JPH0853366A - N−グリコリル化ガングリオシドに対する免疫応答を誘発させるワクチン組成物および癌処置におけるその使用 - Google Patents
N−グリコリル化ガングリオシドに対する免疫応答を誘発させるワクチン組成物および癌処置におけるその使用Info
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Abstract
に対する免疫応答を誘発させるワクチン組成物およびこ
の組成物を癌の処置に使用することに関するものであ
る。 【構成】 本発明に係わるワクチン組成物は、場合に応
じて、適当な蛋白質または複合蛋白質からなる担体に、
非共有結合によりあるいは共有結合により、カプリング
させた、N−グリコリル化ガングリオシドおよび(また
は)その誘導体および(または)その相当するオリゴサ
ッカリドの適量およびさらにいずれか適当なアジュバン
トを含有するものである。
Description
法の分野に関するものであり、特にN−グリコリル化ガ
ングリオシド、特にN−グリコリルGM3 (NGcGM
3 )に対する抗体免疫応答を発現または増大させるため
のワクチン組成物に関するものである。このワクチン組
成物は、癌の予防および処置に使用することができる。
るスフィンゴ糖脂質であり、全ての哺乳動物の細胞膜で
発現される。これらは、サッカリド極性部分と疎水性セ
ラミド(スフィンゴシンと長鎖状脂肪酸)からなる。こ
れらの化合物は、細胞外膜に整合している脂質2層内に
挿入されており、そのオリゴサッカリド鎖は外側周辺に
露出している。ガングリオシドの発現は、種々の細胞の
分化段階および増殖様相により変化する。腫瘍形質転換
中に生じる分化または脱分化は、ガングリオシドの分布
において生じる変化を付随する。
のガングリオシドの発現は、種に限定されている。これ
らのガングリオシド(これは好中球と称される)は、N
−グリコリルノイラミン酸を含有し、ヒトおよびニワト
リを除く、大部分の種の動物(マウス、ラット、イヌ、
ウマ、ブタなど)に存在している。N−グリコリル化ガ
ングリオシドのこの「非自己性」(“non sel
f”)特徴は、これらの化合物のヒトにおける免疫原性
にとって、非常に重要な意味を有する。この事実は、或
る種の病気の処置にウマ血清が実際に慣用であった時代
に、HanganatziuおよびDeicher(H
−D)により、20人で間接的に見出だされた。
る病気を発病していた。かれらの血清は、ウマ抗血清の
成分および異なる種の赤血球と反応することが示され
た。後に、これらのH−D抗原は、ウマ赤血球ガングリ
オシドとして抽出され、それらの主要エピトープはNG
aNAα(2→3)Galβ(1→4)Glc(1→
R)として同定された。培養ヒト腫瘍細胞およびH−D
抗血清を用いて行われた実験により、これらの抗原が一
群のヒト腫瘍に存在することが証明された。従って、腫
瘍特異性抗原であることが見出だされたものと見做され
た。
る細胞培養実験および腫瘍生検試料中のガングリオシド
エキス中の脂質結合したNGcNAの存在の確認が、ガ
スクロマトグラフイ−質量分析技術により行われ、被験
試料中のN−グリコリル化ガングリオシドの濃度が、総
シアル酸の0.05%以下であることが示された(Fu
rukawaらによる、J.Biol.Chem.26
3、18507)。上記結果から、N−グリコリル化ガ
ングリオシドは、癌の免疫療法のターゲットとしては実
用的価値がないものとする、現在の認識が誘導された。
であるらしいことが証明される。乳癌には、比較的大量
のN−グリコリル化ガングリオシドが存在する(キュー
バ国特許出願No.131/93)。ガングリオシドを
伴う腫瘍が、主として神経外胚葉由来腫瘍の処置実験の
ターゲットとして使用された(Ganglioside
s and Cancer、H.F.Oettgen編
集、1989、7頁)。これらの実験は、一般に2つの
原則、すなわち特定のmAbによる受動免疫療法、およ
び対象ガングリオシドによる能動免疫感作、に基づくも
のである。
を用いる免疫感作プロトコールが、メラノーマの患者に
施された。IgMおよびIgGイソタイプの抗−GM2
抗体の存在が、これらの患者で証明された。高力価を有
する患者は、さらに15ヶ月の遅延再発を示した(Li
vingstonらによる(1989)、Cancer
Res.49、7045−7050)。さらにまた、
メラノーマの患者における初期臨床試験が行われた。単
独またはリポソーム中に封入された、第一期腫瘍細胞か
ら得たガングリオシドの混合物による免疫感作は、ガン
グリオシドGM3 、GD3 、GM2 および9−O−アセ
チルGD3 に対して、主としてIgGイソタイプの低い
抗体力値を示した。
復免疫感作により維持することはできず、あるいは増加
させることもできなかった。しかしながら、免疫応答を
有する患者は、もう一度統計学的に有意の再発遅延を示
した(Portoukalainらによる(199
1)、Int.J.Cancer、49、893−89
9)。ガングリオシドに対する免疫応答を改善するため
に、蛋白質−GM2 ガングリオシド複合体、とくにKL
H−GM2 を使用して、メラノーマの患者の臨床試験が
開始された。
IgM抗体力価の発現およびエフェクター品質を有する
特異的IgG抗体の存在を示したが、この免疫応答は、
典型的なT細胞依存性抗原二次応答ではなかった(Li
vingston(1993)、Proceeding
s of the Conference“Speci
fic Immunotherapy of Canc
er with Vaccines”、The N.
