并且包含展示一种或多种抗原、特别是一种或多种流感抗原的VLP，其中所述VLP具有(i)直径在40nm和250nm之间、特别在50nm和200nm之间的平均粒度分布；(ii)由包含脂肪酸和固醇组合的脂质双层组成，其中，在一个实施方案中，脂肪酸:固醇比率>1，(iii)根据GC-MS或LC-MS测定时，油酸的含量小于0.5μg/mL和/或根据GC-MS或LC-MS测定时，花生酸的含量大于0.75μg/mL，和/或根据GC-MS或LC-MS测定时，亚油酸和/或亚麻酸的含量在3.0μg/mL和5.0μg/mL之间，和(iv)通过LC-APPCI-MS/MS测定时，胆固醇:谷固醇比率>1。

在一个实施方案中，所述VLP具有直径在80nm和140nm之间、特别在90nm和130nm之间、特别在80nm和120nm之间、特别在90nm和120nm之间的范围的代表最丰富群体的峰顶。

在本发明的一个实施方案中，展示在前述实施方案中定义的任一种组合物的VLP上的抗原是血凝素，特别是重组血凝素。在本发明的一个实施方案中，血凝素是流感A型或流感B型血凝素，或流感亚型A血凝素选自H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15和H16。

在本发明的一个具体实施方案中，血凝素是H5亚型的。

在本发明的一个具体实施方案中，VLP仅展示一种流感抗原。

在本发明的一个具体实施方案中，VLP仅展示一种流感抗原，并且该抗原是血凝素。

在本发明的一个具体实施方案中，VLP仅展示一种流感抗原，并且该抗原是H5亚型血凝素。

在本发明的另一个具体实施方案中，根据前述任一个实施方案由病毒样颗粒展示的血凝素是S-酰化的或N-糖基化的或同时是S-酰化和N-糖基化的。

在本发明的又一个具体实施方案中，根据前述任一个实施方案由病毒样颗粒展示的血凝素仅具有两个胞质半胱氨酸，所述半胱氨酸通过用棕榈酸酰化受到翻译后修饰。

在本发明的一个实施方案中，前述实施方案的VLP在普通烟草植物或植物细胞中体内或在体外产生。

在本发明的一个具体实施方案中，分离前述实施方案的VLP。

在一个实施方案中，本发明提供一种用于产生如前文中所述的VLP的方法，所述方法包括步骤：通过使用如本文所述的技术(i)纯化/净化(ii)捕获VLP。

在一个具体实施方案中，本发明提供一种组合物，其包含加工的植物生物质，所述植物生物质富集有根据本发明和如本文在多种实施方案中公开的VLP。

在其他实施方案中，本发明构思了药物组合物，所述药物组合物包含、特别地以治疗有效量包含根据本发明和如本文定义的VLP，连同可药用载体。

在一个具体实施方案中，根据本发明和如本文在多种实施方案中所述的药物组合物包含展示一种或多种流感病毒血凝素蛋白、特别展示H5亚型血凝素蛋白的VLP。

在另一个实施方案中，本发明涉及一种药物组合物，所述药物组合物包含、特别地以免疫有效量包含根据本发明和如本文在多种实施方案中定义的VLP或VLP组合物，连同可药用载体，以便施用所述组合物时在受试者中诱导免疫反应。

在又一个实施方案中，本发明涉及一种药物组合物，所述药物组合物包含、特别地以治疗有效量包含根据本发明和如本文定义的VLP或VLP组合物，连同可药用载体，用于治疗或预防需要这种治疗的受试者中的流感病毒感染，特别地是H5亚型流感病毒引起的流感病毒感染。

在本发明的一个具体实施方案中，任一种上文定义的药物组合物还包含佐剂。

本发明进一步涉及本发明和如本文在多种实施方案中定义的VLP组合物或药物组合物中任一者的用途，用于施用所述VLP组合物时在受试者中诱导免疫反应。

本发明进一步涉及如本文在多种实施方案中定义的VLP组合物或药物组合物中任一者的用途，用于治疗或预防需要这种治疗的受试者中的流感病毒感染、特别是H5亚型流感病毒引起的流感病毒感染。

在其他实施方案中，本发明构思了用于在受试者中诱导针对病毒、特别针对流感病毒的免疫反应的方法，所述方法包括以免疫有效量施用如本文在多种实施方案中公开的本发明VLP组合物或药物组合物中任一者至所述受试者。

在其他实施方案中，本发明构思了用于治疗、特别用于预防性治疗或减弱在需要这种治疗的受试者中的病毒感染，特别是流感病毒感染的方法，所述方法包括以治疗有效量施用如本文在多种实施方案中公开的本发明的VLP组合物或药物组合物中任一者至所述受试者。

在本发明的一个实施方案中，可以通过任何合适的途径，特别地通过口服、肠胃外、皮下、腹膜内、局部、透粘膜、经皮、支气管内、肺内和鼻内、心室内、关节内、鞘内、阴道内或气管内施用法施用本发明的VLP组合物或药物组合物。

序列和附图简述

在说明书和实施例中，提到序列表中提出的以下序列：

SEQ ID NO:1：描述植物可选择最小双元载体pPMP1的核苷酸序列。

SEQ ID NO:2：描述5'UTR HT-CPMV的核苷酸序列。

SEQ ID NO:3：描述3'UTR HT-CPMV的核苷酸序列。

SEQ ID NO:4：描述P1-HcPro-P3的核苷酸序列。

SEQ ID NO:5：描述双重MMV启动子的核苷酸序列。

SEQ ID NOs:6和7描述C端血凝素H5肽片段。

SEQ ID NOs:8-13描述从H5成熟蛋白主链获得的不同肽片段。

SEQ ID NO:14：描述流感血凝素5(H5)的核苷酸序列。

在说明书和实施例中参考以下附图：

图1.展示抗原和糖的脂质小泡：通过在60/45％蔗糖缓冲垫上超速离心纯化的烟草衍生的病毒样颗粒的AF4-MALS分析。

A.普通烟草PM132(-x—x—x-)、普通烟草PM204(-o—o—o-)、普通烟草Burley 21(——)和

B.本生烟草(-□—□—□-)。

图2.本生烟草衍生的病毒样颗粒的脂肪酸的GC图谱，从13.00分钟至20.00分钟放大。在峰顶(peak top)上显示指认。将两种未鉴定的脂肪酸假定地指认为硬脂酸和花生酸的C18-0和C20-0异构体，因为它们的质谱非常类似于硬脂酸和花生酸的那些质谱。

图3.展示在各种病毒样颗粒上的血凝素H5的Asn-11糖肽的解卷积N-糖基化模式。H5-PM015，普通烟草Burley 21；H5-PM132，普通烟草PM132；H5-PM204，普通烟草PM204；H5-PM182，本生烟草。还见实施例23。

图4.展示在各种病毒样颗粒上的血凝素H5的Asn-23糖肽的解卷积N-糖基化模式。H5-PM015，普通烟草Burley 21；H5-PM132，普通烟草PM132；H5-PM204，普通烟草PM204；H5-PM182，本生烟草。还见实施例23。

图5.展示在各种病毒样颗粒上的血凝素H5的Asn-154糖肽的解卷积N-糖基化模式。H5-PM015，普通烟草Burley 21；H5-PM132，普通烟草PM132；H5-PM204，普通烟草PM204；H5-PM182，本生烟草。还见实施例23。

图6.展示在各种病毒样颗粒上的血凝素H5的Asn-165糖肽的解卷积N-糖基化模式。H5-PM015，普通烟草Burley 21；H5-PM132，普通烟草PM132；H5-PM204，普通烟草PM204；H5-PM182，本生烟草。还见实施例23。

图7.展示在各种病毒样颗粒上的血凝素H5的Asn-286糖肽的解卷积N-糖基化模式。H5-PM015，普通烟草Burley 21；H5-PM132，普通烟草PM132；H5-PM204，普通烟草PM204；H5-PM182，本生烟草。还见实施例23。

图8.展示在各种病毒样颗粒上的血凝素H5的Asn-484糖肽的解卷积N-糖基化模式。H5-PM015，普通烟草Burley 21；H5-PM132，普通烟草PM132；H5-PM204，普通烟草PM204；H5-PM182，本生烟草。还见实施例23。

图9.具有与S-酰化肽片段相对应的信号的血凝素H5的MALDI-TOF质谱。

定义

通常向本申请范围内所用的技术与科学术语和表述给予在植物生物学的相关领域中常适用于它们的含义。本文中参考本领域技术人员已知的各种方法学。将描述加以参考的这类方法学的出版物和其他材料如同完整阐述那样，通过引用的方式完整并入本文。除非另外说明，否则本发明的实施将使用本领域技术人员能力范围内的化学、分子生物学、微生物学、基因工程和植物生物学的常规技术。

可以在实施本发明中使用本领域技术人员已知的任何适合材料和/或方法；然而，描述优选的材料和/或方法。除非另外指出，在以下描述和实施例中加以参考的材料、试剂等是从商业来源可获得的。

以下全部术语定义均适用于本申请的完整内容。词“包含”不排除其他要素或步骤，并且非限制性冠词“一个”或“一种”不排除复数。单个步骤可以满足权利要求书中所提到的几个特征的功能。与某属性或值相联系的情况下，术语“基本上”、“约”、“大约”等还分别具体地确切限定该属性或确切限定该值。在给定数值或范围的情况下，术语“约”指处于给定值或范围的20％以内、10％以内或5％以内的值或范围。

如本发明范围内所用，术语“植物”指处于其生活周期或发育的任何阶段的任何植物及其子代。

如本文所用，“植物部分”或“植物部分”意指植物的任何部分，即植物中或处于培养的植物器官、植物组织、植物细胞、胚、叶等。在本发明的涉及在高压或低压或其组合下接种植物的某些实施方案中，这个术语指植物中的植物部分。

如本发明范围内所用的“烟草植物”指属于烟草属的物种的植物，包括但不限于普通烟草(或烟草(N.tabacum))。在此使用术语“烟草植物”描述本发明的某些实施方案，而不特指普通烟草，此类描述意在解读为已经特别地包括普通烟草。

如本发明范围内所用的术语“植物细胞”或“烟草植物细胞”指植物、尤其烟草植物的结构及生理单元。植物细胞可以处于以下形式：无细胞壁的原生质体、分离的单个细胞或培养的细胞、或作为高级组织化单元(如但不限于植物组织、植物器官或完整植物)的部分。

如本发明范围内所用的“植物材料”指任何固体、液体或气态组合物或其组合，其从植物，包括叶、茎、根、花或花部分、果实、花粉、卵细胞、配子、种子、插枝、分泌物、提取物、细胞或组织培养物，或植物的任何其他部分或产物可获得。

如本文所用的“植物组织”意指组织成结构单元或功能单元的一组植物细胞。包括在植物中或在培养物中的任何植物组织。该术语包括，但不限于完整植株、植物器官和种子。

如本文所用的“植物器官”涉及植物的不同或分化部分，如根、茎、叶、花芽或胚。

术语“光密度”或“OD”涉及在给定波长(例如600nm＝OD₆₀₀)在分光光度计中测量的光学元件吸光度的光学测定。

术语“多核苷酸”在本文中用来指核苷酸聚合物，其可以是未修饰或修饰的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。因此，多核苷酸可以是，而不限于基因组DNA、互补性DNA(cDNA)、mRNA或反义RNA。另外，多核苷酸可以是单链或双链DNA、作为单链区和双链区的混合物的DNA、包含DNA和RNA的杂合分子或存在单链区和双链区混合的杂合分子。此外，多核苷酸可以由包含DNA、RNA或这两者的三链区组成。一种多核苷酸可以含有一个或多个修饰的碱基，如硫代磷酸酯，并且可以是肽核酸(PNA)。通常，由本发明提供的多核苷酸可以从分离或克隆的cDNA片段、基因组DNA片段、寡核苷酸片段或独立核苷酸片段或前述组合中装配出来。

如本文所用的术语“基因序列”指编码蛋白质或多肽、尤其异源蛋白或多肽或活性RNA的核酸分子或多核苷酸的核苷酸序列，并且包括仅编码异源蛋白片段的部分编码序列的核苷酸序列。基因序列也可以包括对相对于编码序列位于上游或下游的基因的表达具有调节功能的序列以及基因的内含子序列。

术语“转录调节性核苷酸序列”或“调节序列”分别指影响结合(或功能性连接)的待转录核苷酸序列的转录、RNA加工或稳定性或翻译的核苷酸序列。转录调节性核苷酸序列可以位于待转录序列(例如，编码序列)的上游(5'非编码序列)、内部或下游(3'非编码序列)。转录调节性核苷酸序列可以选自包括增强子、启动子、翻译前导序列序列、内含子、5'-非翻译序列、3'-非翻译序列和多聚腺苷化信号序列的组。它们包括天然和合成性序列以及可以作为合成序列和天然序列组合的序列。

术语“启动子”指在基因5'末端处指导基因转录起始的核苷酸序列。通常，启动子序列是必需的，但是并不总是足以驱动与之有效连接的基因表达。在设计可表达的基因构建体中，将基因置于与启动子足够靠近并且相对于它处于合适取向，从而该基因的表达受启动子序列控制。将启动子偏好地安置基因上游并且与转录起始位点相距一段距离，所述距离接近于该启动子和它在其天然背景下控制的基因之间的距离。如本领域已知的，可以耐受这个距离的某些变化而不丧失启动子功能。

如本文所用，术语“有效连接”意指启动子与编码区以如此方式连接，从而这个编码区的转录受此启动子控制和调节。用于使启动子与编码区的手段性是本领域熟知的。

在本发明情景下使用的术语“基因沉默阻抑蛋白”指病毒编码的蛋白质，所述蛋白质允许某些病毒规避因结合至沉默性RNA所致的转录后基因沉默。当导入植物细胞时，转基因也可能触发转录后基因沉默，因此确立这类基因低表达或不表达。

如本文所用的术语“蛋白质”、”多肽”、“肽”或“肽片段”是可互换的并且定义成意指由肽键连接的两个或更多个氨基酸所组成的生物分子，所述生物分子可以折叠成二级、三级或四级结构以实现特定形态。

如本文所用的术语“异源”指在细胞或生物中特定多核苷酸或多肽背景下不天然存在的生物序列。如本文可互换使用的术语“重组蛋白”或“异源蛋白”或“异源多肽”指由细胞产生但是不天然存在于这种细胞中的蛋白质或多肽。例如，在植物细胞或完整植株中产生的重组或异源蛋白可以是哺乳动物蛋白或人蛋白。

可以在修饰的植物细胞中表达的异源蛋白可以是抗原(其可以用于疫苗中，而不限于此)，包括但不限于病原体的蛋白质、病毒蛋白、细菌蛋白、原虫蛋白、线虫蛋白；酶，包括但不限于酶(其可以用于治疗人类疾病或用于工业用途，而不限于此)；细胞因子；细胞因子受体的片段；血液蛋白质；激素；激素受体的片段、脂蛋白；抗体或抗体片段。

术语“抗体”和“多种抗体”指单克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体、骆驼抗体、嵌合抗体、单链Fvs(scFv)、单链抗体、单结构域抗体、结构域抗体(VH、VHH、VLA)、Fab片段、F(ab')片段、二硫键连接的Fvs(sdFv)和上述任一者的表位结合片段。具体而言，抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段(即，含有抗原结合位点的分子)。免疫球蛋白分子可以属于任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。

术语“可表达的”在本发明的语境下指基因与调节元件有效连接，所述调节元件指导由叶内所包含的植物细胞中的基因编码的蛋白质或多肽表达。

如本文所用的术语“坏死”和“坏死反应”可互换地涉及在植物、尤其烟草植物的组织中的超敏反应，所述超敏反应例如因例如用农杆菌菌株接种植物组织而触发。当注射的叶组织已经塌陷并且细胞死亡时，观察到坏死(见Klement和Goodman,Annual Review ofPhytopathology 5(1967)17-44)。由本领域普通技术人员区分坏死与黄化(一种其中不存在叶组织塌陷并且不存在广泛细胞死亡的情况)。

如本文所用，“T-DNA边界”指一种DNA片段，所述DNA片段包含约25核苷酸长度的能够被农杆菌菌株(如根癌农杆菌或发根农杆菌菌株)的毒力基因产物识别的序列或其修饰或突变形式，并且足以将与之连接的DNA序列转移至真核细胞、优选地植物细胞。该定义包括，但不限于，来自野生型Ti质粒的全部天然存在的T-DNA边界以及其任何功能衍生物，并且包括化学合成的T-DNA边界。在一个方面，本发明的表达构建体的编码序列和表达控制序列位于两个T-DNA边界之间。

