CN1305531A - 用于一步法纯化方法的表达载体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种可以通过单一步骤纯化方法而得到应用的表达载体。重组蛋白质以一种与凝集素,特别是与作为纯化的标记的盘基蛋白,融合的蛋白质形式产生。此融合蛋白质可以在Sepharose 4B层析柱上使用半乳糖作为洗脱液被纯化。

Description

用于一步法纯化方法的表达载体
本发明涉及一种可以用于多肽生产中一种新颖的纯化方法的表达载体。
对于低成本生产相关蛋白质来说，提高在特定宿主中重组蛋白质的表达水平以及简化下游操作步骤十分重要。出于此种目的，除了其它的原则外，基于亲和纯化的特异性肽标记的存在(Smith和Pidgeon，美国专利4,569,794；Sharma，美国专利5,594,115；Romanos等人，1995；Kim和Raines,1993；Kroll等人，1993；Smith和Johnson,1988)、重组蛋白质的检测和/或稳定性(Riggs，美国专利4,366,246；LaVallie等人，1993)，已经设计出新的表达载体和纯化方法。这些标记通常可以通过蛋白质水解或化学裂解除去(Hopp等人，美国专利4,782,137；Beghdadi等人，1998)，因而可以允许产生不含有任何多余氨基酸的重组多肽。
以肽标记为基础的已知方法的主要缺点是要使用用于亲和纯化的特殊树脂，这种树脂使得大规模纯化难以进行并且导致高的生产成本。而且，以金属离子为基础的技术可以导致蛋白质的某些残基改变，而在其它情况下，洗脱剂和方法能够影响纯化蛋白质的催化活性。
因而，本发明的目的就是提供一种新的表达系统，它可以通过低成本树脂生产且进行简便高效的多肽纯化。更特定的，本发明的目的是提供一种能够在Sepharose 4B这种已应用于大规模纯化过程的低成本树脂上纯化的表达系统。
根据本发明，通过一种用于产生重组多肽的表达构建体来达到上述目的，这种构建体包含一种至少由下述有效地连接的元件组成的表达盒：
a)启动子；
b)编码一种凝集素结合蛋白质的DNA编码区，尤其是编码盘基蛋白(discoidin)蛋白质家族的成员的DNA编码区，作为纯化标记序列；
c)用于接收要生产的重组多肽之编码区的克隆位点，以及
d)转录终止信号。
为了实际的使用，构建体优选地包含于表达载体中，例如适于转化所期望的宿主的质粒。
在产生本发明的研究中，通过盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum)表达载体(在Fasel和Reymond，美国专利5,736,358中作为实施例进行了描述)探讨了使用盘基蛋白Ⅰ(一种在盘基网柄菌中的受发育调节的凝集素)作为用于生产和纯化重组蛋白质的标记的可能性。而且，添加信号肽可以用于介导表达的蛋白质重新回到内质网，从而允许进行二级修饰和分泌。(Reymond等人，1995)。
盘基蛋白由一个受发育调节的多基因家族编码(Pools和Firtel,1984；Rowekamp等人，1980；Tsang等人，1981)。在盘基网柄菌中，已描述了两种类型的盘基蛋白：Ⅰ和Ⅱ。这两者都是四聚体蛋白质，可以根据其亚基分子量(2528kDa范围)、等电点和肽图谱(Frazier等人，1975)加以区分。在盘基网柄菌中已鉴定出编码盘基蛋白Ⅱ的一个单基因，并且已经证实盘基蛋白Ⅰ参与细胞聚集过程中的细胞-基底间粘附和有序细胞迁移。但是这种活性似乎依赖于盘基蛋白Ⅰ的纤维结合素样细胞结合位点(Springer等人，1984)。虽然大多数盘基蛋白聚集在细胞内，但是有一定数量的盘基蛋白可以通过可能包括于多片层体中(Barondes等人，1985)的某种未知途径进行分泌。虽然盘基蛋白的序列中存在几个潜在的N-糖基化位点，但是，它们不包含任何ER转位信号，因而这些蛋白质不能经由通常的途径外泌和被糖基化。
根据本发明，发现可以通过使用Sepharose 4B亲和层析和N-乙酰半乳糖胺偶联的琼脂糖，将盘基蛋白的凝集素样、半乳糖基结合活性用于纯化包含盘基蛋白和待表达多肽的融合蛋白质，产生了用于重组蛋白质表达和纯化的综合系统。
本发明的一个特别的优点是使用半乳糖进行洗脱，此溶剂不会与蛋白质的主要部分相互作用和/或对其进行修饰。另一个优点是盘基蛋白本身是无毒的，可以使用特定的抗体容易地检测。而且，当目的蛋白质作为与盘基蛋白融合的融合蛋白质进行表达时，目的蛋白质的产量水平会提高。最后，似乎来自大肠杆菌、哺乳动物细胞、或网柄菌属的蛋白质除盘基蛋白以外没有一种可以特异性的结合Sepharose并可通过半乳糖将其释放，因而，可以减少纯化样品中污染物的水平。
