JP6092840B2 - 植物由来タンパク質を回収する方法 - Google Patents
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Description
本発明は、植物由来タンパク質を回収する方法に関する。より具体的には、本発明は、植物および植物組織から、タンパク質超構造体を含むタンパク質を得る方法を提供する。
大腸菌(E.coli)、昆虫細胞培養、および哺乳動物細胞培養などの宿主細胞における現在の組換え発現戦略は、培養培地中で、タンパク質を極めて高レベルに発現させ、分泌させる。これらの系を使って、高レベルな発現、適正なタンパク質フォールディングおよびタンパク質の翻訳後修飾が達成される。さらにまた、細胞内タンパク質は他の構成要素(DNA、小胞、膜、色素など)から容易に隔離することができるので、発現したタンパク質の精製が簡単になる。植物発現系または酵母発現系の場合は、細胞壁が、発現したタンパク質の培養培地への分泌を妨げる。
本発明は、植物由来タンパク質を回収する方法に関する。より具体的には、本発明は、植物および植物組織から、タンパク質またはタンパク質超構造体を回収する方法を提供する。
[表1]細胞壁弛緩用の市販酵素の非限定的な例
MAKNVAIFGLLFSLLLLVPSQIFAEE;配列番号10
を有するタンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド(PDI)、植物感染特異的(pathogenesis related)タンパク質(PRP;Szyperskiら,PNAS 95:2262−2262)、例えばタバコ植物感染特異的タンパク質2(PRP)、ヒトモノクローナル抗体シグナルペプチド(SP、またはリーダー配列)、またはそのタンパク質に関してネイティブな任意のシグナルペプチドなどがあるが、これらに限るわけではない。
VLPの生産に使用しうるコンストラクトは、米国仮特許出願第61/220,161号およびPCT/CA2010/000983(これらは出典明示により本明細書に組み込まれる)、WO2009/009876、WO2009/076778およびWO2010/003225(これらは全て出典明示により本明細書に組み込まれる)に記載されている。コンストラクトには、表2に列挙するものも含めることができる。これらのコンストラクトのアセンブリは、WO2009/009876、WO2009/076778、WO2010/003225およびUS61/220,161に記載されている。既知のHA(表2に記載するものを含むが、これらに限るわけではない)を含み、類似するまたは異なる調節要素およびプロモーターと組み合わされた、他のコンストラクトも、本明細書に記載するように、VLPの生産に使用しうる。
[表2]ヘマグルチニン生産に使用することができるコンストラクトの非限定的な例
このカセットのアセンブリは出典明示により本明細書に組み込まれるWO2009/009876, WO2009/076778およびWO2010/003325に記載されている。
植物における導入遺伝子の発現の制限には転写後遺伝子サイレンシング(PTGS)が関与する場合があり、導入遺伝子mRNAの特異的分解に対抗するために、ジャガイモウイルスY由来のサイレンシングのサプレッサー(HcPro)の共発現を使用することができる(Brignetiら,1998)。これに代わるサイレンシングのサプレッサーは、例えば限定するわけではないが、TEV−p1/HC−Pro(タバコエッチウイルス−p1/HC−Pro)、BYV−p21、トマトブッシースタントウイルスのp19(TBSV p19)、トマトクリンクルウイルスのキャプシドタンパク質(TCV−CP)、キュウリモザイクウイルスの2b;CMV−2b)、ジャガイモXウイルスのp25(PVX−p25)、ジャガイモウイルスMのp11(PVM−p11)、ジャガイモウイルスSのp11(PVS−p11)、ブルーベリースコーチウイルスのp16(BScV−p16)、カンキツトリステザウイルのp23(CTV−p23)、ブドウリーフロール病関連ウイルス−2のp24(GLRaV−2 p24)、ブドウウイルスAのp10(GVA−p10)、ブドウウイルスBのp14(GVB−p14)、ハナウド(Heracleum)潜伏ウイルスのp10(HLV−p10)、またはニンニク潜伏ウイルス(Garlic common latent virus)のp16(GCLV−p16)など、当技術分野ではよく知られており、本明細書において述べるように使用することができる(Chibaら,2006,Virology 346:7−14;これは出典明示により本明細書に組み込まれる)。それゆえに、植物内での高レベルなタンパク質生産をさらに確実にするために、サイレンシングのサプレッサー、例えば限定するわけではないが、HcPro、TEV −p1/HC−Pro、BYV−p21、TBSV p19、TCV−CP、CMV−2b、PVX−p25、PVM−p11、PVS−p11、BScV−p16、CTV−p23、GLRaV−2 p24、GBV−p14、HLV−p10、GCLV−p16またはGVA−p10を、目的のタンパク質をコードする核酸配列と一緒に共発現させることができる。