如本文所用，术语“真空浸润”涉及允许病原菌(农杆菌)渗入胞间隙或间质隙中的方法。在物理上，真空产生导致植物组织中细胞之间气腔缩减的负大气压。持续期越长并且压力越低，则植物组织内部存在的气腔越少。压力的后续增加允许浸润中所用的细菌悬液迁移至植物组织中，并且造成农杆菌细胞接触植物组织内部的植物细胞。

如本文所用，“瞬时表达水平”指每kg植物组织质量表达至少约250微克、至少约500微克、至少约750微克、至少约1mg、至少约2mg、至少约3mg、至少约4mg、至少约5mg、至少约10mg、至少约15mg、至少约25mg、至少约50mg、至少约75mg、至少约100mg、至少约150mg、至少约200mg、至少约500mg、至少约1000mg、至少约1.5g、至少约2g、至少约2.5g、至少约5g、至少约7.5g、至少约10g、至少约15g或至少约20g的能力。

如本文所用，“瞬时”指长到足以允许从合适的植物组织分离蛋白质的一段时间。优选地，蛋白质表达在表达构建体导入植物组织后至少约1日、至少约2日、至少约3日、至少约4日、至少约5日、至少约6日、至少约7日、至少约8日、至少约9日、至少约10日、至少约11日、至少约12日、至少约13日、至少约14日，或至少约15日内处于适当高的水平。在一个方面，在表达构建体导入植物组织后3-7或5-10日内和更优选地在3-5或5-7日内获得适当高的水平。

术语“治疗”、“处理”等在本文中通常用来意指获得所需的药理和/或生理效应。该效应可以就完全或部分预防疾病或其症状而言是预防性的和/或可以就部分或完全治愈疾病和/或归属于该疾病的副作用的而言是治疗性的。如本文所用的术语“治疗”涵盖对受试者中疾病的任何治疗并且包括：(a)防止受试者中与不利免疫反应相关的疾病发生，所述受试者可能预先倾向于患有所述疾病；(b)抑制该疾病，即中止其形成；或(c)减轻该疾病，即造成该疾病消退。

出于本发明目的，“患者”或“受试者”互换地使用并且意在包括人和其他动物，特别是哺乳动物，及其他生物。因而，所述方法适用于人类治疗和兽医应用。在优选的实施方案中，患者或受试者是哺乳动物，并且在最优选的实施方案中，患者或受试者是人。

如本文所用，术语“衰减”指在受试者中或在受治疗者的组织中减少病毒性感染，即减少或清除病毒的量或病毒载量。特定程度或水平的减少或清除是至少15％、25％、35％、50％、65％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或更大。

如本文所用，术语“佐剂”指下述物质，所述物质增加或促进免疫原(即，抗原)在接受该免疫原的受试者中刺激针对该免疫原的免疫反应的能力。在具体的实施方案中，佐剂增加针对免疫原的免疫反至少2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、60、75、100、150、500、1000倍或更多倍。在其他实施方案中，佐剂减少为实现特定水平的(细胞和/或体液和/或粘膜)免疫反应所需要的免疫原的量，例如，减少至少15％、25％、35％、50％、65％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或更多。佐剂还可以是下述物质，所述物质延长免疫反应、任选地保护性免疫反应持续的时间(例如，至少2倍、3倍、5倍、10倍、20倍更长时间段或更多倍数)。

表术“药物组合物”和“治疗性组合物”在本文中可互换地以最广泛意义使用。出于本发明目的，它们意指治疗有效量的有效成分，即式(I)的VLP或其可药用盐，任选地，连同可药用载体或稀释剂。

它包括适于在人类或非人类动物中治愈性治疗、控制、改善、改善病状或预防疾病或病症的组合物。因而，它包括用于人医学或兽医学领域内的药物组合物。这种“治疗性组合物”特征在于，它包含本发明的至少一种VLP和任选地载体或赋形剂，从而盐和载体和赋形剂由采用所述组合物治疗的靶生物耐受。

“治疗有效量”指为给定状况和施用方案提供治疗效果的那种量。具体而言，“治疗有效量”意指有效预防、减轻或改善疾病症状或有效延长正在治疗的受试者存活的量，所述受试者可以是人类或非人类动物。确定治疗有效量处于本领域技术人员的技能范围内。

本发明的化合物的治疗有效量或剂量根据可以在宽限值范围内变动并且可以按相关技术领域已知的方式确定。剂量可以在宽限值范围内变动并且当然，将不得不在每个特定情况下针对个体要求调节。

“免疫原性有效量”指免疫原的在受试者中提供有效(细胞和/或体液)免疫反应的量。在本发明的一些实施方案中，所述免疫反应足以提供保护作用，所述保护作用不需要是完全或永久的。确定免疫有效量处于本领域技术人员的技能范围内。

“佐剂有效量”指佐剂的这种量，所述量增强或刺激在遭遇免疫原时的受试者中由该免疫原提供的有效免疫反应(细胞和/或体液免疫反应或任选地有效粘膜免疫反应)。

在保护性免疫反应的情况下，术语“佐剂有效量”指佐剂的量，所述量是在宿主中加速免疫反应诱导所需要的和/或可能足以减少加强免疫以实现保护的需求。

在延长免疫反应的情况下，术语“佐剂有效量”指下述量，所述量延长免疫反应、任选地保护性免疫反应持续的时间。

在以上所述的上下文中确定佐剂有效量处于本领域技术人员的技能范围内。

先前已经报道多种病毒抗原如HBsAg，NVCP，HPV11-L1或HPV16-L1具有在不同植物系统中装配成纳米粒子的能力，所述植物系统包括烟草、马铃薯、羽扇豆、莴苣、番茄、大豆、本生烟草。这些所谓病毒样颗粒由包含多种脂肪酸(即磷脂)和固醇的脂质双层组成。

进一步显示在本生烟草中表达全长重组血凝素蛋白导致带双层膜的人工病毒样颗粒的形成，其中所述VLP具有100nm和300nm之间范围的尺寸分布。在本生烟草中产生的病毒样颗粒的脂质双层具有等量的脂肪酸和固醇。

在本发明的范围内，现在令人惊讶地发现在普通烟草植物中体内或体外产生的重组流感病毒抗原如血凝素能够装配成VLP并且这些普通烟草产生的VLP具有改善的特性。

在本发明的一个实施方案中，血凝素是流感A型或流感B型血凝素，或流感亚型A血凝素选自H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15和H16。

在本发明的一个具体实施方案中，血凝素是H5亚型的。

在普通烟草植物或植物细胞中产生的展示血凝素的VLP具有大约50-200nm的有利尺寸分布。已经发现20-200nm的小颗粒与引流淋巴结树突细胞和巨噬细胞结合，而较大颗粒一般仅与来自注射部位的树突细胞结合(Manolova等人,(2008)Nanoparticles targetdistinct dendritic cell populations according to their size.Eur.J.Immunol.38:1404-1413)，使得普通烟草中产生的较小颗粒更有免疫原性。

与本生烟草细胞中产生的那些VLP相比，在普通烟草细胞中产生的VLP还在脂质双层的组成方面不同。在普通烟草细胞中产生的病毒样颗粒的脂质双层具有比固醇更多的脂肪酸。

在一个实施方案中，当根据GC-MS或LC-MS测定时，显示在普通烟草产生的病毒样颗粒含有低浓度的单不饱和脂肪酸，特别是C₁₈单不饱和脂肪酸，例如，油酸，所述单不饱和脂肪酸在脂质双层中以小于0.4μg/mL、小于0.5μg/mL、小于1.0μg/mL或小于1.5μg/mL的浓度存在。

在本发明的另一个实施方案中，当根据GC-MS或LC-MS测定时，任一个前述实施方案的VLP的脂质双层具有大于0.5μg/mL、大于0.75μg/mL、大于0.9μg/mL或大于1.0μg/mL的C₂₀饱和脂肪酸含量，特别地是花生酸含量。

另外，当根据GC-MS或LC-MS测定时，显示普通烟草产生的病毒样颗粒含有增加浓度的多不饱和脂肪酸，特别是C₁₈多不饱和脂肪酸，例如，亚油酸和/或亚麻酸，所述多不饱和脂肪酸在脂质双层中以3.0μg/mL和5.0μg/mL之间的浓度存在。

多不饱和脂肪酸如亚油酸对于免疫系统的正常功能是必需的并且参与调节细胞因子反应Fritsche,K(2006)“Fatty acids asmodulators of the immune response”.Annu.Rev.Nutr.26:45-73)。

另外，在普通烟草植物或植物细胞中产生的病毒样颗粒的脂质双层具有改善的胆固醇:谷固醇比率，通过LC-APPCI-MS/MS测定时，所述比率显示为>1。因此，与本生烟草中产生的VLP相比时，普通烟草VLP的脂质双层含有大约50％更多的胆固醇，但仅含有一半浓度的谷甾醇。

胆固醇降低双层膜的流动性和通透性，导致增加的机械劲度，同时保持膜流动(Raffy和Teissie(1999)"Control of lipid membranestability by cholesterol content"Biophys.J.76:2072-2080；Crane和Tamm(2004)"Role of cholesterol in the formation and nature of lipidrafts in planar and spherical model membranes"Biophys.J.86:2965-2979)。源自普通烟草的颗粒的较高胆固醇含量导致较小通透性和因此更稳定的颗粒，同时含于颗粒腔体内部的植物细胞蛋白质更少。在不受这个理论约束的情况下，与本生烟草相比在来自普通烟草的颗粒中高得多的胆固醇百分数表明与哺乳动物质膜更相似的不同细胞器起源。

在本发明的一个实施方案中，由病毒样颗粒、特别地由在普通烟草细胞中表达编码重组血凝素的核苷酸序列所产生的颗粒展示的血凝素是S-酰化的。

在本发明的一个实施方案中，由病毒样颗粒、特别地由在普通烟草细胞中表达编码重组血凝素的核苷酸序列所产生的颗粒展示的血凝素是N-糖基化的。

在本发明的一个实施方案中，由在普通烟草细胞中表达编码重组血凝素的核苷酸序列所产生的病毒样颗粒展示的血凝素是S-酰化和N-糖基化的。

在本发明的一个具体实施方案中，血凝素是H5亚型的。

在又一个具体实施方案中，本发明提供一种包含VLP的VLP组合物，所述VLP展示在选择的普通烟草品种、育种系或栽培品种中产生的流感血凝素5多肽(H5)，特别是如SEQ ID NO:8中所显示的流感血凝素5多肽(H5)。

在普通烟草细胞中产生的H5血凝素仅两个胞质半胱氨酸以翻译后方式受到棕榈酸酰化修饰。因此，普通烟草细胞产生的本发明H5血凝素仅具有2条棕榈酰(棕榈酸酯)链。这与哺乳动物产生的血凝素H5相反，所述哺乳动物产生的血凝素H5使得两个胞质半胱氨酸和一个跨膜半胱氨酸以棕榈酸酯和硬脂酸酯的混合物S-酰化。

烟草产生的本发明H5血凝素因此明显与哺乳动物系统中产生的H5血凝素不同，在于跨膜半胱氨酸未酰化并且在酰化的蛋白质中检测不到硬脂酸酯(C18)。

S-酰化大大增加膜亲和力并且对膜上和膜下循环或进入或离开脂质微域的蛋白质是常见的(综述见Hemsley和Grierson(2008)"Multiple roles for protein palmitoylation in plants".Trends inPlant Sci.13:295-302)。棕榈酸酯的排他性存在表示普通烟草中的血凝素分配至较短脂质组成的微域中。在本发明中，对普通烟草产生的全部血凝素C端肽观察到棕榈酰并且未检测到具有S-酰化/棕榈酰化的肽。S-酰化由蛋白质S-酰基转移酶催化。普通烟草具有5种推定性S-酰基转移酶，而本生烟草仅具有2种，这提示与本生烟草相比，S-酰化更可能在普通烟草中发生，从而增加普通烟草中存在更多血凝素稳定膜复合体的可能性(Hemsley(2009)"ProteinS-acylation in plants"(Review).Molecular Membrane Biology 26:114-125)。

流感病毒的血凝素具有在不同血凝素类型和亚型之间在数目和结构方面大范围变动的N-糖苷糖侧链。这些低聚糖(与血凝素分子上特定位点连接)能够干扰抗体结合作用、受体结合作用、蛋白酶解性活化和三聚体装配并且因此对不同血凝素的生物学特性的调节作用具有显著影响。

由在普通烟草细胞中表达编码重组血凝素的核苷酸序列所产生的病毒样颗粒展示的血凝素也是N-糖基化的。例如，本生烟草中产生的VLP上那些糖苷糖侧链相比，在普通烟草产生的病毒样颗粒上展示的血凝素的糖苷糖侧链通常更简单。

因此，与本生烟草中产生的血凝素相比，对于普通烟草产生的血凝素，更简单的N-糖基化血凝素对充分糖基化的血凝素和Lewis型血凝素之比更高。作为普通烟草产生的血凝素的简单N-糖基化模式的结果，普通烟草血凝素暴露出量更大的包含保守表位的蛋白质主链序列。

总之，普通烟草产生的血凝素在第Asn11、Asn23、Asn154、Asn165、Asn286和Asn484位置处糖基化，其中平均而言，在第Asn154位置处的主要N-聚糖具有单个GlcNAc，在第Asn286位置处的主要N-聚糖具有两个GlcNAc并且在第484位置处的主要N-聚糖在原性末端处没有GlcNAc。

与第11和第286位置处分别具有一些至许多Lewis型N-聚糖的本生烟草血凝素相比，在普通烟草产生的血凝素中在第Asn11、Asn23、Asn154、Asn165和Asn286位置处的N-糖基化显示简单结构。

尤其在第Asn154和165位置处，与本生烟草衍生的血凝素相比，在普通烟草中产生的血凝素显示更简单的结构并且暴露甘露糖残基。甘露糖残基可以在许多病原体(包括流感A型病毒)的表面上展示的糖上找到，在那里，它们作为天然免疫系统的内源性甘露糖结合凝集素('MBL')受体的配体发挥作用，通过召集并活化巨噬细胞诱导促炎反应(综述见Marth和Grewal(2008)"Mammalian glycosylation inimmunity"Nat.Rev.Immunol.8:874-887)。许多天然流感A型病毒在第Asn165位置处展示高甘露糖结构物(见Ward等人(1980)"Carbohydrate composition of the oligosaccharide units of thehemagglutinin from the Hong Kong influenza virusA/Memphis/102/72"Biochem.J.189:649-652)，表明普通烟草衍生的血凝素与流感病毒自身的“天然”血凝素构型更相似，从而使得它成为更好的疫苗目的免疫原(与本生烟草相比)。

可以通过以下方式在普通烟草植物或植物细胞中产生前述实施方案的VLP：将所述普通烟草植物或植物细胞与农杆菌细胞温育，所述农杆菌细胞包含双元载体、尤其最小尺寸双元载体，所述双元载体包含对大肠杆菌及农杆菌细胞中维持和复制质粒以及对转移T-DNA至烟草植物细胞必需的序列元件，并且还包含T-DNA区域，所述T-DNA区域包含在普通烟草植物中有功能的调节元件控制下的一种或多种流感抗原、特别是流感血凝素或其免疫原性片段的编码序列，以及任选地包含植物选择标记基因，其中必需序列元件占到整个最小尺寸双元载体的至少60％、65％、70％、75％、80％。

可以使用包含以下核酸元件、由其组成或基本上由其组成的最小双元载体：

a)包含了编码选择标记的核苷酸序列的第一核酸元件，所述选择标记在大肠杆菌和农杆菌物种中有功能；

b)包含第一复制起点的核苷酸序列的第二核酸元件，所述第一复制起点在大肠杆菌中有功能；

c)包含了编码复制启动蛋白的核苷酸序列的第三核酸元件；

d)包含第二复制起点的核苷酸序列的第四核酸元件，所述第二复制起点与第一复制起点不同并且在农杆菌中有功能；和

e)包含T-DNA区域的核苷酸序列的第五核酸元件，所述T-DNA区域包含肿瘤诱导型根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)质粒或根诱生性发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)质粒的T-DNA右边界序列和T-DNA左边界序列；

其中将上述核酸元件在环状多核苷酸分子上提供并且由不在复制、维持或核酸转移中发挥作用的间隔核苷酸序列分隔，并且其中所述间隔核苷酸序列占据少于20％、25％、30％、35％、40％、45％的载体总尺寸。优选地，间隔核苷酸序列占据少于20％的载体总尺寸。

