JP2002504101A

JP2002504101A - ガングリオシド免疫刺激複合体およびその使用

Info

Publication number: JP2002504101A
Application number: JP50115099A
Authority: JP
Inventors: ジョン、クーパー、コックス; ベングト、ジョン、レナルト、ロンベルグ; シグリード、エリザベート、ショランダー
Original assignee: シーエスエル、リミテッド
Priority date: 1997-06-12
Filing date: 1998-06-12
Publication date: 2002-02-05
Also published as: DE69838757T2; ZA985140B; CA2293439A1; DE69838757D1; AUPO732997A0; EP1019087A4; HK1026855A1; EP1019087B1; EP1019087A1; US6814981B1; WO1998056420A1; NZ501641A

Abstract

(57)【要約】本発明は、一般的には一種または二種以上のガングリオシドを含む免疫刺激複合体に関するものであり、一層詳細には本発明は、少なくとも一種のガングリオシドＧＭ2、ＧＤ2、ＧＤ3およびＧＴ3を含む免疫刺激複合体に関する。本発明はとりわけ腫瘍特にメラノーマの処置における予防および／または治療用医薬物質として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】ガングリオシド免疫刺激複合体およびその使用本発明は一般的には一種または二種以上のガングリオシドを含む免疫刺激複合体に関し、一層詳しくは本発明はガングリオシドＧＭ2、ＧＤ2、ＧＤ3またはＧＴ3の少なくとも一種を含む免疫刺激複合体に関するものである。とりわけ本発明は腫瘍および一層詳しくはメラノーマの処置における予防および／または治療剤として有用である。この明細書中で引用された文献の書誌的詳細を本明細書の最後に集約する。この明細書を通じて特に言及がなければ”含む”なる用語または”含んでなる ”等の異形用語には、記載の要素もしくは完全体、または要素群もしくは完全体群が包含されることを意味するが、他のいかなる要素もしくは完全体、または要素群もしくは完全体群の除外を意味するものではないことを理解されたい。悪性メラノーマ発生率は過去１０年間で急速に増加しつつあり、メラノーマと診察された患者の生存率は一次腫瘍の厚さの増加につれて低減している（Batch ら，1982）。局部的リンパ節転移を伴う患者は一般的に、手術後の生存率が３５％未満である（Coitら，1991）。腫瘍と結び付けて考えられる抗原の同定は腫瘍関連治療法に対してさらなる活動の機会を提供した。腫瘍細胞にとって珍しい抗原および正常細胞と分担し合う両方の腫瘍抗原は活性免疫化の場合の潜在的標的として浮上した。この部類の腫瘍抗原の一例はガングリオシドである。ガングリオシドは親水部分（糖）および疎水部分（セラミド）からなるシアログリコスフィンゴ脂質である。これらは脳および他の神経堤由来の細胞中に一般的に行き渡っており、星状膠細胞種、神経芽細胞腫および悪性黒色腫（メラノーマ）由来の腫瘍上にも見いだされる。細胞表面の表現パターンは腫瘍転換過程で変わる(Halcomori，1985)。全てが腫瘍上に見いだされるわけではないが、７０を超す数のガングリオシドが同定されている。ワクチン開発については、炭水化物抗原に有効な免疫応答の誘発は炭水化物エピトープ（Ｂエピトープ）および抗原提供細胞に対するタンパク質由来のＴエピトープの競演が必要である。従来この競演は担体タンパク質への炭水化物の化学的接合により成就されてきたが、最も知られた例はhaemophilus influenzae typ e bワクチンであり、この場合、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイドまたはNeisseria meningitidis膜外主タンパク質のいずれかに炭水化物が結合する。しかし、この種ワクチンの調製用に化学的接合法を使用すると、エピトープの高次構造が変わり、これらの抗原性がこれにより除去もしくは低減されるという固有の問題が提起される。加えて、化学的結合手順は高価であり、時間を浪費し、均一条件下での遂行が難しく、一般にかなりの材料損失を伴う。さらに、この種の抗原に対する免疫応答の刺激には、通常、アジュバントが抗原の免疫原性増進のために使用される。アジュバント使用に伴う困難性の一つは、これらもまた誘発し得る、好ましからぬ反応性に由来する。用量−部位（dose-site）反応性はワクチン調製におけるアジバントの獣医学的使用およびヒトへの使用両方に対する主要な懸念である。毒性回避の一方法は免疫刺激複合体の使用を通じてである。免疫刺激複合体は通常は小さく、直径３０から４０ナノメーターのケージ様構造で、それらの構造は凍結乾燥すると保持される。しかし、調製の仕方、組成、および測定方法に応じて寸法は変わる。最適量の免疫原性タンパク質またはペプチドを伴う典型的免疫刺激複合体の最終処方は、サポニン、コレステロール、リン脂質およびタンパク質すなわちポリペプチド（５：１：１：１）重量比である。