在本发明的表达载体中纯化标记序列可以位于例如克隆位点的上游和启动子的下游。放置纯化标记的一个替代位置是位于目的蛋白质克隆位点之后。在上述两种情况下，目的蛋白质与纯化标记的融合可以允许通过特定的树脂进行纯化。
为了将要表达的多肽和标记容易地分离，一个裂解位点优选的位于目的蛋白质克隆位点和纯化标记之间。裂解位点可以是例如凝血酶裂解位点。其他可能的位点是因子X，或化学裂解位点，尤其是溴化氢裂解位点。凝血酶裂解位点包含一个编码氨基酸序列LVPRGSDP的DNA序列。
由于盘基蛋白本身不含有信号序列，因而不能自主定位于特定的细胞区室。因而在某些实施方案中表达载体可以进一步包含编码用于将待表达的多肽定位于特定细胞区室的信号肽的序列。这种信号序列通常位于启动子下游，目的蛋白质序列与纯化标记融合子的上游。有利的，用于定位的信号肽是将多肽定位于内质网的信号肽，例如来自前孢子抗原(PsA)蛋白的21个氨基酸前导肽。其具有优点是因为待产生的多肽可以随后被糖基化和分泌。
在本发明的第一个实施方案中，构成纯化标记序列的盘基蛋白是盘基蛋白Ⅰ，另一个合适的盘基蛋白是盘基蛋白Ⅱ，或任何其它具有结合半乳糖多聚体能力的凝集素结合蛋白。
根据本发明另一方面的特征，本发明涉及产生多肽的方法，其包括：
a)通过将多肽的编码序列克隆入本发明表达载体的克隆位点，制备要生产的多肽的表达载体；
b)使用上述方法获得的表达载体转化适当的宿主细胞；
c)在适当的条件下培养宿主细胞，使其允许纯化标记氨基酸序列和与其共价连接的要表达的多肽的氨基酸序列所组成的融合多肽表达；
d)通过纯化标记的氨基酸序列将存在于宿主细胞或培养液中的融合多肽与多糖基质结合，然后从基质上将融合多肽洗脱下来，从宿主细胞或其培养液中分离融合多肽；及
e)除去纯化标记的氨基酸序列。
如果载体包含裂解位点，那么可以通过裂解位点将融合多肽中纯化标记的氨基酸序列裂解，除去纯化标记。
在盘基蛋白Ⅰ的情况中，多糖基质优选Sepharose 4B的球形材料，因为此材料廉价并且主要纯化盘基蛋白Ⅰ和盘基蛋白Ⅱ。洗脱可以优选用半乳糖进行。偶联有N-乙酰半乳糖胺基团的琼脂糖基质是第二步中特别合适的基质，因为它对于盘基蛋白Ⅰ较之与盘基蛋白Ⅱ有更大的亲和力。
本发明进一步涉及通过上述方法得到的新融合多肽，以及这些融合多肽在重组多肽的生产中的应用。
在本申请中使用的术语“启动子”意在包含位于多肽编码序列起始位点5’上游的顺式作用DNA序列，RNA聚合酶可以与这一DNA序列结合并且启动正确转录，可选的，还可以包含增强子。
“融合蛋白”指的是盘基蛋白氨基酸序列与要表达的多肽氨基酸序列的组合。
术语“盘基蛋白”意在涉及对半乳糖多聚体具有亲和力的凝集素结合蛋白质。
所使用的其它所有术语具有本领域公认的含义，例如Gunter Kahl，VCH,Weinheim，德国(1995)出版的“基因技术词典”中所列的含义。
下述是本说明书中使用的缩略语：
ER：内质网
CS：疟原虫环子孢子蛋白
DisPf150,Dis-PfCter,Dis-PyCter：含有盘基蛋白Ⅰα氨基末端标记以及分别含有恶性疟原虫(P.falciparum)CS的Leu19-Cys382或Lys282-Cys382残基或是尤氏疟原虫(P.yoelii)CS的Asn277-Ser345残基的融合蛋白质。SP-Dis-PyCter，是指携带氨基末端ER转位信号的Dis-PyCter。
TCA：三氯乙酸
PBS：磷酸缓冲盐液
mAB：单克隆抗体
本发明将在下述实施例中进一步阐述，其中作为模式系统描述了来源于恶性疟原虫(Pf)和尤氏疟原虫(Py)的多种形式的环子孢子蛋白(CSP)作为盘基蛋白Ⅰ融合蛋白的表达和纯化。很清楚，这一系统同样适用于重组表达的所有其它任何多肽。这些实施例是不具有限制性的，盘基蛋白融合蛋白也可以在其它宿主中进行表达，例如大肠杆菌、酵母、bacculo病毒或哺乳动物。而且，盘基蛋白的半乳糖结合部分或整个盘基蛋白也可能通过化学合成并加到目的多肽上。
在实施例中参考了下述各图：图1：Dis-标记的融合蛋白质图谱