可以将编码流感抗原、特别是流感血凝素或其免疫原性片段的可表达核苷酸序列克隆在最小尺寸的双元载体中，所述双元载体包含对大肠杆菌及农杆菌细胞中维持和复制质粒以及对转移T-DNA至烟草植物细胞必需的序列元件以及任选地植物选择标记基因，其中必需序列元件的比例占到不含编码流感抗原的可表达核苷酸序列的整个最小尺寸双元载体的至少70％核苷酸。

用于本发明的VLP组合物中的载体分子可以具有小于6,000bp、尤其小于5,500bp、尤其小于5,200bp、尤其小于5,100bp，但是特别小于5139bp的总尺寸。

所述最小双元载体基于宽宿主范围质粒pRK2。

最小尺寸的双元载体可以具有如SEQ ID NO:1中所显示的序列。

在本发明的另一个方面，在植物中可工作的控制流感抗原、尤其流感血凝素或其免疫原性片段表达的调节序列包含启动子，尤其如下文公开的启动子之一，但尤其是HT-CPMV启动子，尤其HT-CPMV启动子本身或与如SEQ ID NO:2中所示的最小35SCaMV启动子组合的HT-CPMV启动子。

任选地，调节序列包括5'非翻译前导序列、多聚腺苷化信号、或一个或多个增强子或前者的组合。本发明进一步构思如本领域技术人员已知的和如下文公开的其他调节序列，包括基因沉默阻抑蛋白。

因此，双元载体可以包含编码流感抗原、尤其流感血凝素或其免疫原性片段的可表达核苷酸序列，并且进一步包含与在烟草植物中可工作的调节元件有效连接的基因沉默阻抑蛋白编码序列。

基因沉默阻抑蛋白可以是病毒来源的，并且特别地是选自黄瓜坏死性病毒(CNV)p19蛋白、稻黄斑驳病毒(RYMV)p1蛋白、马铃薯病毒X(PVX)p25蛋白、非洲木薯花叶病毒(ACMV)的AC2蛋白、黄瓜花叶病毒(CMV)2b蛋白和马铃薯Y病毒辅助组分蛋白酶(HcPro)的基因沉默阻抑蛋白。

在本发明的一个方面，在普通烟草植物中产生前述实施方案的VLP，包括步骤：

i)提供普通烟草植物的选定品种、育种系或栽培品种和农杆菌物种选定菌株的组合，其中所述品种、育种系或栽培品种在所述品种、育种系或栽培品种的叶已经通过注射器用细胞密度OD₆₀₀为0.32的选定农杆菌菌株注射5日后显示出少于10％坏死、少于5％坏死、少于2％坏死、少于1％坏死；

ii)将普通烟草选定品种、育种系或栽培品种的完整植株用农杆菌物种的选定菌株的OD₆₀₀在0.1和4.0之间的悬液浸润，所述农杆菌物种包含双元载体、尤其最小尺寸双元载体，所述双元载体包含对大肠杆菌及农杆菌细胞中维持和复制质粒以及对转移T-DNA至烟草植物细胞必需的序列元件，并且还包含T-DNA区域，所述T-DNA区域包含在普通烟草植物中有功能的调节元件控制下的一种或多种流感抗原、特别是流感血凝素或其免疫原性片段的编码序列，以及任选地包含植物选择标记基因，其中必需序列元件占到整个最小尺寸双元载体的至少60％、65％、70％、75％、80％，所述菌株包含在植物中可工作的调节序列控制下编码所述多肽的可表达核苷酸序列；

iii)将浸润的植株在允许可表达核苷酸序列在浸润的植株中表达和异源多肽积累的条件下孵育5日和20日之间、尤其7日和15日之间，但是特别8日和10日之间的时间。

本发明进一步构思包含双元载体的农杆菌细胞的第二悬液用于浸润普通烟草植物的所述选定品种、育种系或栽培品种的用途，其中所述双元载体包含基因沉默阻抑蛋白的编码序列。农杆菌细胞的第二悬液可以任选地具有与选定农杆菌菌株相同的菌株。农杆菌细胞的第一悬液和第二悬液可以按任何顺序或同时浸润。农杆菌细胞的第一悬液和第二悬液可以在用来浸润烟草植物之前混合。任选地，农杆菌细胞的第一悬液和第二悬液以来自每种悬液的细胞数目的限定比率混合。

农杆菌细胞悬液可以用于浸润普通烟草品种、育种系或栽培品种的步骤(ii)中，具有0.15至0.35范围内的细胞密度(OD₆₀₀)。

前述实施方案的VLP可以在普通烟草品种、育种系或栽培品种中产生，所述普通烟草品种、育种系或栽培品种选自如保藏于苏格兰阿伯丁NCIMB的普通烟草登录号PM016、PM021、PM92、PM102、PM132、PM204、PM205、PM215、PM216或PM217、或者DAC Mata Fina、PO2、BY-64、AS44、RG17、RG8、HB04P、Basma Xanthi BX2A、Coker319、Hicks、McNair944(MN944)、Burley 21、K149、Yaka JB125/3、Kasturi Mawar、NC 297、Coker 371Gold、PO2、Simmaba、Turkish Samsun、AA37-1、B13P、来自杂交BU21 xHoja Parado品系97的F4、Samsun NN、Izmir、Xanthi NN、Karabalgar、Denizli和PO1。

在本发明的一个实施方案中，前述实施方案的VLP在普通烟草品种、育种系或栽培品种中产生，所述普通烟草品种、育种系或栽培品种选自PM016，其种子在2011年1月6日按登录号NCIMB 41798保藏于国立工业和海洋微生物保藏有限公司(NCIMB Ltd，一个根据布达佩斯条约位于Ferguson Building，Craibstone Estate，Bucksburn，阿伯丁，AB219YA，英国的国际保藏机构)；PM021，其种子在2011年1月6日按登录号NCIMB41799保藏于NCIMB Ltd.；PM092，其种子在2011年1月6日按登录号NCIMB 41800保藏于NCIMB Ltd.；PM102，其种子在2011年1月6日按登录号NCIMB 41801保藏于NCIMB Ltd.；PM132，其种子在2011年1月6日按登录号NCIMB 41802保藏于NCIMB Ltd.；PM204，其种子在2011年1月6日按登录号NCIMB 41803保藏于NCIMB Ltd.；PM205，其种子在2011年1月6日按登录号NCIMB 41804保藏于NCIMB Ltd.；PM215，其种子在2011年1月6日按登录号NCIMB 41805保藏于NCIMBLtd.；PM216，按登录号NCIMB 41806保藏；和PM217，其种子在2011年1月6日按登录号NCIMB 41807保藏于NCIMB Ltd.。

在产生前述实施方案的VLP中使用的农杆菌菌株可以是选自AGL1、EHA105、GV2260、GV3101和Chry5的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株，特别是农杆菌菌株AGL1或EHA105。

为了在普通烟草植物中产生根据本发明和如本文所述的VLP，所述植物的主要部分(包括植物叶和/或植物花和/或植物茎和/或植物根)，但尤其整个植株，可以原位暴露于低于常压的或为真空的压力。

作为替代，普通烟草植物的主要部分(包括植物叶和/或植物花和/或植物茎和/或植物根)，但尤其整个植株，可以原位暴露于高于常压的压力。

在浸润后，可以将普通烟草植物在日光条件下温育每日7至9小时，优选地每日8小时，以便改善异源蛋白瞬时表达的水平。

在本发明的另一个方面，可以将普通烟草植物以竖直位置或在替代性方面以倒转位置温育。

在本发明的一个具体实施方案中，将普通烟草植物以倒转位置或在日光条件下或同时以这两种条件温育每日7至9小时。

在本发明的又一个方面，普通烟草植物可以(a)在浸润之前，以每平方米至少100个植株的密度培育，或(b)在浸润后，以每平方米至少100个植株的密度培育，或(c)在浸润之前，以每平方米至少100个植株的密度培育，并且在浸润后，以每平方米至少100个植株的密度培育。

在允许表达构建体在多个植物细胞中表达肽抗原的合适条件下孵育植物或植物组织后，肽可以自装配成VLP并且可以在植物或植物部分如植物器官或植物组织中或在其细胞中检出并定量VLP。在收获后，可以使用本领域常规的方法进行VLP分离。例如，可以均化至少一部分生物质，并且提取和进一步纯化展示重组肽抗原的VLP。提取可以包括将匀浆浸泡或浸没于合适的溶剂中。纯化方法包括但不限于，免疫亲和纯化方法和基于肽、蛋白质或蛋白质复合物的特定大小、待分离肽或蛋白质的电泳迁移率、生物活性和/或净电荷或基于蛋白质中存在标签分子的纯化方法。可以通过免疫测定法或通过本领域已知的其他方法实施已分离的肽或蛋白质的表征。例如，肽或蛋白质可以在SDS-PAGE凝胶上通过蛋白质印迹法，或当肽或蛋白质基本上纯化时通过马斯蓝染色进行分析。

可以将借助本发明方法产生的VLP用作药物，并且可以因它们用作营养药和化妆品的用途而表达，因为这些产物用于直接摄入、注射或施加(例如，局部施用)至人。本发明的VLP还可用于产生受类似管理的兽医师产品。

本发明和如本文中公开的VLP可以原样地或以组合物、尤其药物组合物的形式提供。所述组合物可以包含额外的医用物质、药剂、载体、缓冲剂、佐剂、分散剂、稀释剂等，这取决于预期用途和应用。

含有根据本发明和如本文中公开的VLP的合适(药物)组合物的施用可以通过本领域技术人员已知的不同方式实现，例如，通过肠胃外、皮下、腹膜内、局部、透粘膜、透皮、支气管内、肺内和鼻内、心室内、关节内、鞘内、阴道内、气管内、施用和(如果需要局部治疗)病灶内施用。肠胃外施用包括腹膜内、肌内、皮内、皮下、静脉内或动脉内施用。也可以将本发明的组合物直接施用至靶部位，例如，通过生物射弹递送至外部或内部靶部位，如具体受累的器官或肿瘤。

本发明的VLP和含有所述VLP的药物组合物，可以口服施用，并且因此以适于口服施用的形式配制，即配制为固体剂或液体制剂。合适的固体口服制剂包括片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、丸粒剂等。合适的液体口服制剂包括溶液剂、混悬剂、分散剂、乳剂、油剂等。如果以胶囊剂的形式配制，除活性化合物和惰性载体或稀释剂之外，本发明的组合物还包含硬明胶胶囊剂。

本发明的VLP也可以例如配制为含有用于人医学或兽医学中的常规栓剂基料的栓剂，或配制为例如含有常规子宫托基料的阴道栓剂。

合适的药用载体、赋形剂和/或稀释剂的例子是本领域熟知的并且包括但不限于胶、淀粉(例如玉米淀粉、预糊化淀粉)、糖(例如、乳糖、甘露醇、蔗糖、右旋糖)、纤维素材料(例如微晶纤维素)、丙烯酸酯(例如聚丙烯酸甲酯)、碳酸钙、氧化镁、滑石、或它们的混合物。

用于液态制剂的可药用载体是水溶液或非水溶液、悬液、乳液或油。非水溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇和可注射用有机酯如油酸乙酯。油的例子是动物、蔬菜或合成来源的那些油，例如，花生油、大豆油、橄榄油、向日葵油、鱼肝油、另一种海产油、或来自乳或卵的脂质。

含水载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬液，包括盐水和缓冲的介质如磷酸盐缓冲盐水溶液，水、乳液，如油/水乳液、各种类型的润湿剂、无菌溶液等。可以通过熟知的常规方法配制包含这类载体的组合物。合适的载体可以包含与本发明的生物活性化合物组合时保留生物活性的任何材料。

用于肠胃外施用的制品可以包含无菌水溶液或非水溶液、悬液和乳液。非水溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油和可注射用有机酯如油酸乙酯。含水载体包括水、醇/水溶液、乳剂或悬液，包括盐水和缓冲的介质。肠胃外溶媒可以包括氯化钠溶液、Ringer右旋糖液、右旋糖和氯化钠、乳酸化Ringer液或不挥发性油。静脉内溶媒可以包括流体和营养补充物、电解质补充物(如基于Ringer右旋糖的那些)等。防腐剂和其他添加物也可以存在，包括例如抗微生物剂、抗氧化物质、络合剂和惰性气体等。此外，本发明的药物组合物可能包含蛋白质载体，如，血清白蛋白或免疫球蛋白，优选地是人源的。

在另一个实施方案中，本发明和如本文所述的VLP和含有所述VLP的药物组合物可以施用至体表并且因此以适于局部施用的形式配制。合适的局部用制剂包括凝胶剂、油膏剂、乳膏剂、洗剂、滴剂等。对于局部施用，制备式(I)的化合物并且作为生理可接受稀释剂中具有或没有药用载体的溶液、悬液或乳液施加。

本文提供的药物组合物也可以作为控释组合物(即其中活性VLP在施用后的一段时间内释放的组合物)施用。控释组合物或持续释放组合物包括亲脂性储库(例如脂肪酸、蜡、油)中的制剂。在另一个实施方案中，组合物是速释组合物，即其中全部VLP或任何附加有效成分在施用后立即释放的组合物。

另外，根据本发明和如本文所述的VLP可以是包含所述VLP的组合物，所述组合物可以混合至食品、功能性食品、饮料、医用食品中施用。

WO2006/085983中提供合适制剂的其他例子，所述专利的全部内容通过引用的方式并入本文。

这些药物组合物可以按合适的剂量施用至受试者。剂量方案将由主治医生和临床因素决定。如医学领域中熟知，针对任一位患者的剂量取决于许多因素，包括患者的体格大小、身体表面积、年龄、待施用的具体化合物、性别、施用时间和途径、总体健康状况和正在共同施用的其他药物。

根据本发明和如本文所述的VLP可以在人医学和兽医学中用于治疗人和动物，所述动物包括禽类、非人灵长类、犬、猫、猪、山羊、羊、牛、马、小鼠、大鼠和兔。

根据本发明和如本文所述的VLP的合适剂量将取决于受试者的状况、年龄和物种变动，并且可以容易地由本领域技术人员决定。在兽医学和人医学中使用的式(I)化合物的每日总剂量将适当地处于0.01-2000mg/kg体重范围内，优选地是0.1-1000mg/kg体重，优选地是1-100mg/kg并且这些每日总剂量可以作为单一剂量或分立剂量施用，并且额外地，当发现适用时，也可以超出上限。这种剂量将针对每个特定病例中的独立要求调整，所述独立要求包括正在施用的具体化合物、施用途径、正在治疗的病状以及正在治疗的患者。然而，化合物也可以作为储库制剂(植入物、缓释制剂等)每周、每月或以甚至更长间距施用。在这种情况下，剂量将比每日剂量高得多并且必需适应于施用形成、体重和具体适应症。适宜的剂量可以通过实施常规模型测试、优选地通过动物模型确定。通常而言，在口服或肠胃外施用至体重大约70Kg的成人情况下，约10mg至约10.000mg、优选地约200mg至约1.000mg每日剂量应当是适宜的，不过当指示时，可以超过上限。每日剂量可以作为单次剂量或以分立剂量施用，或对于肠胃外施用；可以将它作为连续输注给予。

VLP的有效剂量至少取决于正在治疗的病状的性质、毒性、所述化合物是否以预防方式(较低剂量)或针对活动性感染或病状使用、递送方法和药物制剂，并且将由临床医生使用常规剂量递增研究决定。可以预期它是每日约0.05至约30mg/kg体重。例如，对于局部递送，体重大约70kg的成人的每日候选剂量将是约1mg至约500mg，通常在约5mg和约40mg之间，并且可以采取单个或多个剂量或施用部位的形式。

VLP作为免疫原和佐剂可以在相同或不同的组合物中同时共施用(例如，在彼此数小时范围内)，并且在后一种情况下，通过相同或不同的途径施用。可选地，佐剂可以在施用免疫原之前或之后(例如，在施用免疫原之前或之后约6、12、24、36、48、72、96或120小时或更长时间)。

另外，构思本发明的药物组合物可能包含其他生物活性物质，这取决于药物组合物的预期用途。这些其他生物活性物质可以是例如抗体、抗体片段、激素、生长因子、酶、结合分子、细胞因子、趋化因子、核酸分子和药物。

实施例

提供以下实施例作为说明并且不作为限制。除非另外说明，否则本发明采用相关技术领域技术人员已知的分子生物学、细胞生物学、重组DNA技术、植物生物学、植物育种和蛋白质生产的常规技术和方法。

实施例1：农杆菌浸润烟草植物、栽培浸润的植株和收获植物材料

1.1 农杆菌浸润

这个实施例描述用农杆菌细胞浸润普通烟草的各种方法。完整植株或植物组织可以用农杆菌浸润，通过真空、通过高压或通过无针头注射器辅助。在浸润之前，将烟草植株在温室中在岩棉块内培育，20小时光照时间和4小时黑暗时间，26℃/20℃昼/夜和70％/50％相对湿度(昼/夜)。通过地下渗灌给予植物肥料。