この種の典型的免疫刺激複合体はサポニン約６０重量％、コレステロールおよびリン脂質それぞれ約１０重量％および残部がタンパク質もしくはポリペプチドである。タンパク質もしくはポリペプチドは、免疫刺激複合体中へ担体タンパク質を取り入れ後に、直接または担体タンパク質（例えばインフルエンザ包膜タンパク質）への化学結合のいずれかで免疫刺激複合体中に取り込むことができる。植物起源の表面活性グリコシドの一群であるサポニンのアジュバントは高度に有効なアジュバントである。しかし有効ではあるが、これらは毒性を示す。この種の毒性は免疫刺激複合体中にサポニンを取り込むと低減可能である。この事実は複合体中のコレステロールとサポニンが提携して細胞膜中のコレステロールに結合するその能力を低減させることによる。さらに、類似レベルのアジュバンド効果を生じさせるに要するサポニンの所要量が一層少ない。ガングリオシドはリン脂質に構造的に関連しているので、本発明へと導く過程で発明者らは、免疫刺激複合体のリン脂質成分をガングリオシド分子で置換できることを見いだした。両分子はグリセロールを介して頭部基に結合する二つのアシル鎖を有する。本発明の働き方を一種類の作用態様のみに限定することを意図するものではないが、ガングリオシド分子の性質は極性頭基を有する脂肪酸鎖であり、この脂肪酸鎖は露出した極性頭基を残してこの免疫刺激複合体中に浸されており、これにより上記頭部基は露出Ｂ細胞エピトープとして機能するものと信じられる。この種の処方は免疫刺激複合体構造の表面にガングリオシドの抗原部分をもたらす。したがって本発明の一観点は、サポニン調剤、ステロール、タンパク質エピトープを、リン脂質および少なくとも一種のガングリオシドもしくは少なくとも一種のガングリオシド単独と共に含む免疫刺激複合体に関する。本発明における使用に適するサポニン製剤、ステロールおよびリン脂質はＰＣＴ／ＡＵ 95/00670号公報に記載があり、ここに引用して含める。本発明の免疫原性免疫刺激複合体は当業者に周知の技法により調製でき、この方法はCoxおよびCoulter（1992）による刊行物およびMoreinらのオーストラリア特許明細書第558258号、同第589915号、同第590904号、および同第632067号公報中に詳細な記載があり、これらの開示をここに引用して加入する。ガングリオシドまたはタンパク質エピトープの配座が変更される危険を最少限にするために、本発明の免疫原性免疫刺激複合体の調製には、化学的結合法は包含されない。単一の免疫刺激複合体中には多様のタンパク質およびガングリオシドを取り込める。かくすると、ガングリオシドに対するタンパク質成分の比率が個々の免疫刺激複合体間で変わるような免疫刺激複合体の調製が可能になる。以後”ガングリオシド”なる呼称は、ガングリオシドの全ての形態およびそれらの誘導体を包含するものと判読されるべきである。誘導体の例中には、フラグメント、一部分、部分、化学的同等物、突然変異体、同族体（homologs）および類似体を包含する。ガングリオシドの化学的同等物はガングリオシドの機能性類似体として働き得る。化学的同等物は必ずしもガングリオシド由来であることを要しないが、ある種の立体配座的類似性を共有できる。これとは別に、化学的同等物はガングリオシドのある種の生理化学的性質を模倣するように特に設計できる。化学的同等物は化学的に合成してもよく、または例えば天然産物のスリーニングに従って見付けることもできる。本発明において考慮するガングリオシド同族体の例中には、各種の種に由来するガングリオシドが包含されるが、これらのみに制限はされない。上記ガングリオシドはＧＭ2、ＧＤ2、ＧＤ3および／またはＧＴ3（Lloy，1993 ）またはそれらの誘導体から選択される。したがって、好ましい実施態様において本発明は、リン脂質および少なくとも一種のガングリオシドＧＭ2、ＧＤ2、ＧＤ3および／またはＧＴ3もしくは少なくとも一種のガングリオシドＧＭ2、ＧＤ2、ＧＤ3および／またはＧＴ3 単独と共に、サポニン製剤、ステロール、タンパク質エピトープを含む免疫原性免疫刺激複合体に関する。本発明における複合体の”タンパク質”なる用語の例中には、抗原表示細胞による表示に適するＴ細胞エピトープが包含される。この例中には、メラノーマ抗原例えばMel 40、MAGE、GAGE、ESO1、Melan A、Mag3（Stockertら、1998）、インフルエンザヘマグルチニン、キーホール・カサガイ・ヘモシアニン、または、がん特異性タンパク質（例えば、治療用ワクチンが使用できる観点からがんに関係がある、がん特有タンパク質）およびそれらの機能性誘導体、化学的同等物、同族体、類似体、突然変異体、その変異体もしくは誘導体が包含されるが、これらのみには限定されない。上記タンパク質はガングリオシドに対する抗体応答の誘発を支援するＴ細胞エピトープとして、およびそれ自体で保護抗原として働き得る。例えばMelan Aは抗原表示細胞による表示に適するＴ細胞エピトープを提供でき、これにより本発明のガングリオシド成分に対する抗体応答の誘発を支援するが、同時に、Melan Aエピトープに対する免疫応答もそれ自体で刺激できる。上記タンパク質がメラノーマ特有抗原である場合、上記タンパク質に対する免疫応答の誘発は治療的効能を生じ得る。