用肌动蛋白6启动子替代盘基蛋白启动子来修饰盘基网柄菌转化载体pEDⅡ CS150。整个盘基蛋白Ⅰ编码区通过PCR进行扩增，同时加入编码凝血酶裂解共有序列位点的下游序列。将PCR产物符合读框地插入CS编码区。Dis-PyCter和Dis-PfCter的获得是通过如材料和方法部分中所述，分别用来源于尤氏疟原虫和恶性疟原虫CSP基因的PCR扩增产物替代BamHⅠ/SacⅠ Pf150片段而实现的。通过用含有肌动蛋白15启动子和其后的盘基网柄菌PsA信号肽编码序列的PCR产物替代肌动蛋白6启动子，可以从Dis-PyCter中衍生出SP-Dis-PyCter。(74-229)Dis-Pf150是通过用编码74-229残基的PCR产物替代盘基蛋白编码区序列来建的。图2：Dis-PfCter的表达和亲和纯化
约4×108Dis-PfCter表达细胞的可溶性提取物如材料和方法部分所述，用1mlSepharose 4B柱进行层析。结合的蛋白质用0.3M的半乳糖TBS溶液洗脱，收集到0.7ml洗脱级分。
A．使用针对PfCter羧基末端的小鼠多克隆抗体进行Western印迹分析。这些抗体的特异性通过分析来源于DP4对照细胞的可溶级分得到验证(泳道1)。泳道2-7显示的是Dis-PfCter纯化级分；泳道2是可溶性提取物；泳道3是非保留部分；泳道4-7是用0.3M半乳糖洗脱的级分1-4。
B和C．分别是Dis-PfCter和DP4级分的考马斯蓝凝胶染色/卑斯麦棕凝胶染色的结果。泳道1显示的是可溶性级分；泳道2为流出部分；泳道3-6为用0.3M半乳糖洗脱的级分1-4。
箭头显示大约44kDa的重组蛋白质的位置。每一个总的和流出样品的上样量都是约15μg蛋白质。对于半乳糖洗脱级分，每一泳道的上样量是相应级分体积的五十分之一。图3Dis-PyCter的表达和亲和纯化
A．使用J-Ⅲ小鼠多克隆抗体(见材料与方法)对Dis-PyCter级分进行Western印迹分析。可溶性细胞提取物如图2所述进行纯化。泳道1显示的是可溶性级分；泳道2为流出级分；泳道3-4是用0.3M半乳糖洗脱的级分2-3。泳道5所示的是如何用平行的来源于DP4对照细胞的可溶性提取物对抗体的特异性进行鉴定。
B和C．分别含有Dis-PyCter(B)和DP4(C)Sepharose纯化级分12％凝胶的考马斯蓝染色结果。泳道1显示的是可溶性级分；泳道2-4为半乳糖洗脱级分2-4。
箭头显示的是大约35kDa的重组蛋白质的位置。图4Dis-Pf150的表达和亲和纯化
A．如图2所描述使用Sepharose层析进行可溶性细胞提取物的纯化。在用10％的胶分离样品后，使用SP3E9小鼠(参见材料与方法)对Dis-Pf150进行Western印迹分析。泳道1显示的是可溶性级分；泳道2为非保留蛋白质；泳道3-4分别为0.3M半乳糖洗脱级分2-3；泳道5显示的是如何使用平行的DP4提取物进行分析以鉴定抗体的特异性。
B．Dis-Pf150和(74-229)Dis-Pf150细胞在HL5中生长至约5×106细胞/ml的密度。在约500g离心后两种细胞沉淀(C)的相同等份和培养基上清(M)用SDSPAGE电泳分离，CSP如A中所述使用Western印迹进行检测。
C．(74-229)Dis-Pf150可溶性细胞提取物如图2中所述进行处理，如A中所述进行Western印迹分析。泳道1显示的是可溶性级分；泳道2为非保留蛋白质；泳道3-6为0.3M半乳糖洗脱级分1-4。
箭头显示的是大约84kDa的重组蛋白质的位置。每一个总的和流出样品的上样量都是约15μg蛋白质。图5SP-Dis-PyCter的糖基化
按照产品制造商说明SP-Dis-PyCter(泳道a和b)和Dis-PyCter(泳道c和d)的裂解物用反应缓冲液(K)或PN-聚糖酶F(G)(泳道2和4)(泳道1和3)进行处理。37℃孵育1小时后，加入4×Laemmli样品缓冲液以终止反应，PyCter使用12.5％的凝胶进行SDS-PAGE电泳分析，并使用J-Ⅲ小鼠血清进行Western印迹分析。图6Dis-PyCter的凝血酶裂解
SP-Dis-PyCter表达细胞用材料与方法中所述方法进行裂解，只是裂解缓冲液中不含蛋白酶抑制剂。提取物在如所示的不断增加浓度的凝血酶(单位/毫升)下于25℃孵育。然后如图5所述对PyCter进行检测。实施例导言
本实施例描述允许在盘基网柄菌中生产融合蛋白质的新表达载体的构建。利用盘基蛋白Ⅰ能够与Sepharose-4B结合的能力建立几乎是单一步骤的纯化方法。盘基蛋白Ⅰ编码区域与网柄菌属表达载体中的疟疾寄生虫CSP基因的几种形式相融合，这一载体允许在细胞内聚积，以及融合蛋白质经由与内质网和高尔基体无关的途径部分分泌。存在于细胞提取物中的融合蛋白质用Sepharose 4B柱进行亲和纯化。信号肽的加入可以允许融合蛋白质进行内质网定位和糖基化。含有凝血酶裂解位点可以允许从CSP蛋白质中裂解出盘基蛋白。使用稳定的和低成本的Sepharose4B作为亲和基质可以允许进行大规模的制备。材料与方法1．试剂