1.1.1 接种物的组合物

将包含双元载体(其含有在植物调节元件控制下的不带目的基因的T-DNA)的根癌农杆菌或发根农杆菌细菌(A.rhizogenes)在回转摇床上的锥形烧瓶中包含2g/L牛肉提取物、0.4g/L酵母提取物、2g/LBacto-蛋白胨、2g/L蔗糖，0.1g/L MgSO₄和用于选择相应农杆菌菌株及双元载体的合适抗生素的YEB-培养基内在28℃和250转/分钟培育直至OD₆₀₀>1.6。随后将培养物在含有10mM2-(N-吗啉代)-乙磺酸(MES)和合适抗生素的新鲜LB培养液Miller培养基中1:100稀释并且进一步在回转摇床上在28℃和250转/分钟培育直至OD₆₀₀>2。通过在8,000g和4℃离心15分钟收集细菌。将沉淀的细菌重悬于终末pH为5.6并且OD₆₀₀>2的含有10mM MgCl₂和5mM MES的浸润溶液(在本文中称作浸润溶液)中任选地，可以细菌进一步稀释于浸润溶液中，并且可以添加乙酰丁香酮以诱导毒力。任选地，如上文所述制备的第一农杆菌细菌悬液与携带具有第二可表达基因的第二双元载体的第二农杆菌悬液混合。这种第二基因的非限制性例子是编码基因沉默阻抑蛋白的编码序列。任选地，接种物可以在使用之前于4-6℃贮存至多到1周。

1.1.2 注射器浸润

将具有标准2-ML注射器尺度的注射器填充细菌浸润溶液和在没有针头的情况下抵住叶的背轴面压紧。压下活塞以迫使细菌悬液进入叶组织中。重复这个过程直至大多数叶表面被浸润。在浸润后，保持植株处于低光照最低8小时并且在第一日期间保护免

受充分光照。次日，将植株置于正常光照条件下直至收获。

1.1.3 真空浸润

通过以下方式浸润植株：在填充有细菌接种物的10L烧杯中浸没地上部分并且使整个感染的植株或感染的植物部分暴露于大大降低的常压(本文中通常称作真空)。使用与V-855调节器连接的泵，在玻璃钟型罩(SCHOTT-DURAN MOBILEX300mm)内进行真空浸润，和压力在3至4分钟内从常压(1巴)降至50毫巴。一旦达到，将钟型罩中的真空保持1分钟，随后在大约2秒内返回常压。在整个浸润过程期间保持人工光照(80-100μmol光子/cm²)以确保一致性光照条件。在浸润后，将植物连同未浸润的对照植物一起置于温室中直至收获。生长条件如施肥、光周期和温度与浸润之前所用相同。使用滴灌系统将水和肥料施加至植物。

1.2 以倒转位置温育浸润的烟草植株

令人惊讶地发现以倒转位置温育浸润的烟草植株导致增加的重组蛋白表达。浸润的烟草植株，特别在温室中以高密度温育时，倾向于倒伏，因为植株和植物茎不能支撑浸润叶片的重量。提供的解决方案是温育颠倒的浸润植株，这导致与按正常竖直位置温育的烟草植物相比，重组蛋白产量显著增加。岩棉中培育的并且高度均为大约28cm的5至6周龄普通烟草PM132植株(其种子在2011年1月6日按登录号NCIMB41802保藏于NCIMB LTD.)用农杆菌菌株Agl1的细胞真空浸润，所述细胞携带了包含TGFP表达盒的质粒sPC91或包含H5表达盒的pC71。

基因构建体pC91是PBINPLUS(VAN ENGELEN等人(1995)TRANSGENIC RESEARCH4:288-290)衍生性双元载体，该载体包含经克隆处于花椰菜花叶病毒35S启动子和HT-CPMV序列及NOS终止子序列控制下的EVROGEN的TurboGFP(tGFP)绿色荧光蛋白基因。pC71如之前描述。如上文所述，培育并且用携带质粒pC91或pC71的农杆菌菌株Agl1的细胞真空浸润烟草植株。全部烟草植株均用如上文所述的包含可表达HcPro基因沉默阻抑蛋白的pC120共浸润。

全部烟草植株也用如上文所述的包含可表达HCPRO基因沉默阻抑蛋白的PC120共浸润。

在浸润后立即将浸润的植株颠倒孵育，同时从温室中植物上方的位置提供光照。在浸润后4日和6日，从每个处理组收获4个植株并且使用每个植株三个叶盘来测量tGFP表达。将叶盘在液氮下冷冻并在2ml微量离心管中研磨成细粉末，并且如上文所述进行tGFP的提取。为了tGFP表达的定量，将5μL每种提取物稀释至200μL并且荧光如所述测量。制备三个重复。

植株没有显示水胁迫症状。在植株倒悬后数日，植株的茎向从上方较高位置射下的光弯曲，形成钩样结构。与按竖直位置培育的正常处理的植株相比，对于以倒转位置(即，倒转)温育的植物，tGFP表达和荧光平均高两倍。

1.3 高密度生长

本实施例描述了在浸润之前以高密度培育烟草植株对tGFP和重组H5表达的令人惊讶的影响。这个实验显示，基于浸润的生物质的重量，相对于正常竖直条件下孵育时以较低密度培育的植株，两个烟草品种PM132和PM217(其种子保藏于NCIMB)在浸润之前以高密度培育时明显地产生大约40％更多的tGFP和70％更多的重组H5。

1.3.1 植株和浸润

为了研究以不同种植密度培育烟草的效果，将普通烟草PM132(其种子在2011年1月6日按登录号NCIMB 41802保藏于NCIMB Ltd.)植株和PM217(其种子在2011年1月6日按登录号NCIMB 41807保藏于NCIMB Ltd.)植株以两个密度培育：每平方米25个和100个植株。在播种后46日，如前文所述，将植株用包含pC91或pC71的根癌农杆菌菌株Agl1并且各自同时用包含pC120的根癌农杆菌菌株Agl1浸润，其中所述含pC91含有tGFP表达盒，所述pC71含有H5表达盒，所述pC120含有HcPro基因沉默阻抑蛋白。浸润中使用的最终OD₆₀₀是0.32。对于以两种密度培育的植株，在浸润之前测量平均植株高度、气孔直径，叶绿素含量、叶厚度和含水量。以高密度培育的植株较大，具有较少的叶绿素和较薄的叶，但是气孔直径相同。对于PM132，以低密度或高密度培育的植株的含水量相同，但是对于PM217，以低密度培育时，含水量低得多。在浸润后，将一半植株竖直或倒转(颠倒)温育。对每个处理总计九(9)个植株进行测量，在每3个植株的三次重复范围内扩展。

浸润后5日收获叶，制备提取物并且如上文所述，进行tGFP表达的分析。将提取物1:1稀释于GFP缓冲液中并且将5μL与200μLGFP缓冲液混合用于荧光定量。与低密度培育的植株相比时，对于以正常向上位置孵育时的两个品种，浸润之前以高密度培育的植株以mg/kg鲜重叶生物量计的tGFP表达平均高41％。对于H5，获得相似的结果，其中与以低密度培育并且在浸润后以正常向上位置孵育的植物相比时，所述H5显示以高密度培育时平均表达增加21-40％之间。为研究倒转温育对tGFP和H5表达的影响，在浸润后，将一半的浸润植株以倒转位置温育。对于以倒转位置温育并以低密度培育的植株，tGFP和H5的表达存在显著增加，但是对于浸润之前以高密度培育的植株，表达增加少得多。对于以低密度按倒转位置培育的PM132植株，这导致tGFP增加40％和H5增加71％。对于浸润之前以高密度培育的植株，与按正常竖直位置温育的植株相比，这种增加对于tGFP仅是3％并且对于H5仅是7％。确立可溶性总蛋白(TSP)并且相对于TSP估计tGFP和H5的表达。对于以高密度培育并以倒转位置温育的植株，tGFP和H5的表达总是较高。在竖直位置中，以低密度培育的植株具有大约10.5％的tGFP表达增加。对于以高密度培育的植株，这种增加是大约13.6％。就H5而言，对于浸润之前以竖直位置温育和以低密度培育的植株，产量增加是0.25％，而对于以高密度培育的植株，产量增加增加是0.37％。就tGFP和H5而言，以倒转位置温育导致表达增加(如按TSP的百分比测量)。对于以低密度培育的植株，以倒转位置温育导致生物量增加40-60％。对于以高密度培育的植株，以倒转位置温育导致增加20％。就tGFP而言，最高蛋白质产率是16.2％并且在植株在浸润之前以高密度培育并且以倒转位置温育时获得。这种表示就％TSP而言，与按低密度培育并以正常竖直位置温育的植株相比(10.5％的TSP)相比，蛋白质产率增加54％。

1.4 收获和材料采样

采样可以在16小时后开始，但是一般，在温室中温育6日后收获浸润的叶或浸润的叶区域。任选地，在温育10日后收获浸润的叶或浸润的叶区域。将叶材料置于可热密封的小袋内，密封并置于干冰层之间至少10分钟。在收获后，将全部叶样品贮存在-80℃直至进一步加工。使用咖啡研磨机，将收获的叶子在干冰上均化成细粉末并且通过以下方式提取：(i)2个步骤在含有50mM Tris碱、100mM NaCl、1mMEDTA、0.2％Triton X-100、终末pH7.5的3vol/wt提取缓冲液中涡旋混合，每次20秒，并且(ii)通过在20,000g离心15分钟。将可溶性提取物保持在冰上直至分析。

实施例2：用于瞬时表达的双元载体

这个实施例描述双元载体以及pC100的设计和开发，它们用于本申请中。本申请的双元载体用于植物细胞中表达血凝素，导致病毒样颗粒形成。这种血凝素的非限制性例子可以是流感毒株A/印度尼西亚/05/2005(H5N1)的血凝素H5或流感毒株A/加利福尼亚州/04/2009(H1N1)的血凝素H1。

2.1 T-DNA区域和主链片段pC100的构建

对多拷贝双元载体pBIN61(Bendahmane等人,2000.PlantJournal21:73-81)的约13,500碱基对长度的核苷酸序列分析在转基因细胞复制、维持、选择和转移T-DNA方面具有功能的核酸。形成仅包含具有如上所述功能的核酸的新核苷酸序列。将所得到的核苷酸序列以两个部分化学地合成。化学地合成第一片段，所述第一片段含有由T-DNA右边界(RB)和T-DNA左边界(LB)界定的T-DNA区域、在胭脂碱合酶(pNOS)启动子和tNOS终止子控制下的pBIN61的植物可选性卡那霉素抗性(nptII)基因和单一StuI、AscI和EcoRI限制性位点，带有侧翼PvuII限制性位点，并且将其克隆在pUC衍生的pMK载体(Geneart，雷根斯堡，德国)的PvuII位点中，所述pMK载体还含有ColE1复制起点(Col E1ori)和细菌性卡那霉素抗性基因(KmR)，从而产生pGA13。化学地合成第二片段，所述第二片段含有带ColE1ori的主链区域和最小RK2oriV复制起点以及编码源自pBIN61的TrfA复制启动蛋白的RK2的基因，带有单一AscI、StuI和PvuII限制性位点，并且将其克隆在pUC衍生的pMA载体(Geneart，雷根斯堡，德国)中，所述pMA载体还含有氨苄青霉素(ApR)抗性基因，从而产生pGA14。

2.2 pC100双元载体的设计和形成

通过合并从头合成的两个片段-第一片段和第二片段，产生植物可选择最小双元载体pC100(SEQ ID NO:1)。第一片段含有1：在大肠杆菌和农杆菌中有功能并包含新霉素磷酸转移酶III基因的卡那霉素耐药基因；2：ColE1复制起点；3：最小oriV复制起点(Kowalczyk L.等人,Molecular Microbiology,2005,57(5):1439-1449)；4：IncP质粒的激活oriV的trfA1基因(Kongsuwan K.等人,J.Bacteriology,2006,188(15):5501-5509)；和5：在所述片段顶端的单一AscI和StuI限制性核酸内切酶识别位点，用于合并所述片段1和片段2以产生最小双元载体pC100。第二片段含有T-DNA区域，所述T-DNA区域含有6：农杆菌T-DNA左边界序列；7：农杆菌T-DNA右边界序列；8：任选地，用于选择转基因植物细胞并且包含在根癌农杆菌胭脂碱质粒的胭脂碱合酶启动子和胭脂碱合酶终止子序列控制下的新霉素磷酸转移酶II基因的选择标记基因；9：用于克隆外来基因并且位于7(T-DNA右边界)和8(选择标记基因)之间的单一EcoRI限制性核酸内切酶识别位点，和10，在所述片段顶端的单一AscI和StuI限制性核酸内切酶识别位点，用于合并所述片段2和片段1以产生最小双元载体pC100(SEQ ID NO:1)。

实施例3：流感病毒样颗粒的瞬时表达

这个实施例描述在烟草属植物细胞中瞬时表达血凝素，导致病毒样颗粒形成。这种血凝素可以是血凝素H5。

3.1 基因构建体

将编码烟草蚀纹病毒(TEV P1-HcPro-P3；SEQ ID NO:4)分离株TEV7DA的HcPro基因沉默阻抑蛋白(GenBank：DQ986288.1)的基因克隆在pC100的单一EcoRI位点中以产生pC120。HcPro的编码序列处于双重花椰菜花叶病毒35S启动子、TEV7DA的5'非翻译区和胭脂碱合酶终止子序列控制下。将编码流感H5N1毒株A/印度尼西亚/05/2005(Genebank：EF541394)血凝素5(H5)的第4区段的序列在5'末端置于最小花椰菜花叶病毒35S启动子和HT-CPMV的5'UTR(SEQ ID NO:2)的控制下，并且在3'末端置于胭脂碱合酶终止子和HT-CPMV的3'UTR(SEQ ID NO:3)的控制下，并且在首先缺失pC100的植物可选择卡那霉素抗性基因以获得如SEQ ID NO:1中所显示的pPMP1最小双元载体后，克隆于pC100的单一EcoRI位点中。

任选地，将血凝素的编码序列置于美国专利5,994,521A中公开的玄参花叶病毒(FMV)全长转录物(FLt)启动子或带双增强子的FMV-FLt启动子，如；如美国专利5,850,019A中公开的花生褪绿条纹病毒(PCISV)FLt启动子或带双增强子的PCISV-FLt启动子；如美国专利6,420,547B1中公开的紫茉莉花叶病毒(MMV)FLt启动子或带双增强子的MMV-FLt启动子(MMV；SEQ ID NO:5)；或如美国专利6,930,182B1中公开的MMV亚基因组转录物(Sgt)启动子的控制下。如实施例1中所述培育植物。

3.2 植物材料和农杆菌接种物

将普通烟草白肋烟草Burley 21、PM132(其种子在2011年1月6日按登录号NCIMB 41802保藏于NCIMB Ltd.)和PM204(其种子在2011年1月6日按登录号NCIMB 41803保藏于NCIMBLtd.)和本生烟草植株在温室中的岩棉块中在26℃/20℃昼/夜温度下和70％/50％昼/夜相对湿度培育，伴以20小时光照时间，4小时暗夜时间。将基因构建体引入根癌农杆菌Agl1中。

将细菌在实施例1.1中报道的条件下培育直至最终OD₆₀₀为3.5。将含有pC229基因构建体和pC120基因沉默阻抑蛋白构建体的农杆菌培养物以3:1比率混合并且在含有10mM MgCl₂和5mMMES，最终pH5.6的浸润溶液中稀释至OD₆₀₀＝0.8。可选地，这类培养物可以进一步稀释用于浸润。

3.3 浸润烟草属植物和提取浸润的植株

3.3.1 普通烟草：

通过以下方式浸润植物：在15秒内降低空气压力至常压以下900毫巴，维持60秒时间，随后在大约2秒内返回至常压。将浸润的本生烟草植株在收获之前在温室中温育5日。

浸润植株的叶从10个植株采集并且在4℃于黑暗下保持过夜。使用螺旋压机(Green Star Corrupad,GS1000,Korea Co.或Vincent CP-4)在15-20Kg/小时使用圆锥体上的至少45-psi压力，将叶匀浆。收集绿色汁液提取物并向绿色汁液添加焦亚硫酸钠至终浓度10mM以减少样品氧化。将提取物的pH调节至pH5.3并且随后在室温孵育20-30分钟，不进行搅拌。然后将CelpureP300(Sigma-Aldrich)10％添加至提取物并混合1分钟。将溶液经Whatman滤纸过滤，所述Whatman滤纸用Celpure P300(10mM焦亚硫酸钠中的10％Celpure P300浆液)预涂覆。

