CZ20004732A3 - Konstrukt pro expresi - Google Patents

Konstrukt pro expresi Download PDF

Info

Publication number
CZ20004732A3
CZ20004732A3 CZ20004732A CZ20004732A CZ20004732A3 CZ 20004732 A3 CZ20004732 A3 CZ 20004732A3 CZ 20004732 A CZ20004732 A CZ 20004732A CZ 20004732 A CZ20004732 A CZ 20004732A CZ 20004732 A3 CZ20004732 A3 CZ 20004732A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
sequence
tag
discoidin
protein
expression
Prior art date
Application number
CZ20004732A
Other languages
English (en)
Inventor
Christophe Dominique Reymond
Nicolas Joseph Fasel
Original Assignee
Rmf Dictagene S. A.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Rmf Dictagene S. A. filed Critical Rmf Dictagene S. A.
Publication of CZ20004732A3 publication Critical patent/CZ20004732A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/44—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from protozoa
    • C07K14/445—Plasmodium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/04—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing an ER retention signal such as a C-terminal HDEL motif
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/90—Fusion polypeptide containing a motif for post-translational modification
    • C07K2319/91—Fusion polypeptide containing a motif for post-translational modification containing a motif for glycosylation
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká nového expresního vektoru, který může být použit spolu s novým protokolem purifikace při výrobě polypeptidů.
Dosavadní stav techniky
Zvyšování míry exprese rekombinantních proteinů u hostitelů a zjednodušení kroků zpracování ve větším měřítku jsou nezbytná opatření pro produkci příslušných proteinů a zachování nízkých nákladů. K tomuto účelu byly navrženy nové expresní vektory a postupy purifikace, které jsou založeny mimo jiné na principech přítomnosti specifických peptidových sekvencí (tagů) pro čištění afinitními technikami (Smith a Pidgeon, US patent 4,569,794; Sharma, US patent 5,594,115; Romanos, M. A., Hughes, F. J., Comerford, S. A., a Scorer, C. A. (1995); Production of a phosphorylated GST::HPV6 E7 fusion protein using a yeast expression vector and glutathione Stransferase fusions; Gen 152, 137 - 8. 1995; Kim, J. S., a Raines, R. T. (1993); Ribonuclease S-peptide as a carrier in fusion protein; Protein Science 2, 348 - 56; Kroll, D. J., Abdel-Malek Abdel-Hafiz, H., Marceli, T., Simpson, S., Chen, C. Y., Gutierrez-Hartmann, A., Lustbader, J. W., a Hoeffler, J. P. (1993); A multifunctional prokaryotic protein expression systém: overproduction, affinity purification, and selective detection; DNA & Cell Biology 12, 441 - 53; Smith, D. B., a Johnson, K. S., (1988); Single-step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione Stransferase; Gen 67, 31 - 40), detekci a/nebo stabilizaci
- 2 • · · · · ♦ · 9 · · · · · • •49 · 4 · 9 9 9 9
4 4 44994 4 4 4
4 4 · 9 · 4 4 9
4944 49 444 49 444 rekombinantních proteinů (Riggs, US patent 4,366,246; LaVallie, E.
R., DiBlasio, E. A., Kovacic, S., Grant, K. L., Schendel, P. F., a McCoy, J. M. (1993). A thioredoxin gen fusion expression systém that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm; Bio/Technoiogy 11, 187 - 93). Tyto specifické sekvence (tags) mohou být často odstraněny proteolytickým nebo chemickým štěpením (Hopp a další, US patent 4,782,137; Beghdadi a další, 1998), což umožní produkci rekombinantního polypeptidu, ve kterém se nevyskytují případné externí aminokyseliny.
Hlavní nevýhodou známých metod založených na specifických peptidových sekvencích je použití speciálních pryskyřic pro afinitní čištění, což komplikuje purifikaci ve velkém měřítku a vede k vysokým výrobním nákladům. Technologie založené na kovových iontech navíc vedou k modifikaci některých zbytků proteinů, zatímco v jiných případech interferují rozpouštědla a postupy používané při eluci s katalytickou aktivitou čištěných proteinů.
Podstata vynálezu
Předmětem předkládaného vynálezu je tedy poskytnutí nového expresního systému, který umožňuje snadnou a účinnou purifikaci vyrobeného polypeptidu použitím laciných pryskyřic. Předmětem vynálezu je zvláště poskytnutí expresního systému umožňujícího purifikaci na materiálu Sepharose 4B, což je levná pryskyřice, které se již při purifikačních postupech ve velkém měřítku používá.
Podle vynálezu se toho dosahuje expresním konstruktem pro výrobu rekombinantních polypeptidů, kde tento konstrukt obsahuje expresní kazetu, která se skládá alespoň z následujících prvků, které jsou operativně propojeny:
a) promotor;
• · ·· ·» ·©·· ·· • · · · · « · ··· • · · · · ··· · ·
- 3 • · · · · ·©·· ·* ···· ·· ··© ·· ··«
b) kódující oblast DNA kódující lektinový vazebný protein, zvláště DNA kódující některý ze skupiny diskoidinových proteinů jako specifickou purifikační sekvenci (tag);
c) klonovací místo pro příjem kódující oblasti rekombinantního polypeptidu, který má být produkován; a
d) signál ukončení transkripce.
Pro praktické použití je tento konstrukt s výhodou obsažen v expresním vektoru, jako je plasmid vhodný pro transformaci požadovaného hostitele.
Při výzkumu, který vedl k předkládanému vynálezu, byla možnost použití diskoidinu I, vývojově regulovaného lektinu discoideum, jako specifické sekvence (tágu) pro produkci a purifikaci rekombinantních proteinů, zkoumána pomocí expresních vektorů Dictyostelium discoideum (které jsou například popsány v Fasel a Reymond, US patent 5,736,358). Navíc může být přidání signálního peptidu použito pro přesměrování exprimovaného proteinu do endoplasmatického retikula, což umožňuje sekundární modifikace a sekreci (Reymond, C. D., Beghdadi, R. C., Roggero, M., Duarte, E. A., Desponds, C., Bernard, M., Groux, D., Matile, H., Bron, C., Corradín, G., a další (1995); Anchoring of an immunogenic Plasmodium falciparum circumsporozoite protein on the surface of Dictyostelium discoideum; J. Biol. Chem. 270, 12941 - 7).
Diskoidiny jsou kódovány vývojově regulovanou multigenní skupinou (Pool, S. J., a Firtel, R. A. (1984); Conserved structural features are found upstream from the three coordinately regulated discoidin I genes of Dictyostelium discoideum; Journal of Molecular Biology 172, 203 - 20; Rowekamp, W., Pool, S., a Firtel, R. A. (1980); Analysis of the multigen family coding the developmentally regulated karbohydrate-binding protein discoidin-l in Dictyostelium discoideum;
Cell 20, 495 - 505; Tsang, A. S., Devin, M., a Williams, J. G. (1981);
The multiple subunits of discoidin I are encoded by different genes;
00 000000 00 >000 0·· 00
0 0 0 0 000 0 0
000 00000 _ 4 _ 00 0000 00 040 00
Dev. Biol. 84, 212 - 217). U D. discoideum byly popsány dvě třídy diskoidinů, I a II. Obě představují tetramerní proteiny, které mohou být rozlišeny na základě molekulové hmotnosti podjednotek (rozmezí 2528 kDa), isoelektrického bodu a peptidové mapy (Frazier, W. A., Rosen, S. D., Reitherman, R. W., a Barondes, S. H. (1975); Purification and comparison of two developmentally regulated lectins from Dictyostelium discoideum - Discoidin I and II., J. Biol. Chem. 250, 7714 - 7721). Jeden jednoduchý gen kódující diskoidin II byl identifikován v D. discoideum, zatímco se předpokládá, že diskoidin I se účastní adheze buněk na substrát a uspořádané migrace buněk při agregaci. Zdá se však, že tato aktivita závisí na buněčném vazebném místě diskoidinů I podobném fibronektinu, které se liší od karbohydrátového vazebného místa (Springer, W. R., Cooper, D. N., a Barondes, S. H. (1984); Discoidin I is implicated in cell-substratum attachment and ordered cell migration of Dictyostelium discoideum and resembles fibronectin; Cell 39, 557 - 64). Ačkoli se většina diskoidinů akumuluje uvnitř buňky, určité množství je sekrenováno dosud neznámým biochemickým pochodem, kterého se pravděpodobně účastní multilamelární tělíska (Barondes, S. H., Haywood, R. P., a Cooper, D. N. (1985); Discoidin I, an endogenous lectin, is externalized from Dictyostelium discoideum in multilamellar bodies; J. Cell Biol. 100, 1825 - 1833). Diskoidiny neobsahují žádné ER translokační signály a proto se tyto proteiny ani nevylučují obvyklým způsobem sekrece, ani nejsou glykosylovány, ačkoli mají ve své sekvenci několik potenciálních míst pro N-glykosylaci.