特に好ましい実施態様では上記タンパク質はそれ自体で保護抗原として機能できる。本発明の好ましい一実施態様に従えば、リン脂質および少なくとも一種のガングリオシドＧＭ2、ＧＤ2、ＧＤ3および／またはＧＴ3もしくは少なくとも一種のガングリオシドＧＭ2、ＧＤ2、ＧＤ3および／またはＧＴ3単独と共に、サポニン製剤、ステロール、インフルエンザヘマグルチニンを含む免疫原性免疫刺激複合体が提供される。他の好ましい実施態様では、上記タンパク質はメラノーマ特異性タンパク質である。本発明の好ましい一実施態様に従えば、リン脂質および少なくとも一種のガングリオシドＧＭ2、ＧＤ2、ＧＤ3および／またはＧＴ3もしくは少なくとも一種のガングリオシドＧＭ2、ＧＤ2、ＧＤ3および／またはＧＴ3単独と共に、サポニン製剤、ステロール、メラノーマ特異性タンパク質を含む免疫原性免疫刺激複合体が提供される。 ”哺乳類”なる用語中には、ヒト、霊長類動物、家畜（例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ロバ）、実験室的試験用動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、テンジクネズミ）、付き添い動物（例えば、イヌ、ネコ）、および捕らえた野生動物（例えば、カンガルー、シカ、キツネ）が包含される。好ましくはヒトまたは実験室的試験用動物である。一層好ましい哺乳類はヒトである。細胞中の大半のガングリオシドは炭水化物部位を外側にして血漿膜中に見いだされる。この事実およびガングリオシドが腫瘍中に広く分布する事実の両方から、ガングリオシドは細胞表面抗原標的として働くのに理想的である。さらに、同定された７０を超すガングリオシドの幾つかは、ある種の腫瘍細胞中に顕著に見いだされる。例えば、メラノーマ腫瘍は各種の量のＧＭ2およびＧＤ2を発現する。その上、免疫刺激複合体中に取り込まれたタンパク質は抗原授与細胞による授与に適するＴ細胞エピトープである。したがって本発明のさらなる観点は、体液および／または細胞仲介免疫応答を包含する、哺乳類の免疫応答の誘発に関するが、これらのみには限定はされない。従って本発明の他の観点は、一種または二種以上の医薬として容認し得る担体および／または希釈剤と共に、以上に概略した免疫刺激複合体を活性成分として含むワクチン組成物に関する。注射用に適する医薬形態の例中には、滅菌水性溶液（ここでは水溶性）もしくは分散物および注射用滅菌溶液および分散物即席調製用の滅菌粉が包含され、またはクリーム形態または局所用に適する他の形態であってもよい。この形態は製造および貯蔵条件下に安定であることを要し、かつバクテリアおよびカビ等の微生物の汚染作用下に保存性がある必要がある。上記担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコールおよび液状ポリエチレングルコールその他）、これらの適切な混合物、ならびに植物油を包含する溶媒または分散媒体である。レシチン等の被膜を利用したり、分散物の場合には所要の粒径を維持したり、界面活性剤を利用すれば適切な流動性が維持できる。例えば、パラベン、クロロブタノール、フエノール、ソルビン酸、チメロサール（thimerosal）等の各種抗細菌剤および抗菌剤の使用により微生物の働きは防止される。多くの場合、例えば糖類または塩化ナトリウム等の等張力性剤の含有が好ましい。例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン等の吸収遅延剤を組成物中に使用すると、注射用組成物の長期吸収が成し遂げられる。注射用滅菌溶液は、必要に応じて上記の他の各種構成要素と共に、上記活性化合物の所要量を適当な溶媒中に均一混合し、次いで濾過滅菌して調製する。一般的に分散物は、先に列挙の他の所要構成要素および基本的分散媒体を含有する滅菌ビヒクル中に各種滅菌活性成分を均一混合して調製する。滅菌注射溶液を調製するための滅菌粉末の場合の好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥手法であり、これによると活性成分以外にも、予め濾過滅菌したその溶液からの追加的所望成分のいずれかを含む粉末が生成する。この活性成分を適切に保護すると、例えば不活性希釈剤または消化吸収性食用担体と共に経口投与ができ、または硬質もしくは軟質ゼラチンカプセル中に封入でき、または錠剤に圧縮でき、またはダイエット食品と共に取り入れができる。経口治療投与の場合、この活性成分は賦形剤と共に取り込んで、経口消化、ほお錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁物、シロップ、ウエハー、その他の形態で使用できる。この種の組成物および製剤は活性化合物を少なくとも１重量％で含有すべきである。当然乍ら、組成物および製剤の百分率は変更でき、約５重量％から約８０重量％範囲が好都合である。治療的に有用なこの種の組成物中の活性成分の量は、適切な用量が得られるような量である。本発明に従う好ましい組成物または製剤は、活性化合物約０．１μｇから２０００ｍｇを経口用量単位形態が含有するように調製する。