Y.Academy of Science;abs
t.24)。別の担体、例えばナイゼリア メニンギチ
ジス(Neisseria meningitidi
s)のOMPC(外膜複合蛋白質)に、疎水性結合また
は共有結合によりカプリングされたGD3 を使用する、
マウスにおける免疫原性に係わる最近の実験では、ガン
グリオシドに対する免疫応答の質的改善には成功しなか
った。これは多分、GD3 の「自己」抗原の特徴が、主
としてT細胞依存性抗原に類似した特徴を有する免疫応
答の隠蔽を生じさせたものと見做された(Living
stonらによる(1993)、Vaccine 1
1、1199−1204)。
けるその発現の利点を考慮すると、N−グリコリル化ガ
ングリオシドに由来する治療用ワクチンは、ヒト乳癌の
処置に有効であることができる。ワクチンの開発には、
適当な抗原供給源の同定が重要である。N−グリコリル
化ガングリオシドに係わり、この特徴を有する天然源は
開示されたことはない。別の手段として、N−グリコリ
ル化ガングリオシド誘導体の総合成が提案された(Og
awaらによる、米国特許No.4950750)。こ
の別の手段は、都合の良い手段ではない。これは、ガン
グリオシド誘導体に対して得られる抗体が一般に、元の
ガングリオシドを認識しないからである。
然供給源を提供するものである。GM3 およびNGcG
M3 は、mAbsの工業的生産に使用されるハイブリド
ーマ細胞の主要ガングリオシドであり、このことは、本
発明の治療用ワクチンの成否にとって重要なことであ
る。その蛋白質担体としての使用が、宿主免疫系の免疫
ターゲット設定および活性化という利益をもたらすにも
かかわらず、複合ワクチンの蛋白質担体としてのモノク
ローナル抗体の使用は、一般にほとんど行われたことは
なく、また癌治療用ワクチンにおける使用は全く開示さ
れたことはない。
疫抗体応答を刺激または増大させるワクチン組成物を提
供する。従って、本発明の目的は、癌の予防用または処
置用のワクチン組成物であって、適当な担体にカプリン
グさせた(疎水性結合または共有結合による)、純粋な
N- グリコリル化ガングリオシド、主としてNGcGM
3 および(または)その誘導体および(または)その相
当するオリゴサッカリドの有効量および例えば天然由来
のまたはモノクローナル抗体(mAb)であることがで
きる、アジュバントを含有するワクチン組成物を提供す
る。
ドの適当な生物学的供給源として、モノクローナル抗体
の工業的産生に使用されたハイブリドーマ バイオマス
を使用することにある。本発明の重要な特徴は、mAb
sの工業的産生から得られるハイブリドーマバイオマス
から、N−グリコリル化ガングリオシドを得ることにあ
る。特に、乳房腫瘍に存在する抗原であるNGcGM3
を、この方法で得ることができる。このガングリオシド
および(または)その誘導体および(または)その相当
するオリゴサッカリドを、疎水性結合性または共有結合
性担体蛋白質、特にmAbsにより、適当な担体にカプ
リングさせる。
の採取 Hakomoriの方法(Hakomoriらによる、
Methods in Enzymology、vo
l.32、PartB、350(1974))の変法を
用いて、発酵槽におけるmAbsの工業的生産から得
た、ハイブリドーマバイオマスを処理する。培養培地の
濾過により得られたバイオマス(0.5−1kg)を、
メタノール2−5リットルとともに均質にした。その後
に、メタノール2−5リットルをさらに添加し、次いで
還流の下に、5−20時間抽出した。
透明な液体を−20℃ないし−70℃で48時間放置し
た。この沈殿を、4℃で遠心分離により採取し、中程度
のアルカリ処理に付する(0.2N NaOH−MeO
H、37℃、1−7時間)。その後に、0.2N HC
l−MeOHにより中和し、次いで40℃の温度で、濃
縮乾燥させた。4℃において、炭酸塩緩衝液(pH7)
に対して過度に透析処理し、次いで凍結乾燥させた。
macia、スエーデン国)Ac−型において、MeO
H中の0.02M NaAcにより溶出する、イオン交
換クロマトグラフイにより(マトリックス容積/使用試
料:1mL DEAE−セファデックス/NANA0.