硝酸纤维素膜Schleicher&Schuell(Dassel，德国)生产。ECL-western印迹试剂购自Amersham公司。
Sepharose 4B为法玛西亚(Uppsala，瑞典)生产。D(+)半乳糖、过氧化物酶偶联的蛋白A、衣霉素和人凝血酶购自Sigma公司(圣路易斯，MO)。肽：N-糖苷酶F(PNGase F)购自新英格兰生物实验室(贝弗里，MA)，蛋白酶抑制剂为宝灵曼(Mannheim，德国)生产。
过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠免疫球蛋白来自Nordic免疫学实验室(提尔堡，荷兰)。针对(NANP)3重复序列的免疫球蛋白从SP3E9杂交瘤细胞(Boulanger等人，1988)中纯化得到。
小鼠血清Ⅳ-4是针对含有恶性疟原虫CSP羧基末端区282-382氨基酸的合成肽的抗血清(Roggero等人，1995)。
小鼠血清J-Ⅲ是针对含有尤氏疟原虫CSP羧基末端区277-344氨基酸的合成肽之抗血清(MA.Roggero和G.P.Corradin，未发表之结果)。2．DNA构建体
Dis-Pf150构建体来源于pEDH-CS150(Reymond等人，1985)，其中的盘基蛋白启动子由肌动蛋白6启动子替代；CsA信号肽由盘基蛋白Ⅰa编码区替代。肌动蛋白6启动子使用PCR由pDNeoⅡ质粒(Witke等人，1987)扩增得到，使用寡核苷酸5’GCGCTCGAGACTAGAGAGGTTTATTTTTAA3’作为5’扩增引物，它能够与肌动蛋白6启动子的20个核苷酸杂交，并且在此序列上游包含XhoⅠ限制性位点。使用寡核苷酸5’TTCTCTAGACATTTTATATTATATTTATTTATTTG3’作为3’扩增引物，它能够与肌动蛋白6启动子的23个核苷酸杂交，包含ATG起始密码子和XbaⅠ限制性位点。
扩增的片段起始于第1663核苷酸残基，终止于起始密码子ATG(第948位核苷酸)。经XhoⅠ/XbaⅠ双消化后，DNA片段插入到已去除包含盘基蛋白启动子的XhoⅠ/XbaⅠ插入区域的载体pEDⅡ-CS中。
使用BamHⅠ线性化的质粒pWR7(Poole等人，1981)作为模板，5’ATGTCTAGACAAGGTTTAGTTCAACTCCTCG3’和5’CATGAATTCTGGATCCGAACCACGTGGAACTAATTCCAAAGCGGTAGCAATGT3’分别作为5’和3’扩增引物，扩增出盘基蛋白Ⅰa编码区。5’扩增引物对应于盘基蛋白编码区的头33个碱基，并且提供了XbaⅠ限制性位点。3’扩增引物起始于EcoRⅠ限制性位点和凝血酶裂解位点编码序列的33个碱基处，其中的序列已经优化以适于基盘网核菌密码子偏好，随后是能够与盘基蛋白编码区的最后20个碱基杂交的一段延伸序列。融合基因编码629个氨基酸长的多肽，其包含盘基蛋白标记(Met1至Met257)和364个氨基酸长的恶性疟原虫CSP片段(Leu19至Cys382)以及引入两者之间的8个氨基酸长的凝血酶识别位点(LVPRGSAP)。
为了使恶性疟原虫CSP羧基末端区段101个氨基酸的区域(Lys282至Cys382)获得表达，其相应的DNA通过使用5’GGTGGATCCAGGAATTCAAAAAAACAATCAAGGTAATGGA3’和5’AAGCGAGCTCTTAACATMCCATMACAAAT3’分别作为5’和3’扩增引物由CS NF54基因(Caspers等人，1989)扩增得到。
5’扩增引物能够和CSP基因的21个核苷酸杂交。在CSP序列的上游，5’扩增引物包含BamHⅠ限制性位点和代表EcoRⅠ限制性位点及编码氨基酸G、I、Q的10个核苷酸。
3’扩增引物可以与CSP基因的22个核苷酸杂交，并且能够使框内UAA和SacⅠ限制性位点插入到基因中。经过BamHⅠ/SacⅠ双消化后，得到的片段用于替换DisPf150表达载体中相应的插入序列。得到的基因编码369个氨基酸长的多肽，它包含盘基蛋白标记的257个残基、凝血酶裂解位点的8个残基和来自CS基因的108个氨基酸。
Dis-PyCter构建体的构建过程与Dis-PfCter相似，不同的是编码来源于CS基因的羧基末端片段((Asn277至Ser345)的PCR产物由尤氏疟原虫17X(de la Cruz等人，1988)DNA扩增得到，并用于替换DisPf150表达载体中的BamHⅠ/SacⅠ插入序列。下述两个寡核苷酸分别用作5’和3’扩增引物：5’GGTGGATCCAGGAATTCAAAATGAAGATTCTTATGTCCCA3’5’CGTACGAGCTCTTAAGATATCAATGAACAMATCCATMAC3’