また錠剤、トローチ、カプセルその他は次に掲げる成分も含んでもよい：ガム、アカシア、コーンスターチまたはゼラチン等の結合剤；リン酸二カルシウム等の賦形剤；コーンスターチ、ポテトスターチ、アルギン酸その他の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム等の滑剤；およびスクロース、ラクトースもしくはサッカリン等の甘味料、ペパーミント、ウインターグリーン油等の香料。用量単位形態がカプセルの場合、上記型の材料以外にも液状担体を含んでもよい。被覆剤として、または用量単位の物理的形態を異なった風に修飾するための他の各種材料が提供される。例えば錠剤、ピルまたはカプセルはシェラック、砂糖またはこの両方で被覆できる。シロップまたはエリキシルは、活性成分、甘味料としてのスクロース、保存料としてのメチルおよびプロピルパラベン、チエリーまたはオレンジフレーバー等の染料および香料を含有できる。当然乍ら、適用量単位形態のいずれかの調製に使用するいずれの材料も医薬用として純粋であり、使用量において実質的に無毒であることを必要とする。加えて、この活性化合物は持続性製剤および処方物中に均一混合され得る。本発明のさらなる他の観点は、疾病状態との関連における本発明の使用に関する。例えば本発明は腫瘍特にメラノーマの治療に特に有用であるが、これのみには限定されない。したがって本発明の他の観点は、哺乳類の疾病状態に対する免疫応答を引き出す、または、誘発する方法に関し、上記方法は先に記載のワクチン組成物の有効量を上記哺乳類に投与することを包含し、この場合、上記免疫応答の引き出しまたは誘発は疾病状態の開始もしくは進行を阻害、休止または遅延させる。 ”有効量”なる用語は、、所望の免疫応答に少なくとも部分的に達するに必要な量、または特定疾病状態の開始もしくは進行を処置する場合の開始の遅延化もしくは進行の阻止または両方の休止に少なくとも部分的に必要な量を意味する。この量は治療を受ける個人の健康および物理適条件、治療を受ける個人の分類学グループ、抗体を合成する個人の免疫系能力、所望される保護の程度、ワクチンの処方、医学的情勢の評価、および他の関連因子に応じて変わる。この量は日常業務検査を通じて測定できる比較的広い範囲内に入ることが期待される。上記の疾病状態とは腫瘍の場合およびさらにメラノーマの場合が好ましい。本発明の好ましい上記観点に従えば本発明は、哺乳類におけるメラノーマまたは他の腫瘍に対する免疫応答を引き出し、または誘発する方法に関し、上記方法は、上記のワクチンの有効量を上記哺乳類に投与することを包含し、この場合、上記免疫応答の引き出しまたは誘発が、メラノーマまたは他の腫瘍の開始もしくは進行を阻止、休止または遅延させる。上記のように、処置を受ける哺乳類は疾病状態または潜在的疾病状態の治療または予防処置が必要なヒトまたは動物である。本発明のさらなる他の観点は、疾病状態の開始もしくは進行を阻止、休止または遅延させるための医薬物質の製造への免疫原性免疫刺激複合体の使用に関する。好ましくは上記疾病状態は腫瘍の場合であり、一層好都合にはメラノーマの場合である。本発明のさらなる他の観点は、免疫原性免疫刺激複合体を含む、疾病状態の開始もしくは進行を阻止、休止または遅延するのに使用するための薬剤に関する。好ましくは上記疾病状態は腫瘍の場合であり、一層好都合にはメラノーマの場合である。本発明のさらなる特徴は次に記載の図面および／または実施例中に一層詳細に記載される。しかし、この詳細な記載は単に本発明を例示するために包含されることを理解されたい。上記の広範な本発明の記載を制限するものと理解されるべきではない。図面において：図１は、ＧＭ2 A/Texas免疫刺激複合体のスクロース濃度勾配分析を示すグラフであり、スクロース濃度勾配フラクションのコレステロール、タンパク質およびＧＭ2モノシアロガングリオシド含有量を示す。図２は、A/Texasに対する血清抗体応答を示すグラフである。平均力価＋／−ＳＥＭは、A/Texas免疫刺激複合体またはモノシアロガングリオシドＧＭ2を含むA/ Texas免疫刺激複合体を用いたマウスの第１および第２回免疫後に示す。図３は、A／Texsa免疫刺激複合体を用いて免疫にしたウサギ３匹のA／Texasに対する個々の血清抗体レベルを示すグラフである。図４は、ＧＭ2 A/Texas免疫刺激複合体で免疫にしたウサギ３匹のモノガングリオシドＧＭ2に対する個々の血清抗体レベルを示すグラフである。図５は、ＧＤ3 ｐ−ＯＶＡ免疫刺激複合体のスクロース濃度勾配分析を示すグラフであり、スクロース濃度勾配フラクションのコレステロール、タンパク質およびＧＤ3モノシアロガングリオシド含有量を示す。図６は、ＧＤ3 ｐ−ＯＶＡ免疫刺激複合体を用いて免疫にしたウサギ３匹のオボアルブミンの個々の血清抗体レベルを示すグラフである。抗体レベルは血清希釈１：６４０の吸光度で示す。図７は、ＧＤ3 ｐ−ＯＶＡ免疫刺激複合体を用いて免疫にしたウサギ３匹のモノシアロガングリオシドＧＤ3に対する個々の抗体レベルを示すグラフである。抗体レベルは血清希釈１：４０の吸光度として示す。実施例１モノシアロガングリオシドＧＭ2およびインフルエンザタンパク質を含む免疫刺激複合体の調製 Moreinらの方法（1989）により免疫刺激複合体配合物を調製した。簡潔に述べれば、４．５ｍｌＰＢＳ中のヒトA/Texas株からの洗剤分断（disrupted）ヘマグルチニン（ＨＡ）５．