GTATTAGTAATTAGAATTTGGTGTC(配列番号11)
とsupP19−plasto.r
CCTTGTATAGCTCGTTCCATTTTCTCTCAAGATG(配列番号12)
とを使って、プラストシアニンプロモーターのセグメントを増幅した。これと並行して、Voinnetら(The Plant Journal 33:949−956(2003))に記載のコンストラクト35S:p19をテンプレートとして使用し、プライマーsupP19−1c
ATGGAACGAGCTATACAAGG(配列番号13)
とSupP19−SacI.r
AGTCGAGCTCTTACTCGCTTTCTTTTTCGAAG(配列番号14)
とを使って、p19のコード配列を含有するもう一つのフラグメントを増幅した。次に、増幅産物を混合し、プライマーPlasto−443cとSupP19−SacI.rとによる2ラウンド目の増幅(アセンブリング反応)のテンプレートとして使用した。その結果生じたフラグメントをBamHI(プラストシアニンプロモーター中)とSacI(p19コード配列の末端)とで消化し、前もって同じ制限酵素で消化しておいたコンストラクト番号660にクローニングすることで、コンストラクト番号R472を得た。これらのプラスミドを使用して、エレクトロポレーション(Mattanovichら,1989)により、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacteium tumefaciens)(AGL1;ATCC、米国バージニア州マナッサス20108)を形質転換した。全てのアグロバクテリウム・ツメファシエンス株の完全性を制限酵素マッピングによって確認した。R472(図11B)を含むアグロバクテリウム・ツメファシエンス株を「AGL1/R472」と名付けた。
市販のピートモス基質で満たした平箱においてベンセミアナタバコ(Nicotiana benthamiana)植物を種子から生長させた。植物は、温室において、16/8光周期および日中25℃/夜間20℃の温度レジーム下で生長させた。播種の3週間後に、個々の小植物を選定し、鉢に移植して、温室中、同じ環境条件下でさらに3週間生長させた。6週間後に、植物の平均重量は80g、高さは30cmである。
4、5、6、7および8日間のインキュベーション後に、植物の地上部分を収穫し、直ちに使用した。1%Triton X−100および0.004%メタ重亜硫酸ナトリウムを含有する3体積の冷50mM Tris(pH8.0)、0.15M NaCl中で植物組織をホモジナイズすることによって全可溶性タンパク質を抽出した。植物組織は、1体積の冷50mM Tris(pH8)、0.15M NaCl中で、POLYTRON(商標)を使用するか、乳鉢と乳棒で粉砕するか、またはCOMITROL(商標)を使って、機械的にホモジナイズした。COMITROL(商標)と共に使用した緩衝液は、0.04%メタ重亜硫酸ナトリウムも含有していた。ホモジナイゼーション後に、粉砕した植物材料のスラリーを、4℃、5,000gで、5分間遠心分離し、粗抽出物(上清)を分析のためにとっておいた。清澄化した粗抽出物の総タンパク質含量は、参照標準としてウシ血清アルブミンを使用するブラッドフォードアッセイ(Bio−Rad、カリフォルニア州ハーキュリーズ)によって決定した。
ベンサミアナタバコ植物から葉組織を収集し、〜1cm2の小片に切断した。葉小片を500mMマンニトールに室温(RT)で30分間浸漬した。次に、マンニトール溶液を除去し、プロトプラスト化溶液(500mMマンニトール、10mM CaCl2および5mM MES/KOH(pH5.6))中の酵素混合物(トリコデルマ・ビリデ(Trichoderma viride)由来のセルラーゼ(オノズカR−10;3%v/v)およびクモノスカビ(Rhizopus)属由来のペクチナーゼの混合物(マセロチーム(商標);0.75%v/v)(どちらもヤクルト薬品工業))と交換した。使用した比は、溶液100mLあたり葉小片20gである。この調製物を浅い容器(〜11×18cm)に均等に拡げ、40rpmおよび26℃のロータリーシェーカー上で16時間インキュベートした。
