JPS62135770A - ヒトインタ−ロイキン−２の測定法，測定用試薬，抗体および複合体 - Google Patents
ヒトインタ−ロイキン−２の測定法，測定用試薬，抗体および複合体Info
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- JPS62135770A JPS62135770A JP61178403A JP17840386A JPS62135770A JP S62135770 A JPS62135770 A JP S62135770A JP 61178403 A JP61178403 A JP 61178403A JP 17840386 A JP17840386 A JP 17840386A JP S62135770 A JPS62135770 A JP S62135770A
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- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明はヒトインターロイキン−２の測定法。
測定用試薬、抗体および複合体に関する。
従来の技術
インターロイキン−２（以下において、ｒｌＬ−２」と
略称することらある。）はレクチンや抗原の刺激を受け
たＴリンパ球が生産するリンホカインの一種である。Ｉ
Ｌ−２にはｉｎ ｖｉｔｒｏにおけろ′ｒ細胞の長期
増殖促進以外に、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導、牌細胞中の
Ｂ細胞の抗体産生の誘導、 Ｎ Ｋ細胞の活性化などの
生物活性が報告されている。
略称することらある。）はレクチンや抗原の刺激を受け
たＴリンパ球が生産するリンホカインの一種である。Ｉ
Ｌ−２にはｉｎ ｖｉｔｒｏにおけろ′ｒ細胞の長期
増殖促進以外に、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導、牌細胞中の
Ｂ細胞の抗体産生の誘導、 Ｎ Ｋ細胞の活性化などの
生物活性が報告されている。
また一方、このような生理作用から、ＩＬ−２には、近
年免疫不全症や癌の治療への臨床応用の期待がかかり、
注目を浴びている。しかしながら、その大量投与による
臨床効果の検討は培養細胞での生産量がきわめて少ない
ため、遅れていた。最近、組換えＤ Ｎ Ａ技術が急速
に進歩し、組換え型ＴＬ−２（以下において、ｒｒｌＬ
−２」と略称することもある。）の大量供給への道が拓
かれ、その効果の検討が開始されている。
年免疫不全症や癌の治療への臨床応用の期待がかかり、
注目を浴びている。しかしながら、その大量投与による
臨床効果の検討は培養細胞での生産量がきわめて少ない
ため、遅れていた。最近、組換えＤ Ｎ Ａ技術が急速
に進歩し、組換え型ＴＬ−２（以下において、ｒｒｌＬ
−２」と略称することもある。）の大量供給への道が拓
かれ、その効果の検討が開始されている。
発明が解決しようとする問題直
ＩＬ−２の生物活性は、従来、バイオアッセイ法［バイ
オケミカル・バイオフィジカル・リサーチ・コミューケ
ーシぢンズ（Ｂ ｉｏｃｈｅｍ、 Ｂ １ｏｐｈｙｓ。
オケミカル・バイオフィジカル・リサーチ・コミューケ
ーシぢンズ（Ｂ ｉｏｃｈｅｍ、 Ｂ １ｏｐｈｙｓ。
Ｒｅｓ、 Ｃｏｍｍｕｎ、 ）、１０９，３６３（１９
８２）］で測定されて来たが、不法によるＩＬ−２の血
中濃度の測定限界は１−１０μｇ／ｄである。しかしな
がら、ＩＬ−２は超微量でその生物活性を示すことから