1−1μmol)、モノシアロガングリオシドフラクシ
ョンを得る。4℃で透析によって脱塩した後に、このフ
ラクションを凍結乾燥させる。このガングリオシドGM
3 およびNGcGM3 の精製は、シリカゲル60(23
0−400メッシュ、Merck、ドイツ国)を用いる
吸着クロマトグラフイにより行う。
を、平衡化し、次いでCCl3 H:MeOH:2.5M
NH3 (v/v)65:25:4により溶出する。G
M3 およびNGcGM3 をそれぞれ単独で含有するフラ
クションを混合し、次いで乾燥させる。10×20cm
シリカゲル60プレート(Merck、ドイツ国)およ
びCCl3 H:MeOH:0.25%KCl中2.5M
のNH3 (50:40:10)を使用するHPTLCに
よりカラムを追跡し、レゾルシノール試薬により染色す
る(Sevnnerholm L.;Biochem.
Biophys.Acta、24(1957)、604
−611)。ガングリオシドの定量分析をまた、レゾル
シノール法により行う。20−60mgの量のGM3 お
よびNGcGM3 が得られる。
用することができる:腫瘍中に存在するN−グリコリル
化ガングリオシド;それらの還元性末端が種々のスペー
サーにより適当に修飾されており、これにより当該免疫
系の各種成分に対するそれらの接近が改善されている、
それらのオリゴサッカリド;またはそのセラミド中に、
担体蛋白質への共有結合を可能にする、官能性基(アミ
ノ基、カルボキシル基またはアルデヒド基)を導入する
ことによって修飾されている、これらのガングリオシド
の誘導体。担体蛋白質としては、いずれか生理学的に耐
容性の蛋白質を使用することができる。これらの担体
は、いずれか慣用の結合方法(SPDP、カルボジイミ
ド、還元性アミノ化、等)を用いて、前記抗原への共有
結合を可能にする、遊離のアミノ基およびカルボキシル
基を有するべきである。
バクテリア、例えばナイゼリアメニンギチジス、の外膜
蛋白質は、適当な担体蛋白質である。公知の一級アミノ
酸配列を有する、これらの蛋白質の場合には、適当な結
合法の選択に、ヘルパーT細胞エピトープの予想に係わ
り開示されている、いくつかの数学的アリゴリズムを使
用することができる。これによって、抗原の結合によっ
て生じる、これらのエピトープの可能な損傷が回避され
る。本発明の場合には、Margalitらにより開示
されたアリゴリズムが使用された(J.Immuno
l.138、2213−2219、1987)。
ら形成されるプロテオリポソームの成分として、天然ガ
ングリオシドを使用する。このタイプの免疫原の調製に
は、ナトリウム デオキシコレート(0.1−1%)ま
たはドデシル硫酸ナトリウム(0.1−1%)またはB
rij96(0.1−1%)を使用する、N.メニンギ
チジスのプロテオリポソームの予備分散液が必要であ
る。この分散は、超音波浴中で10−30分間行い、次
いで5−20倍過剰のガングリオシド(あるいはガング
リオシドを多価ワクチンにするガングリオシド)を含有
する溶液を加える。生成する分散液を再度、5−20分
間超音波処理し、次いで室温で30分間放置する。最後
に、デタージェントが消失するまで、透析する。
な組成は、蛋白質の質量単位当たりで2−5個のガング
リオシドの含有を示すものである。最も効果的なガング
リオシド用量は、10−400μgである。結合免疫原
(担体蛋白質に共有結合した抗原)の構築においては、
ガングリオシドオリゴサッカリドまたは構造的に修飾さ
れているガングリオシドを使用する。抗原として、ガン
グリオシドオリゴサッカリドが使用される場合には、ス
ペーサー アームを加えて、距離を長くし、これによっ
てこれらを免疫系でさらに利用できるようにし、そして
また潜伏(cripticity)を回避しなければな
らない。
1個の遊離アミノ基を有し、かつまた他の一端にカルボ
キシル基またはアミノ基を有する、脂肪族化合物を使用
することができる。このスペーサー試薬の糖へのカプリ
ングは、還元剤として水素化シアノホウ素ナトリウムを
使用する、還元的アミノ化反応により行われる(Sto
ll M.Sらによる、Biochem.J.、25
6,661−664,1988)。代表的反応条件は次