H5に関する血球凝集アッセイは、NayakおよびReichl(2004)に記載の方法に基づいた。簡単に述べると、試験試料の連続二倍希釈液(100μL)を、100μLのPBSが入っているV底96ウェルマイクロタイタープレートに作成し、各ウェルに100μLの希釈試料が残るようにした。100μlの0.25%シチメンチョウ赤血球懸濁液(Bio Link Inc.、ニューヨーク州シラキュース)を各ウェルに加え、プレートを室温で2時間インキュベートした。完全な血球凝集を示す最高希釈度の逆数を血球凝集活性として記録した。並行して、組換えHA5標準(A/Vietnam/1203/2004 H5N1)(Protein Science Corporation、コネティカット州メリデン)をPBSに希釈し、各プレート上で対照として処理した。
1%Triton X−100による処理とそれに続くTissue Lyser(商標)(Qiagen)での1分間の機械的撹拌によって破壊した精製ウイルス様粒子で、HA5標準を調製した。U底96ウェルマイクロタイタープレートを、4℃、16〜18時間において、50mM炭酸塩−重炭酸塩コーティング緩衝液(pH9.6)中の10μg/mLの捕捉抗体(Immune Technology Corporation、#IT−003−005I)でコーティングした。洗浄は全て0.1%Tween−20を含有する0.01M PBS(リン酸緩衝食塩水)(pH7.4)で行った。インキュベーション後に、プレートを3回洗浄し、37℃において1時間、PBS中の1%カゼインでブロッキングした。インキュベーション後に、プレートを3回洗浄し、37℃において1時間、PBS中の1%カゼインでブロッキングした。ブロッキングステップ後に、プレートを3回洗浄した。500〜50ng/mLの標準曲線を作成するために、HA5標準をモック抽出物(AGL1/R472のみを浸潤させた葉組織から調製したもの)に希釈した。定量するための試薬を1%Triton X−100中で処理してから、マイクロプレートにローディングした。プレートを37℃で1時間、さらにインキュベートした。洗浄後に、HA5に対するヒツジポリクローナル抗体(CBER/FDA)の1:1000希釈液を加え、プレートを37℃で1時間インキュベートした。洗浄後に、1:1000希釈したセイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲートウサギ抗ヒツジ抗体を加え、プレートを37℃で1時間インキュベートした。最後の洗浄後に、プレートをSureBlue TMBペルオキシダーゼ基質(KPL)と共に室温で20分間インキュベートした。1N HClの添加によって反応を停止させ、Multiskan Ascentプレートリーダー(Thermo Scientific)を使って、A450値を測定した。
本酵素抽出法から得られるHAの量および相対的活性を、一般的な機械的抽出法から得られるHAのものと比較した。ベンサミアナタバコ植物にAGL1/685を浸潤させ、5〜6日のインキュベーション期間後に、葉を収穫した。葉ホモジネートを次のように調製した:2gの葉をポリトロンホモジナイザーでホモジナイズし;4gの葉を乳鉢と乳棒で粉砕し;25kgの葉を、抽出緩衝液(50mM Tris、150mM NaCl、pH8.0、比1:1w/v)中、COMITROL(商標)プロセッサー(Urschel Laboratories)でホモジナイズした。酵素抽出は次のように行った:収穫した葉20グラムを、上述のマセロチームペクチナーゼおよびオノズカR−10セルラーゼによる消化に付した。消化後に、葉破片を濾過(ナイロンフィルター、250μmメッシュ)によって除去した。懸濁状態のプロトプラストを200×gでの遠心分離(15分)によって除去し、5000×gでの遠心分離(15分)によって上清をさらに清澄化した。
[表3]異なる機械的方法または酵素的方法によって生成した植物抽出物から回収されるHA−VLP。活性に基づく比較およびELISA比較のために、新鮮バイオマスの液体抽出の相対的体積に応じてデータを標準化した。Comitrol抽出を使って得られたタンパク質を100%とし、他の方法をこの値と比較した。
分画遠心分離とサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)とを併用して、本明細書に記載する酵素抽出法によって得られるHAが、VLPとして組織化されていることを実証した。ベンサミアナタバコ植物に、実施例1で述べたように、AGL1/685をアグロインフィルトレートした。実施例1で述べたように、浸潤の6日後に植物から葉を収集し、〜1cm2の小片に切断した後、消化し、粗濾過し、遠心分離した。