3.3.2本生烟草：

在本生烟草植株中如D'Aoust等人(D'Aoust等人(2008)Influenza virus-like particles produced by transient expression inNicotiana benthamiana induce a protective immune responseagainst a lethal viral challenge.Plant Biotechnology Journal 6(2008)930-940)中所述，使用前述基因构建体和培养物，或可选地通过将气压在15秒内降低至常压以下900毫巴，60秒保持时间，随后在大约2秒内返回常压，产生流感病毒样颗粒。将浸润的本生烟草植株在收获之前在温室中温育6日。

采集来自浸润植株的叶并且叶提取如上文实施例3.3.1中所述实施。

3.4 病毒样颗粒的纯化

为了超速离心，在超速离心管中如下制备三种蔗糖缓冲垫：1)3ml80％蔗糖；2)1.5ml的60％和45％蔗糖每种；和3)1ml60％、45％和35％蔗糖。将澄清和过滤的提取物样品(至多到13ml)柔和地置于蔗糖梯度的顶部并且在吊桶式转头(swinging bucket typerotor)(Sorvall Surespin630；Kendro)在4℃以24,000转/分钟进行超速离心1小时(最大相对离心力135,000)。将蔗糖浓缩的样品用0.45μm滤器预过滤并在等强度条件下在自动化AKTA层析系统上进行大小排阻层析(SEC)。运行缓冲液是TBS，pH7.5，并且样本容量是在HiLoad16/60Superdex200柱(GE Healthcare,17-1069-01)上流速1ml/分钟下4ml。将含有纯化H5的级分汇集并用30kDa截留值Centricon超滤膜装置(Millipore)浓缩至约0.3mg/ml并进一步分析。

3.5 H5的凝胶电泳和蛋白质印迹检测

使用标准技术，将汇集级分的样品直接进行SDS-PAGE、蛋白质印迹和Blue Native-PAGE。可选地，使用咖啡研磨机，将浸润植株的叶首先研磨成细粉末并且通过以下2个步骤提取：(i)在含有50mM Tris碱、100mM NaCl、1mM EDTA、0.2％Triton X-100、最终pH7.5的3vol/wt提取缓冲液中涡旋混合，每次20秒，并且(ii)通过在20,000g离心15分钟，以确定前述浸润叶中H5的存在。在4-12％SDS-PAGE凝胶上进行SDS-PAGE。作为H5的阳性对照，使用Immune Technology Corp.的市售重组H5(New York，目录号。#IT-003-0052p)。在分离后，蛋白质用Imperial M蛋白质染液(Pierce#24615)染色。对于蛋白质印迹，第一抗体是兔抗HA抗体(H5N1VN1203/04#IT003-005V,Immune Technology Corp.,New York)。对于检测，使用HRP-标记的亲和纯山羊IgG FC-片段(Jackson Laboratories,#111-035-046)。使用Immuno-star HRP化学发光试剂盒(BIO-RAD Laboratory,170-5040)通过化学发光进行检测。使用Chimio-Capt3000捕获结果并且在大小排阻层析后显示用pC229基因构建体浸润的植物的提取物和级分中存在H5。分子量与商业重组H5的分子量相似。Native-PAGE在4-16％Bis-Tris预制聚丙烯酰胺凝胶(Novex，Invitrogen，USA)上进行。为了上样，将样品用天然聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)样品缓冲液中的洋地黄皂苷处理并在4℃温育1小时。随后，将Native-PAGEG-250样品添加物(Novex，Invitrogen，USA)添加至终浓度0.5％，并且加载样品并且在4-16％Bis-Tris PAGE凝胶上运行。凝胶在4℃以150V恒压运行持续前60分钟。随后，增加电压至250V持续另外30分钟并且凝胶用Imperial M蛋白质染液染色。天然-PAGE和蛋白质印迹法的结果显示在烟草和本生烟草中瞬时表达后分别成功表达H5。

3.6 血凝作用

血凝素具有与红细胞中红细胞表面上存在的单糖唾液酸结合的能力。血凝作用可以用来确定血凝素蛋白的相对活性并且用来确定如前所述瞬时表达H5的普通烟草的粗提物中在病毒样颗粒中存在的重组H5的生物活性。通过将植物提取物以及借助大小排阻层析法纯化后所获得的级分的1.5倍连续稀释物与96孔板中特定量的红细胞温育，测量病毒样颗粒中存在的H5的血凝活性。不与H5结合的红细胞沉至孔底部并形成沉淀物，并且正确折叠的三聚体H5将结合红细胞。在大小排阻层析用pC229基因构建体分别浸润的烟草植株和本生烟草植株的提取物后所获得的提取物和级分中观察到血凝活性。

实施例4：通过超速离心在蔗糖缓冲垫上纯化病毒样颗粒

这个实施例描述通过蔗糖-梯度离心纯化病毒样颗粒。可以通过在植物细胞中表达例如流感血凝素H5或H1获得这类病毒样颗粒。这类植物细胞可以是普通烟草或本生烟草的细胞。

4.1 病毒样颗粒的分离

根据本发明在本生烟草或普通烟草中产生血凝素H5-病毒样颗粒。纯化根据本发明中描述的实施例和程序进行并且使用实施例6和7中概述的一组分析工具检验病毒样颗粒的品质。在三个不同普通烟草品种：普通烟草Burley 21、PM132(其种子在2011年1月6日按登录号NCIMB 41802保藏于NCIMB Ltd.)和PM204(其种子在2011年1月6日按登录号NCIMB 41803保藏于NCIMBLtd.)中制得病毒样颗粒并进行测试。

4.2 匀浆和提取

在农杆菌浸润后6日收获表达血凝素病毒样颗粒的本生烟草植株和普通烟草植株的叶，并且所述叶在4℃于黑暗下保持过夜。使用螺旋压机将植物生物质(包括叶和茎)匀浆(Green StarCorrupad,GS1000,Korea Co.)并添加焦亚硫酸钠至10mM终浓度以避免样品氧化。

4.3 澄清和过滤

使用20％稀释的乙酸，将从螺旋压机获得的粗制汁液迅速调节至pH5.3。提取物在不搅拌的情况下在室温停留20-30分钟以便部分澄清。借助Whatman滤纸进行过滤，所述滤纸预涂以2mm高Celpure P300(MBS10mM中的10％Celpure P300浆液)。将真空保持在508毫巴。将Celpure P300(10％)添加至提取物并混合5分钟。最后，将提取物温和地过滤，逐份添加提取-celpure浆液(不高于过滤滤饼上方的2cm液相)。

4.4 通过蔗糖缓冲垫纯化

在超速离心管中制备3ml蔗糖缓冲垫(1.5ml45％蔗糖和1.5ml60％蔗糖)。将澄清并过滤的提取物样品(至多13mL)添加在蔗糖缓冲垫的顶部上并经历超速离心至吊桶式转头中(24,000rpm＝最大相对离心力135,000，1小时，4℃和加速曲线和减速曲线9，Sorvall Surespin630转子，Kendro)。从转子取出管并且将蔗糖从剩余的提取物分离。使用0.45μm滤器预过滤蔗糖浓缩的样品并且使所述样品在等强度条件下在自动化AKTA色谱系统上经历凝胶过滤层析(运行缓冲液TBS，pH7.5，样本容量4mL，流速1mL/分钟，HiLoad16/60Superde x200柱GEHealthcare17-1069-01)以移除蔗糖。将含有纯化H5-VLP的级分汇集并用30kDa截留值Centricon超滤膜装置(Millipore)浓缩至约0.3mg/mL。将纯化的H5-VLP样品立即等分并贮存在4℃直至需要。

实施例5：替代性病毒样颗粒纯化方案

这个实施例描述了根据本发明中描述的方法，从浸润的植株叶的提取物中纯化病毒样颗粒的替代方案。这个方案描述了通过在冷的匀浆缓冲液(而不使用螺旋压机)中使叶匀浆而纯化。

5.1 VLP纯化方案

1.在浸润后2至10日收获浸润的叶并在冷的匀浆缓冲液中匀浆，所述匀浆缓冲液含有50mM Tris pH8、50mM NaCl、0.04％焦亚硫酸钠、用乙酸缓冲至pH6的甲醇中的1mM PMSF。任选地，可以添加蛋白酶抑制剂至匀浆缓冲液。

2.使用研钵和研杵，以1.5mL匀浆缓冲液对1g叶组织的比率研磨收获的叶组织。添加玻璃株至研磨的混合物以帮助裂解植物细胞。经两层粗滤布挤出匀浆。

3.在42℃加热裂解物5分钟。

4.添加硅藻土至热处理的提取物以吸附杂质。

5.经#1Whatman滤纸过滤所产生的浆液。

6.将匀浆以10,000x g在室温离心10分钟。

7.经0.8μm Corning注射器滤器随后经0.2μm Corning注射器滤器过滤上清液

8.向滤液添加60μL Fetuin琼脂糖/1mL上清液。在添加至上清液之前，首先将Fetuin琼脂糖在匀浆缓冲液中洗涤3次。允许在室温混合30分钟。

9.使用含有400mM NaCl，25mM Tris，缓冲在pH 6.0的洗涤缓冲液用10倍柱体积洗涤该柱3次，以除去未结合的蛋白质并且以2000转/分钟离心5分钟。回收沉淀物。

10.用等体积的含有1.5M NaCl，50mM MES，缓冲在pH 6.0的洗脱缓冲液从该柱洗脱蛋白质，其中向所述洗脱缓冲液添加0.0005％(终浓度)Tween-80。洗脱至少3次。

11.在10kDa MWCO离心管上浓缩洗脱液并在冰上存储于4℃，或

12.取洗脱缓冲液中5.5ml的45％蔗糖敷设在洗脱缓冲液中的2.5ml60％蔗糖上。将样品敷设在45％蔗糖上。

任选地，可以省略步骤11和12。

13.在4℃以60,000x g离心14小时。

14.刺穿该管并使用注射器和针头收集病毒带。

15.在冰中或在-80℃中存储于4℃直至下一个步骤。

实施例6：用于清洁和捕获植物衍生的病毒样颗粒的两步骤捕获方法

这个实施例描述了一个用于从根据本申请中描述的方法所获得的植物提取物捕获病毒样颗粒的两步骤清洁和捕获方法。在第一步骤中，从含有病毒样颗粒的提取物移除绿色物质。这种绿色物质可能堵塞和堵住在纯化病毒样颗粒的色谱期间使用的柱。

6.1 两步骤方法

如上文所述并通过使用螺旋压机，当将浸润和温育的叶匀浆时，则获得绿色植物汁液提取物。首先在预捕获步骤中处理绿色植物汁液，因为绿色植物汁液提取物并且尤其这类提取物中造成绿颜色的任何物质优势地粘附至色谱中使用的大部分配体并且因此造成色谱纯化期间使用的柱阻塞和堵塞。用于植物衍生的病毒样颗粒的两步骤捕获方法设立成首先清洁该提取物，该方法包括：

步骤1，使用与平均粒度为150μm的粒子连接的聚乙烯亚胺(PEI)离子交换剂，在pH 7以静态结合/分批温育模式结合决定绿色植物汁液提取物的绿颜色的杂质和物质；

步骤2，使用与平均粒度为50μm的粒子连接的二乙基氨乙基(DEAE)离子交换剂，在pH7以扩张床吸附模式结合来自步骤1的上清液中的病毒样颗粒。

6.2 实验设置

制备如所述和在本发明中例举的表达病毒样颗粒的烟草植物的普通烟草提取物、过滤并且在使用之前用去离子水稀释5倍。最终pH设定在pH7并且步骤1中用于温育的总体积是150mL。电导率是5.3mS/cm。聚乙烯亚胺(PEI)吸附剂的平衡用5个床体积的0.5M Tris/HCl缓冲液pH7进行，随后用10个床体积的10mMTris/HCl缓冲液pH7.0进行。静态模式下PEI吸附剂对绿色汁液提取物的比率是1:15。总使用9.5mL PEI吸附剂。温育在室温持续30分钟并且温育后，收集140mL上清液用于步骤2。

在步骤2中，将步骤1的120mL上清液调节至pH7.0并且以扩张床吸附模式运行。电导率是5.4mS/cm并且以膨胀床模式使用的二乙基氨乙基(DEAE)离子交换剂的平衡用5个床体积的0.5MTris/HCl缓冲液pH7进行，随后用10个床体积的10mM Tris/HCl缓冲液pH7.0进行。使用总计12mL DEAE吸附剂。膨胀床柱具有1cm直径，柱高度70cm并且床高度是15cm。DEAE吸附剂对样品的比率是1:10。将步骤1的上清液以流速3.8cm/分钟加载到该柱上并且在加载后，将该柱用含有10mM Tris/HCl pH7.0的洗涤缓冲液洗涤。使用含有50mM Tris/HCl和1M NaCl，pH9.0的洗脱缓冲液，洗脱结合的物质。以25mL体积收集通流(Runthrough)和洗涤级分。将洗脱物收集在一个级分中并且在收集洗脱物之前，通过添加1/10体积的1M Tris/HCl，pH6.5溶液至管，将洗脱期间的pH调节至pH7。

6.3 检测血凝素

如之前描述那样，对进入步骤1之前的过滤的普通烟草绿色汁液提取物、以静态模式温育后的上清液、通流、洗液和膨胀床模式吸附和洗脱后的洗脱物估计血凝素蛋白的量。使用标准方案估计提取物和级分中的总蛋白含量。表1中给出在过滤的绿色汁液提取物、以静态模式与PEI离子交换剂温育的起始材料、提取物与PEI离子交换剂温育时所衍生的上清液、使用DEAE离子交换剂的扩张床吸附的起始材料、洗脱膨胀床时的通流和洗脱物中如使用血凝集测定法测量的血凝素的量，连同所述级分和样品的总蛋白含量。在这个实验中，在不丢失血凝素蛋白的情况下，在步骤1中使用PEI吸附剂移除造成绿颜色和柱阻塞的大部分物质，并且在扩张床吸附模式期间使用DEAE离子交换剂捕获包含血凝素蛋白的病毒样颗粒。

表1.步骤1和步骤2的多种提取物和级分的血凝活性(初始提取物％)和总蛋白含量(mg/ml)。ND，未测定。

实施例7：使用膨胀床色谱大规模捕获病毒样颗粒

这个实施例描述大规模捕获在植物提取物中产生并从中提取的包含血凝素的病毒样颗粒和以工业规模使用膨胀床色谱。

7.1 提取物

将烟草植株如所述那样浸润并在浸润后，在温室中温育6日，之后收获。收获浸润的植株的叶并且将生物质在4℃于黑暗下保持过夜并使用螺旋压机(Vincent CP-4)以15-20Kg/小时，使用锥体上的至少45-psi压力匀浆。取得含有血凝素H5病毒样颗粒的250kg粗制叶生物质用于进一步加工。收集绿色汁液提取物并向绿色汁液添加焦亚硫酸钠至终浓度10mM。测量电导率并且提取物在使用之前用水稀释至大约10的最终电导率。提取物在室温保持。稀释后的总体积是大致1,250L提取物。

7.2 柱特性

珠组成：表氯醇交联的琼脂糖(4％w/v)。芯部：碳化钨(占据大约10-15％的珠体积)。配体：DEAE离子交换剂。粒子平均直径：50μm。吸附剂粒子的平均密度：16kg/L。柱直径：45cm。沉降状态下的空隙容积：装填容积的大约40％。总体积：添加63L吸附剂材料至45cm直径柱。该柱用5个柱体积的0.5M Tris-Cl缓冲液，pH7平衡，随后用10个柱体积的10mM Tris-Cl缓冲液，pH 7平衡。

7.3 加载

通过以流速450cm/小时(等同于653L/小时)向上泵送1,250L提取物进行加载。膨胀因数保持在2.0-2.5并且用10mM Tris/HCl，pH 7以相同膨胀速率洗去未结合的物质。

7.4 洗脱

通过用50mM Tris-Cl和1M NaCl，pH9以膨胀速率1.2洗脱回收流感病毒样颗粒。通过在收集洗脱峰之前添加1/10体积1MTris/HCl，pH6.5至容器，将洗脱的级分中和。将含有如根据本发明方法测量包含血凝素的病毒样颗粒的级分汇集用于进一步捕获和纯化。