のとおりである:オリゴサッカリド(5−25μmo
l)、スペーサー アーム(250−1250μmo
l)、水素化シアノホウ素ナトリウム(5−25m
g)、室温(40−70℃)および反応時間(24−7
2時間)。
ッカリドを次いで、オリゴサッカリドよりも3−5倍モ
ル過剰のN−スクシンイミジル3−(2−ピリジルジチ
オ)プロピオネート(SPDP、Carlsson
J.、Biochem.J.、173,723−73
7,1978)に、室温で6−10時間カプリングさせ
る。次いで、このSPDPに室温で4−12時間の反応
により、オリゴサッカリドよりも3−5倍モル過剰の担
体蛋白質をカプリングさせる必要がある。
−50mMのジチオスレイトール溶液を使用して、室温
で1−5時間行う。このアミノ化オリゴサッカリド−S
PDPと還元された蛋白質−SPDPとの引き続くカプ
リングは、この糖を、蛋白質中の遊離アミノ基の数に対
して2−5モル過剰で使用する反応で行う。この反応
は、室温で24−72時間行う。これらの条件の下に、
10−100モルのオリゴサッカリド(またはその均等
物)が、担体蛋白質にカプリングされる。多価ワクチン
に使用されるべき免疫原を構築するための、もう一つの
方法には、前記の2工程が包含される:1個または2個
以上のガングリオシドが非共有結合されているプロテオ
リポソームの形成およびスペーサー アームが結合され
ているガングリオシドからの1個のオリゴサッカリドの
共有結合。
びNGcGM3 の単離 モノクローナル抗体 ior t3の発酵製造業者(C
IMAB S.A.、キューバ国)から得たハイブリド
ーマ バイオマスを、Hakomoriの方法の変法を
用いて処理した(Hakomoriらによる、Meth
ods inEnzymology、vol.32、P
artB、350(1974))。
ーマ バイオマス(500g)を、ホモジナイザーを用
いて、メタノール(2.5リットル)と均質化した。さ
らにメタノールを添加し(2.5リットル)、次いで還
流の下に、10時間抽出を行った。このエキスを熱いう
ちに濾過し、得られた透明な液体を−20℃で2日間放
置した。沈殿を、4℃で遠心分離により採取し、中程度
のアルカリによる処理に付した(0.2N NaOH/
MeOH、37℃、2時間)。0.2N HClにより
中和した後に、回転蒸発器で乾燥させ、得られた固形物
を4℃で炭酸塩緩衝液(pH7)に対する過度の透析に
より脱塩させた。この透析生成物を凍結乾燥させた。
は、DEAE−セファデックスA−25(Ac- )にお
いて、溶出剤としてMeOH中の0.02M NaAc
を用いる、DEAE−セファデックスA−25(A
c- )におけるイオン交換クロマトグラフイによって得
た。このフラクションを透析により脱塩させた後に、凍
結乾燥させ、CCl3 H:MeOH:2.5M NH3
(65:25:4)中に再溶解し、次いで35gのシリ
カゲル60のカラムに適用した。このカラムをCCl3
H:MeOH:2.5M NH3 (65:25:4)の
混合物により溶出して、相当するガングリオシド フラ
クションを得た。
で含有するフラクションを混合し、次いで回転蒸発器を
用いて乾燥させた。シリカゲル分離からの相違するフラ
クション中のガングリオシド含有量の測定は、CCl3
H/MeOH/0.25%KCl中2.5MのNH
3 (50:40:10)溶剤系およびレゾルシノールに
よる染色を使用して、シリカゲル60プレートにおける
高速薄層クロマトグラフイ(HPTLC)により行っ
た。、GM3 30mgおよびNGcGM3 24mgが得
られた。
白質(OMPC)に対するガングリオシドNGcGM3
の非共有カプリングに基づく免疫原の調製 Carlos J.Finlay Institute
から入手したN.メニンギチジスのOMPCを使用した
(C.CampaらによるEP301992)。このO
MPC10mgを、超音波浴中で10分間、ナトリウム
デオキシコレートの0.3%溶液中に分散させた。次い
で、NGcGM3 ガングリオシド20mgを含有する溶
液を添加した。生成する分散液を再度、5分間超音波に
さらし、次いで30分間放置した。
−NGcGM3 の分離は、100KD膜を使用する5日