３ｍｇ中に、２０％ＭＥＧＡ−１０洗剤（ｗ／ｖ）中のコレステロール１０ｍｇ／ｍｌおよびモノシアロガングリオシドＧＭ2（Larodan F ine Chemicals AB，Sweden）１０ｍｇ／ｍｌを含む水性溶液１ｍｌを添加した。混合後、ＰＢＳ中のＩＳＣＯＰＲＥＰ^TM 703 １０ｍｇ／ｍｌを含む溶液３．５ｍｌを添加し、溶液を温和な撹拌下に２５℃で１時間保った。ＰＢＳ／アジドに対する引く続く透析の間に、インフルエンザＨＡ、コレステロール、ＩＳＯＣＯＰＲＥＰ^TM 703およびモノシアロガングリオシドＧＭ2を含む免疫刺激複合体が形成される。これらの免疫刺激複合体は電子顕微鏡によれば典型的外観を示した。同様に、A/Texas免疫刺激複合体を調製したが、この場合、モノシアロガングリオシドＧＭ2はジパルミトイルホスフアチジルクロリド（ＤＰＰＣ）で置き換えた。透析後、試料をスクロース濃度勾配（１０から５０％スクロース）で精製し、フラクションの放射活性（トリチウム化されたコレステロールの検出）、タンパク質（インフルエンザ抗原の検出）を分析し、さらにＨＰＬＣによる分析（モノシアガングリオシドの検出）を行った（図１）。逆相ＨＰＬＣを用いるモノシアロガングリオシドＧＭ2の検出はPalestini（1990）らの方法に従った。三つの基本的成分はこれらのフラクション中にピークを示し、この場合、特徴的な免疫刺激複合体はＥＭで識別したが、免疫刺激複合体中への全ての成分の取り込みを示した。実施例２モノシアロガングリオシドＧＭ2またはDPPCを含むA/TEXAS免疫刺激複合体を用いたマウスの免疫ＩＳＣＯＰＲＥＰ^TM 703 １１μｇ、ヒトA/Texas株からのインフルエンザタンパク質１μｇ、およびモノシアロガングリオシドＧＭ2 ３μｇを含むＧＭ2 A/Te xas免疫刺激複合体（調製法は実施例１記載）０．１ｍｌを用いて０日目目、２８日目および１１０日目に異系交配ＮＩＨ株マウスを皮下経由で免疫にした。全てのマウスは２８日目、３５日目および１２５日目に眼窩後方で血を抜き取った。 A/Texasを指向する血清ＩｇＧ抗体の誘発をＥＩＡ（ＥＩＡ）で測定した。０．０５Ｍ Carbonate緩衝液，ｐＨ７．２中の破壊A/Texasインフルエンザウイルス２．５μｇ／ウエルを用いてF96 MaxiSorpプレート(Nunc，Denmark)を室温で一昼夜被覆した。このプレートを、カゼイン０．１％、Thiomersalおよび安定剤０．０１％を含む０．０１ＭＰＢＳ，ｐＨ７．２中で室温で最低１時間ブロックし、減圧下に乾燥した。１０００中１から始めたマウス血清の５倍希釈液を、カセイン１％、Tween-20 ０．０５％およびThiomersal（検定緩衝剤）０．０１％を含む０．０１ＭＰＢＳ，ｐＨ７．２中に調製し，１００μｌ／ウエルを室温で２時間保温した。各プレートは２０中１から始めた２倍希釈標準血清を含んでいた。Tween-20 ０．０５％およびThiomersal０．０００５％を含む０．０１ＭＰＢＳ，ｐＨ７．２中で５回洗浄後、プレートを検定緩衝液中０．０６μｇ／ｍｌに希釈したセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ki rkegaard & Perry Laboratories，USA）と共に室温で２時間保温した。さらに３回洗浄後、基質溶液（ＴＭＢ，Microwell Peroxidase Substrate System，Kirke gaard & Perry Laboratories，USA）を１００μｌ／ウエルで加え、室温で１０分間保温した。０．５ＭＨ₂ＳＯ₄を５０μｌ／ウエルで添加して酵素反応を停止させ、４５０ｎｍでの吸光度を判読した。標準曲線の直線部分のフオーパラメーターフイット分析(four parameter fit analysis)から終点力価を計算した。ＧＭ2 A/Texas免疫刺激複合体を用いた免疫ではA/Texasを指向するＩｇＧ抗体を生じた（図２）。第１および第２免疫（ｐ＜０．０５）の間に有意の促進効果が観察された。Wilcoxon signed rank試験およびGraphPad Instat v2 .03コンピユータソフトウエアを用いたMann-Whitney U-試験によりこれらの力価を比較した。モノシアロガングリオシドＧＭ2（Larodan Fine Chemicals AB，Sweden）を含み、被覆材料としてのタンパク質は含まない免疫刺激複合体（１．７μｇ／ドットＩＳＣＯＰＲＥＰ^TM 703および０．２５μｇ／ドットＧＭ2）を用い、点染検定でモノシアロガングリオシドＧＭ2に対する血清抗体の誘発を測定した。ＧＭ2 免疫刺激複合体の調製はインフルエンザタンパク質の添加を省いた以外は、実施例１のＧＭ2 A/Texas免疫刺激複合体の場合と本質的に同じであった。ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ^TMを含むドットは対照試料として用いた（１．７μｇ／ドットＩＳＣＯＰＲＥＰ^TM 703）。ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ^TMの調製はインフルエンザタンパク質の添加を省略し、かつモノシアロガングリオシドＧＭ2をＤＰＰＣで置き換えた以外は、実施例１のＧＭ2 A/Texas免疫刺激複合体の場合と本質的に同じであった。