清澄化粗抽出物の総タンパク質含有量は、参照標準としてウシ血清アルブミンを使用するブラッドフォードアッセイ(Bio−Rad、カリフォルニア州ハーキュリーズ)によって決定した。SEC溶出物画分中に存在するタンパク質をアセトンで沈殿させ(Bollagら,1996)、それぞれSDS−PAGE分析用またはイムノブロット用に0.25体積または0.05体積の変性試料ローディング緩衝液(0.1M Tris pH6.8、0.05%ブロモフェノールブルー、12.5%グリセロール、4%SDSおよび5%ベータ−メルカプトエタノール)に再懸濁した。SDS−PAGEによる分離は還元条件下で行い、タンパク質染色にはクマシーブリリアントブルーR−250を使用した。
ベンサミアナタバコ植物に、実施例1で述べたように、AGL1/685をアグロインフィルトレートした。実施例1で述べたように、浸潤後6日目に葉を収集し、〜1cm2の小片に切断し、消化し、粗濾過し、遠心分離した。
ベンサミアナタバコ植物に、実施例1で述べたように、AGL1/685をアグロインフィルトレートした。浸潤後6日目に葉を収集し、〜1cm2の小片に切断し、オービタルシェーカーにおいて室温で15時間消化した。消化緩衝液は、1.0%(v/v)MultifectペクチナーゼFE、1.0%(v/v)Multifect CX CGおよび/または1.0%(v/v)Multifect CX B(いずれもGenencor製)を、それぞれ600mMマンニトール、75mMクエン酸塩、0.04%重亜硫酸ナトリウム(pH6.0)緩衝液中に含有し、1:2.5(w/v)のバイオマス:消化緩衝液比で使用した。
ベンサミアナタバコ植物に、実施例1で述べたように、目的のヘマグルチニン(H1/Cal WT、B/Flo、H5/IndoまたはH1/Cal X179A)を発現するコンストラクトを保有するアグロバクテリウムAGL1株をアグロインフィルトレートした。浸潤後6日目に葉を収集し、〜1cm2の小片に切断し、以下に注記する点以外は実施例4に従って消化した。濾過、遠心分離および清澄化は、実施例4で述べたように行った。
[表4]消化ステップへのNaClの添加が、HA−VLPの回収収量に及ぼす効果(血球凝集活性単位で測定;dil:希釈度の逆数)
[表5]消化ステップへのNaClの添加が清澄化ステップ後のHA−VLP回収収量に及ぼす効果(血球凝集活性単位によって測定)
ベンサミアナタバコ植物に、実施例1で述べたように、目的のヘマグルチニン(H5/Indo)を発現するコンストラクトを保有するアグロバクテリウムAGL1株をアグロインフィルトレートした。浸潤後6日目に葉を収集し、約1cm2の小片に切断し、消化緩衝液に500mM NaClを加えるか、500mM NaClと25mM EDTAとを加えて、実施例4で述べたように消化した。濾過、遠心分離および清澄化は実施例4で述べたように行った。
[表6]消化緩衝液への25mM EDTAの添加がH5−VLP調製物の緑色着色に及ぼす効果
ベンサミアナタバコ植物に、実施例1で述べたように、目的のヘマグルチニン(H5/Indo)を発現するコンストラクトを保有するアグロバクテリウムAGL1株をアグロインフィルトレートした。浸潤後6日目に葉を収集し、〜1cm2の小片に切断し、実施例4に従って消化した、ただし、消化緩衝液は、表7〜9に記すとおり、0%、0.25%、0.5%、0.75%または1%v/vのMultifectペクチナーゼFE、Multifect CX−CGセルラーゼおよびMultifect CX Bセルラーゼを含むように改変した。濾過、遠心分離および清澄化は、実施例4で述べたように行った。
[表7]ベンサミアナタバコ葉の消化によるH5/Indo VLPの放出。どの条件も多重に試験した。(血球凝集活性によって測定したHA−VLPの濃度、dil:希釈度の逆数)
[表8]ベンサミアナタバコ葉の消化によるH1/Cal WT VLPの放出。どの条件も多重に試験した。(血球凝集活性によって測定したHA−VLPの濃度、dil:希釈度の逆数)
[表9]ベンサミアナタバコ葉の消化によるH1/Cal WT VLPの放出。どの条件も多重に試験した。(血球凝集活性によって測定したHA−VLPの濃度、dil:希釈度の逆数)
消化中のpHの制御は、一部のVLPの抽出にとって極めて重要でありうる。消化ステップ中に起こる細胞壁の解重合が、適当な緩衝液の存在下で溶液を酸性化(すなわちpH6〜5)させうる酸性糖を放出しうること、および一部のVLP(例えばH3/BrisおよびB/Flo HAを含むもの)が温和な酸性条件に対して強い感受性を示していることを考慮して、そのような潜在的酸性化が生産されるVLPの収量に及ぼす影響を調べた。
[表10]B/Flo VLPの抽出収量に対する消化緩衝液組成の効果
[表11]H5/Indo VLPの抽出収量に対する消化緩衝液の初期pHの効果
[表12]B/Flo VLPの抽出収量に対するさまざまな消化緩衝液構成要素の効果