Podle vynálezu nyní bylo zjištěno, že lektinu podobná, galaktosylová vazebná aktivita diskoidinů může být využita pro purifikaci fúzních proteinů obsahujících diskoidin a exprimovaný polypeptid afinitní chromatografii na materiálu Sepharose-4B a agaróze s konjugovaným N-acetylgalaktosaminem, což poskytne integrovaný systém pro expresi a purifikaci rekombinantních proteinů.
* · 4 4 · ♦ 4 · · · 44 • 44» 444 444
444 444 4 4
- 5 444 44 4 4 4 4
4444 44 444 44 444
Konkrétní výhody předkládaného vynálezu jsou v tom, že eluce se dosahuje pomocí galaktózy, rozpouštědla, které neinteraguje s většinou proteinů a/nebo většinu proteinů nemodifikuje. Další výhodou je, že diskoidin samotný není toxický a může být snadno detekován specifickými protilátkami. Navíc může dojít ke zvýšení míry produkce požadovaného proteinu, jestliže je exprimován ve fúzovaném stavu s diskoidinem. Konečně se zdá, že žádný protein z E. coli, savčích buněk nebo Dictyostelium, kromě diskoidinů, se specificky neváže na Sepharosu a neuvolňuje se galaktózou, což snižuje množství kontaminujících látek ve vyčištěných vzorcích.
V expresním vektoru podle vynálezu je specifická purifikační sekvence (tag) umístěna proti směru exprese vzhledem ke klonovacímu místu a po směru exprese vzhledem k promotoru. Alternativně je možno umístit specifickou purifikační sekvenci (tag) za klonovací místo požadovaného proteinu. V obou případech umožní fúze specifické purifikační sekvence (tágu) s požadovaným proteinem purifikací na specifických pryskyřicích.
Aby bylo umožněno snadné oddělení tágu od exprimovaného polypeptidu, mezi specifickou purifikační sekvencí (tágem) a klonovacím místem požadovaného proteinu je s výhodou umístěno štěpicí místo. Štěpícím místem je například trombinové štěpící místo. Další možná štěpicí místa jsou faktor X, nebo chemická štěpicí místa, zvláště využívající CNBr. Trombinové štěpicí místo se skládá ze sekvence DNA kódující aminokyselinovou sekvenci LVPRGSDP.
Samotný diskoidin není automaticky směrován do určitého konkrétního oddělení buňky, protože neobsahuje signální sekvence. Proto může v některých provedeních expresní vektor dále obsahovat sekvenci kódující signální polypeptid pro nasměrování produkovaného polypeptidu do specifické části buňky. Tato signální sekvence je obvykle umístěna ve směru exprese vzhledem k promotoru a proti směru exprese vzhledem k fúzi specifické purifikační sekvence (tágu)
·· ·« 99 9999 «·
• • • · * • • 9 9 9 9
• • • • • 9 9 9 • 9
• « • • • • • 9
···· • · ·· · ·· 9 9
a sekvence požadovaného proteinu. Signální peptid pro směrování je s výhodou signální peptid pro nasměrování polypeptidu do endoplasmatického retikula, jako například úvodní peptid o délce 21 aminokyseliny z proteinu presporového antigenu (prespore antigen, PsA). To je výhodné, protože produkovaný polypeptid může potom být glykosylován a vylučován.
V prvním provedení vynálezu je diskoidinem, který tvoří specifickou purifikační sekvenci (tag) diskoidin I. Dalším vhodným diskoidinem je diskoidin II nebo jakýkoli jiný protein vázající se na lektin schopný navázat se na galaktózové polymery.
Podle dalšího provedení se vynález týká způsobu výroby polypeptidu, který zahrnuje následující kroky:
a) připraví se expresní vektor produkovaného polypeptidu klonováním kódující sekvence tohoto polypeptidu do klonovacího místa expresního vektoru podle vynálezu;
b) takto získaným expresním vektorem se trasformuje vhodná hostitelská buňka;
c) tato hostitelská buňka se kultivuje za podmínek umožňujících expresi fúzního polypeptidu složeného z aminokyselinové sekvence specifické purifikační sekvence (tágu) s kovalentně navázanou aminokyselinovou sekvencí exprimovaného polypeptidu;
d) fúzní polypeptid se izoluje z hostitelské buňky nebo kultivačního média pomocí vazby fúzního polypeptidu přítomného v buňce nebo v médiu prostřednictvím aminokyselinové sekvence specifické purifikační sekvence (tágu) na polysacharidovou matrici a eluce fúzního polypeptidu z této matrice; a
e) odstraní se aminokyselinová sekvence purifikačního tágu.
V případě, že vektor obsahuje štěpící místo, se odstranění purifikačního tágu provede štěpením aminokyselinové sekvence purifikačního tágu fúzního polypeptidu prostřednictvím štěpícího místa.
• 9
9·
- 7 ·· 9999 99 • 999 999 999 • 9 9 9 9 999 9 9
9999 9999
999 99 999
V případě diskoidinu I je polysacharidovou matricí s výhodou materiál Sepharose-4B ve formě kuliček, protože tento materiál je laciný a čistí zvláště diskoidin I a II. Eluce potom může být provedena galaktózou. Agarózová matrice s konjugovanými N-acetylgalaktos-aminovými skupinami je zvláště vhodnou matricí ve druhém stupni pro relativně vyšší afinitu diskoidinu I proti diskoidinu II pro tuto matrici.
Vynález se dále týká nového fúzního polypeptidu připravitelného tímto způsobem a použití těchto fúzních polypeptidů při výrobě rekombinantních polypeptidů.
Slovo „promotor“, jak se používá v předkládané přihlášce, má zahrnovat cis-působící sekvenci DNA umístěnou v 5’ oblasti proti směru exprese iniciačního místa kódující sekvence pro polypeptid, na jehož sekvenci DNA se může vázat RNA polymeráza a zahájit správnou transkripci, a popřípadě také zahrnuje zesilující sekvence (enhancery).
„Fúzní protein“ je kombinace aminokyselinové sekvence diskoidinu a aminokyselinové sekvence exprimovaného polypeptidu.
Termín „diskoidin“ se má týkat lektinového vazebného proteinu s afinitou ke galaktózovým polymerům.
Všechny další používané termíny mají význam, který se obecně používá v oboru a uvádí se například v publikaci „Dictionary of Gene Technology“, Ganter Kahl, VCH, Weinheim, Germany (1995).
V předkládané přihlášce se používají následující zkratky:
ER: endoplasmatické retikulum
CS: je protein Plasmodium circumsporozoite
DisPf150, Dis-PfCter, Dis-PyCter: fúzní proteiny obsahující aminokoncovou specifickou sekvenci (tag) diskoidinu la a případně zbytky Leuig až Cys382 nebo Lys282 až Cys382 CS P. falciparum nebo zbytky Asn277 až Ser345 CS P. yoelii. SP-Dis-PyCter, Dis-PyCter nesou aminokoncový signál translokace z ER ·· 0« ·» 0000 00
0000 000 000 » »000» 00
- 8 000 00 0000 00 0000 00 000 00 000
TCA: kyselina trichloroctová
PBS: fyziologický roztok s fosfátovým pufrem mAB: monoklonální protilátka
Vynález je dále ilustrován na následujícím příkladu, ve kterém se jako modelový systém popisuje exprese a purifikace různých forem circumsporozoitálního proteinu (CSP), jak z Plasmodium falciparum (Pf), tak i Plasmodium yoelii (Py) jako fúzních proteinů diskoidinu I. Je jasné, že tento systém je vhodný pro všechny další polypeptidy, které se rekombinantně exprimují. Tyto příklady nemají být omezující a diskoidinové fúzní proteiny mohou být exprimovány i v jiných hostitelích, jako je E. coli, kvasinky, bakuloviry, nebo savci. Navíc může být galaktózová vazebná část diskoidinu nebo celý diskoidin chemicky syntetizován a přidán k požadovanému polypeptidu.
V příkladech se bude odkazovat na následující obrázky:
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1
Mapa fúzních proteinů s diskoidinovou specifickou vazebnou sekvencí (tágem)
Transformační vektor pEDII CS150 D. discoideum byl modifikován náhradou diskoidinového promotoru promotorem aktin 6. Celá kódovací oblast diskoidinu I byla amplifikována PCR se současným přidáváním sekvence ve směru exprese kódující konvenční trombinové štěpící místo. Produkt PCR byl vložen ve správném čtecím rámci do kódující oblasti CS. Dis-PyCter a Dis-PfCter byly získány náhradou fragmentu BamHl/SacI Pf150 amplifikačními produkty PCR získanými z genů CSP P. yoelii a P. falciparum, jak se popisuje v části Materiály a metody. SP-Dis-PyCter byl odvozen z DisPyCter náhradou ·· 9 9 »9 9 ·· · 9 9
9··· 999 999
9 9 9 9 999 9 ·
- 9 999 ·9 9999
9999 99 999 99 «99 promotoru aktin 6 produktem PCR obsahujícím promotor aktin 15 následovaný kódující sekvencí signálního peptidu PsA D. discoideum. (74-229) Dis-Pf150 byl získán genetickým inženýrstvím náhradou diskoidinové kódující sekvence produktem PCR kódujícím zbytky 74 až 229.