7.5 性能监测

通过测量在280nm和600nm处的UV吸收、电导率和pH监测色谱性能。通过如实施例2中所述或根据D'Aoust等人(2008，上文)的ELISA和血凝法，定量地测量含有血凝素H5的病毒样颗粒的捕获。使用Bradford测定法来确定级分的总蛋白含量。如实施例2中或通过D'Aoust等人(2008，上文)所述，SDS-PAGE用来建立纯度并且使用血凝素H5特异性抗体，将蛋白质印迹法用于鉴定和表征。

实施例8：定量性显微测量粒子形态

这个实施例描述了用于根据本发明方法确定含有血凝素的病毒样颗粒的结构特征的方法。通过透射电子显微术测量病毒样颗粒上血凝素纤突的长度和横向周期通过扫描电子显微术测量病毒样颗粒大小。

8.1 叶样品的透射电子显微术

根据本发明浸润和温育的未冷冻的新鲜叶随1x磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液(50uL缓冲液中1x1cm叶盘)一起在微量离心管中碾碎。将所产生的混合物以10Kg离心15分钟并将上清液置于透射电子显微术(TEM)栅极上10分钟，用滤纸干燥并置于一滴pH6.5的3％磷钨酸上用于负染色。透射电子显微镜图像在JEOLJEM1010透射电子显微镜上以加速电压80kV获得并且用ImageJProcessing Toolkit分析。

8.2 纯化的病毒样颗粒的透射电子显微术

将100微升病毒样颗粒样品置于微量离心管中。将栅极置于管底部处，该管随后以10K离心25分钟。取出栅极，用滤纸干燥并置于一滴pH6.5的3％磷钨酸上用于负染色。显微镜图像在JEOLJEM1010透射电子显微镜上以加速电压80kV获得并且用ImageJProcessing Toolkit分析。

8.3 扫描电子显微术(SEM)

扫描电子显微术用来对悬液中的病毒样颗粒成像，因为透射电子显微术需要固相支持物。扫描电子显微术允许分析处于其天然环境下的病毒样颗粒。使用以下流程、方法和材料：黄色粒子40-80nm(Spherotech，Inc Ct编号：CFP-00552-2)；黄色粒子90-300nm(Spherotech，IncCt编号：CFP-0252-2)；500nm和40nm二氧化硅粒子和金粒子(quantomix)校正珠。QX-102舱(quantomix)用聚-L-赖氨酸(Sigma目录号P8920)涂覆以改善悬液中粒子的成像结果。将15μl0.1％聚-L-赖氨酸溶液施加至液碟并在室温温育1小时。移除溶液并将液碟用蒸馏水淋洗2次。最后，移除水并且将液碟施加病毒样颗粒之前干燥。以500g温和离心5分钟用来固定聚-L-赖氨酸基质上病毒样颗粒。

实施例9：通过分级确定病毒样颗粒的尺寸分布

这个实施例描述了通过分级法测量病毒样颗粒的大小的方法，所述病毒样颗粒根据本申请中描述的方法获得。

9.1 AF4-MALLS

基于病毒样颗粒的水动力特性，与多角度光散射法组合的非对称流场-流分级(AF4)(AF4-MALLS)用来分离病毒样颗粒，因为它涉及与固定相的相互作用。含有病毒样颗粒的样品由非对称流FFF系统(Eclipse3+,Wyatt Technology Europe GmbH)分离，随后由MALLS分析(DAWN HELEOS II检测器,Wyatt TechnologyEurope GmbH)。Agilent1100HPLC系统(Agilent Technologies)用来注入样品并递送流动相至FFF系统。FFF装置装配有形成梯形流道的350μm厚特富龙垫片。该膜由30kDa分子量临界值的PES制成。样品以其中粒子以大小渐增顺序洗脱的正常洗脱模式分离。样品首先聚集在通道头部处，所述通道头部具有0.2ml/分钟的两个对立横向流场和0.6ml/分钟的一个垂直错流场。聚集时间是2分钟。样品在50mM NaNO₃，pH7.5中洗脱。全部样品以横向流速率1.5ml/分钟和错流梯度0.6-0ml/分钟在35分钟内洗脱。对于纯化的病毒样颗粒样品，进样量是50μl。在FFF分离后，用18-角MALS检测器检测病毒样颗粒。入射光束波长是680nm并且由30mW砷化镓激光器产生。使用Astra软件(Wyatt TechnologyEurope GmbH)确定基线散射界限和峰界限。通过光散射瑞利比的角度依赖性对二阶指数指数拟合，计算粒子均方根(rms)回转半径(Rg)。拟合结果外推至零角度并且使用Astra软件根据Berry形式化，从零角度处的斜率计算半径。

9.2 粒度

从图1A可以见到，来自普通烟草Burley 21、普通烟草PM132和PM204的病毒样颗粒具有直径约40-220nm的尺寸分布。这类病毒样颗粒之间的尺寸分布差异对于普通烟草PM132，随一个约45nm的峰见到，对于普通烟草PM204，随一个约60nm的峰见到，并且对于普通烟草Burley 21，随一个约50nm的峰见到(图1A*)。与从本生烟草分离的具有直径约100-300nm尺寸分布的那些病毒样颗粒相比，普通烟草衍生的病毒样颗粒明显更小(图1B*)。代表本文最丰富群体的峰顶在等同于150nm粒径的75nm(±0.4％)处。

(*全部峰值均称作半径)

实施例10：用于脂肪酸分析的方法

这个实施例描述用于分析本发明病毒样颗粒的脂质含量和脂质组成的方法。脂质由脂肪酸组成。存在几种类别的脂质，它们当中磷脂代表生物脂质双层膜的主要组分。

10.1 通过GC-MS分析样品组成和脂肪酸

通过在65℃使用柔和氮气流移除溶剂至干燥，在自动进样器小瓶中浓缩100μl根据本发明获得的病毒样颗粒溶液浓缩。随后，添加2ml己烷和0.2ml氢氧化钾甲醇溶液(2M)用于水解和酯化。在超声处理10分钟后，所产生的溶液用1M氢氯酸中和。将己烷相分离并浓缩至干燥。将所产生的脂肪酸甲酯溶解于0.5ml异辛烷中并分析。将2μl来自小瓶的等分试样以脉冲不分流方式上样在气相色谱仪(带有5973质量选择性检测器的Agilent6890GC系列，MSD)中的毛细管柱(BPX90，30m x0.25mm内径，0.25μm膜厚度)。上样器温度是260℃并且恒温器经编程以维持80℃持续1分钟，随后5℃/min上升至180℃，并且进一步10℃/分钟上升至220℃，保持3分钟。以流速1.2ml/分钟使用氦气作为载气。使用扫描范围50至350amu的扫描模式，优势地进行GC-MS筛选分析。此外，对于一些分析物和分析，使用单离子监测(SIM)模式。表2中列出SIM模式下使用的离子质量。

表2.离子质荷比(m/z)

首先通过实验质谱与NIST质谱文库比较鉴定脂肪酸甲酯。最终，通过比较停留时间和质谱与参考脂肪酸甲酯化合物的那些停留时间和质谱鉴定脂肪酸。

实施例11：脂质类别筛选

这个实施例描述了通过LC-MS/MS进行脂质类别筛选的方法。通过这种方法靶向各种磷脂和植物甾醇。

11.1 用于脂质分析的样品组成

对于液体-液体提取，将375μL2:1(v/v)甲醇-亚甲基氯化物混合物添加至100μL病毒样颗粒溶液并将溶液涡旋混合。接下来，添加125μL二氯甲烷并且将溶液涡旋混合；添加125μL水并且将溶液再次涡旋混合。接着，将溶液在室温以1000转/分钟离心5分钟以允许两个相分离。

移除上层水相并且将下层有机相转移至自动进样器小瓶并添加200μL乙酸铵甲醇溶液(1mM)。使用100μL水代替病毒样颗粒溶液，遵循相同的流程平行制备空白样品。

11.2 靶向的脂质结构

通过这种方法靶向的磷脂是磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇。靶向的植物甾醇是胆固醇、菜子甾醇、菜油甾醇、豆甾醇和谷固醇。

11.3 借助LC-MS/MS的脂质类别筛选

对于磷脂分析，将2μl从自动采样器小瓶上样到高效液相色谱(HPLC)柱(Phenomenex，Synergi4μ极性RP，150mm x2.0mm)。液相色谱分离用配备有三台泵、一台脱气机、一个冷却自动采样器和一个柱温箱的Shimadzu Prominence20A进行。表3中给出用于LC分离的流速和梯度程序。柱温度是30℃并且为了检测分析物，使用串联质谱仪(Applied Biosystems4000Q trap)。使用阳性以及阴性电喷雾电离(ESI)进行分析物的电离。分析以中性丢失或前体离子扫描模式进行，扫描范围从400Da至1200Da。在表5和表6中给出离子源的仪器参数和不同化合物类别的质量分析器设置。用验证过的色谱数据系统(Analyst1.4.1)进行数据采集和数据处理。

表3：脂质类别筛选的参数设置

表4.脂质类别筛选的源参数

表5.脂质类别筛选的质量分析器设置

11.4植物甾醇筛选

对于植物甾醇分析，将20μl从自动采样器小瓶上样到高效液相色谱(HPLC)柱(Merck，Chromolith SpeedROD RP-18e，50mm x4.6mm)，所述柱偶联至保护柱(Phenomenex C-18，3mm x4mm，5μm)。液体色谱拆分用配备二元泵、脱气机、冷却孔板自动采样器和柱温箱的Agilent1100进行。将柱温箱设定至温度40℃并且将孔板自动进样器设定至6℃。表6中给出用于LC分离的流速和梯度程序。为了检测谷固醇、豆甾醇、菜油甾醇、菜籽甾醇和胆固醇，使用串联质谱仪(Applied Biosystems 4000Qtrap)。使用正大气压化学电离(APPCI)进行分析物的电离。分析以多反应监测(MRM)模式进行。在表8和表9中给出离子源的仪器参数和不同化合物类别的质量分析器设置。用验证过的色谱数据系统(Analyst1.4.2)进行数据采集和数据处理。该技术在本文中称作LC-APPCI-MS/MS。

表6.用于植物甾醇筛选的梯度程序

表7.用于植物甾醇筛选的源参数

表8.用于植物甾醇筛选的质量依赖性设置

实施例12：来自本生烟草的病毒样颗粒的脂肪酸组成

这个实施例描述包含病毒样颗粒的三种本生烟草样品的脂肪酸组成，所述病毒样颗粒包含本发明的血凝素。

12.1结果

图2中的色谱图显示脂肪酸筛选本生烟草病毒样颗粒样品VLP1的结果。可以见到六种脂肪酸：棕榈酸(C16-0)、硬脂酸(C18-0)、花生酸(C20-0)、油酸(C18-1)、亚油酸(C18-2)和亚麻酸(C18-3)。图2中所见的两种额外的脂肪酸可能是硬脂酸和花生酸的异构体，因为该质谱与硬脂酸和花生酸的质谱十分相似。为取得关于这种病毒样颗粒样品中脂肪酸浓度的定量性信息，针对棕榈酸甲酯和油酸甲酯进行校准。使用这2种校正将所述样品中存在的分析物定量(表9)。因此定量地确定棕榈酸和油酸，而仅半定量地确定硬脂酸、花生酸、亚油酸和亚麻酸。还考虑到未鉴定的脂肪酸，所述病毒样颗粒样品的脂肪酸含量经计算是大约1.9pmol/mL样品溶液。

表9.本生烟草病毒样颗粒样品的脂肪酸浓度

以扫描模式进行本生烟草的两份其他病毒样颗粒样品VLP2和VLP3的脂肪酸分析，并且对于棕榈酸和油酸，也以SIM模式进行。校正仅对棕榈酸和油酸再次进行并且用于定量样品1的如上文所述全部脂肪酸。进行三次技术性重复并且表10给出来自三次技术性重复的计算均值。

表10.本生烟草样品VLP2和VLP3中的脂肪酸浓度。

实施例13：本生烟草病毒样颗粒的磷脂组成

这个实施例描述在本发明的本生烟草中产生并从中分离的病毒样颗粒的磷脂组成。

13.1 借助LC-MS的脂质剖析和定量

借助LC-MS的靶向方案允许通过监测与其特征性极性头部基团相关的特定离子检测并鉴定磷脂。在不同停留时间洗脱并具有限定分子量的种类可以借助特定头部基团的存在来分类并且进一步通过MS-MS片段化来表征，从而允许表征与之连接的脂肪酸。使用这种方法，靶向磷脂磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇以及固醇类：菜子甾醇、菜油甾醇、豆甾醇和谷固醇。样品组成根据Bligh&Dyer(A rapid method for total lipidextraction and purification.Can J Biochem Physiol37(1959)911-917)。

13.2结果

LC-MS揭示5种磷脂酰乙醇胺(PE)和3种磷脂酰胆碱(PC；表11)。对于3种PE(MW分别为739、741和743)和1种磷脂酰胆碱(MW为783)，可以从精确分子质量推出2种可能的结构。还鉴定到2种磷脂酰肌醇(PI)(表11)。

表11：如通过LC-MS鉴定和表征，在源自本生烟草并含有血凝素H5的病毒样颗粒中所代表的磷脂

实施例14：烟草衍生的病毒样颗粒的总脂质组成

这个实施例描述实施例15至19中描述的多种方法学和脂质衍生化后脂肪酸的GC-MS测量如何可以用来确定在本发明的烟草属植物细胞中产生的病毒样颗粒的总脂质含量和组成。为了定量这类病毒样颗粒中的总脂肪酸，测量游离脂肪酸和构成磷脂、固醇脂质及酯的那些脂肪酸。

14.1 用于剖析病毒样颗粒脂质含量的方法

脂类由脂肪酸组成并且存在几种类别的脂质，它们当中磷脂代表生物脂质双层膜的主要组分。磷脂、固醇脂质和酯和鞘脂是脂质双层膜的结构单元。三种方法用来确定根据本发明的方法获得的植物衍生的病毒样颗粒的脂质组成。第一方法1)借助GC-MS并且用于病毒样颗粒中脂肪酸的筛选和半定量。将脂肪酸作为甲基酯分析。为此目的，优化磷脂的水解及其组成性脂肪酸的酯化以允许剖析。第二方法2是基于LC-MS的方法，所述方法用于磷脂的脂质类别筛选，所述磷脂包括磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(Pl)和鞘磷脂(SM)。进行这些磷脂的定性测定和对比测定。使用纯胆固醇、菜子甾醇、菜油甾醇、豆甾醇和谷甾醇作为化合物测量植物甾醇。使用确定母离子以及串联质谱片段离子的精确质量的高分辨率质谱仪进行脂质的鉴定。高阶片段化实验用单位分辨率进行以获得额外的结构信息。借助基于LC-MS的非靶向筛选方法进行病毒样颗粒的各种脂质的更广泛分析。根据Bligh和Dyer(1959，上文)从病毒样颗粒选择性地提取磷脂、鞘脂和固醇脂质以允许分析所产生的混合物并且通过允许脂质类别筛选的LC-MS剖析和表征混合物内存在的全部不同脂质。第三方法3)是直接分析病毒样颗粒中存在的脂质混合物以允许鉴定通过方法1和2检测不到的分子并且定量和鉴定任何未知的种类。

14.2 衍生化方法

取100μL病毒样颗粒样品并且添加50μl ISTD(C17-0，1,2-双十七酰-甘油酰-3-磷脂酰胆碱)；回旋；添加2mL己烷；添加0.4mL2M KOH(甲醇)；回旋；通过超声波处理法处理10分钟；用1M HCl(pH3和7之间)中和；移走己烷；在氮气下干燥并再溶解于0.5mL异辛烷中。

14.3 GC-MSD方法

GC柱BPX90，30m，0.25mm，0.25μm。在260℃上样3μl，脉冲不分流。恒温器程序：1分钟，80℃；5℃/分钟升高至180℃，0分钟；10℃/分钟升高至220℃，3分钟。MSD：SIM.C16-0,m/z:74(87,143,270)；C17-0,m/z:74(87,143,284)；C18-0,m/z:74(87,143,298)；C18-1,m/z:264(55,67,74)；C18-2,m/z:81(67,95,294)；C18-3,m/z:79(67,95,292)；C20-0,m/z:74(87,143,326)。用于质量控制的化合物：C16-0:1,2-二棕榈酰-甘油酰-3-磷脂酰乙醇胺；C18-0:1,2-二硬脂酰-甘油酰-3-磷脂酰乙醇胺；C18-1:1,2-二油酰-甘油酰-3-磷脂酰乙醇胺；C18-2:1,2-二亚油酰-甘油酰-3-磷脂酰胆碱；C18-3:1,2-二亚麻酰-甘油酰-3-磷脂酰胆碱；C20-0:1,2-二花生四烯酰-甘油酰-3-磷脂酰胆碱。C17-0:1,2-双十七酰-甘油酰-3-磷脂酰胆碱(ISTD)。在无样品组合物的情况下通过脂肪酸的甲基酯进行校正；R^2：0.997-0.999。在TRIS缓冲液中制备质量控制化合物。