、バイオアッセイ法以上の精度を持つ測定法の開発が急
がれている。
８２）］で測定されて来たが、不法によるＩＬ−２の血
中濃度の測定限界は１−１０μｇ／ｄである。しかしな
がら、ＩＬ−２は超微量でその生物活性を示すことから
、バイオアッセイ法以上の精度を持つ測定法の開発が急
がれている。
本発明者らは、このような情勢に鑑み、ヒト■Ｌ−２の
より高感度、高精度の測定法の研究を鋭意行ったところ
、組換え型ヒトインターロイキン−２を温血動物に接種
して得られた抗体を用い、サンドイッチ法による酵素免
疫測定法（ＥＩＡ。
より高感度、高精度の測定法の研究を鋭意行ったところ
、組換え型ヒトインターロイキン−２を温血動物に接種
して得られた抗体を用い、サンドイッチ法による酵素免
疫測定法（ＥＩＡ。
Ｅｎｚｙｍｅ−ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）でヒトインタ
ーロイキン−２を測定すると、バイオアッセイ法に比し
顕苫に高感度でＩＬ−２を測定できることを見い出した
。
ーロイキン−２を測定すると、バイオアッセイ法に比し
顕苫に高感度でＩＬ−２を測定できることを見い出した
。
本発明者らは、これらの知見にもとつき、さらに研究し
た結果、本発明を完成した。
た結果、本発明を完成した。
本発明は、
（１）、担体に保持された抗体、抗原および標識抗体を
用いるサンドイッチ法による酵素免疫測定法において、
担体に保持された抗体および標識抗体の各抗体が、温血
動物起源の抗原換え型ヒトインターロイキン−２抗体又
はそれらのフラグメントであることを特徴とするヒトイ
ンターロイキン−２の測定法。
用いるサンドイッチ法による酵素免疫測定法において、
担体に保持された抗体および標識抗体の各抗体が、温血
動物起源の抗原換え型ヒトインターロイキン−２抗体又
はそれらのフラグメントであることを特徴とするヒトイ
ンターロイキン−２の測定法。
（２）、（ａ）温血動物起源の抗原換え型ヒトインター
ロイキン−２抗体又はそのフラグメント、および（ｂ）
温血動物起源の抗原換え型ヒトインターロイキン−２抗
体又はそのフラグメントと標識剤との複合体。
ロイキン−２抗体又はそのフラグメント、および（ｂ）
温血動物起源の抗原換え型ヒトインターロイキン−２抗
体又はそのフラグメントと標識剤との複合体。
からなるヒトインターロイキン−２のサンドイッチ法に
よる免疫化学的測定用キット。
よる免疫化学的測定用キット。
（３）、温血動物起源の抗原換え型ヒトインターロイキ
ン−２抗体又はそのフラグメント、および（４）、温血
動物起源の抗原換え型ヒトインターロイキン−２抗体又
はそのフラグメントと標識剤との複合体である。
ン−２抗体又はそのフラグメント、および（４）、温血
動物起源の抗原換え型ヒトインターロイキン−２抗体又
はそのフラグメントと標識剤との複合体である。
本発明のサンドイッチ法において用いられる温血動物起
源の抗原換え型ヒトインターロイキン−２抗体は、組換
え型ヒトＩＬ−２を抗原として温血動物に接種して製造
される。
源の抗原換え型ヒトインターロイキン−２抗体は、組換
え型ヒトＩＬ−２を抗原として温血動物に接種して製造
される。
本明細書においては、担体に保持される抗体を第一抗体
と、標識剤と結合される抗体を第二抗体とそれぞれ称す
ることもある。
と、標識剤と結合される抗体を第二抗体とそれぞれ称す
ることもある。
抗原として用いられる組換え型ヒトＩＬ−２としては、
遺伝子組換え技術により製造され、天然のヒトインター
ロイキン−２と同禄の生物学的もしくは免疫学的活性、