Obr. 2
Exprese a afinitní purifikace Dis-PfCter
Rozpustné extrakty z ~4 x 108 buněk exprimujících Dis-PfCter byly čištěny chromatografii na 1 ml koloně Sepharose-4B, jak se popisuje v části Materiály a metody. Navázaný protein byl eluován 0,3M galaktózou v TBS a byly jímány frakce 0,7 ml.
A. Analýza westernovým přenosem použitím myší polyklonální protilátky proti karboxylovému konci PfCter.
Specificita protilátky byla ověřována analýzou rozpustné frakce z kontrolních buněk DP4 (dráha 1). Dráhy 2 až 7 ukazují frakce purifikace Dis-PfCter: dráha 2 ukazuje rozpustné extrakty, dráha 3 ukazuje nezachycené frakce; dráhy 4 až 7 ukazují frakce 1 až 4 eluované 0,3M galaktózou.
B a C. Barvení gelů metodou Coomassie-Blue/Bismarck Brown s frakcemi Dis-PfCter a DP4.
Dráha 1 ukazuje rozpustnou frakci; dráha 2 ukazuje prošlý materiál; dráhy 3 až 6 ukazují frakce 1 až 4 eluované 0,3M galaktózou.
Šipka ukazuje polohu rekombinantního proteinu o molekulové hmotnosti přibližně 44 kDa (44 000). Přibližně 15 pg proteinu bylo nanášeno jak pro vzorky celkového materiálu, tak i prošlého materiálu.
Pro frakce eluované galaktózou byl do každé dráhy nanesen objem odpovídající 1/50 objemu frakce.
• · e »4 *
- 10 9 4 9 9 4 499 ···· 49 9»9 99 9
Obr. 3
Exprese a afinitní purifikace Dis-PyCter
A. Analýza westernovým přenosem frakcí Dis-PyCter použitím myší polyklonální protilátky J-III (viz Materiály a metody). Rozpustné buněčné extrakty byly čištěny podle popisu v obr. 2. Dráha 1 ukazuje rozpustnou frakci. Dráha 2 ukazuje frakci prošlého materiálu; dráhy 3 až 4 ukazují frakce 2 až 3 eluované 0,3M galaktózou, dráha 5 ukazuje, jak byla ověřována specificita protilátky při použití paralelních rozpustných extraktů z kontrolních buněk DP4 jako vzorku.
B. a C. Barvení metodou Coomassie blue 12% gelů obsahujících frakce Dis-PyCter (B) a DP4 (C) z čištění na Sepharose.
Dráha 1 ukazuje rozpustnou frakci; dráhy 2 až 4 ukazují frakce 2 až 4 eluované galaktózou.
Šipka ukazuje polohu rekombinantního proteinu s molekulovou hmotností přibližně 35 kDa (35 000).
Obr. 4
Exprese a afinitní purifikace Dis-Pf150
A. Rozpustné buněčné extrakty byly čištěny jak bylo popsáno u obr. 2 chromatografií na Sepharose. Po dělení vzorků v 10% gelu, byl Dis-Pf150 detekován westernovým přenosem s pomocí myší SP3E9 (viz Materiály a metody). Dráha 1 ukazuje rozpustnou frakci; dráha 2 ukazuje nezachycený protein; dráhy 3 až 4 ukazují frakce 2 a 3 eluované 0,3M galaktózou; dráha 5 ukazuje, jak byla specificita protilátky ověřována analýzou paralelních extraktů DP4.
B. Dis-Pf150 a (74-229) Dis-Pf150 buňky byly pěstovány v médiu HL5 až do hustoty přibližně 5 χ 106 buněk/ml. Po centrifugaci při přibližně 500 g byly děleny ekvivalentní alikvoty jak usazených buněk (C), tak i supernatantu (M) elektroforézou SDS-PAGE a CSP byl detekován westernovým přenosem, jako tomu bylo v případě A.
·· ·· »··· ··
4 4« < · » · · · • « · « 0 00· » · • « 0 4 « · · · · *
000 · · 000 _ 11 _ ..............
C. Rozpustné buněčné extrakty (74-229) Dís-Pf150 byly zpracovány podle popisu v obr. 2 a analyzovány westernovým přenosem jako v části A. Dráha 1 ukazuje rozpustnou frakci; dráha 2 ukazuje nezachycený protein; dráhy 3 až 6 ukazují frakce 1 až 4 eluované 0,3M galaktózou.
Šipka ukazuje polohu rekombinantního proteinu s molekulovou hmotností přibližně 84 kDa (84 000). Pro každý z celkových vzorků a vzorků prošlého materiálu bylo nanášeno celkově přibližně 15 pg proteinu.
Obr. 5
Glykosylace SP-Dis-PyCter
SP-Dis-PyCter (dráhy a a b) a Dis-PyCter (dráhy c a d) ve formě lyzátů byly zpracovány buď reakčním pufrem (K) nebo enzymem PNGlycanase F (G) (dráhy 2 a 4) (dráhy 1 a 3) podle instrukcí výrobce.
Po 1 hod inkubace při 37 °C byla reakce zastavena přidáním 4 x Laemmliho vzorkového pufru a PyCter byl analyzován elektroforézou SDS-PAGE na gelu 12,5 % a westernovým přenosem použitím myšího séra J-111.
Obr. 6
Štěpení Dis-PyCter trombinem
Buňky exprimující SP-Dis-PyCter byly lyžovány jak je popsáno v části Materiály a metody s tím rozdílem, že z lyzačního pufru byly vynechány inhibitory proteáz. Extrakty byly inkubovány při 25 °C v přítomnosti vzrůstajících koncentrací trombinu, jak je uvedeno na obr. (jednotky/ml). PyCter byl potom detekován jak bylo popsáno v obr. 5.
• 0
0«
0 0 0
0 · • 000 • 00 ·· 00··
- 12 •0 ···· 0 ·
0 0·
0 • · • · ·
•
Příklady provedení vynálezu
Úvod
Tento příklad popisuje konstrukci nového expresního vektoru, který umožňuje produkci fúzních proteinů Dictyostelium discoideum. Využívá se schopnosti diskoidinu I vázat se na materiál Sepharose-4B, čímž je možno dosáhnout téměř jediného kroku purifikačního postupu. Kódující oblast diskoidinu I je fúzována do několika forem genu CSP parazita malárie v expresním vektoru Dictyostelium, což umožňuje intracelulární akumulaci stejně jako částečnou sekreci prostřednictvím biochemické cesty, která není spojená s endoplasmatickým retikulem a Golgiho aparátem. Fúzní proteiny přítomné v buněčných extraktech byly čištěny afinitní chromatografií na kolonách Sepharose-4B. Přídavek signálního peptidu umožňuje směrování do endoplasmatického retikula a glykosylaci fúzního proteinu. Zavedení trombinového štěpícího místa umožní odštěpení diskoidinu od proteinu CSP. Použití stabilního a laciného materiálu Sepharose 4B jako afinitní matrice by mělo umožnit přípravu ve velkém měřítku.
Materiály a metody
1. Použitá reakční činidla
Nitrocelulózové membrány byly od firmy Schleicher & Schuell (Dassel, Germany). Reagencie pro ECL-westernový přenos byly získány od firmy Amersham.
Použitý materiál Sepharose 4B pocházel od firmy Pharmacia (Uppsala, Švédsko). D(+)galaktóza, protein A konjugovaný s peroxidázou, tunicamycin a lidský trombin byly získány od firmy Sigma (St. Louis, MO). Peptid: N-glykosidase F (PNGáza F) byl získán od firmy New England Biolabs (Beverly, MA) a inhibitory proteázy od firmy Boehringer (Mannheim, Germany).
·· ·· ·· ···· • · · · · · · • · · · · ···
Kozí antimyší imunoglobuliny konjugované s peroxidázou byly od firmy Nordic Immunological Laboratories (Tilburg, Nizozemí). Imunoglobuliny proti opakující se sekvenci (NANP)3 byly čištěny z hybridomových buněk SP3E9 (Boulanger, N., Matile, H., a Betschart,
B. (1988); Formation of the circumsporozoite protein of Plasmodium falciparum in Anofeles stephensi; Acta Tropica 45, 55 - 65).