[表13]H3/Bris VLPの抽出収量に対する消化溶液中のマンニトールおよび重亜硫酸ナトリウムの濃度の効果
[表14]マンニトールの濃度が異なる緩衝液中で行われたバイオマスの消化によるH5/Indo VLPの放出
2マンニトールなし(試行1)およびマンニトール100mM(試行2)とマンニトール600mMとを対比してVLPの抽出収量を比較するために、2つの試行を行った。
本明細書に記載する植物バイオマスの酵素消化法は、多種多様なHA−VLPの抽出に応用できる可能性を有している。先の実施例で示したH5/Indo、H1/Cal WT VLP、H3/BrisおよびB/Floを含むHA−VLPの抽出に加えて、本明細書に記載の方法は、表15に示すように、季節性H1/BrisおよびH1/NCからのHA−VLPの抽出に適していることも示された。
[表15]アグロインフィルトレートされたベンサミアナタバコ葉の消化による季節性H1/BrisおよびH1/NC VLPの放出(血球凝集活性によって測定されたHAの濃度、dil:希釈度の逆数)。
C2B8発現カセット(コンストラクト番号595)のアセンブリ
C2B8は、非ホジキンリンパ腫(NHL)上に発現するB細胞特異的抗原CD20に対するキメラ(マウス/ヒト)モノクローナル抗体である。C2B8は、補体および抗体依存性細胞性細胞傷害を媒介し、インビトロで悪性B細胞株に対して直接的な抗増殖効果を有する(N Selenkoら,Leukemia,October 2001,15(10);1619−1626)。
p19タンパク質をコードするコンストラクトR472については上で説明した(「サイレンシングのサプレッサー」;図11B参照)。
ベンサミアナタバコ植物は、上述のように(「植物バイオマスの調製、接種材料、アグロインフィルトレーション、および収穫」)、温室において、16/8光周期および日中25℃/夜間20℃の温度レジーム下で生長させた。播種の3週間後に、個々の小植物を選定し、鉢に移植して、温室中、同じ環境条件下でさらに3週間生長させた。
インキュベーション後に、植物の地上部分を収穫し、直ちに使用した。家庭用ブレンダーにおいて、1.5体積の冷20mM NaPO4(pH6.0)、0.15M NaClおよび2mMメタ重亜硫酸ナトリウムで3分間、植物組織をホモジナイズすることによって、全可溶性タンパク質を抽出した。ホモジナイゼーション後に、大きな不溶性破片を除去するために、粉砕された植物材料のスラリーをMiraclothで濾過した。1M HClの添加によって抽出物のpHを4.8に調節し、非可溶性材料を、18000gで15分間(4℃)の遠心分離によって除去した。上清を集め、2MのTris塩基でpHを8.0に調節した。4℃、18000gで15分間の遠心分離によって不溶物を除去し、粗抽出物(上清)を集めた。清澄化粗抽出物のタンパク質含有量は、参照標準としてウシ血清アルブミンを使用するブラッドフォードアッセイ(Bio−Rad、カリフォルニア州ハーキュリーズ)によって決定した。
ベンサミアナタバコ植物から葉組織を収集し、〜1cm2の小片に切断した。葉小片を2.425体積の消化溶液(75mMクエン酸塩pH6.9、600mMマンニトール、1%MultifectペクチナーゼFE、1%Multifect CXG、1%Multifect B)に入れた。この調製物を浅い容器に均等に拡げ、120rpmおよび18℃のオービタルシェーカー上で16時間インキュベートした。インキュベーション後に、葉破片をナイロンフィルター(250μmメッシュ)での濾過によって除去した。抽出物を5000gで15分間(22℃)遠心分離し、上清を集め、0.65μmガラス繊維で濾過した。抽出物を0.5M Tris塩基でpH6.0に調節し、PESメンブレン0.45/0.22μmで濾過した。
タンパク質抽出物に硫酸アンモニウムをゆっくり加えて45%飽和にした。抽出物を60分間氷上に保ち、18000gで20分間(4℃)遠心分離した。上清を捨て、使用時までペレットを凍結保存(−80℃)した。
総タンパク質含有量は、参照標準としてウシ血清アルブミン(粗タンパク質抽出物用)または市販のリツキシマブ(Rituxan(登録商標)、Hoffmann−La Roche、カナダ国ミシソーガ)(精製抗体用)を使用するブラッドフォードアッセイ(Bio−Rad、カリフォルニア州ハーキュリーズ)によって決定した。クマシー染色SDS−PAGEはLaemmli(Nature 1970,227:680−685)に記述されているとおりに行った。