精製および分断A/Texasを含むドットは追加の対照材料（ヘマグルチニンの約８０ｎｇ／ドット）として用いた。ニトロセルロースシート上でドットを作った。室温で１０分間乾燥後、ニトロセルロースシートを室温で１時間、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（ブロッキング緩衝液）を含む０．０１ＭＰＢＳ，ｐＨ７．２中で保温した。ＧＭ2 A/Texas免疫刺激複合体で免疫にしたマウスから１２５日目に採取した血清プール、A/Texas免疫刺激複合体で免疫にしたマウスからの血清プール、および純のマウスからの血清と共にこれらのブロットを保温した。血清の上記３プールは、ブロットに添加したブロッキング緩衝液中で全て１０００中１に希釈し、室温で１時間保温した。０．３％ＢＳＡを含む０．０１ＭＰＢＳ，ｐＨ７．２中でそれぞれ１０分間３回洗浄後、これらのブロットをブロッキング緩衝液中で０．０６μｇ／ｍｌまで希釈したセイヨウワサビペルオキシダーゼ接合ヤギ抗マウスＩｇＧγ特異性(Kirkegaard & Perry Labo ratories，USA)と共に室温１時間保温した。さらに３回洗浄後、基質溶液（４ＣＮ Peroxidase Substrate System，Kirkegaard & Perry Laboratories，USA）を加え、室温で約１０分間保温した。これらのブロットを乾燥し、暗所で保管した。ＧＭ2 A/Texas免疫刺激複合体で免疫にしたマウスからの血清によりＧＭ2免疫刺激複合体が認識されたが、A/Texas免疫刺激複合体（表１）に向かって高めた対照血清によっては認識されず、この血清中の抗体集団はＧＭ2を指向することを示した。ＧＭ2 A/Texas免疫刺激複合体で免疫にしたマウスからの血清もＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ^TMと反応したが、ＧＭ2を含むものとは反応しなかった。A/Tex as免疫刺激複合体に向かって高められた対照血清はＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ^TMとは反応しなかった。恐らく、ＧＭ2 A/Texas免疫刺激複合体で免疫にしたマウスはガラクトース部位を認識するある種の抗体を生ずるものと考えられ、この部位は、全部ではなくても殆どのキラヤサポニン上のアグリコンキラヤ酸のＣ3位置における固定炭水化物である。実施例３モノシアロガングリオシドＧＭ2を含むA/Texas免疫刺激複合体を用いたウサギの免疫ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ^TM 703 ２００μｇ、A/Texas２０μｇおよびモノシアロガングリオシドＧＭ2 ５０μｇを含むＧＭ2 A/Texas免疫刺激複合体（調製法は実施例１記載）０．５ｍｌを用いて０日目および１９日目に皮下経由でラビット３匹を免疫にした。これらのウサギは０、７、１９および２５日目に血を抜き取った。 A/Texasを指向する血清ＩｇＧ抗体の誘発をＥＩＡで測定した。この検定は、検定緩衝液中１μｇ／ｍｌに希釈したセイヨウワサビペルオキシダーゼ接合ヤギ抗ウサギＩｇＧＨ＋Ｌ（(Kirkegaard & Perry Laboratories，USA)をマウス接合体（conjugate）の代わりに使用した以外は実施例２記載のＥＩＡ手法と本質的に同一であった。図３に見られるように、A/Texasインフルエンザタンパク質に対する抗体レベルはＧＭ2 A/Texas免疫刺激複合体での免疫後に高まった。最初の免疫後、０日目から７日目までに抗体レベルは約４倍増加し、次いで７日目から１９日目までに４倍も高まった（ｐ＝０．０５）。第１および第２免疫化（ｐ＝０．０５）の間に有意のブースター効果が観察され、抗体レベルは約１．５倍に増加した。Gr aphPad Instst v2.03コンピユータソフトウエアを用いたWilcoxon signed rank 試験により抗体レベルを比較した。モノシアロガングリオシドＧＭ2を指向する血清ＩｇＧ抗体の誘発をＥＩＡにより測定した。F96 MaxiSorpプレート（Nunc，Denmark）を、０．１Ｍ Carbonat e緩衝液，ｐＨ０．４中に溶解したモノシアロガングリオシドＧＭ2（Larodan Fi ne Chemicals AB，Sweden）を用いて０．１μｇ／ウエルで被覆した。プレートを＋４℃で一昼夜保温したが、次の工程は検定緩衝液中１μｇ／ｍｌに希釈したセイヨウワサビペルオキシダーゼ接合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Kirkegaard & Perry Laboratories，USA)をマウス接合体の代わりに使用した以外は、実施例２記載のＥＩＡ手法と本質的に同じであった。図４は、モノシアロガングリオシドＧＭ2に対する個々の抗体が全てのウサギの場合で０日目よりも７日目目には約２倍も高く、モノシアロガングリオシドＧＭ2に対して低レベルの抗体が生じたことを示す。モノシアロガングリオシドＧＭ2を指向する血清ＩｇＧ抗体の誘発も、ドットブロット検定を用いて測定した。