Bylo získáno antigenní myší sérum IV-4 proti syntetickému peptidů obsahujícímu aminokyseliny 282 - 382 z karboxylové oblasti F\ falciparum CSP (Roggero, M. A., Filippi, B., Church, P., Hoffman, S. L., Blum-Tirouvanziam, U., Lopez, J. A., Esposito, F., Matile, H., Reymond, C. D., Fasel, N., a Corradin, G. P. (1995); Synthesis and immunological characterization of 104-mer a 102-mer peptides corresponding to the N- and C-terminal regions of the Plasmodium falciparum CS protein; Molecular Immunology 32, 1301 - 9). Bylo připraveno také antigenní myší sérum J-lll proti syntetickému peptidů obsahujícímu aminokyseliny 277 - 344 z karboxylové koncové oblasti P. yoelii CSP (M. A. Roggero a G. P. Corradin, nepublikované výsledky).
2. Konstrukty DNA
Konstrukt Dis-Pf150 se odvozuje od pEDII-CS150 (Reymond, C.
D., Beghdadi, R. C., Roggero, M., Duarte, E. A., Desponds, C., Bernard, M., Groux, D., Matile, H., Bron, C., Corradin, G., a další (1995); Anchoring of an immunogenic Plasmodium falciparum circumsporozoite protein on the surface of Dictyostelium discoideum; J. Biol. Chem. 270, 12941 -7), ve kterém je diskoidinový promotor nahrazen promotorem aktin 6 a signální peptid CsA je nahrazen kódující oblastí diskoidinu la. Promotor aktin 6 byl amplifikován PCR z plasmidů pDNeoll (Witke, W., Nellen, W., a Noegel, A. (1987); Homologous recombination in the Dictyostelium alpha-actinin gen leads to an altered mRNA a lack of the protein; EMBO J. 6, 4143 - 14 • 444 • 4 4 4 4444 ·· 4444 44 444
4148) s použitím oligonukleotidu 5’GCGCTCGAGACTAGAGAGG-TTTATTTTTAA3’, jako 5’amplimeru, který hybridizuje s 20 nukleotidy promotoru aktin 6 a obsahuje restrikční místo Xhol proti směru exprese vzhledem k této sekvenci. Jako 3’amplimer byl použit oligonukleotid 5’TTCTCTAGACATTTTATATTATATTTATTTATTTG3’. Ten hybridizuje s 23 nukleotidy promotoru aktin 6 a obsahuje iniciační kodon ATG a restrikční místo Xbal.
Amplifikovaný fragment začíná na nukleotidu 1663 a končí iniciačním kodonem ATG (nukleotid 948). Po dvojím štěpení Xhol/Xbal byl fragment DNA vložen do vektoru pEDII-CS150 , ze kterého byl odstraněn úsek Xhol/Xbal obsahující diskoidinový promotor.
Kódující oblast diskoidinu la byla amplifikována použitím BamHI linearizovaného plasmidu pWR7 (Poole, S., Firtel, R. A., Lamar, E., a Rowekamp, W. (1981); Sequence and expression of the discoidin I gen family in Dictvostelium discoideum; J. Mol. Biol. 153, 273 - 289) jako templátu a 5’ATGTCTAGACAAGGTTTAGTTCAACTCCTCG3’ a 5’CATGAATTCTGGATCCGAACCACGTGGAACTAATTCCAAAGCGG-AGCAATGT3’ jako 5’, popřípadě 3’amplimerů. 5’amplimer odpovídá prvním 33 bázím diskoidinové kódující oblasti a poskytuje štěpící místo Xbal. 3’amplimer začíná 33 bázemi počínaje restrikčním místem EcoRI a kódující sekvencí trombinového štěpícího místa, optimalizovanou pro použití kodonu D. discoideum, následovanou úsekem hybridizujícím s alespoň dvaceti bázemi kódující oblasti diskoidinu. Fúzní gen kóduje polypeptid o délce 629 aminokyselin obsahující specifickou sekvenci (tag) diskoidinu (Meti až Met25z) a fragment CSP P. falciparum (Leu19 až Cys382), o délce 364 aminokyselin, mezi něž bylo zavedeno trombinové rozpoznávací místo o délce 8 aminokyselin (LVPRGSAP).
Pro dosažení exprese C-koncového segmentu P. falciparum CSP o délce 101 aminokyselin (Lys282 až Cys382) byla amplifikována odpovídající DNA z genu CS NF54 (Caspers, P., Gentz, R., Matile, H., Pink, J. R., a Sinigaglia, F. (1989); The circumsporozoite protein gen
- 15 from NF54, a Plasmodium falciparum isolate ušed in malaria vaccin trials. Molecular & Biochemical Parasitology 35, 185 - 9) s použitím 5’GGTGGATCCAGGAATTCAAAAAAACAATCAAGGTAATGGA3’ a 5’AAGCGAGCTCTTAACATMCCATMACAAAT3’, jako 5’, popřípadě 3’amplimerů.
5’amplimer hybridizoval s 21 nukleotidem genu CSP proti směru exprese vzhledem k sekvenci CSP obsahoval 5’amplimer restrikční místo BamHI a 10 nukleotidů reprezentujících štěpící místo EcoRI a kódujících aminokyseliny G, I a Q.
3’amplimer hybridizoval s 22 nukleotidy genu CSP a umožňoval inzerci in-frame UAA a restrikčního místa Sací do genu. Po dvojím štěpení BamHl/SacI byl získaný fragment použit pro náhradu odpovídajícího inzertu v expresním vektoru DisPf150. Získaný gen kóduje polypeptid o délce 369 aminokyselin obsahující 257 zbytků specifické sekvence (tágu) diskoidinu, 8 zbytků trombinového štěpícího místa a 108 aminokyselin genu CS.
Konstrukt Dis-PyCter byl získán podobným způsobem jako DisPfCter s tím rozdílem, že produkt PCR kódující C-koncový segment (Asn277 až Ser345) genu CS byl amplifikován z P. yoelii 17X (de la Cruz, V. F., Lal, A. A., a McCutchan, T. F. (1988); Variation among circumsporozoite protein genes from rodent malarias; Molecular & Biochemical Parasitology 28, 31 - 8) DNA a použit pro náhradu inzertu BamHl/SacI v expresním vektoru Dis-Pf150. Jako 5’, popřípadě 3’amplimery byly použity následující dva oligonukleotidy:
5’GGTGGATCCAGGAATTCAAAATGAAGATTCTTATGTCCCA3’
5’CGTACGAGCTCTTAAGATATCAATGAACAMATCCATMAC3’.
5’amplimer hybridizoval s 21 nukleotidem genu CSP. Proti směru exprese vzhledem k sekvenci CSP obsahoval 5’amplimer restrikční místo BamHI a 10 nukleotidů reprezentujících štěpící místo EcoRI a kódujících aminokyseliny G, I a Q.
- 16 3’amplimer hybridizoval s 20 nukleotidy genu CSP a umožňoval vložení 12 dalších nukleotidů do genu obsahujících štěpící místo EcoRV a kódujících linker Lys-lle-Ser mezi aminokyselinami L, I, S a in-frame stop kodon UAA proti směru exprese vzhledem k restrikčnímu místu Sací. Získaný gen kóduje polypeptid o délce 340 aminokyselin včetně sekvence obsahující diskoidinové a trombinové místo o délce 257 + 8 zbytků následované 79 zbytky P, yoelii CSP.
Expresní vektor fúzního proteinu Dis-PyCter obsahující aminokoncový signální peptid translokace do endoplasmatického retikula (PS-Dis-PyCter) byl odvozen z expresního vektoru Dis-PyCter (popsaného výše), ve kterém byl promotor aktin 6 nahrazen promotorem aktin 15 (Knecht, D. A., Cohen, S. M., Loornis, W. F., a Lodish, H. F. (1986); Developmental regulation of Dictyostelium discoideum actin gen fusions carried on low-copy and high-copy transformation vectors; Mol. Cell. Biol. 6, 3973 - 3983), následovaným sekvencí signálního peptidů PsA D. discoideum (Early, A. E., Williains, J. G., Meyer, Η. E., Por, S. B., Smith, E., Williains, K. L., a Gooley, A. A. (1988); Structural characterization of Dictyostelium discoideum prespore-specific gen D19 and of its product, cell surface glycoprotein PsA; Molecular & Cellular Biology 8, 3458 - 66). Úvodní peptid PsA II. discoideum (aminokyseliny 1-21) byl amplifikován PCR z vektoru pMUW1630 (K. Williams a M. Slade, School of Biological Sciences, Macquarie University, Sydney, Austrálie) s použitím amplimerů 5’AGCTCGAGATTCACAAATTAATTAATCCCATC3’ a
5’AATCTAGATTCATATGCATTGGCGTATGTTAA3’, jako 5’ a 3’amplimerů.