間の透析により行った。ガングリオシドの蛋白質への結
合の度合いを蛋白質用のBio−Rad試薬およびシア
ル酸用のレゾルシノールを使用して測定した。NGcG
M3 2mg/OMPC 1mgの結合が得られた。
リゴサッカリド部分のP3ネズミmAbへの共有結合に
基ずく、免疫原(ネオグリコプロテイン)の調製 a)NGcGM3 のオリゴサッカリド成分(NGcGM
3 OS)の単離 NGcGM3 10mgを、超音波器の補助の下に、Me
OH4mL中に溶解し、次いで10分間、オゾンにより
処理した(Weigandt H.およびBascha
ng G.Z.によるNaturforsch.、20
b:164−166、1965)。この溶液を、蒸発乾
燥させ、残留物を一夜にわたり撹拌することによって、
0.1M Na2 CO3 10mL中に分散させ、DOW
EX50W−X8により中性にし、次いで焼結ガラスロ
ートに通して濾過した。
し、その水性相をHPTLCにより試験して、その反応
の完了を測定した。オリゴサッカリドの存在は、適用時
点における陽性のレゾルシノール染色により評価した。
NGcGM3 OSの最終精製を、溶出剤として0.1M
HAcを使用して、セファデックスG−25カラムで
行った。最後に、NGcGM3 OSの構造を、H1 核磁
気共鳴および質量分析(FABスペクトル)により決定
した。
−ジオキソオクタン500μmol含有メタノール5m
L中に溶解し、アルゴンにより浄化し、次いで50℃で
2時間反応させ、その後にNaBH3 CN 10mgを
加え、反応を50℃で40時間継続させた。この反応混
合物を、アルゴン雰囲気の下に乾燥させ、次いでAcH
を添加して、過剰のNaBH3 CNを除去した。この修
飾されたオリゴサッカリドを、BiogelP−2カラ
ム内で脱塩処理し、次いでCM−セルロースカラムで精
製した(ZopfらによるMethods Enzym
ol.50:171−175、1978)。このアミノ
化誘導体の同定は、ピリジン−酢酸エチル−酢酸−水
(6:3:1:3)またはクロロホルム−メタノール−
0.2%塩化カルシウム(60:35:8)溶剤中で、
シリカゲル60プレートを使用するHPTLCにより行
い、オルシノールまたはレゾルシノール試薬により検出
した。
グ試薬N−スクシンイミジル3−(2−ピリジルジチ
オ)プロピオネート(SPDP)との反応 当該オリゴサッカリド10μmolを、100mMリン
酸塩緩衝溶液、0.1M NaCl、pH7.5中に溶
解し、次いでSPDP30−50μmolを添加し、室
温で6時間反応させた。得られた誘導体を、Bioge
lP2カラムを使用して精製した。得られた誘導体の同
定は、工程bと同一プレートを用いるHPTLCおよび
検出系により行った。
の反応 P3モノクローナル抗体(これは、脂質に結合した高特
異性N−グリコリルノイラミン酸により認識されるIg
M mAbである)10mgを、室温で100nMリン
酸塩緩衝溶液、0.1M NaCl、pH7.5中に溶
解した。この溶液に、SPDP5mgを加え、反応を8
時間継続させた。セファデックスG−50カラムにおい
て、0.1Mリン酸塩緩衝溶液(pH6.5)、5mM
EDTA溶剤系を用いて、P3−SPDPの分離を行
った。該当蛋白質を含有するフラクションを混合し、引
き続く工程で使用した。
トールによる還元 新たに生成されたジスルフィド架橋を還元するために、
0.1Mリン酸塩緩衝溶液(pH6.5)、5mM E
DTA中の25mMジチオスレイトール溶液を添加し、
次いで室温で2時間反応させた。得られた誘導体を、セ
ファデックスG−50カラムにおいて、前記と同一の溶
剤系を使用して分離した。P3にカプリングしたSPD
Pの数の計算は、この反応中に生成された遊離チオピリ
ジンを計算することによって推定した。この数の計算
は、分光光度計による343nmの波長における吸光の
増加の測定およびランバート−ビール(Lambert
−Beer)の法則の適用に基いている。7.06×1
0-9×M-1×cm-1のモル吸光係数を使用した。
られた蛋白質と反応させた。得られたネオグリコプロテ
インを、セファデックスG−50カラムを使用して、反
応生成物から分離した。蛋白質にカプリングした糖質の