5’扩增引物能够和CSP基因的21个核苷酸杂交。在CSP序列的上游，5’扩增引物包含BamHⅠ限制性位点和代表EcoRⅠ限制性位点及编码氨基酸G、Ⅰ、Q的10个核苷酸。
3’扩增引物可以与CSP基因的20个核苷酸杂交，并且能够使另外12个核苷酸插入基因，所述12个核苷酸包含EcoR V限制性位点和位于氨基酸L、I、S与SacⅠ限制性位点上游的框内终止密码子UAA之间的编码赖氨酸-异亮氨酸-丝氨酸连接头。得到的基因编码340个氨基酸长的多肽，它包含257+8盘基蛋白-凝血酶位点序列，其后是尤氏疟原虫CSP的79个残基。
用于Dis-PyCter融合蛋白质(其包含氨基末端ER转位信号肽)(PS-Dis-PyCter)的表达载体衍生自Dis-PyCter表达载体(如前所述)，其中，肌动蛋白6启动子已经由肌动蛋白15启动子替代(Knecht等人，1986)，其后是盘基网柄菌PsA信号肽(Early等人，1988)。盘基网柄菌PsA前导肽(氨基酸1-12)是通过PCR由pMUW1630载体(K.Williams和M.Slade，生物科学院，麦克夸利大学，悉尼，澳大利亚)扩增得到，其中分别使用了5’AGCTCGAGATTCACAAATTAATTAATCCCATC3’和5’AATCTAGATTCATATGCATTGGCGTATGTTAA3’作为5’和3’扩增引物。
5’扩增引物能够和肌动蛋白15启动子的20个核苷酸杂交，并在序列上游包含XhoⅠ限制性位点。3’扩增引物可以和PsA基因的24个核苷酸杂交，并且在序列下游包含XbaⅠ限制性位点。扩增完成并且经XhoⅠ和XbaⅠ限制性消化后，将DNA片段插入到Dis-PyCter载体用以替代肌动蛋白6启动子。
最终得到的载体编码开始于与盘基蛋白Ⅰa(氨基酸位置3T→R)的第二个氨基酸融合的PsA蛋白质前21个氨基酸(前导肽的裂解发生在第19残基之后)。因而，在蛋白质的加工过程中的信号肽的裂解可以产生仅仅比Dis-PyCter构建体表达得到的蛋白质多一个氨基酸的融合蛋白质。
Dis-Pf150的一个截短形式，即(74-229)DisPf150是通过PCR的方法分别使用如下寡核苷酸：5’AATCTAGAGTTGCTGCTCTCCAAGGTCGTGGT3’和5’AGGGATCCATATCGAAACCMGGTGGTAATGTT3’作为5’和3’扩增引物，对Dis-PH50中编码盘基蛋白Ⅰa的DNA区Val74至Asp229进行扩增而构建出来的。
以与构建DisPf150相似的方法，PCR产物插入到肌动蛋白6启动子旁，而信号肽由截短的盘基蛋白Ⅰ替代。3．细胞培养与转染
如Anjard等人(1992)所述，使用电穿孔法用质粒转染纯培养的盘基网柄菌细胞AX2。在滕黄微球菌(Micrococcus luteus)PRF3菌苔上在G418选择下选择克隆转化子(Wilczynska和Fisher,1994)。在22℃HL5培养基(Sussman,1987)中，在G418的浓度最高增加到50-100μg/ml的条件下选择稳定细胞株。4．重组蛋白质的纯化
培养物在HL5中生长至约7×106细胞/ml。300g离心5分钟收获细胞，然后将细胞沉淀按2×108细胞/ml的比例重悬于包含1％曲拉通X-100,5mM苯甲脒，0.1单位/ml抑酶肽，50μg/ml胰蛋白酶抑制剂和2μg/ml抗蛋白酶的TBS(25mM Tris,pH7.4,137mM NaCl,2.7mM KCl)裂解溶液中。一个冻融循环后，裂解物在5℃下10000g离心15分钟。将上清中CaCl2调到10mM，然后将其上样于用补充有10mMCaCl2的裂解溶液预平衡的Sepharose 4B层析柱上。每4×108细胞使用1ml柱床体积。使用20倍柱床体积的TBS，包含蛋白酶抑制剂的10mM CaCl2洗柱。使用0.3M的半乳糖TBS溶液洗脱蛋白质，每级分0.7柱床体积，约90％的融合蛋白质在第2-4级分中洗脱下。5.凝胶电泳与免疫印迹
使用3×Laemmli样品缓冲液(包含200mM DDT)(Laemmli,1970)在80℃加热10分钟来制备15μl纯化级分样品或2μl原始裂解物(总级分)的可溶性级分。对于Sepharose柱流出级分，将其上样体积调整到与总级分有相同蛋白质量的程度。使用考马斯蓝/贝斯麦棕R染色(Choi等人，1996)或银染(Morrissey,1981)显示蛋白质。通过半干电转移装置转移至硝酸纤维素膜上进行Western印迹分析。用包含4％脱脂牛奶的PBS封闭后，将膜在不同类型的血清和mAb中温育，例如如图中所示的针对已合成的(NANP)50-重复的Sp3E9mAb。