5’amplimer hybridizoval s 20 nukleotidy promotoru aktin 15 a obsahuje restrikční místo Xhol proti směru exprese vzhledem k této sekvenci. 3’amplimer hybridizoval s 24 nukleotidy genu PsA a obsahuje štěpící místo Xbal ve směru exprese vzhledem k této sekvenci. Po amplifikaci a štěpení restrikčními enzymy Xhol a Xbal byl • · · · ·· ·«· · ·· *··· · · · · · · · · 444·· 44 •44 44 444 _ ί7 - ···.·. ·· ... .· · fragment DNA vložen do vektoru Dis-PyCter pro náhradu promotoru aktin 6.
Hotový vektor kóduje protein počínající první skupinou 21 aminokyseliny proteinu PsA (štěpení úvodního peptidu probíhá za zbytkem 19) fúzovaný k druhé aminokyselině diskoidinů la (poloha aminokyselin 3 T -> R). Štěpení signálního peptidu při zpracování (procesingu) proteinu vede k fúznímu proteinu, který je pouze o jednu aminokyselinu delší než protein získaný expresí konstruktu DisPyCter.
Zkrácená forma Dis-Pf150 (74-229) DisPf150 byla zkonstruována amplifikací oblasti DNA kódující zbytky diskoidinů la Val74 až ASP229 v Dis-Pf150 pomocí PCR s použitím následujících oligonukleotidů (3’, popřípadě 5’amplimery):
5’AATCTAGAGTTGCTGCTCTCCAAGGTCGTGGT3’
5’AGGGATCCATATCGAAACCMGGTGGTAATGTT3’.
Produkt PCR byl vložen dále do promotoru aktin 6 podobným způsobem jako byl vytvořen DisPf150, zatímco signální peptid byl nahrazen zkrácenou formou diskoidinů I.
3. Kultivace a transfekce buněk
Buňky D, discoideum axenického řetězce AX2 byly transfekovány elektroporací plasmidy podle popisu v publikaci Anjard,
C., Pinaud, S., Kay, R. R., a Reymond, C. D. (1992); Overexpression of DdPK2 protein kinase causes rapid development and affects the intracellular cAMP pathway of Dictyostelium discoideum: Development 115, 785 - 790. Transformantní klony byly selektovány růstem za selekce G418 na nárůstu Micrococcus luteus PRF3 (Wilczynska, Z., a Fisher, P. R. (1994); Analysis of a complex plasmid insertion in a phototaxis-deficient transformant of Dictyostelium discoideum selected on a Microccocus luteus lawn. Plasmid 32, 182 - 94). Stabilní buněčné ···· · · · ··· • 9 · · · · · · ·· • · · · · · ···· -18- ...... ..... *.. · linie byly selektovány růstem buněk při 22 °C v médiu HL5 (Sussman,
M. (1987); Cultivation and synchronous morphogenesis of Dictyostelium under controlled experimental conditions; Meth. Cell Biol. 28, 929) v přítomnosti vzrůstajících koncentrací G418 až do 50 až 100 pg/ml.
4. Purifikace rekombinantních proteinů
Kultury byly pěstovány v médiu HL5 až do hustoty přibližně 7 x 106 buněk/ml. Buňky byly sklizeny pětiminutovou centrifugací při 300 g a potom byly resuspendovány v lyzačním roztoku v koncentraci 2 χ 108 buněk/ml. Lyzační roztok obsahoval 1% Triton X-100, 5mM benzamidin, 0,1 U/ml aprotininu, 50 pg/ml inhibitoru trypsinu a 2 pg/ml antipainu v TBS (25mM Tris, pH 7,4, 137mM NaCl, 2,7mM KCI). Po jednom cyklu zmrazení a roztáni byly lyzáty centrifugovány 15 min při 10 000 g při 5 °C. Koncentrace CaCI2 v supernatantech byla upravena na 10mM a supernatanty byly potom naneseny na kolony s materiálem Sepharose-4B, které byly předem ekvilibrovány v lyzačním roztoku doplněném 10mM CaCb. Na 4 χ 108 buněk byl použit objem lože 1 ml. Kolony byly promyty dvacetinásobkem objemu TBS, 10mM CaCh s obsahem inhibitorů proteáz. Protein byl eluován 0,3M galaktózou v TBS, 0,7 objemu lože na frakci. Ve frakcích 2 až 4 bylo eluováno přibližně 90 % fúzního proteinu.
5. Gelová elektroforéza a imunopřenosy
15pl vzorky purifikačních frakcí nebo 2 pl rozpustné frakce počátečních lyzátů (celková frakce) byly připraveny použitím 3 x Laemmliho vzorkovacího pufru (Laemmli, U. K. (1970); Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4; Nátuře 227, 680 - 5) s obsahem 200mM DTT zahřátého na 80 °C po dobu 10 minut. Pro frakce, které projdou Sepharosou byl nanesený * · · · • · · · · • · ♦ · f ·
- 19 objem nastaven tak, aby bylo získáno stejné množství proteinu jako v celkové frakci. Protein byl detekován buď barvením CoomassieBlue/Bismarck Brown R (Choi, J. K., Yoon, S. H., Hong, Η. Y., Choi, D. K., a Yoo, G. S. (1996); A modified Coomassie blue staining of proteins in polyacrylamide gels with Bismark brown R; Analytical Biochemistry 236, 82 - 4) nebo barvením stříbrem (Morrissey, J. H. (1981); Silver stain for proteins in polyacrylamide gels: a modified proceduře with enhanced uniform sensitivity; Analytical Biochemistry 117, 307 - 10). Westernové přenosy byly prováděny polosuchým elektropřenosem na nitrocelulózu. Po blokování v PBS s obsahem 4 % odstředěného mléka byly membrány inkubovány v přítomnosti různých typů séra nebo monoklonálních protilátek, jako je protilátka Sp3E9 mproti syntetické opakující se sekvenci (NANP)5o, jak je ukázáno na obrázcích.
Po třech promytích v PBS, 0,02% Tween, byla membrána inkubována 1 hod v přítomnosti buď kozího antimyšího séra konjugovaného s peroxidázou při ředění 1/2000 v pufru PBS-mléko nebo proteinu A konjugovaného s peroxidázou. Po promytí membrány bylo imunitní barvení vyvoláno použitím kitu ECL podle instrukcí výrobce.
Výsledky
1. Exprese a purifikace intracelulárních proteinů s diskoidinovym tágem
Schopnost diskoidinu I být použit jako specifická sekvence (tag) pro purifikaci proteinu byla vyhodnocována jeho fúzí s fragmentem karboxylového konce proteinu CSP P. falciparum (PfCter) obsahujícím aminokyseliny 282 - 382 (obr. 1). Oblast kódující diskoidin I byla amplifikována PCR z genomické DNA a byla přidána vhodná restrikční místa pro vytvoření fragmentu kompatibilního s expresním vektorem Ελ discoideum (srv. Materiály a metody). Získaný vektor pAC6-Dis-PfCter
- 20 byl použit pro transformaci axenických buněk AX2 D. discoideum metodou elektroporace.
Po selekci stabilních transformantů pomocí G418 v koncentracích do 50 pg/ml byla analyzována exprese fúzního proteinu imunopřenosem a porovnávána s buňkami transfekovanými vektorem nesoucím pouze selekční markér (DP4) (Anjard, C., Pinaud, S., Kay, R. R., a Reymond, C. D. (1992); Overexpression of DdPK2 protein kinase causes rapid development and affects the intracellular cAMP pathway of Dictyostelium discoideum; Development 115, 785 790).
Myší sérum (IV-4) proti C-koncovému peptidů P. falciparum (Roggero, M. A., Filippi, B., Church, P., Hoffman, S. L., BlumTirouvanziam, U., Lopez, J. A., Esposito, F., Matile, H., Reymond, C.
D., Fasel, N., a Corradin, G. P. (1995); Synthesis and immunological characterization of 104mer and 102-mer peptides corresponding to the Na C-terminal regions of the Plasmodium falciparum CS protein; Molecular Immunology 32, 1301 - 9) detekovalo protein s molekulovou hmotností 44 kDa (44 000) na westernovém přenosu, přičemž tato velikost je očekávaná pro protein Dis-PfCter, který byl nepřítomen v kontrolním řetězci DP4 (obr. 2A). Přítomnost pruhu s nižší molekulovou hmotností ukazuje, že může probíhat bud’ částečná degradace nebo neúplná syntéza tohoto proteinu. Akumulace DisPfCter se lišila podle hustoty buněk a byla maximální při hustotě přibližně 7 x 106 buněk/ml.