この方法は検定緩衝液中１μｇ／ｍｌに希釈したセイヨウワサビペルオキシダーゼ接合ヤギ抗ウサギＩｇＧ(Kirkegaard & Perr y Laboratories，USA)をマウス接合体の代わりに使用した以外は、実施例２記載のと本質的に同じであった。ＧＭ2免疫刺激複合体は第２免疫（２５日目）後の１週間で採取したウサギ血清により認識されただけであり、モノシアロガングリオシドＧＭ2を指向する抗体のブースター応答が観察されたことを示している（表２）。このＥＩＡは、応答が７日目に検出されたのでドットブロット検定よりも高度の感度を有するようにみえる。実施例２と同じように、２５日目からのウサギ血清はＧＭ2を含まないＩＣＯＭＡＴＲＩＸ^TMと反応した。これより早期の血液抜取ではＩＣＯＭＡＴＲＩＸ^TMとは反応しなかった。恐らくこれは、Ｍ2 A/Texas免疫刺激複合体を用いて免疫にしたウサギもＩＣＯＭＡＴＲＩＸ^TM中のアグリコンキラヤ酸上に多分存在するガラクトース部位を認識する、ある種の抗体を生ずるものと考えられる。実施例４ジシラノガングリオシドおよびパルミチン化オバルブミンを含む免疫刺激複合体の調製ジシアロガングリオシドＧＤ3およびパルミチン化(palmitified)ｐ−ＯＶＡ）を含む免疫刺激複合体を実施例１記載の方法およびMowatらの方法（1991）に本質的に従って調製した。モノシアロガングリオシドＧＭ2はジシアロガングリオシドＧＤ3で代替し、A/Texaはｐ−ＯＶＡで代替した。透析後、試料をスクロース濃度勾配（１０から５０％スクロース）を使用して精製し、フラクションの放射活性をトリチウム化されたコレステロール検出のために分析し、ｐ−ＯＶＡ検出のためにタンパク質を分析し、ジシアロガングリオシドＧＤ3検出のためにＨＰＬＣによりフラクションを分析した。逆相ＨＰＬＣを用いるジシアロガングリオシドＧＤ3の検出はPalestiniらの方法（1990）に従った。３種全ての成分はこれらのフラクション中にピークを示し、この場合、典型的免疫刺激複合体はＥＭにより同定されたが、免疫刺激複合体中への全ての成分の取り込みを示した。実施例５ジシアロガングリオシドＧＤ3を含むｐ−ＯＶＡ免疫刺激複合体を用いたウサギの免疫ウサギ３匹を、ＩＳＣＯＰＲＥＰ^TM703 ２００μｇ、ｐ−ＯＶＡ１７μｇおよびジシアロガングリオシドＧＤ3 １１１μｇを含む０．５ｍｌのＧＤ3 ｐ−ＯＶＡ免疫刺激複合体（調製法は実施例４記載）を用いて０日目に皮下経由で免疫にした。このウサギは０日目および７日目に血を抜き取った。オバルブミンに対する血清ＩｇＧ抗体の誘発をＥＩＡで測定した。F96 MaxiSo rpプレート(Nunc，Denmark)を、１０Ｍ Acetate緩衝液，ｐＨ４．２中に溶解したオバルブミン（Sigma，USA）を用いて５μｇ／ウエルで被覆した。このプレートを＋４℃で一昼夜保温し、以後の工程は検定緩衝液中１μｇ／ｍｌに希釈したセイヨウワサビペルオキシダーゼ接合ヤギ抗ウサギＩｇＧＨ＋Ｌ(Kirkegaard & Perry Laboratories，USA)をマウス接合体の代わりに使用した以外は、実施例２記載の工程と本質的に同じであった。図６に見られるようにオバルミンに対する抗体レベルは、ＧＤ3 ｐ−ＯＶＡ免疫刺激複合体を用いた免疫後は高められた。この抗体レベルは、０日目から７日目（ｐ＝０．０５）に約３倍も増加した。GraphPad Instst v2.03コンピユータソフトウエアを用いたWilcoxon signed rank試験で抗体レベルを比較した。ジシアロガングリオシドＧＤ3を指向する血清ＩｇＧ抗体の誘発はＥＩＡにより測定した。F96 MaxiSorpプレート（Nunc，Denmark）を、０．１ＭＣＰＢＳ緩衝液，ｐＨ7.2中に溶解したジシアロガングリオシドＧＭ3(Larodan Fine Chemicals AB，Sweden)を用いて０．１μｇ／ウエルで被覆した。プレートを＋４℃で一昼夜保温したが、次の工程は、検定緩衝液中１μｇ／ｍｌに希釈したセイヨウワサビペルオキシダーゼ接合ヤギ抗ウサギＩｇＧ(Kirkegaard & Perry Laboratories ，USA)をマウス接合体の代わりに使用し、洗浄緩衝液および検定緩衝液中のTwee n-20を省略した以外は、実施例２記載のＥＩＡ手法と本質的に同じであった。図７は、ジシアロガングリオシドＧＤ3に対する個々の抗体はウサギ３匹中２匹のウサギの場合、７日目から０日目で約１．５倍増加し、ジシアロガングリオシドＧＤ3に対する低レベルの抗体が生じたことを示す。応答しなかったウサギは０日目に高い読みを示したが、これは免疫後に低減した。ＩＳＯＰＲＥＰ^TM 703およびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ^TMはIscotec A.B．の製品である（国際特許出願ＰＣＴ／ＡＵ95/00670号公報参照）。表１．ドットブロット検定により測定したモノシアロガングリオシドＧＭ2 に応答する血清抗体。マウスはＧＭ2 A/Texas免疫刺激複合体を用いて免疫化した。 − 抗原と血清とは反応しない＋抗原と血清とは明瞭に反応する＋＋抗原と血清とは強く反応する表２．ドットブロット検定により測定したモノシアロガングリオシドＧＭ2 に応答する血清抗体。ウサギはＧＭ2 A/Texas免疫刺激複合体を用いて免疫化した。− 抗原と血清とは反応しない＋抗原と血清とは明瞭に反応する＋＋抗原と血清とは強く反応する