マルチウェルプレート(Immulon 2HB、ThermoLab System、マサチューセッツ州フランクリン)を、50mM炭酸塩緩衝液(pH9.6)中、4℃で、16〜18時間、2.0μg/mlのモノクローナルマウス抗ヒトIgG(Abcam、Ab9243)でコーティングした。次に、マルチウェルプレートを、リン酸緩衝食塩水(PBS)中の1%カゼイン(Pierce Biotechnology、イリノイ州ロックフォード)において、37℃で1時間インキュベートすることにより、ブロッキングした。リツキシマブ(Rituxan(登録商標)、Hoffmann−La Roche、カナダ国ミシソーガ)の希釈液を使って標準曲線を作成した。イムノアッセイを行う際は、マトリックス効果を排除するために、全ての希釈(対照および試料)を、モック接種材料(AGL1/R472のみ)を使って浸潤およびインキュベーションを行った植物組織から得られる植物抽出物で行った。プレートをタンパク質試料および標準曲線希釈液と共に37℃で1時間インキュベートした。PBS中の0.1%Tween−20(PBS−T)で3回洗浄した後、プレートをペルオキシダーゼコンジュゲートロバ抗ヒトIgG抗体(ブロッキング溶液中に1/4000希釈)(Jackson ImmunoResearch 709−035−149)と共に37℃で1時間インキュベートした。PBS−Tによる洗浄を繰り返し、プレートを、3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMB)Sure Blueペルオキシダーゼ基質(KPL、メリーランド州ゲイサーズバーグ)と共にインキュベートした。1N HClを加えることによって反応を停止させ、吸光度を450nmで読み取った。各試料を三重にアッセイし、濃度を標準曲線の直線部分に内挿した。
C2B8(Rituxan(商標);50μg)を含む試料を15%SDS/PAGEで分離した。重鎖および軽鎖をクマシーブルーで明らかにし、重鎖に対応するタンパク質バンドを切り出し、小さな断片に切断した。断片を0.1M NH4HCO3/CH3CN(1/1)の溶液600μLで3回、各15分間洗浄し、乾燥した。
C2B8抗体の抽出について酵素消化を機械的抽出と比較した。ベンサミアナタバコ植物にAGL1/595とAGL1/R472をアグロインフィルトレートした。6日間のインキュベーション後に、葉を収穫し、タンパク質を酵素消化または機械的抽出によって抽出した。抽出は2回行い、その結果生じた抽出物を、体積、タンパク質濃度および抗体(C2B8)含有量について比較した。結果を表16に示す。
[表16]細胞壁の機械的破壊(ブレンダー抽出)と酵素消化についての抽出収量の比較
C2B8抗体を、実施例10で述べたように、アフィニティークロマトグラフィーによって抽出物から精製した。機械的抽出または消化によって得られた抽出物から精製された産物を、そのタンパク質内容物に基づいて比較した。各抽出ロットから精製された抗体の電気泳動プロファイルを図12に示す。これらの結果は、ブレンダー抽出または細胞壁消化から精製された産物のプロファイルが類似していることを示している。
タンパク質のN−グリコシル化の本質は、N−X−S/T配列(ここで、Nはアスパラギンであり、Xはプロリンを除く任意のアミノ酸であり、S/Tはセリンまたはスレオニンである)を有する分泌タンパク質のアスパラギン上の複合型グリカン構造の付加にある。前駆体グリカンは、タンパク質の翻訳に際し、早期に、小胞体において付加され、それらが分泌経路を移行する間に、N−グリカンは成熟を起こす。小胞体(ER)中の高マンノース型N−グリカンから始まる植物におけるN−グリカン成熟には、グルコース残基の付加および除去、遠位にあるマンノースの除去、ならびにN−アセチルグルコサミン、キシロース、フコースおよびガラクトース残基の付加が含まれる。植物におけるN−グリカン成熟については、Gomordらが、「Post−translational modification of therapeutic proteins in plants」(Curr.Opin.Plant Biol. 2004,7:171−181)に記載している。N−グリコシル化経路の酵素は、分泌経路の各コンパートメント中の正確な場所、すなわち小胞体、シスゴルジ、中間ゴルジおよびトランスゴルジに配置されている。それゆえにタンパク質のN−グリコシル化パターンは、抽出の瞬間におけるその位置に依存して異なるであろう。本発明者らは、ベンサミアナタバコのアグロインフィルトレーションを使って生産された抗体が、アポプラストへのターゲティングにもかかわらず、一定の比率で高マンノース型の未熟N−グリカンを保持することを、以前に観察していた(Vezinaら,Plant Biotechnol.J. 2009 7:442−455)。同様の観察が、他でも報告されている(Sriramanら,Plant Biotechnol.J. 2004,2,279−287)。どちらの場合も、一定比率の抗体上に未熟N−グリカンが存在することは、抽出の瞬間に分泌経路の初期コンパートメント中に抗体が存在した結果と解釈された。