在含0.02％吐温的PBS中洗涤3次后，将膜在按1/2000稀释于PBS-牛奶中的过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠血清或过氧化物酶偶联的蛋白A中孵育1小时。洗膜后，按照制造商的使用说明使用ECL试剂盒进行免疫染色。结果1．细胞内盘基蛋白标记的蛋白质的表达和纯化
用作蛋白质纯化标记的潜在盘基蛋白Ⅰ是通过将其与包含氨基酸282-382(图1)的恶性疟原虫CSP蛋白质羧基末端的一个片段进行融合来评价的。使用PCR的方法从基因组DNA扩增出盘基蛋白Ⅰ编码区域，并且为了产生与盘基网柄菌表达载体(见材料与方法)相容的片段，加入了方便的限制性酶切位点。产生的载体pAC6-Dis-PfCter通过电穿孔的方法用于盘基网柄菌细胞纯培养株AX2。
使用浓度高达50μg/ml的G418选择稳定的转化株之后，通过免疫印迹对融合蛋白质的表达进行了分析，并且与用只携带选择标记的载体(DP4)(Aniard等人，1992)转染的细胞进行比较。
使用针对恶性疟原虫羧基末端肽(Roggero等人，1995)的小鼠抗血清(Ⅳ-4)在Western印迹中发现了在对照组DP4株中不存在的44kDa的蛋白质，该大小是预期的Dis-pfCter蛋白质的大小。(图2A)。一条更低一些的区带的存在显示可能发生了蛋白质的部分降解或不完全合成。Dis-PfCter的聚集程度随着细胞密度变化，在大约7×106细胞/ml附近时达到最大。
使用Sepharose 4B层析(Simpson等人，1974)之盘基蛋白Ⅰ、Ⅱ的纯化操作可以允许对Dis-PfCter进行部分纯化(图2A和C)。44kDa的蛋白质(箭头所示)可以在0.3M半乳糖加入时于第二和第三级分中从树脂中洗脱下来，同时洗脱下来的还有内源性盘基蛋白(25和28kDa)。在Western印迹中还发现大约35kDa的中等大小的区带。在DP4级分中44和35kDa蛋白质的缺失(图2B)说明考马斯蓝染色的区带确实是Dis-PfCter或其衍生物。而且，使用梯度而不是0.3M半乳糖的洗脱显示，盘基蛋白Ⅰ和重组蛋白质同时在200和220mM半乳糖之间洗脱下来，而盘基蛋白Ⅱ的洗脱则需略微高些的半乳糖浓度(未列出数据)。使用这样的方法，采用Bradford分析(Bradford,1976)和考马斯染色胶的密度度量分析(Choi等人，1996)进行鉴定，大约每升培养物可以分离出1-2mg的融合蛋白质。计算得到的纯化因子大约是30倍，用Western印迹分析测得回收率主要随着实验中所用的Sepharose/蛋白质比率的变化在50％-70％之间变化。综合上述结果，可以估计出Dis-PfCter至少占盘基网柄菌可溶性蛋白质的1％。
进一步分析了是否有其它的蛋白质可以与Dis标记连接而不影响其Sepharose结合活性。来源于尤氏疟原虫的CSP的羧基末端区(PyCter)有着与PfCter不同的氨基酸组成(de la Cruz等人，1988)。编码尤氏疟原虫CSP的277-344残基的DNA符合读框地克隆入盘基蛋白Ⅰ的编码序列，得到的基因置于肌动蛋白6启动子控制之下。使用针对尤氏疟原虫CSP羧基末端(参见材料与方法)的小鼠血清(J-Ⅲ)在用pAC6-Dis-PyCter质粒转化的盘基网柄菌细胞中检测出大约35kDa的一条区带(图3A)。Dis-PyCter融合蛋白质与Sepharose 4B的结合以及用半乳糖来洗脱都与Dis-PfCter相似(图3A)，这些使得使用考马斯蓝染色可以检测出大约35kDa的蛋白质。每升培养物累积大约0.2mg Dis-PfCter蛋白质。因而这些结果证实了盘基蛋白Ⅰ作为用于重组多肽纯化标记的可应用性。
为了检查是否更大的蛋白质可以通过使用盘基蛋白Ⅰ融合载体进行表达，只缺少最后23个氨基酸的PfFCSP的一种形式CS150(Reymond等人，1995)与盘基蛋白Ⅰ进行了融合，并在盘基网柄菌中进行了表达。虽然表达水平比Dis-PfCter低(大约每升0.1mg，)，但是在用针对(NANP)3重复(Boulanger等人，1988)(图4A)的SP3E9单克隆抗体或针对CSP282-382(未列出数据)的小鼠血清染色的细胞裂解物免疫印迹中，发现了大约84KDa的一条区带。这一蛋白质可以在与Dis-PfCter和Dis-PyCter相似的条件下采用Sepharose亲和层析进行纯化。