表12.多种病毒样颗粒样品中脂肪酸(单位μg/mL)的浓度和性质。鉴定到作为甲基酯的六种脂肪酸，即，棕榈酸(C16-0)、硬脂酸(C18-0)、花生酸(C20-0)、油酸(C18-1)、亚油酸(C18-2)和亚麻酸(C18-3)。硬脂酸和花生酸作为优化色谱条件下清晰解析的两种异构体的混合物被鉴定。

使用该分析技术，比较显示使用普通烟草产生的VLP的脂质双层具有小于0.5μg/mL的油酸含量，而本生烟草中的油酸含量是约2μg/mL。因此，本生烟草衍生的VLP中油酸的量至少是普通烟草VLP的4至5倍。

比较还显示使用普通烟草产生的VLP的脂质双层具有小于0.8μg/mL的花生酸含量，而本生烟草中的花生酸含量是约0.4μg/mL。因而，普通烟草衍生的VLP中花生的量至少比本生烟草VLP高2倍。

14.4 总植物甾醇

表13汇总了从根据本发明的多个普通烟草品种和本生烟草获得的病毒样颗粒中植物甾醇的浓度，如通过LC-APPCI-MS/MS所测量。

表13.各种病毒样颗粒样品中总植物甾醇的浓度(ng/ml)和百分数(％)，如通过LC-APPCI-MS/MS所测量。

这项分析显示胆固醇与谷固醇的比率是不同的。在普通烟草衍生的VLP中，胆固醇与谷固醇的比率是大致相同(即，约1.0)，而在本生烟草衍生的VLP中，该比率低得多，处于约0.3。

烟草衍生的病毒样颗粒的总脂肪酸

表14汇总了针对本发明的各种病毒样颗粒以及所述颗粒脂质:蛋白质比率，如使用各种技术测量并且在表14和表15中部分提出的磷脂和植物甾醇的结果。使用标准技术测量蛋白质含量。

实施例15：用于蛋白质表征的方法

这个实施例描述了用于结构性表征在本发明病毒样颗粒上展示的血凝素蛋白的几种方法。血凝素作为疫苗组合物中抗原的功能性依赖于几个结构特征。最重要的是血凝素H蛋白质折叠并装配成同型三聚体。功能性的另一个重要特征是蛋白质的N-糖基化模式，包括多种糖型。纳米级液相色谱偶联高分辨率-电喷雾质谱法或基质辅助激光解吸附电离-质谱法用来阐明所述血凝素蛋白的氨基酸序列和N-聚糖组成和糖型。

15.1 用于H5分析的样品组合物

为了溶液中的酶消化，将三氯乙酸、丙酮和0.1M甲醇氢氯酸(50:50，v/v)或甲醇二氯甲烷的混合物添加至50-100μL含有从本发明病毒样颗粒获得或提取的血凝素H5的溶液用于蛋白质沉淀。在蛋白质沉淀后，将样品离心2分钟并且将沉淀物溶解于50μL50mM碳酸氢铵缓冲液中。对于不进行蛋白质沉淀的样品组合物，将RapiGest(Waters，UK)添加至50-100μL的H5溶液。在添加RapiGest后，将溶液加热至100℃持续5分钟并且添加50μL50mM在50mM碳酸氢铵缓冲液中的二硫苏糖醇(DTT)溶液和25μL100mM在50mM碳酸氢铵缓冲液中的碘乙酰胺溶液用于还原和烷基化。通过添加5μL50mM在50mM碳酸氢铵缓冲液中的DTT溶液和额外80μL50mM碳酸氢铵缓冲液，终止烷基化。随后，添加2.3μL胰蛋白酶溶液(50mM碳酸氢铵缓冲液/乙腈80:20中20μg/mL)并且将混合物在37℃温育过夜。通过添加1μL甲酸终止胰蛋白酶消化。

15.2 借助LC-ESI-MS的肽质量指纹分析

从自动采样器小瓶，将5μL上样到HPLC柱(Advanced MaterialTechnology，Halo018，100mm x2.1mm，2.7μm)。液体色谱拆分用配备二元泵、脱气机、冷却孔板自动采样器和柱温箱的Agilent1100进行。将柱温箱设定至温度60℃。表15中给出用于LC分离的流速和梯度程序。为了检测分析物，使用高分辨率-质谱仪Thermo LTQ-FTUltra。使用阳性电喷雾电离(ESI)进行分析物的电离。以扫描模式进行分析并且扫描范围是300Da至2000Da。表16中给出质量分析器的仪器参数。

表15.用于肽质量指纹分析的梯度程序

表16.质量分析器设置

扫描	细节	检测	片段化	分辨率
					(1)	扫描(300-2000Da)	FTMS	-	50000
(2)	MS2最强烈(1)	FTMS	CID	12500
					(3)	MS2第二(1)	FTMS	CID	12500
(4)	MS2第三(1)	FTMS	CID	12500
					(5)	MS2最强烈(1)	FTMS	ECD	12500
(6)	MS2第二(1)	FTMS	ECD	12500
					(7)	MS2第三(1)	FTMS	ECD	12500

15.3 通过纳米-LC借助LC-MALDI-MS的肽质量指纹分析

将如上文制备的5μL样品上样到配备前置柱(NanoseparationsNS-MP-10 BioSphere 018，5μm，120A，360/100pm，L＝2cm)的纳米-HPLC柱(Nanoseparations NS-AC-10BioSphere018，5μm，120A，360/75μm，L＝10cm)。液相色谱分离用Bruker EASY-nLC II在室温进行。表17中给出用于纳米-LC分离的流速和梯度程序。10秒(即50nl)级分与α-氰基-4-羟基肉桂酸溶液在线混合并使用BrukerMALDI Spotterfc II点在锚芯片不锈钢MALDI靶(384MTP,800pm锚)上。

表17.用于纳米-LC的梯度程序

15.4 基质辅助激光解吸附/电离(MALDI)质谱法

为了检测分析物，使用MALDI质谱仪Bruker Ultraflextreme使用BrukerIll激光器(改良Nd/YAG激光器)以1kHz采集速率进行解吸附和电离。分析以正模式进行，扫描范围从700Da至4000Da。质量分析器以反射仪模式运行。能谱按MS模式以及按MS/MS模获得。在MS模式中，添加来自1次激光射击的2500个单谱并且在MS/MS模式中，添加来自1次激光射击的2000个单谱。

实施例16：证实蛋白质序列完整性。

这个实施例描述实验以证实如展示在根据本发明产生的病毒样颗粒的表面上的重组血凝素蛋白的序列完整性。在首先还原并烷基化蛋白质样品并随后用胰蛋白酶和Glu-C内切蛋白酶解消化之后，通过UPLC-Qtof-MSE和肽定位进行序列证实。

16.1 样品组合物

将蛋白质样品在20mM DTT(30分钟；56℃)中还原并由NanoSep10K Omega浓缩器超滤，所述蛋白质样品包含从本生烟草和普通烟草纯化的病毒样颗粒的血凝素H5。对于胰蛋白酶消化，在超滤后，将等分试样溶解于100mM Tris-HCl消化缓冲液(pH8.5)，并且将另一份等分试样在含2μg胰蛋白酶的100mM Tris-HCl(37℃，18小时)中处理。对于Glu-C消化，在超滤后，将等分试样溶解于50mM碳酸氢铵缓冲液(pH8.0)中，并且将另一份等分试样在含2μg内切蛋白酶Glu-C的50mM碳酸氢铵缓冲液(37℃，18小时)中处理。

16.2 本生烟草血凝素

在胰蛋白酶消化后，源自从本生烟草分离的病毒样颗粒的血凝素的序列覆盖率是99.1％。从总计552个氨基酸中鉴定到547个氨基酸并且未鉴定到与预期的信号肽氨基酸序列相对应的肽。对于胰蛋白酶消化，剩余的0.9％是根据不能通过这种方法检测到的胰蛋白酶切割特异性而检测不到的单氨基酸胰酶肽类。一级结构精确匹配来自印度尼西亚2005毒株(GenBank:ABP51969.1)的H5蛋白的氨基酸序列。肽测序还指示高效加工由未定位的序列MEKIVLLLAIVSLVKS组成的信号肽(本图中未显示)。还报道了一些产物相关的杂质，如天冬酰胺和谷氨酰胺残基的脱酰胺化以及甲硫氨酸残基的氧化。对第11、23、84、154、165和286位置处的天冬酰胺显示N-糖基化。

16.3 普通烟草血凝素

如从普通烟草Burley 21获得的血凝素H5的序列覆盖率是97.5％，对于普通烟草PM132，是95.7％，并且对于普通烟草PM204，是97.5％。全部三种血凝素的信号肽被正确地切割并且N末端和C末端均正确和如预期那样。对第11、23、84、154、165和286位置处的天冬酰胺观察到N-糖基化。

实施例17：病毒样颗粒上血凝素的N-糖基化模式

这个实施例描述了包含于本发明病毒样颗粒内部的血凝素蛋白N-糖基化模式。

17.1 样品组合物

从凝胶切下如从其相应分子量所确定并通过蛋白质印迹分析法证实的包含血凝素蛋白的SDS-PAGE凝胶条带，并将这些条带在25mMNH₄HCO₃中的30％乙腈内洗涤，通过在56℃用25mM NH₄HCO₃中的10mM DTT处理还原30分钟，并且在25mM NH₄HCO₃中的40mM碘乙酰胺内在室温烷基化20分钟。样品用胰蛋白酶消化过夜并且生成的肽用水中的50％乙腈5％甲酸提取。

17.2 反相-超高效液相色谱条件

柱：UPLC Acquity柱BEH C18；1.7μm；1.0x100mm；柱恒温器在40℃。系统A：水中的0.1％甲酸。系统B：乙腈中的0.1％甲酸。流速：70μL/分钟。上样：5μL。梯度：从0-25分钟2-40％系统B；从25-27分钟40-80％系统B；从27-28分钟80-98％系统B。

17.3 数据组成和处理

通过因高能量片段化而出现的特征性聚糖片段B-HexNAc(m/z＝204.09)的提取离子流色谱图确定糖肽的停留时间。根据聚糖片段的停留时间，将低能模式采集的扫描结果总结、置中并且通过最大熵III算法解卷积。使用GlycoWorkBench1.1软件(欧洲碳水化合物数据库计划)，使所产生的质量与聚糖数据库匹配。

17.4 烟草衍生的血凝素H5蛋白的N-糖基化位点

使用离子提取方法学鉴定并表征含N-聚糖的肽种类，通过UPLC-QTof-MS^E分析从本生烟草衍生和普通烟草衍生的病毒样颗粒分离并提取的血凝素H5，揭示存在六个N-糖基化位点(表18)。

表18.H5成熟蛋白主链上的天冬酰胺(Asn)位置、糖肽序列和N-糖基化模式(图中的解卷积模式)。N是N-糖基化的天冬酰胺残基。

选择在m/z＝204.09(B-HexNAc)与作为N-聚糖低聚糖结构的常见结构单元的N-乙酰葡糖胺残基的氧鎓离子对应的离子作为参照。图3(Asn-11)、图4(Asn-23)、图5(Asn-154)，6(Asn-165)、图7(Asn-286)和图8(Asn-484)中显示普通烟草Burley 21(H5-PM015)衍生、普通烟草PM132(H5-PM132)衍生、普通烟草PM204(H5-PM204)和本生烟草(H5-PM182)衍生的血凝素H5蛋白的6个N-糖基化位点各自的解卷积N-糖基化模式。

实施例18：血凝素的S-酰化

这个实施例描述了评估在本发明的病毒样颗粒根据上展示的血凝素的S-酰化的实验。分析血凝素H5从第524位至第568位氨基酸显的C端片段显示存在2条棕榈酰链。

18.1 化学品和耗材

水来自J.T.Baker(Deventer，荷兰)，氯仿、TFA和甲醇来自Fisher Scientific(Loughborough，UK)，Tris Ultra Quality和HCl来自Roth(卡尔斯鲁厄，德国)，乙腈来自VWR(Darmstadt，德国)，菠萝蛋白酶来自菠萝茎(Sigma-Aldrich，Steinheim，德国)，o-氰基-4-羟基肉桂酸(HCCA)来自Bruker Daltonik GmbH(Bremen，德国)，Nanosep离心装置来自PALL Life Sciences(Dreieich，德国)。

18.2 样品处理

血凝素H5病毒样颗粒在普通烟草PM132中根据本发明产生并且通过由蔗糖梯度分离以及用1％CHAPS处理以破坏颗粒。通过大小排阻层析在1％CHAPS存在的情况下在磷酸盐缓冲盐水中移除脂质。250μg量的样品溶解于pH7.4的Tris-HCI缓冲液中，并在37℃用大约3.8mg菠萝蛋白酶消化1小时。在甲醇/氯仿(4:1)中提取S-酰化肽片段。将含有肽片段的有机相与HCCA一起点在靶平板上并且通过MALDI-TOF-MS分析样品。

18.3 结果

菠萝蛋白酶消化产生了包括第524至568位氨基酸的连同3个潜在半胱氨酸酰化位点的C端血凝素H5片段(见表19)。在m/z5289.45处的主要信号是具有2条棕榈酰链的C端肽(图9；表19)。不存在与没有棕榈酰基(预期质量4813.791)、具有1或3个棕榈酰基或与硬脂酰和棕榈酰链任何组合的C端肽的相对应的信号(图9)。然而检测到其他的微小信号，这些信号提示菠萝蛋白酶的可变切割位点(图9；表19)。

表19.C端血凝素H5肽片段的氨基酸序列、酰化类型和计算的质量。PAL，棕榈酰。潜在半胱氨酸酰化位点以粗体标出。加下划线标出菠萝蛋白酶在赖氨酸(K)处的可变剪接。

实施例19：减少粒度

这个实施例描述了获得更均匀和更小颗粒的方法。这些方法可以随展示本发明血凝素的病毒样颗粒和如实施例29中所例举的多种脂质组成一起使用。

19.1 减少粒度的超声处理

超声处理如下用来获得更均匀和更小的颗粒：

1.添加0.001M荧光素至展示本发明血凝素的病毒样颗粒的样品和/或其与如实施例29中所例举的脂质和/或额外化合物的混合物以可视化脂质体的形成。

2.使用FS20D超声破碎器和每分钟60次声波爆的设置，在42℃超声处理30分钟。

3.将超声处理的材料敷设在包含45-60-70-80％蔗糖的蔗糖梯度上。基于样本容量选择梯度的体积。

4.在4℃以65,000g离心14小时。

5.收集通过UV可视化的荧光条带。

6.添加1体积包含1.5M NaCl、50mM MES，pH6.0和0.0005％Tween-80的透析缓冲液至样品并将样品置于透析管中以通过对过量的透析缓冲液透析而除去蔗糖。

7.检查280nm处的吸光度。

任选地，通过电子显微术分析浓度为大约0.5mg/mL的样品并且将Eppendorf Centricon MWCO10,000膜用来浓缩样品至大约一半收集的离心体积。

19.2 快速挤出

也可以通过依次经孔径从30至200nm的聚碳酸酯滤器挤出而获得按大小均匀分类的病毒样颗粒。滤器孔径可以是30、50、100或200nm。

实施例20：测量在小鼠中的免疫反应和功效

这个实施例描述用于测量小鼠中针对根据本发明产生的流感血凝素H5病毒样颗粒的免疫反应和进行这种免疫时针对流感病毒致死性感染的保护作用的方法。

20.1 测量内毒素和残余DNA

使用大肠杆菌0111:B4内对照，通过鲎阿米巴样细胞溶解物检验试剂盒(QCL-1000，Lonza，Wakersville，MD)确定内毒素。残余DNA通过PicoGreenH荧光染料测定法(Invitrogen)确定并且通过荧光测定法使用Lambda DNA作为标准物(Invitrogen)测量。