Protokol purifikace diskoidinů I a II umožňoval částečnou purifikaci použitím chromatografie na materiálu Sepharose 4B (Simpson, D. L., Rosen, S. D., a Barondes, S. H. (1974) Discoidin, a developmentally regulated carbohydrate binding protein from Dictyostelium discoideum; Purification and characterization; Biochem. 13, 3487 - 3493) umožňující částečnou purifikaci Dis-PfCter (obr. 2A a C). Protein s molekulovou hmotností 44 kDa (44 000) (viz šipka) se • · · · ·· ···· · · • · · · « · · · · * • · · ····· ··
- 21 • · t · · « « · · ·· · ··· ·· · · · · · · · · eluoval z pryskyřice ve druhé a třetí frakci po přídavku 0,3M galaktózy spolu s endogenními diskoidiny (25 a 28 kDa, 25 000 a 28 000). Mezilehlý pruh s molekulovou hmotností přibližně 35 kDa (35 000) byl pozorován také, stejně jako na westernových přenosech. Nepřítomnost proteinů s molekulovou hmotností jak 44, tak i 35 kDa (44 000, popř. 35 000) ve frakcích DP4 (obr. 2B) ukázala, že pruhy barvené Coomassie blue byly skutečně Dis-PfCter nebo deriváty. Navíc ukázala eluce použitím gradientu galaktózy namísto 0,3M galaktózy, že jak diskoidin I, tak i rekombinantní protein se eluují společně mezi 200 a 220mM galaktózou, zatímco eluce diskoidinu II byla mírně posunuta směrem k vyšším koncentracím galaktózy (údaje nejsou ukázány). Použitím tohoto postupu bylo na litr kultury izolováno přibližně 1 až 2 mg fúzního proteinu, jak bylo zjištěno testy podle Bradforda (Bradford, Μ. M. (1976); A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding; Analytical Biochemistry 72, 248 - 54) a densitometrickou analýzou gelů barvených Coomassie (Choi, J. K., Yoon, S. H., Hong, Η. Y., Choi, D. K., a Yoo, G. S. (1996); A modified Coomassie blue staining of proteins in polyacrylamide gels with Bismark brown R; Analytical Biochemistry 236, 82 - 4). Vypočtený faktor purifikace je přibližně 30 x. Účinnost izolace kolísá mezi 50 a 70 %, při stanovení analýzou westernovým přenosem, v závislosti zejména na poměru Sepharose/protein použitém při experimentu. Jestliže vezmeme současně v úvahu oba tyto výsledky, je možno odhadnout, že Dis-PfCter představuje alespoň 1 % rozpustných proteinů D. discoideum.
Dále bylo analyzováno, zda by mohly být na Dis-tag navázány další proteiny, aniž by došlo k interferenci se schopností komplexu vázat se na sepharosu. C-koncová oblast CSP z P. yoelii (PyCter) má rozdílné aminokyselinové složení než PfCter (de la Cruz, V. F., Lal, A. A., a McCutchan, T. F. (1988); Variation among circumsporozoite protein genes from rodent malarias; Molecular & Biochemical
A ·
- 22 Parasitology 28, 31 - 8). DNA kódující zbytky 277 - 344 P, yoelii CSP byla klonována ve správném čtecím rámci s kódující sekvencí pro diskoidin I a získaný gen byl vložen pod řízení promotoru aktin 6. Pomocí myšího séra (J-111) proti karboxylovému konci P. yoelii CSP (viz Materiály a metody) byl detekován pruh o molekulové hmotnosti přibližně 35 kDa (35 000) v buňkách D. discoideum transformovaných plasmidem pAC6-Dis-PyCter (obr. 3A). Vazba fúzního proteinu DisPyCter na materiál Sepharose-4B a eluce galaktózou se podobala stejnému procesu s Dis-PfCter (obr. 3A), což umožňuje detekci proteinu s molekulovou hmotností přibližně 35 kDa (35 000) metodou barvení Coomassie blue. Protein Dis-PfCter se akumuloval v množství do přibližně 0,2 mg na litr kultury. Tyto výsledky tedy potvrdily použitelnost diskoidinu I jako specifické purifikační sekvence (tágu) pro purifikaci rekombinantních polypeptidů.
Pro zjištění, zda by mohly být použitím fúzního vektoru diskoidinu I exprimovány i větší proteiny, byl fúzován protein CS150, forma PfFCSP postrádající pouze poslední 23 aminokyseliny (Reymond, C. D., Beghdadi, R. C., Roggero, M, Duarte., E. A., Desponds, C., Bernard, M., Groux, D., Matile, H., Bron, C., Corradín, G., a další (1995); Anchoring of an immunogenic Plasmodium falciparum circumsporozoite protein on the surface of Dictyostelium discoideum; J. Biol. Chem. 270, 12941 - 7) do diskoidinu I a exprimován v D, discoideum. Ačkoli se tento protein exprimoval v nižší koncentraci než Dis-PfCter (přibližně 0,1 mg na litr), v imunopřenosech buněčných lyzátů byl detekován pruh s molekulovou hmotností přibližně 84 kDa (84 000) s použitím buď monoklonální protilátky SP3E9 proti opakující se sekvenci (NANP)3 (Boulanger, N., Matile, H., a Betschart, B. (1988); Formation of the circumsporozoite protein of Plasmodium falciparum in Anopheles stephensi; Acta Tropica 45, 55 - 65) (obr. 4A) nebo myšího séra proti CSP282-382 (údaje nejsou ukázány). Tento protein mohl být tedy čištěn
0
- 23 •0 00·· • 0 • ··♦
0 0 00 «00 00 0 0 0 0 0 0 ·00 00 afinitní chromatografií na Sepharose za podmínek podobných podmínkám popsaným pro Dis-PfCter a Dis-PyCter.
Pro další ověření specificity vazby fúzních proteinů na Sepharosu bylo deletováno prvních 73 aminokyselin diskoidinu I, a zkrácený peptid byl fúzován do P. falciparum CS 150 ((74-229) DisPf150). (74-229) Dis-Pf150 nebyl schopen vazby na Sepharose 4B, což ukazuje, že zbytky 1 až 73 na aminovém konci diskoidinu I jsou nezbytné pro jeho vazebnou aktivitu (obr. 4B).
2. Exprese a purifikace extracelulárních proteinů s diskoidinovou specifickou sekvencí (tágem)
Protože bylo ukázáno, že diskoidiny jsou uvolňovány D. discoideum (Barondes, S. H., Cooper, D. N., a Haywood-Reid, P. L. (1983); Discoidin I and discoidin II are localized differently in developing Dictyostelium discoideum; J. Cell Biol. 96, 291 - 296; Barondes, S. H., Haywood, R. P., a Cooper, D. N. (1985); Discoidin I, an endogenous lectin, is externalized from Dictyostelium discoideum in multilamellar bodies; J. Cell. Biol. 100, 1825 - 1833), byla testována přítomnost proteinů s diskoidinovou spedifickou sekvencí (Dis-tagged) v extracelulárním médiu a byla testována jejich schopnost afinity na materiál Sepharose 4B. V kultivačním médiu bylo možno pomocí westernových přenosů detekovat jak Dis-PfCter, tak i Dis-Pf150, přičemž bylo dosaženo hladin mezi 20 a 50 % z celkového vyprodukovaného fúzního proteinu (obr. 4C a neuvedené údaje). Potom bylo zjišťováno, zda je pro sekreci použitím deleční mutanaty, které schází prvních 72 aminokyselin diskoidin, nezbytná diskoidinová část. I když se protein (73-229) Dis-Pf150 akumuloval uvnitř buněk až do podobné koncentrace jako Dis-Pf150 s úplnou délkou, v extracelulárním médiu nebyl detekován žádný fúzní protein (obr. 4C). Tyto výsledky ukazují, že pro správný průběh sekrece je nutná integrita diskoidinové specifické sekvence (tágu).
- 24 •· »**· • 0 • 000
004 00 «00
0· 0000 00 000 00
3. Adice signálního peptidu ER vede k N-glykosylaci Dis-PyCter
Způsob, který používají diskoidiny I a II pro proniknutí do extracelulárního prostoru, nebyl ještě úplně prozkoumán. Aminokyselinová sekvence diskoidinů obsahuje čtyři potenciální místa N-glykosylace Asn-X-Ser/Thr-X. Nepřítomnost signálního peptidu stejně jako nedostatek údajů týkajících se glykosylace diskoidinů ukazují, že protein se dostává do extracelulárního prostoru biochemickou cestou, která pravděpodobně nezahrnuje endoplasmatické retikulum (ER) a Golgiho aparát.