为了进一步验证融合蛋白质对Sepharose结合的特异性，删除了盘基蛋白Ⅰ的前73个氨基酸，并将删除后的多肽与恶性疟原虫CS150((74-229)DisPf150)融合。(74-229)DisPf150不能够与Sepharose 4B结合，说明盘基蛋白Ⅰ的氨基末端的1-73残基对于其结合活性是必需的(图4B)。2．细胞外盘基蛋白标记的蛋白质的表达和纯化
既然盘基蛋白是由盘基网柄菌向外排出的(Barondes等人，1983；Barondes等人，1985)，那么我们就研究了Dis标记的蛋白质在细胞外培养基中的存在情况，并且评价了其与Sepharose 4B的亲和性。Dis-PfCter和Dis-Pf150都可以通过Western印迹的方法在培养基中检测出，其水平可以达到产生的总的融合蛋白质的20-50％之间(图4C，数据未列出)。那么我们就要问使用删除突变体，缺失前72个盘基蛋白氨基酸的分泌是否需要盘基蛋白部分。虽然(73-229)Dis-Pf150在细胞内聚积可以达到与全长的Dis-Pf150相似的水平，但是在细胞外培养基中检测不到融合蛋白质(图4C)。这些结果提示，要进行分泌需要盘基蛋白标记的完整性。3．ER信号肽的加入产生Dis-PyCter的N-糖基化
盘基蛋白Ⅰ和盘基蛋白Ⅱ进入细胞外空间的途径还没有完全研究清楚。盘基蛋白Ⅰ的氨基酸序列中包含4个潜在的Asn-X-Ser/Thr-X的N糖基化位点。但是，缺少信号肽以及缺少关于盘基蛋白糖基化的相关报道说明，蛋白质是通过一个可能不包含内质网(ER)和高尔基体的途径到达细胞外空间。
为了特异性地将融合蛋白质定位到ER/高尔基体分泌途径，将来源于盘基网柄菌PsA细胞表面抗原的信号肽(Early等人，1988)与Dis-PyCter的氨基末端融合。没有任何SP-Dis-PyCter蛋白质进行了分泌(数据未列出)。而且，SP-Dis-PyCter不能与Sepharose 4B结合(数据未列出)。如Western印迹分析，SP-Dis-PyCter蛋白质与DispyCter相比以相似的水平进行表达，但前者比后者大了约15kDa(参见图5)。
SP-Dis-PyCter和Dis-PyCter细胞裂解物之间可见15kDa的差异比信号肽本身的19个氨基酸大。既然盘基蛋白Ⅰ中包含4个潜在的糖基化位点(39-42NGTN,97-100NLSW,212-215NQTR,222-225NITT)以及表达的尤氏疟原虫CSP中另外的一个糖基化位点(328-331NLTL)，因而SP-Dis-PyCter大小的增加反映了它的糖基化。
实际上，用聚糖酶F处理导致SP-Dis-PyCter区带分子量向下迁移约35kDa(图5)，从而与Dis-PyCter接近。作为对照，缺少PsA信号肽的DisPyCter用聚糖酶F处理后，其在SDS PAGE凝胶电泳上的迁移率并不改变(图5)。SP-Dis-PyCter糖基化的另一个证明是通过向培养基中加入N糖基化阻断剂衣霉素后，导致更低分子量形式的出现而得到的(数据未列出)。这些结果说明向融合蛋白质提供信号肽可以导致重组蛋白质向ER/高尔基体区室定位，随后在该处被糖基化。4．盘基蛋白标记的去除
为了能够将盘基蛋白标记从重组蛋白质中去除，在Dis标记和尤氏疟原虫羧基末端肽之间插入凝血酶裂解位点(参见图1)。如图6所示，重组蛋白质的大小随着凝血酶的浓度上升而减小，说明盘基蛋白标记可被裂解除去。讨论
将重组蛋白质与盘基蛋白Ⅰ融合可以仅仅使用Sepharose 4B，以单一步骤去除绝大多数的杂质。既然缺失突变体不能与亲和树脂结合，那么就需要保持盘基蛋白部分的完整性。对于所有的细胞质融合蛋白质，盘基蛋白标记在与Sepharose结合方面是完全有功能的，与内源性的盘基蛋白Ⅰ相比在亲和性方面没有显著的差异。正如使用考马斯和银染色所示，除了内源性的盘基蛋白，几乎没有其他的蛋白质可共同纯化，因而此纯化系统是有效的。基于不同的方法(如离子交换层析、分子排阻或高效液相层析)的额外步骤可以向上述过程中加入，以将融合蛋白质与盘基蛋白分离。
在一个优选的实施方案中，第二次通过Sepharose 4B的滞留，可从融合蛋白质中去除盘基蛋白标记。为此，在盘基蛋白Ⅰ和CSP序列之间加入凝血酶裂解位点。在蛋白酶识别位点附近加入多聚甘氨酸连接头可能进一步有助于盘基蛋白Ⅰ标记除去。