20.2 免疫和滴度测量

免疫研究和接种研究用6-8周龄雌性BALB/c小鼠(Charles RiverLaboratories)进行。这种免疫研究的非限制性例子是采用随机分成6组、每组5只动物的30只小鼠实验。任选地，可以增加或减少组的数目和每个组内动物的数目。免疫实验的非限制性例子涉及以两次给药方案免疫小鼠，第二次免疫是在第一次免疫后3周。任选地，免疫可以按三次给药方案进行，第二和第三次免疫分别在初次免疫和第一次加强免疫后3周。任选地，免疫可以作为单次剂量免疫进行。在非限制性例子中，使用以1:1比率配制在Alhydrogel2％中的0.1μg、1μg、5μg、12μg或20μg剂量(明矾，Accurate Chemical&ScientificCorporation，Westbury，NY，US)，通过在后腿用包含血凝素H5的纯化病毒样颗粒肌内施用，免疫未麻醉的小鼠。任选地，在具有或没有佐剂的情况下使用0.1μg、1μg、5μg、12μg或20μg剂量，通过用包含血凝素H5的纯化病毒样颗粒鼻内、皮下或经皮施用，免疫未麻醉的小鼠。作为对照，一组小鼠用5μg配制在明矾中并从ImmuneTechnology购买的重组血凝素H5免疫，并且一组小鼠用配制在明矾中的磷酸盐缓冲盐水免疫。在初次免疫和第二次免疫未麻醉的小鼠后14日采集外侧隐静脉血。通过以8000g离心10分钟收集血清并且如所述那样测量血清的血凝素滴度(Kendal等人，1982；WHO，2002)。灭活的A/印度尼西亚/5/05病毒(美国食品药品管理局，生物制品评估与研究中心，Rockville，MD，美国)可以用来检验小鼠血清样品的血凝素活性。血清用从霍乱弧菌(Vibrio cholerae)制备的受体破坏酶II(Accurate Chemical and Scientific Corporation的RDE II)预处理。血凝分析用0.5％火鸡红细胞进行。血凝素抗体滴度可以定义为导致完全抑制血凝集的最高稀释度的倒数。

20.3 小鼠中的致死性攻击

在非限制性例子中，使用随机分成5组每组8只小鼠的40只小鼠，用6-8周龄雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories)进行实验。任选地，可以使用不同的组数和每组小鼠数目。小鼠是用与0.5μg，2.5μg或7.5μg血凝素的剂量相对应的流感病毒样颗粒免疫并且将磷酸盐缓冲盐水用于第四对照组的小鼠。抗原可以用明矾以终浓度1％(v/v)配制。任选地，不使用佐剂和明矾。在非限制性例子中，小鼠在第0日和第14日肌内免疫并在第二次免疫后75日用一个LD₅₀剂量的活流感病毒(A/越南/1194/04；H5N1)鼻内攻击。在攻击后每日监测小鼠的行为变化，每2日测量体重，或如果动物显示疾病体征，每日测量体重。将体重下降25％的小鼠根据标准程序安乐死并且在14日时间范围内测量存活率。

实施例21：测量疫苗在雪貂中的功效

这个实施例描述了在雪貂中检验包含展示本发明血凝素的病毒样颗粒的流感疫苗功效的实验。雪貂非常易于遭受人流感病毒感染并广泛地用于流感研究。另外，雪貂形成在人类中见到的一些流感症状。

21.1 雪貂研究

将雄性Fitch雪貂去势、检查世系并且就呈现代表性循环型人流感A型毒株血清阴性进行分析。在实验开始时，雪貂为6-8月龄并且在0.8kg和1.6kg之间。将雪貂用包含本发明流感病毒样颗粒的组合物并且用相应剂量的0.7mg、1.8mg、3.7mg或11.0mg以明矾配制(AlhydrogelH；1mg/ml剂量)的血凝素H5蛋白在第0日和第21日肌内接种2次。作为对照，雪貂用含明矾的磷酸盐缓冲盐水溶液免疫。在非限制性例子中，在第21日第一次强化免疫后45日，将1.8mg或3.7mg接种剂量的每组8只动物和对照组的每组8只动物用致死剂量的流感病毒A/越南/1203/04(H5N1进化枝1病毒)鼻内攻击。致死剂量等同于10倍雪貂LD₅₀。在接种和攻击之间的时间期间每周以及在攻击时间期间每日监测雪貂的体重减轻、温度变化和活动性丧失。攻击后14日，将存活的雪貂安乐死。在攻击后3日处死每个组的三只攻击动物并且将肺和鼻甲组织收集、称重、在液氮中急冻以便稍后用于确定病毒滴度。将匀浆的样品连续稀释十倍并接种至活的10至11日龄胚化鸡卵中并且通过卵感染剂量₅₀(EID₅₀)测定法测量流感病毒滴度。使用Reed-Muench方法(Reed和Muench(1938)A simple method ofestimating fifty percent endpoints，将数据表述为log₁₀(EID₅₀/mL)。The Amer J of Hygeine27：493-497)。在第一次和第二次免疫之前以及在第二次免疫后14日，通过前腔大静脉采集麻醉雪貂的血液。血清以等分试样贮藏在-20℃直至使用。

21.2 评估免疫反应

血凝抑制分析如世界卫生组织所推荐那样进行(WHO/CDS/CSR/NCS/2002.5WHO动物流感诊断与监督手册)。灭活的病毒是H5N1毒株A/印度尼西亚/5/05、A/越南/1203/2004、A/安徽/01/2005或A/火鸡/土耳其/1/05。血清用受体破坏酶II(Denka SeikenCo.的RDE II，东京，日本)在37℃预处理过夜，添加磷酸盐缓冲盐水以获得1:8和1:10稀释度。将血清在V形底微量滴定平板中两倍连续稀释。将25μL测试病毒(2-8HAU/50μL)添加至每个孔并将平板在室温温育30分钟，之后添加0.5％马红细胞(Lampire Biologicals，Pipersville，PA)。平板是进一步在室温温育60至90分钟并且血凝素滴度定义为导致完全抑制血凝的最高稀释度的倒数。将血清转换定义为血凝素滴度从基线(≤8)至血凝素滴度ε32增加4倍。将血清保护作用定义为血凝素滴度≥40的受试者的比例。

实施例22：用于确定病毒样颗粒的脂质对蛋白质比率的方法

这个实施例描述了确定病毒样颗粒样品的总脂质对蛋白质比率的硫-磷酸-香兰素法。

22.1 硫-磷酸-香兰素法

含有10mM磷酸钠、150mM氯化钠，pH7.5的磷酸盐缓冲盐水来自Biorad(Biorad161-0780)。将0.6g香兰素(Sigma63118)溶解于10mL无水乙醇中，之后用纯化水补足至100mL。所产生的溶液随后与400mL浓H₂PO₄在下恒定搅拌混合以产生磷酸-香兰素。将磷酸-香兰素溶液在室温贮藏于深色瓶中。将油酸(Sigma01008)以10g/L溶解在无水乙醇中并在适宜的情况下进一步稀释。

22.2 确定脂质:蛋白质比率

通过添加1％(v/v)Triton X-100使浓缩的纯化病毒样颗粒破碎并且使用TissueLyzer II(Qiagen)在25℃均化30秒以使血凝素蛋白与脂类解离。添加0.4mL浓H₂SO₄至含有0.2mL待测试的蛋白质-脂质样品的试管。将该管在沸水浴中加热10分钟，随后冷却，并将0.4mL等分试样置于一支清洁干燥的管中。添加1mL磷酸-香兰素试剂至如使用Bradford法所测定的50μg样品。混合物随后在黑暗下温育45分钟并且在525nm波长处测量最终吸光度值。样品分析总是一式三份进行并且最终值作为均值报道。用200、100、50、10和0μg油酸产生标准曲线并且使用平板读数仪测定吸光度值。在病毒样颗粒纯化后马上测定脂质含量。

22.3 烟草衍生的病毒样颗粒的脂质:蛋白质比率

对于三个不同批次的本生烟草衍生的病毒样颗粒，使用硫-磷酸-香兰素试验检测到的脂质的量从130μg脂质变动至134μg脂质/50μg血凝素蛋白。所产生的蛋白质对脂质比率是0.37，标准偏差为0.05(表20)。

表20.从三个不同批次的本生烟草植物生物质获得的蛋白质对脂质比率。

如下表(表21)中所示，来自批次1和3的H5-VLP显示相似的结果，而来自批次2的H5-VLP显示十分低的总脂质的量和蛋白质的量，不过它们的比率仍是可接受的。

表21.三个批次的本生烟草病毒样颗粒的脂质和蛋白质含量

	脂质(μg/ml)	蛋白质(μg/ml)	脂质/蛋白质比率
				VLP1	5	24	0.2
VLP2	1.3	3	0.4
				VLP3	4.6	20	0.2

实施例23：用于改变病毒样颗粒的脂质组成的方法

基于脂质的粒子如脂质体、醇质体、传递体(transferosome)、胆汁酸体(bilosome)和免疫刺激复合物是高度免疫原性的并且可以用于皮下、鼻内、口腔粘膜或经皮施用。这个实施例描述用于变动或改变病毒样颗粒的脂质组成的方法。这类方法可以用来改变展示血凝素的本发明病毒样颗粒的内膜的脂质组成。通过这么做，可以改变这类粒子和结合的抗原的物理和/或免疫原特性。

23.1 脂质体

在非限制性例子中，可以通过脂质薄膜水化或脱水-再水化产生包含磷脂和胆固醇的脂质体。

23.2 阳离子脂质体

可以通过脂质薄膜水化或脱水-再水化产生包含磷脂和阳离子脂质例如DOTAP、DOTAP/DOPE、DOTMA、DOSPA、DOSPA/DOPE、DOTAP/胆固醇、DC/胆固醇或二甲基双十八烷基铵的阳离子脂质体。

23.3 ISCOM

可以通过透析、离心、脂质薄膜水化、乙醇注射或醚注射产生包含皂树(Quillaja)皂素、DC-胆固醇和磷脂的免疫刺激复合物。

23.4 PLUSCOM

可以通过脂质薄膜水化产生包含皂树皂素、DC-胆固醇和/或磷脂的阳离子笼样粒子。

23.5 传递体

可以通过脂质薄膜水化产生磷脂、胆酸钠、脱氧胆酸钠、山梨糖醇酐单月桂酯和/聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酯的传递体。

23.6 醇质体

可以通过脂质薄膜水化产生包含磷脂和大量乙醇(20-45％)的醇质体。

23.7 胆汁酸体

可以使用脂质薄膜水化产生包含非离子表面活性剂小泡和/或胆盐的胆汁酸体。

23.8 脂质植入物

可以使用脂质薄膜水化和冷冻干燥及压制，产生包含皂树皂素或咪喹莫特或α-半乳糖基脑苷脂、胆固醇或DC-胆固醇或磷脂的脂质植入物。

实施例24. 聚合病毒样颗粒

这个实施例描述了通过聚合在病毒样颗粒脂质双层平面中的组分增强本发明病毒样颗粒的稳定性的方法。

24.1 通过聚合稳定

将可聚合官能团(如但不限于丙烯酸基、苯乙烯基、乙炔基和二烯酰基)在本发明病毒样颗粒的脂质的头部区、链区或尾部区掺入。以这种方式，本发明的病毒样颗粒可以因聚合在病毒样颗粒脂质双层的表面处的反应性头部基团或因聚合磷脂尾中的反应基团而稳定。

实施例25 粒子的低温电子显微测量和原子力显微测量

这个例子公开了使用低温电子显微术和原子力显微术测量病毒样颗粒的形状、结构和均匀性的方法。高分辨率原子力显微术允许测量将病毒样颗粒束缚在一起的相互作用和稳定性及结构转变(例如因机械应力或pH变化所致)。

25.1 低温电子显微术

高分辨率低温电子显微镜(JEM-3200)用来研究病毒样颗粒的结构。使用Vitrobot浸没低温固定装置，将病毒样颗粒包埋于标本栅极上玻璃状冰的薄膜中。通过使用经设计在最小电子暴露量下记录辐射敏感性标本的高分辨率图像的低剂量方案观察标本。

25.2 原子力显微术

对于原子力显微术，将病毒样颗粒悬浮于含有25mM Hepes和150mM NaCl的缓冲液(pH7.5)。作为基板，使用新切割的高定向热解石墨(HOPG)。原子力显微镜可以是AA2000原子力显微镜或AA5000多功能扫描探测显微镜(SPM)系统装置(Angstrom AdvancedInc.,Braintree，美国)。

保藏：

以下种子样品在2011年1月6日依据布达佩斯条约的条款以菲利普莫里斯生产公司的名义保藏于NCIMB，Ferguson Building，Craibstone Estate，Bucksburn，阿伯丁AB219YA，苏格兰，英国：

PM种子品系名称	保藏日期	登录号
			PM016	2011年1月6日	NCIMB41798
PM021	2011年1月6日	NCIMB41799
			PM092	2011年1月6日	NCIMB41800
PM102	2011年1月6日	NCIMB41801
			PM132	2011年1月6日	NCIMB41802
PM204	2011年1月6日	NCIMB41803
			PM205	2011年1月6日	NCIMB41804
PM215	2011年1月6日	NCIMB41805
			PM216	2011年1月6日	NCIMB41806
PM217	2011年1月6日	NCIMB41807

PCT/RO/134表

Claims

1.一种从普通烟草(Nicotiana tabacum)植物获得的病毒样颗粒即VLP的组合物，其包含展示一种或多种流感抗原的VLP，其中所述VLP具有直径在40nm和250nm之间的平均粒度分布。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中VLP具有直径在50nm和200nm之间的平均粒度分布。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述VLP由包含脂肪酸和固醇组合的脂质双层组成。

4.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中VLP的脂质双层具有以下含量

a.小于0.5μg/mL的油酸；和/或

b.浓度在3.0μg/mL和5.0μg/mL之间的亚油酸和/或亚麻酸；和/或

c.大于0.75μg/mL的花生酸。

5.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中通过LC-APPCI-MS/MS测定时，VLP的脂质双层具有>1的胆固醇:谷固醇比率。

6.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中VLP显示出在0.30和0.45之间的脂质(脂肪酸和固醇)对蛋白质的质量比。

7.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中展示在VLP上的抗原是血凝素。

8.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中血凝素是流感A型血凝素或流感B型血凝素。

9.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中流感亚型A血凝素选自H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15和H16。

10.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中流感亚型A血凝素是H5亚型血凝素。

11.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中由病毒样颗粒展示的血凝素是

a.S-酰化的；

b.N-糖基化的；

c.S-酰化和N-糖基化的。

12.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中血凝素是SEQID NO:14所示的流感血凝素5多肽(H5)。

13.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中仅两个胞质半胱氨酸通过用棕榈酸酰化受到翻译后修饰。

14.一种组合物，以治疗有效量或免疫有效量包含如前述权利要求任一项中公开的展示一种或多种流感抗原的VLP，连同可药用载体。

15.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，包含佐剂。

16.根据权利要求14或权利要求15所述的组合物，用于施用所述组合物时在受试者中诱导免疫反应。

17.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，用于治疗或预防需要这种治疗的受试者中的流感病毒感染，特别是H5亚型流感病毒引起的流感病毒感染。

18.一种产生根据权利要求1-14任一项中所公开的VLP的方法，包括步骤：

i.提供普通烟草植物的选定品种、育种系或栽培品种和农杆菌物种选定菌株的组合，其中所述品种、育种系或栽培品种在所述品种、育种系或栽培品种的叶已经通过注射器用细胞密度OD₆₀₀为0.32的选定农杆菌菌株注射5日后显示出少于10％坏死、少于5％坏死、少于2％坏死、少于1％坏死；

ii.用OD₆₀₀在0.1和4.0之间的包含双元载体的农杆菌物种选定菌株的悬液浸润普通烟草植物的选定品种、育种系或栽培品种，所述双元载体包含一种或多种流感抗原的编码序列，所述编码序列处于普通烟草植物中有功能的调节元件控制下；

iii.将浸润的植株在允许可表达核苷酸序列在浸润的植株中表达和异源多肽积累的条件下孵育5日和20日之间的时间。

19.如权利要求18中公开的方法，还包括步骤：(i)纯化/净化和(ii)捕获VLP。

20.根据权利要求18和19中任一项所述的方法，其中所述双元载体是最小尺寸的双元载体，所述双元载体包含对于质粒在大肠杆菌(Escherichia coli)和农杆菌(Agrobacterium)细胞中维持和复制及转移T-DNA至烟草植物细胞必需的序列元件并且还包含T-DNA区域，并且其中必需序列元件占据整个最小尺寸双元载体的至少60％、65％、70％、75％、80％。

21.根据权利要求18至20中任一项所述的方法，其中流感抗原是流感血凝素或其免疫原性片段。

22.根据权利要求18-21中任一项所述的方法，其中所述双元载体包含植物选择标记基因。

23.根据权利要求18-22中任一项所述的方法，其中将浸润的植株温育7日和15日的时间。

24.根据权利要求18-22中任一项所述的方法，其中将浸润的植株温育在8日和10日之间的时间。