ベンサミアナタバコ植物に、実施例1で述べたように、目的のヘマグルチニン(H1/CA07)を発現するコンストラクトを保有するアグロバクテリウムAGL1株をアグロインフィルトレートした。浸潤後5日目に葉を収集し、〜1cm2の小片に切断し、実施例4に従って、75mMクエン酸塩、500mM NaCl(pH6.1)緩衝液を使用し、0、25、100または250mM EDTAを含むように改変を加えて、消化した。細胞破片の粗濾過および遠心分離は実施例4で述べたように行った。この遠心分離からの上清を、タンパク質濃度および血球凝集活性について試験した。植物を、タンパク質の放出に対するEDTAの効果を例証するために、実施例4で述べたように、消化酵素ありまたは消化酵素なしで処理した。消化緩衝液に添加した酵素が約0.8mg/mlを占めることに注目すべきである。図15は、植物にEDTAを添加すると、酵素なしで、アポプラストからタンパク質を抽出することができ、それがH1 VLPを含有することを示している。
ベンサミアナタバコ植物に、実施例1で述べたように、目的のヘマグルチニン(H1/CA07)を発現するコンストラクトを保有するアグロバクテリウムAGL1株をアグロインフィルトレートした。浸潤後5日目に葉を収集し、〜1cm2の小片に切断し、実施例4に従って消化した。対照消化緩衝液は、1.0%(v/v)MultifectペクチナーゼFE、1.0%(v/v)Multifect CX CGおよび/または1.0%(v/v)Multifect CX B(いずれもGenencor製)を、それぞれ600mMマンニトール、75mMクエン酸塩、25mM EDTA、0.04%重亜硫酸ナトリウム(pH6.0)緩衝液の溶液中に含有し、1:2.5(w/v)のバイオマス:消化緩衝液比で使用した。同じ消化緩衝液中に3%MultifectペクチナーゼFE(v/v)を含有する比較消化を行った。細胞破片の粗濾過および遠心分離は実施例4で述べたとおりとした。この遠心分離からの上清をタンパク質濃度および血球凝集活性について調べた。表17は、ペクチナーゼ構成要素がタンパク質およびHA VLPの放出を可能にすることを示している。
[表17]
酵素浸潤は全葉からのVLP放出を増加させうる。このアプローチを検討するために、減圧下または加圧下で細胞壁弛緩組成物を浸潤させた葉からVLPを抽出した。
植物に、実施例1で述べたように、AGL1/#685をアグロインフィルトレートした。葉組織は、ベンサミアナタバコ植物から、浸潤後5日目または7日目に収集した。全植物体および/または全葉を、600mMマンニトール、75mMクエン酸塩、0.04%重亜硫酸ナトリウム(pH6.0)緩衝液中に1つ以上のペクチナーゼ(1%〜4%(v/v)のBiocatalyst 162L、1%〜4%(v/v)のBiocatalysts 444L、またはそれぞれ1%〜4%(v/v)のそれらの組み合わせ、1%〜4%(v/v)のBiocatalysts PDN33を含む酵素溶液に、比が1:2.5(w/v)の新鮮バイオマス:消化緩衝液を使って、浸漬するか、または浸潤(アグロインフィルトレーションについて上述したものと同様の条件を使用;「植物バイオマスの調製、接種材料、アグロインフィルトレーション、および収穫」参照)に付した。全植物体または全葉を、600mMマンニトール、75mMクエン酸塩、0.04%重亜硫酸ナトリウム(pH6.0)緩衝液中にペクチナーゼ(1%〜4%(v/v)のBiocatalyst 162Lおよび1%〜4%(v/v)のBiocatalysts 444L)およびセルラーゼ(Multifect CX CGおよび/またはMultifect CX B(Genencor)、それぞれ1%〜4%(v/v))を含む酵素溶液でも、比が1:2.5(w/v)の新鮮バイオマス:消化緩衝液を使って、浸漬または浸潤させた。ある例では、Biocatalyst 162Lを1%になるように加え、Biocatalyst 44Lを4%444Lになるように加えたが、消化期間に応じてこれらのパーセンテージを変更しうることは、当業者には理解されるであろう。ペクチナーゼ活性が高いほど、消化期間は短い。また当業者には、この手法のペクチン分解要件が満たされる限り、当技術分野で知られる広範囲にわたる酵素を使用しうることも理解される。緩衝液は5.0〜6.5のpHまたはその間の任意の量に調節して、消化の継続期間中はそのままにしておくか、または緩衝溶液の添加によって初期値(すなわち5.0〜6.5の範囲またはその間の任意の量)が保たれるようにpHを調節することができる。さらにまた、場合によっては、緩衝液に、さまざまな酸化防止剤、例えばメタ重亜硫酸塩などを補足してもよい。酵素溶液からの酵素は、減圧浸潤または加圧浸潤によって全植物体または全葉に浸潤させる。