量の測定は、糖質用のレゾルシノール試薬および蛋白質
用のBio−Rad試薬を使用して、シアル酸含有量を
計算することによって行った。これらの条件の下に、P
3 1モルあたりNGcGM3 OS 25モルの結合度
が得られた。蛋白質にカプリングした糖質はまた、非還
元条件下でのポリアクリルアミドゲル(SDS−PAG
E)における電気泳動により試験し、次いでウェスター
ン法および抗ガングリオシド特異性mAbとの反応によ
り試験した。
用による免疫原(ネオグリコプロテイン)の調製、この
ガングリオシドNGcGM3 による予備可溶化、引き続
くNGcGM3 OSへの共有結合によるカプリング a)OMPCの可溶化 OMPCの可溶化は、例2にしたがい行った。 b)OMPC−NGcGM3 可溶性複合体へのNGcG
M3 OSのカプリング オリゴサッカリドNGcGM3 OSは、例3の工程aに
記載のとおりにして得、例3の工程bに記載の還元的ア
ミノ化に付し、次いで例3の工程cに記載のとおりにS
PDPにカプリングさせた。
C−NGcGM3 を、例3の工程dに記載のとおりにS
PDP試薬にカプリングさせ、例3の工程eに記載のと
おりにジチオスレイトールにより還元し、次いで例3の
工程fに記載のとおりに適当な糖質にカプリングさせ
た。これら全ての場合に、試薬の量および反応条件は、
例3に詳述されているとおりであった。各種NGcGM
3 誘導体の特徴確認に使用された分析方法およびまたO
MPCおよびその誘導体の特徴確認に使用された分析方
法もまた、例3に記載の方法と同一であった。NGcG
M3 OS 1mg/OMPCプロテオリポソーム 1m
gの結合度が得られた。
ニワトリの免疫感作 前記の種々のワクチン組成物を、ニワトリの免疫感作に
使用し、得られた特異的体液免疫応答を試験した。対照
として、フロイント完全アジュバントを用いて、PBS
0.6mL中のNGcGM3 1mgにより1ヶ月間、
弱く免疫感作した1群のニワトリを使用した。4回の投
与の後の2週間の時点で、ブースターを適用し、4日後
に動物から採血した。
ン調製物で処置したニワトリのグループに使用した。こ
れらの抗体応答は、ELISAおよびTLC−免疫染色
法(immunostaining)によって、抗原と
してガングリオシドNGcGM3 を使用して評価した。
ワクチン組成物により免疫感作されたニワトリのグルー
プでは全部の場合に、NGcGM3 ガングリオシドに対
する特異抗体のレベルは、対照の前免疫血清(pre−
immune serum)に比較して増大していた。
対照群はまた、抗体応答の増加を示したが、この応答は
IgMタイプの応答であった。これに対して、本発明に
係わるワクチン調製物はいづれも、免疫感作された動物
の大部分において、特異的IgG応答を示した。
の発現 手術中に、10個の乳房腫瘍の生検試料を得た。これら
の試料を組織学的に分類し、使用時点まで−70℃で保
存した。これらの腫瘍は、以下に簡単に記載する方法に
それぞれ従い処理した:含水状態の、重量測定した腫瘍
に、蒸留水3容量を加え、冷却状態(4℃)で均質にし
た。この均質化した試料中の総蛋白質含有量を、ローリ
イ(Lowry)の方法により測定した。各試料の残り
の部分に、CCl3 H−CH3 OH(2:1)混合物5
容量を加え、37℃で1時間撹拌した。次いでCH3 O
Hを添加して、CCl3 H:CH3 OHを1:1にし、
抽出操作を反復した。最終混合物を遠心分離し、上澄液
を分離した。
2 O(1:2:0.8)混合物を使用して37℃で2時
間撹拌することによって、抽出した。次いで再度遠心分
離し、上澄液を分離した。上記両方の上澄液を混合し、
次いで濃縮乾燥させて、各腫瘍の総脂質混合物を得た。
この総脂質混合物を、CCl3 H:CH3 OH(9:
1)5mL中に溶解し、フェニル−セファロース カラ
ム(2mL)に通し、同一溶剤混合物3容量により、次
いでCCl3 H:CH3 OH(85:15)により洗浄
した。その後に、ガングリオシドを、CCl3 H:CH
3 OH(1:1)5容量およびCH3 OH5容量により
溶出した。
Sonninoらの方法(Anal.Bioche
m.、128(1983)104−114)によりHP