Aby bylo možno specificky směrovat fúzní protein do biochemické sekreční cesty ER/Golgiho aparát, signální peptid buněčného povrchového antigenu PsA D. discoideum (Early, A. E., Williains, J. G., Meyer, Η. E., Por, S. B., Smith, E., Williains, K. L., a Gooley, A. A. (1988); Structural characterization of Dictyostelium discoideum prespore-specific gen D19 and of its product, cell surface glycoprotein PsA; Molecular & Cellular Biology 8, 3458 - 66) byl fúzován do N-konce proteinu Dis-PyCter. Žádný protein SP-Dis-PyCter nebyl sekrenován (údaje nejsou ukázány). Navíc nebyl schopen protein SP-Dis-PyCter vázat se na Sepharose 4B (data nejsou uvedena). Protein SP-Dis-PyCter byl exprimován v podobné koncentraci jako Dis-PyCter při analýze westernovým přenosem, ale měl o přibližně 15 kDa (15 000) větší velikost než Dis-PyCter (viz obr. 5).
Roztíl 15 kDa (15 000) pozorovaný u buněčných lyzátů mezi SPDis-PyCter a Dis-PyCter je větší než 19 aminokyselin samotného signálního peptidu. Protože existují v diskoidinů I čtyři potenciální místa N-glykosylace (39-42 NGTN, 97-100 NLSW, 212-215 NQTR, 222-225 NITT) plus jedno další místo na exprimované sekvenci P. yoelii CSP (328-331 NLTL), přírůstek velikosti by mohl odrážet glykosylaci proteinu SP-Dis PyCter.
99
9 9 · 9
9 9 9
- 25 • · 9 9··
9 9 999 • ·φ · · 9 9 9
9 9 99 9 9 9 9 99 9 9
Skutečně také působení glykanázy F vedlo k posunu velikosti pruhu SP-Dis-PyCter směrem k velikosti 35 kDa (35 000) (obr. 5), těsně sousedící s velikostí Dis-PyCter. Pro kontrolu provedené zpracování Dis-PyCter, který postrádá signální peptid PsA, pomocí glykanázy F nevedlo ke změně migrace na elektroforéze SDS PAGE (obr. 5). Další potvrzení glykosylace proteinu SP-Dis-PyCter bylo získáno přidáním tunicamycinu blokujícího N-glykosylaci do kultivačního média, což vedlo k objevení forem s nižší molekulovou hmotností (údaje nejsou ukázány). Tyto výsledky ukazují, že přidání signálního peptidu k fúznímu proteinu vede ke směrování rekombinantního proteinu do ER/Golgiho aparátu, kde dochází k následné glykosylací.
4. Odstranění diskoidinové specifické sekvence (tágu)
Pro umožnění odstranění diskoidinového tágu z rekombinantního proteinu bylo vloženo mezi Dis-tag a C-koncový peptid P. yoelii trombinové štěpící místo (viz obr. 1). Jak je ukázáno na obr. 6, velikost rekombinantního proteinu klesala se vzrůstem koncentrací trombinu, což ukazuje, že diskoidinový tag může být odštěpen.
Diskuse
Fúze rekombinantních proteinů k diskoidinu I umožňuje odstranění většiny kontaminant v jednoduchém jediném kroku pouze s použitím materiálu Sepharose 4B. Integrita diskoidinové části je nezbytná, protože deleční mutanta nebyla schopna vázat se na afinitní pryskyřici. Pro všechny fúzní proteiny v cytosolu je diskoidinový tag zcela funkční co se týče vazby na Sepharosu, bez významného rozdílu v afinitě při srovnání s endogenním diskoidinem I. Tento purifikační systém je účinný, protože s výjimkou endogenních diskoidinů dochází
- 26 ·· ·♦·· ·· ·· • · · * · · · • · · · · · · · • · · ·· « · · ·· ···· ·· ··· ·· ke společnému zachycení pouze několika dalších proteinů při čištění, jak je vidět jak při barvení Coomassie, tak i při barvení stříbrem. Pro oddělení fúzních proteinů od diskoidinů může být do procesu zařazen další krok založený na odlišném postupu, jako je iontoměničová chromatografie, frakcionace podle velikosti nebo HPLC.
Ve výhodném provedení je diskoidinová specifická sekvence (tag) odstranitelná od fúzního proteinu, což umožní zachycení při druhém průchodu Sepharosou 4B. K tomuto účelu je mezi sekvence diskoidinů I a CSP zařazeno trombinové štěpící místo. Adice polyglycinových linkerů do sousedství proteázových rozpoznávacích míst může odstraňování specifické sekvence (tágu) diskoidinů I dále zlepšit.
Směrování rekombinantního produktu do extracelulárního prostředí zjednodušuje purifikaci a umožňuje sekndární modifikace. Vynález dále ukazuje, že směrování diskoidinového fúzního proteinu do ER a Golgiho aparátu přidáním úvodního peptidů o délce 21 aminokyselin z proteinu presporového antigenu PsA vede ke glykosylaci alespoň určité části potenciálních glykosylačních míst CSP P. yoelii (328-331 NLTL) a diskoidinů I (39-42 NGTN, 97-100 NLSW, 212-215 NQTR, 222-225 NITT).
Vynález ukazuje, že diskoidinová specifická sekvence (tag) může být použita pro purifikaci fúzních proteinů. Této vlastnosti může být využito v jiných expresních systémech od E. coli až po savčí buňky, za předpokladu, že se použije správných expresních vektorů a může tedy dojít ke změně některých kodonů. Kromě toho vynález dále ukazuje, že D. discoideum poskytuje atraktivní možnost produkce rekombinantních proteinů, buď jako složek subjednotkových vakcín, nebo pro další biotechnologické aplikace. Na rozdíl od mnoha typů bakterií není D, discoideum patogenní a neprodukuje enterotoxiny. Z tohoto důvodu by měla být značně zjednodušena purifikace proteinů určených pro injekce zvířatům nebo lidem. Imunizační experimenty ·· ·« • · · · • · ·
9
9 9
- 27 9 9 9999 • · t • · ··* • · · ·« ···· • · · ·· ··· · ·
999 ukázaly, že buněčné lyzáty nejsou toxické pro myší (Reymond, C. D., Beghdadi, R. C., Roggero, M., Duarte, E. A., Desponds, C., Bernard, M., Groux, D., Matile, H., Bron, C., Corradin, G., a další (1995); Anchoring of an immunogenic Plasmodium falciparum circumsporozoite protein on the surface of Dictyostelium discoideum; J. Biol. Chem. 270, 12941 - 7) nebo opice (N. Fasel, C. Reymond, a S. Herrera, nepublikované výsledky), což vytváří základ pro imunizaci lidí čištěnými polypeptidy bez rizika zachování stop toxických složek.
Kromě jednoduchých růstových požadavků a možnosti získání stabilních buněčných linií se vyznačuje D. discoideum různými vlastnostmi, které usnadní úpravu (procesování) ve srovnání s dalšími organismy, jako jsou bakterie a kvasinky. Nepřítomnost buněčné stěny umožní rychlou a snadnou lyži buněk jednoduchým zmražením a roztáním, která může být dosažena použitím malé koncentrace Tritonu X-100. To by mělo zjednodušit izolaci choulostivých proteinů v aktivní formě. Zavádění jednoduché purifikační metody založené na diskoidinové specifické sekvenci (tágu) a Sepharose-4B jako laciné matrice pro afinitní chromatografií, jak navrhuje předkládaný vynález, by mělo zvýšit přitažlivost D, discoideum v oboru biotechnologie.
Zastupuje:
00 ♦ • 00 0 0 0 • 0 0*0 • ··♦ 00 • • 0 • • 0
0 0 0 0 •
• •
• • 0 • « 0 0 •
00 0000 00 • 00 • 0 • ·
PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (17)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Expresní konstrukt pro výrobu rekombinantních polypeptidů, který zahrnuje expresní kazetu, skládající se alespoň z následujících operativně spojených prvků:
    a) promotoru;
    b) kódující oblasti DNA kódující galaktózový vazebný člen skupiny diskoidinových proteinů jako specifickou purifikační sekvenci, neboli tag;
    c) klonovacího místa pro příjem kódující oblasti produkovaného rekombinantního polypeptidu; a
    d) signálů ukončení transkripce.
  2. 2. Expresní konstrukt podle nároku 1, ve kterém je specifická purifikační sekvence neboli tag, umístěna v těsné blízkosti klonovacího místa, ve směru exprese vzhledem k promotoru.
  3. 3. Expresní konstrukt podle nároku 1 a 2, kde proteázové štěpící místo je umístěno mezi specifickou purifikační sekvencí neboli tágem, a klonovacím místem.
  4. 4. Expresní konstrukt podle některého z nároků 1 až 3, kde specifická purifikační sekvence neboli tag kóduje diskoidin la.
  5. 5. Expresní konstrukt podle některého z nároků 1 až 3, kde specifická purifikační sekvence neboli tag kóduje diskoidin II.
    99 9 • 99 • 9 9 99 • 9 9 9 9 9 99 9 9 9 9 • 9 9 · 9 9 9 9 9 9 9 • 9 9 9 9 9 9 99 9 9 9 9 9· 999 9 9 9 9
  6. 6. Expresní konstrukt podle některého z nároků 3 až 5, kde štěpícím místem je trombinové štěpící místo.