将重组蛋白质向细胞外培养基定位可以简化纯化，并且可以允许次级修饰。本发明显示通过加入来源于前孢子抗原PsA蛋白质的21个氨基酸的前导肽，而使融合蛋白质向内质网和高尔基体定位，这导致尤氏疟原虫CSP(328-331 NLTL)和盘基蛋白Ⅰ(39-42 NGTN,97-100 NLSW,212-215 NQTR,222-225 NITT)潜在位点中至少有一些糖基化。
本发明显示盘基蛋白标记可以用于纯化融合蛋白质。如果使用正确的表达载体以及某些密码子可能在序列上改变一下，这一特性可以应用于包括从大肠杆菌到哺乳动物细胞的其它表达系统。而且，本发明还显示，盘基网柄菌组成了用于可以作为亚单位疫苗成分或其他生物技术应用的重组蛋白质生产的诱人选择。与其它许多类型的细菌相比，盘基网柄菌没有致病性且不会产生肠毒素。因此，用于动物或人类注射的蛋白质之纯化应当可以大大简化。免疫实验显示细胞裂解物对于小鼠(Reymond等人，1995)或猴(N.Fasel,C.Reymond，和S.Herrera，未发表之结果)是无毒的，这使得使用无微量毒性成分风险的纯化多肽进行人类免疫变得可行。
除了简单的生长需要以及可获得稳定的细胞系，盘基网柄菌还具有多个特点，这使得比使用其它生物体(例如细菌和酵母)时的操作更容易。由于没有细胞壁，所以允许将细胞快速且容易的裂解，方法是通过使用低百分比的曲拉通X-100的冻融过程。这应当可以筒化将脆弱的蛋白质以活性形式进行分离的过程。本发明提出的基于盘基蛋白标记和Sepharose 4B作为廉价亲和载体的直接纯化方法，应当可以提高盘基网柄菌在生物技术方面的应用价值。
参考文献
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Claims (20)

1．用于产生重组多肽的表达构建体，所述构建体包含至少由下述可操作连接的元件组成的表达盒：
a)启动子；
b)作为一种纯化标记序列的编码凝集素结合蛋白质的DNA之编码区，尤其是编码盘基蛋白蛋白质家族成员的DNA；
c)用于接受待产生的重组多肽之编码区的克隆位点；以及
d)转录终止信号。
2．如权利要求1所述的表达构建体，其中纯化标记序列置于紧邻克隆位点处，启动子的下游。
3．如权利要求1和2所述的表达构建体，其中裂解位点位于纯化标记序列和克隆位点之间。
4．如权利要求1-3所述的表达构建体，其中用于将所要产生的多肽定位于特定细胞区室的信号肽位于启动子下游，且在纯化标记序列或克隆位点之前。
5．如权利要求1-4所述的表达构建体，其中纯化标记序列编码盘基蛋白Ⅰa。
6．如权利要求1-4所述的表达构建体，其中纯化标记序列编码盘基蛋白Ⅱ。
7．如权利要求3-6所述的表达构建体，其中裂解位点是凝血酶的裂解位点。
8．如权利要求7所述的表达构建体，其中凝血酶裂解位点由编码氨基酸序列LVPRGSDP的DNA序列构成。
9．如权利要求4-8所述的表达构建体，其中用于定位的信号肽用于将多肽定位于内质网。
10．如权利要求9所述的表达构建体，其中用于定位的信号肽是来源于前孢子抗原(PsA)蛋白质的21个氨基酸的前导肽。
11．用于产生多肽的方法中的如权利要求1-10所述的表达构建体。
12．包含如权利要求1-10所述的表达构建体的表达载体。
13．用于产生多肽的方法中的如权利要求12所述的表达载体。
14．用于产生多肽的方法，包括：
a)通过将多肽的编码序列克隆到如权利要求12所述的表达载体之克隆位点，来制备用于所要产生的多肽的表达载体；
b)使用由上得到的表达载体转化一种合适的宿主细胞；
c)在允许融合多肽表达的条件下培养宿主细胞，所述融合多肽包含纯化标记的氨基酸序列以及共价连接于其上的要表达的多肽的氨基酸序列；以及
d)通过纯化标记的氨基酸序列将存在于宿主细胞或培养液中的融合多肽与多糖基质结合，然后将融合多肽从基质上洗脱下来的方法，从宿主细胞或其培养液中分离融合多肽；以及
e)除去纯化标记的氨基酸序列。
15．如权利要求14所述的方法，其中载体包含如权利要求3-10所述的构建体，除去纯化标记是通过裂解位点将融合多肽中纯化标记的氨基酸序列裂解来进行。
16．如权利要求14或15所述的方法，其中基质是Sepharose 4B，洗脱是用半乳糖进行。
17．如权利要求14或15所述的方法，其中多糖基质是一种有乙酰半乳糖胺基团偶联于其上的琼脂糖基质，洗脱是用半乳糖进行。
18．如权利要求17所述的方法，其中Sepharose 4B基质是珠的形式。
19．通过如权利要求14和16-18所述的方法可以获得的融合多肽。
20．通过如权利要求15-18所述的方法纯化的多肽。
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