たとえばＩ Ｌ −２レセプターや抗ＩＬ−２抗体との
結合能、を有するものであれ（ｊいずれてもよい。
遺伝子組換え技術により製造され、天然のヒトインター
ロイキン−２と同禄の生物学的もしくは免疫学的活性、
たとえばＩ Ｌ −２レセプターや抗ＩＬ−２抗体との
結合能、を有するものであれ（ｊいずれてもよい。
抗原として用いられろ組換え型ヒトＩＬ−２としては、
次のらのが挙げられろ。
次のらのが挙げられろ。
遺伝子工学技術により製造される第１図で示されるアミ
ノ酸配列を有するポリペプチド（１）ＣＰＣＴ ／ Ｊ
Ｐ ８４／Ｑ（１４６Ｑ明細書実施例１（１９８４年
９月２６日出願）。特開昭６１−７８７９’ ９号公報
に対応する。］、その生物学的もしくは免疫学的活性に
必要な一部分のアミノ酸配列からなるフラグメントでも
よい。上記フラグメントとしては、例えばポリペプチド
（１）のアミノ末端から１個のアミノ酸（ＲＰＣ公開９
１５３９号公報）または４個のアミノ酸を欠くフラグメ
ント（特開昭６０−１２６０８８号公報）やカルボキシ
ル末端部の数側のアミノ酸を欠くフラグメントなどが挙
げられろ。さらに上記ポリペプチド（（）の構成アミノ
酸の一部が欠損しているか他のアミノ酸に置換された乙
の、例えば １２５位のシスティン残基かセリン残基に
置換されたもの（特開昭５９−９３０９３号公報）でも
よい。
ノ酸配列を有するポリペプチド（１）ＣＰＣＴ ／ Ｊ
Ｐ ８４／Ｑ（１４６Ｑ明細書実施例１（１９８４年
９月２６日出願）。特開昭６１−７８７９’ ９号公報
に対応する。］、その生物学的もしくは免疫学的活性に
必要な一部分のアミノ酸配列からなるフラグメントでも
よい。上記フラグメントとしては、例えばポリペプチド
（１）のアミノ末端から１個のアミノ酸（ＲＰＣ公開９
１５３９号公報）または４個のアミノ酸を欠くフラグメ
ント（特開昭６０−１２６０８８号公報）やカルボキシ
ル末端部の数側のアミノ酸を欠くフラグメントなどが挙
げられろ。さらに上記ポリペプチド（（）の構成アミノ
酸の一部が欠損しているか他のアミノ酸に置換された乙
の、例えば １２５位のシスティン残基かセリン残基に
置換されたもの（特開昭５９−９３０９３号公報）でも
よい。
上記遺伝子工学技術で製造されろＩＬ−２（ｒｔＬ−２
）は、ポリペプチド（Ｉ）のアミノ末端にさらにＭｅｔ
を有していてもよ＜［ＰＣＴ／ＪＰ８４１００４６０明
細書実施例１（１９８４年９月２６日出願）。特開昭６
１−７８７９９号公報に対応する。コ、またポリペプチ
ド（１）とそのアミノ末端にさらにＭｅｔを有するポリ
ペプチド（１）の混合物でもよい［特開昭６０−１１５
５２８号公報コ。
）は、ポリペプチド（Ｉ）のアミノ末端にさらにＭｅｔ
を有していてもよ＜［ＰＣＴ／ＪＰ８４１００４６０明
細書実施例１（１９８４年９月２６日出願）。特開昭６
１−７８７９９号公報に対応する。コ、またポリペプチ
ド（１）とそのアミノ末端にさらにＭｅｔを有するポリ
ペプチド（１）の混合物でもよい［特開昭６０−１１５
５２８号公報コ。
抗原として用いるｒＩＬ−２は、とりわけポリペプチド
（１）、あるいはそのアミノ末端にＭｅｔを有するポリ
ペプチド（Ｉ）またはそれらの混合物が好ましい。
（１）、あるいはそのアミノ末端にＭｅｔを有するポリ
ペプチド（Ｉ）またはそれらの混合物が好ましい。
抗原が接種される。温血動物としては、ヒト以外のもの
が用いられ、その例としては、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、
ラット、マウス、モルモット、ウシ、ウマ。