TLCおよび2d−HPTLCによって試験した。主要
ガングリオシドの相対量は、デンシトメーターにより評
価した。得られた結果は、乳房腫瘍に存在する主要ガン
グリオシドは、GM3 (平均:356.4ng/mg蛋
白質)およびGD3 (平均:133.1ng/mg蛋白
質)であり、GD1aおよびGT1bがこれに続くことを示
した。正常乳房組織におけるGM3 およびGD3 の発現
は、乳房腫瘍における発現に比較して、低い(それぞれ
平均:183.5ng/mg蛋白質および48.6ng
/mg蛋白質)。
83gの塊を集め、その特徴をまた試験した。この腫瘍
塊は、前記と同様に処理し、そして抽出した。ガングリ
オシドの総混合物を、DEAE Toyopearlで
イオン交換クロマトグラフイに付し、そして総酸フラク
ションは、勾配溶剤系を用いてQ−セファロースカラム
におけるクロマトグラフイに再度、付し、9フラクショ
ンを得た。2d−HPTLCによるクロマトグラフイ試
験を、FAB−MSおよびO−アセチル化ガングリオシ
ドに対して特異性のモノクローナル抗体を用いるTLC
免疫染色試験と組み合わせると、被験試料中のOAcG
D3 およびOAcGT 3 の存在を検出することができ
る。
cGM3 以外の同一のRfを有するバンドの存在もまた
検出することができた。H−D抗原と反応する抗体を使
用するTLC免疫染色試験は、さらに別の2種のグリコ
リル化ガングリオシドの存在を示した。このTLC免疫
染色試験は、H−Dおよび10個の各腫瘍から得たガン
グリオシドの混合物に対する抗−OAcガングリオシド
mAbの両方を使用して行った。結果を表Iに示す。乳
癌における、各種タイプの脂質結合シアル酸の相対量
を、4つの腫瘍で試験した。
を、100℃において、 0.5%HCl/MeOH中
でメタノール分解に付した。試料を、N2 雰囲気の下に
乾燥させ、フェニル−α−N−アセチルグルコースアミ
ニド0.5μgを内部標準として添加した。試料は次い
で、無水酢酸:ピリジン(1:1)の混合物中で、10
0℃において30分間アセチル化した。過剰の無水酢酸
をMeOHとの蒸発により除去した後に、試料をCCl
3 H中に溶解し、次いでOV−17カラム(0.25m
m×5m)を供えたJeolDX−304装置で、電子
衝撃モードを用いて、GC/MSに付した。このカラム
の温度は228℃であり、そしてインジェクターの温度
は260℃であった。使用したキャリア気体は、0.5
mL/分のHeであった。この結果を表IIに示す。
フラクション中のH−D抗原の存在
瘍試料である。 (c)NGNA:N−グリコリルノイラミン酸(N−グ
リコリル)。 (d)U1およびU2:未知のN−グリコリル化ガング
リオシド(N−グリコリル化)。 (e)+:低反応性;+++:中程度の反応性;+++
+:高反応性;−:非反応性。
腫瘍試料である(表I参照)。 (b)NANA:N−アセチルノイラミン酸 NGNA:N−グリコリルノイラミン酸 OAcNANA:O−アセチルN−アセチルノイラミン
酸 (c)これらの数値は、総脂質結合シアル酸のパーセン
トである。
Claims (26)
- 【請求項1】 N−グリコリル化ガングリオシドに対す
る抗体免疫応答を刺激または増大させるためのワクチン
組成物であって、場合に応じて、適当な蛋白質または複
合蛋白質からなる担体に、非共有結合あるいは共有結合
によりカプリングさせた、N−グリコリル化ガングリオ
シド、および(または)その誘導体、および(または)
その相当するオリゴサッカリドの適量およびさらにいず
れか適当なアジュバントを含有するワクチン組成物。 - 【請求項2】 N−グリコリル化ガングリオシドが、N
−グリコリルGM3(NGcGM3 )であることを特徴
とする、請求項1に記載のワクチン組成物。 - 【請求項3】 NGcGM3 ガングリオシドおよび(ま
たは)その誘導体および(または)NGcGM3 オリゴ
サッカリドの有効量が10−400μgであることを特
徴とする、請求項1または2に記載のワクチン組成物。 - 【請求項4】 複合蛋白質として、ナイゼリア メニン
ギチジス(Neisseria meningitid
is)の外膜複合蛋白質(OMPC)を含有する、請求