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１１年３月２９日（１９９９．３．２９）【補正内容】請求の範囲１．（ｉ）リン脂質および少なくとも一種のガングリオシド、または（ｉｉ）少なくとも一種のガングリオシド単独のいずれかと共に、サポニン製剤、ステロール、タンパク質エピトープを含む免疫原性免疫刺激複合体であって、上記ガングリオシドが上記タンパク質エプトープに化学的に結合していない上記免疫原性免疫刺激複合体。２．上記ガングリオシドがＧＭ2、ＧＤ2、ＧＤ3および／もしくはＧＴ3またはこれらの誘導体から選択される、請求項１記載の免疫原性免疫刺激複合体。３．上記タンパク質が、がん特異性タンパク質である、請求項１または２記載の免疫原性免疫刺激複合体。４．上記タンパク質が、メラノーマ特異性タンパク質である、請求項３記載の免疫原性免疫刺激複合体。５．上記メラノーマ特異性タンパク質がＭＥＬ４０、ＭＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＥＳＯ１またはmelan Ａから選択される、請求項４記載の免疫原性免疫刺激複合体。６．上記タンパク質がインフルエンザヘマグルチニンである、請求項１または２記載の免疫原性免疫刺激複合体。７．医薬として許容し得る一種または二種以上の担体および／または希釈剤と共に、請求項１から６いずれか記載の免疫原性免疫刺激複合体を活性成分として含む、ワクチン組成物。８．引き出される、または誘発される免疫応答が疾病状態の開始もしくは進行を阻害、休止または遅延させる、哺乳類の疾病状態に対する免疫応答の引き出し方法または誘発方法であって、請求項７記載のワクチン組成物の有効量を上記哺乳類に投与することを包含する方法。９．上記疾病状態が腫瘍である、請求項８記載の方法。１０．上記腫瘍がメラノーマである、請求項９記載の方法。１１．上記哺乳類がヒトである、請求項８または９または１０記載の方法。１２．疾病状態の開始もしくは進行を阻止、休止または遅延させるための医薬の製造における請求項１から７のいずれか一項記載の免疫原性免疫刺激複合体の使用。１３．上記疾病状態が腫瘍である、請求項１２記載の使用。１４．上記腫瘍がメラノーマである、請求項１３記載の使用。１５．請求項１から７のいずれか一項記載の免疫原性免疫刺激複合体を活性成分として含む、疾病状態の開始もしくは進行の阻止、休止または遅延用に使用するための薬剤。１６．上記疾病状態が腫瘍である、疾病状態の開始もしくは進行の阻止、休止または遅延用に使用するための、請求項１５記載の薬剤。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．（ｉ）リン脂質および少なくとも一種のガングリオシド、または（ｉｉ）少なくとも一種のガングリオシド単独のいずれかと共に、サポニン製剤、ステロール、タンパク質エピトープを含む免疫原性免疫刺激複合体。２．上記ガングリオシドがＧＭ2、ＧＤ2、ＧＤ3およびＧＴ3またはそれらの誘導体から選択される、請求項１記載の免疫原性免疫刺激複合体。３．上記タンパク質が、がん特異性タンパク質である、請求項１または２記載の免疫原性免疫刺激複合体。４．上記がん特異性タンパク質がメラノーマ特異性タンパク質である、請求項３記載の免疫原性免疫刺激複合体。５．上記メラノーマ特異性タンパク質がＭＥＬ４０、ＭＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＥＳＯ１またはmelan Ａから選択される、請求項４記載の免疫原性免疫刺激複合体。６．上記タンパク質がインフルエンザヘマグルチニンである、請求項１または２記載の免疫原性免疫刺激複合体。７．一種または二種以上の医薬として容認し得る担体および／または希釈剤と共に、請求項１から６のいずれか１項記載の免疫原性免疫刺激複合体を活性成分として含むワクチン組成物。８．引き出される、または誘発される免疫応答が疾病状態の開始もしくは進行を阻止、休止または遅延させる場合の、哺乳類の疾病状態に対する免疫応答の引き出し方法、または誘発方法であって、請求項７記載のワクチン組成物の有効量を哺乳類に投与することを包含する方法。９．上記疾病状態が腫瘍である、請求項８記載の方法。１０．上記腫瘍がメラノーマである、請求項９記載の方法。１１．上記哺乳類がヒトである、請求項８または９または１０記載の方法。１２．疾病状態の開始もしくは進行を阻止、休止または遅延させるための医薬の製造用への請求項１から７のいずれか一項記載の免疫原性免疫刺激複合体の使用。１３．上記疾病状態が腫瘍である、請求項１２記載の使用。１４．上記腫瘍がメラノーマである、請求項１３記載の使用。１５．請求項１から７のいずれか一項記載の免疫原性免疫刺激複合体を活性成分として含む、疾病状態の開始もしくは進行の阻止、休止または遅延用に使用する薬剤。１６．上記疾病状態が腫瘍であるば場合において、疾病状態の開始もしくは進行の阻止、休止または遅延用に使用する、請求項１５記載の医薬物質。１７．上記腫瘍がメラノーマである腫瘍の開始もしくは進行の阻止、休止または遅延用に使用するための、請求項１６記載の薬剤。