Claims (22)
- 植物または植物質から超構造体タンパク質またはウイルス様粒子(VLP)を回収する方法であって、
a.アポプラスト局在性VLPまたは75〜1500kDaの分子量を有するアポプラスト局在性超構造体タンパク質を含む植物または植物質を取得すること、
b.細胞壁が弛緩するように植物または植物質を20〜250mM EDTAまたはEGTAを含む組成物で処理して、弛緩した細胞壁を有する植物または植物質を生産し、それによって、アポプラスト局在性超構造体タンパク質またはアポプラスト局在性VLPを放出して植物インキュベーション混合物を生産し、植物インキュベーション混合物を分離して植物細胞画分およびアポプラスト画分を生産すること、および
c.アポプラスト画分から超構造体タンパク質またはVLPを回収すること
を含む方法。 - 処理ステップ(ステップb)がソニケーションをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 処理ステップ(ステップb)において組成物が酵素混合物をさらに含む、請求項1に記載の方法であって、酵素混合物を酵素浸潤によって植物または植物質に導入して、弛緩した細胞壁を有する植物または植物質を生産するものである、方法。
- 処理ステップ(ステップb)が繰り返される、請求項1に記載の方法。
- 酵素浸潤が減圧浸潤または加圧浸潤の群から選択される、請求項3に記載の方法。
- 酵素混合物が、1つもしくは2つ以上のペクチナーゼ、1つもしくは2つ以上のセルラーゼ、または1つもしくは2つ以上のペクチナーゼと1つもしくは2つ以上のセルラーゼを含む、請求項3に記載の方法。
- 組成物が、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)を含む、請求項1に記載の方法。
- 組成物が、リパーゼ、プロテアーゼまたはペクチナーゼの1つ以上を含まない、請求項3に記載の方法。
- 取得ステップ(ステップa)において、植物が、タンパク質、タンパク質ロゼット、タンパク質複合体、プロテアソーム、メタボロン、転写複合体、組換え複合体、光合成複合体、膜輸送複合体、核膜孔複合体、タンパク質ナノ粒子、糖タンパク質、抗体、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、一本鎖モノクローナル抗体、ウイルス様粒子、ウイルスエンベロープタンパク質、ウイルス構造タンパク質、ウイルスキャプシドタンパク質、およびウイルスコートタンパク質、キメラタンパク質、キメラタンパク質複合体、キメラタンパク質ナノ粒子、キメラ糖タンパク質、キメラ抗体、キメラモノクローナル抗体、キメラ一本鎖モノクローナル抗体、およびキメラヘマグルチニンの群から選択されるタンパク質または超構造体タンパク質をコードする核酸配列で形質転換され、植物または植物質が収穫される、請求項1に記載の方法。
- 核酸が一過性に植物に導入される、請求項9に記載の方法。
- 核酸が植物のゲノム内に安定に組み込まれる、請求項9に記載の方法。
- 取得ステップ(ステップa)において、植物を生長させ、植物または植物質が収穫される、請求項1に記載の方法。
- 核酸がモノクローナル抗体またはインフルエンザヘマグルチニンをコードする、請求項9に記載の方法。
- 超構造体タンパク質がノイラミニダーゼもMタンパク質も含まない、請求項1に記載の方法。
- 植物質が葉および培養植物細胞の群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 植物質が全葉を含む、請求項1に記載の方法。
- d)アポプラスト画分から超構造体タンパク質またはVLPを精製するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- d)精製ステップが、深層濾過を使ってアポプラスト画分を濾過することで、清澄化抽出物を生産し、次にサイズ排除クロマトグラフィー、陽イオン交換樹脂もしくはアフィニティークロマトグラフィー、またはそれらの組み合わせを使って清澄化抽出物のクロマトグラフィーを行うことを含む、請求項17に記載の方法。
- 処理ステップ(ステップb)において、分離が、遠心分離、深層濾過、またはそれらの組み合わせによって行われる、請求項1に記載の方法。
- 酵素浸潤が中性pHで行われる、請求項3に記載の方法。
- 1つもしくは2つ以上のペクチナーゼの濃度が0.01%(v/v)〜2.5%(v/v)である、請求項6に記載の方法。
- 1つもしくは2つ以上のセルラーゼの濃度が0.1%(w/v)〜5%(w/v)である、請求項6に記載の方法。
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