項1ー3のいずれか1項に記載のワクチン組成物。 - 【請求項5】 N.メニンギチジスのOMPCを、N−
グリコリル化ガングリオシドにより可溶化し、次いでス
ペーサー アームを使用して、これをN−グリコリル化
ガングリオシドオリゴサッカリドに共有結合によりカプ
リングさせることを特徴とする、請求項1ー4のいずれ
か1項に記載のワクチン組成物。 - 【請求項6】 担体蛋白質として、モノクローナル抗体
を含有することを特徴とする、請求項1または2に記載
のワクチン組成物。 - 【請求項7】 スペーサー アームを使用して、N−グ
リコリル化ガングリオシドオリゴサッカリドに共有結合
によって、モノクローナル抗体がカプリングされている
ことを特徴とする、請求項6に記載のワクチン組成物。 - 【請求項8】 スペーサー アームが、炭素原子3−1
0個を有する、飽和または不飽和ジアミンであることを
特徴とする、請求項5ー7のいずれか1項に記載のワク
チン組成物。 - 【請求項9】 アジュバントが、天然由来のアジュバン
ト、またはモノクローナル抗体であることを特徴とす
る、請求項4または5に記載のワクチン組成物。 - 【請求項10】 天然由来のアジュバントが、アルミニ
ウム塩からなることを特徴とする、請求項9に記載のワ
クチン組成物。 - 【請求項11】 モノクローナル抗体が、P3であるこ
とを特徴とする、請求項9に記載のワクチン組成物。 - 【請求項12】 アジュバントが、天然由来のアジュバ
ント、またはモノクローナル抗体であることを特徴とす
る、請求項6ー8のいずれか1項に記載のワクチン組成
物。 - 【請求項13】 天然由来のアジュバントが、QS21
またはDETOXであることを特徴とする、請求項12
に記載のワクチン組成物。 - 【請求項14】 天然由来のアジュバントが、アルミニ
ウム塩であることを特徴とする、請求項12に記載のワ
クチン組成物。 - 【請求項15】 精製GM3 ガングリオシドおよび(ま
たは)このガングリオシドの誘導体および(または)そ
の相当するオリゴサッカリドをさらに含有することを特
徴とする、請求項1に記載のワクチン組成物。 - 【請求項16】 精製GD3 ガングリオシドおよび(ま
たは)このガングリオシドの誘導体および(または)そ
の相当するオリゴサッカリドをさらに含有することを特
徴とする、請求項1に記載のワクチン組成物。 - 【請求項17】 ガングリオシドが、生物学的供給源か
ら精製されたものである、請求項1−16のいずれか1
項に記載のワクチン組成物。 - 【請求項18】 生物学的供給源が、モノクローナル抗
体の工業的産生に使用されるハイブリドーマ バイオマ
スであることを特徴とする、請求項17に記載のワクチ
ン組成物。 - 【請求項19】 癌の予防および処置における、請求項
1−14のいずれか1項に記載のワクチン組成物の使
用。 - 【請求項20】 乳癌の予防および処置における、請求
項19に記載のワクチン組成物の使用。 - 【請求項21】 GM3 ガングリオシド、その誘導体お
よび(または)その相当するオリゴサッカリドに対する
免疫応答の刺激あるいは増大における、請求項15に記
載のワクチン組成物の使用。 - 【請求項22】 GD3 ガングリオシド、その誘導体お
よび(または)その相当するオリゴサッカリドに対する
免疫応答の刺激あるいは増大における、請求項16に記
載のワクチン組成物の使用。 - 【請求項23】 N−グリコリル化ガングリオシドある
いはそのオリゴサッカリドまたはその誘導体の有効量
を、適当なアジュバントとともに哺乳動物に投与するこ
とからなる、乳癌の処置方法。 - 【請求項24】 ガングリオシドが、N−グリコリル−
GM3 である、請求項23に記載の処置方法。 - 【請求項25】 ガングリオシドを、10−400μg
/投与単位の量で投与する、請求項24に記載の処置方
法。 - 【請求項26】 ガングリオシドの製造方法であって、 a)ハイブリドーマを培養し、 b)このハイブリドーマ バイオマスを単離し、 c)ガングリオシド フラクションを抽出、および(ま
たは)単離する、工程からなる製造方法。
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