  7. 7. Expresní konstrukt podle nároku 6, kde trombinové štěpící místo obsahuje sekvenci DNA kódující sekvenci aminokyselin LVPRGSDP.
  8. 8. Expresní konstrukt podle některého z nároků 1 až 7 pro použití při způsobu výroby polypeptidů.
  9. 9. Expresní vektor obsahující expresní konstrukt podle některého z nároků 1 až 7.
  10. 10. Expresní vektor podle nároku 9 pro použití při způsobu výroby polypeptidů.
  11. 11. Způsob výroby polypeptidů, vyznačující se tím, ž e zahrnuje následující kroky:
    a) připraví se expresní vektor pro produkovaný polypeptid klonováním kódující sekvence tohoto polypeptidů do klonovacího místa expresního vektoru podle nároku 9;
    b) takto získaným expresním vektorem se transformuje vhodná hostitelská buňka;
    c) hostitelská buňka se kultivuje za podmínek umožňujících expresi fúzního polypeptidů tvořeného aminokyselinovou sekvencí specifické purifikační sekvence neboli tágu,
    - 30 • · ** ·« ··»· · · • · · · 9 9 9 » · » • · · »···· 9 9
    9 9 9 4 4 9 9 9 9
    99 9999 99 499 99 999 s kovalentně navázanou aminokyselinovou sekvencí exprimovaného polypeptidu; a
    d) z hostitelské buňky nebo kultivačního média se izoluje fúzní polypeptid pomocí vazby přítomného fúzního polypeptidu prostřednictvím aminokyselinové sekvence specifické purifikační sekvence neboli tágu na polysacharidovou matrici a provede se eluce fúzního polypeptidu z matrice; a
    e) odstraní se aminokyselinová sekvence specifické purifikační sekvence neboli tágu.
  12. 12. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že se použije vektor obsahující konstrukt podle některého z nároků 3 až 7 a odstranění specifické purifikační sekvence neboli tágu se provede odštěpením aminokyselinové sekvence specifické purifikační sekvence fúzního polypeptidu prostřednictvím štěpícího místa.
  13. 13. Způsob podle některého z nároků 11 nebo 12, vyznačující se tím, že jako matrice se použije materiál Sepharose 4B a eluce se provede galaktózou.
  14. 14. Způsob podle některého z nároků 11 nebo 12, vyznačující se tím, že jako polysacharidová matrice se použije agarózová matrice s konjugovanými Nacetylgalaktosaminovými skupinami a eluce se provádí galaktózou.
  15. 15. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, ž e matrice materiálu Sepharose 4B je ve formě kuliček.
    • 9 ·« • 999 999 99
    99 · 999*9 99
    - 31 999 99 999
    99 9999 99 999 99
  16. 16. Fúzní polypeptid připravitelný způsobem podle některého z nároků 11 a 13 až 15.
  17. 17. Polypeptid vyčištěný způsobem podle některého z nároků 12 až
CZ20004732A 1998-06-16 1999-06-16 Konstrukt pro expresi CZ20004732A3 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP98202018 1998-06-16

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ20004732A3 true CZ20004732A3 (cs) 2001-08-15

Family

ID=8233820

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20004732A CZ20004732A3 (cs) 1998-06-16 1999-06-16 Konstrukt pro expresi

Country Status (16)

Country Link
US (1) US6482607B1 (cs)
EP (1) EP1088083A1 (cs)
JP (1) JP2002518017A (cs)
KR (1) KR20010071342A (cs)
CN (1) CN1305531A (cs)
AU (1) AU762984B2 (cs)
CA (1) CA2333602A1 (cs)
CZ (1) CZ20004732A3 (cs)
HU (1) HUP0102562A3 (cs)
IL (1) IL140027A0 (cs)
NO (1) NO20006181L (cs)
NZ (1) NZ508676A (cs)
PL (1) PL345091A1 (cs)
RU (1) RU2241035C2 (cs)
WO (1) WO1999066053A1 (cs)
ZA (1) ZA200006387B (cs)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002540772A (ja) 1999-03-24 2002-12-03 ボード オブ リージェンツ， ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム 線状および環状発現エレメント
US7094345B2 (en) * 2002-09-09 2006-08-22 Cytonome, Inc. Implementation of microfluidic components, including molecular fractionation devices, in a microfluidic system
JP4891581B2 (ja) * 2005-09-02 2012-03-07 ゼライス株式会社 ポリペプチドの製造方法およびキット
ES2327309B1 (es) * 2008-04-02 2010-07-26 Consejo Superior De Investigaciones Cientificas (Csic) Proteinas de fusion con un dominio lectina de tipo beta-trebol, procedimiento de obtencion y sus aplicaciones.
US9115205B2 (en) 2010-10-18 2015-08-25 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Army Plasmodium falciparum circumsporozoite vaccine gene optimization for soluble protein expression
CN111057155A (zh) * 2019-12-31 2020-04-24 河南农业大学 O型fmdv vp1蛋白-铁蛋白融合蛋白、蛋白笼纳米颗粒及其制备方法
CN111116757A (zh) * 2019-12-31 2020-05-08 河南农业大学 带有半乳糖结合凝集素ew29标签的铁蛋白融合蛋白、蛋白笼纳米颗粒及其制备方法
CN111057156A (zh) * 2019-12-31 2020-04-24 河南农业大学 O型fmdv衣壳蛋白-铁蛋白融合蛋白、蛋白笼纳米颗粒及其制备方法
CN111171157A (zh) * 2019-12-31 2020-05-19 河南农业大学 A型fmdv 1d蛋白-铁蛋白融合蛋白、蛋白笼纳米颗粒及其制备方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL9100869A (nl) 1991-05-17 1992-12-16 Univ Lausanne Dictyostelide expressievector en werkwijze voor het tot expressie brengen van een gewenst eiwit.
US6051397A (en) * 1993-11-16 2000-04-18 Max Planck Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften DNA encoding MCK-10, a novel receptor tyrosine kinase

Also Published As

Publication number Publication date
EP1088083A1 (en) 2001-04-04
KR20010071342A (ko) 2001-07-28
IL140027A0 (en) 2002-02-10
HUP0102562A2 (hu) 2001-10-28
CA2333602A1 (en) 1999-12-23
JP2002518017A (ja) 2002-06-25
ZA200006387B (en) 2001-06-28
NO20006181D0 (no) 2000-12-05
RU2241035C2 (ru) 2004-11-27
AU762984B2 (en) 2003-07-10
PL345091A1 (en) 2001-12-03
HUP0102562A3 (en) 2005-10-28
NO20006181L (no) 2001-02-08
US6482607B1 (en) 2002-11-19
AU4514199A (en) 2000-01-05
CN1305531A (zh) 2001-07-25
WO1999066053A1 (en) 1999-12-23
NZ508676A (en) 2002-07-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100227167B1 (ko) 인체혈청알부민의 n-말단 단편을 함유하는 융합단백질
EP0511747A1 (en) Hybrid polypeptide containing an avidin binding polypeptide
JPH02501112A (ja) 免疫親和性による精製方法
CZ363796A3 (en) Polypeptide encoding dna structure, recombinant expression vector, yeast strain and process for preparing heterologous protein
JPS6143991A (ja) Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原およびその製造法
KR20190030263A (ko) 식물에서 단백질의 분리정제를 위한 재조합 벡터
CZ20004732A3 (cs) Konstrukt pro expresi
EP0307472B1 (en) Immunogenic recombinant yeast expression product and method for purifying it
AU686840B2 (en) Fusion proteins comprising GM-CSF and antigens and their expression in yeast
Schuster et al. Protein expression in yeast; comparison of two expression strategies regarding protein maturation
AU1776299A (en) Non-identical genes and their application in improved molec ular adjuvants
AU617668B2 (en) Immunogenic polypeptide and method for purifying it
JP3398380B2 (ja) ディクチオステリド発現ベクターおよび所望のタンパク質の発現方法
van Bemmelen et al. Expression and one-step purification of Plasmodium proteins in Dictyostelium
Waśniowska et al. Expression and binding properties of a soluble chimeric protein containing the N-terminal domain of the Duffy antigen
Vanheeke et al. Gene Fusions with Human Carbonic Anhydrase II for Efficient Expression and Rapid Single-Step Recovery of Recombinant Proteins: Expression of the Escherichia coli F1-ATPase ϵ Subunit
US5736358A (en) Dictyostelid expression vector and method for expressing a desired protein
JP2002000276A (ja) タンパク質のｏ−グリコシル化に関わるアミノ酸配列
KR20230143720A (ko) 식물에서 TGFbeta1 재조합 단백질의 생산 방법
Delano-Frier Expression of the prosystemincDNA in E. coli: Isolation, characterization and in situ localization of the prosystemin protein