が用いられ、その例としては、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、
ラット、マウス、モルモット、ウシ、ウマ。
ブタなどの哺乳動物、ニワトリ、ハト、アヒル、ガヂョ
ウ、ウズラなどの鳥類等などが挙げられる。
ウ、ウズラなどの鳥類等などが挙げられる。
ｒＩＬ−２の接種量は該動物に抗体を産生させるに何効
な量であればよいが、通常１口約０．１〜１０ｍｇ程度
、例えばウサギならば１回約１ｍｇ、ヤギならば１回約
４ｍｇを、フロイントの完全アジュバントとともに、背
部皮内、筋肉内、後肢掌皮内等に２週間ごとに１−１０
回投与する。生成したＩＬ−２に特異的な抗体は、採血
（たとえば、ウサギであれば通常、最終接種後７〜１２
日の間に耳静脈から採血する。）し、遠心分離した血清
より得ることができる。すなわち、例えば血清をまず硫
安で塩析し、沈殿を遠心でとり、沈殿を例えばホウ酸緩
衝液にとかし、ついでｒｌＬ−２を担体に固定化したカ
ラム［特願昭５９−１７６３０６号明細書（昭和５９年
８月２３日出願）。特開昭６１−５３３００号公報に対
応する。コを用いるアフィニティクロマトグラフィーに
よって精製を行い、ＩＬ−２に特異的な抗体を取得する
。
な量であればよいが、通常１口約０．１〜１０ｍｇ程度
、例えばウサギならば１回約１ｍｇ、ヤギならば１回約
４ｍｇを、フロイントの完全アジュバントとともに、背
部皮内、筋肉内、後肢掌皮内等に２週間ごとに１−１０
回投与する。生成したＩＬ−２に特異的な抗体は、採血
（たとえば、ウサギであれば通常、最終接種後７〜１２
日の間に耳静脈から採血する。）し、遠心分離した血清
より得ることができる。すなわち、例えば血清をまず硫
安で塩析し、沈殿を遠心でとり、沈殿を例えばホウ酸緩
衝液にとかし、ついでｒｌＬ−２を担体に固定化したカ
ラム［特願昭５９−１７６３０６号明細書（昭和５９年
８月２３日出願）。特開昭６１−５３３００号公報に対
応する。コを用いるアフィニティクロマトグラフィーに
よって精製を行い、ＩＬ−２に特異的な抗体を取得する
。
上記の操作により本発明の第一抗体および第二抗体がそ
れぞれ得られる。第一抗体取得および第二抗体取得のた
めに免疫する温血動物は、それぞれ異なる種の動物を用
いることが好ましく、とりわけ第一抗体取得のためには
、比較的大量の抗体が得られるヤギなどが好ましく、他
方第二抗体取得のためには、ウサギなどが好ましい。
れぞれ得られる。第一抗体取得および第二抗体取得のた
めに免疫する温血動物は、それぞれ異なる種の動物を用
いることが好ましく、とりわけ第一抗体取得のためには
、比較的大量の抗体が得られるヤギなどが好ましく、他
方第二抗体取得のためには、ウサギなどが好ましい。
本発明に用いる抗ＩＬ−２抗体のうち、上記遺伝子工学
技術で製造されるＩＬ−２を抗原として、温血動物に接
種して得られる抗体は新規であり、ＥＩＡ法による測定
で１０４〜１０’以上の抗体価を有する。
技術で製造されるＩＬ−２を抗原として、温血動物に接
種して得られる抗体は新規であり、ＥＩＡ法による測定
で１０４〜１０’以上の抗体価を有する。
このようにして得られた抗体は、天然型ヒトＩＬ−２を
も認識する。
も認識する。
標識体として用いる本発明の第二抗体は、上記で得られ
る抗体を、例えば公知の方法に従い、ペプシンで部分消
化し、抗体フラグメントＦ （ａｂ’）。
る抗体を、例えば公知の方法に従い、ペプシンで部分消
化し、抗体フラグメントＦ （ａｂ’）。
として抗体のＣ領域を削除し、ついで還元により抗体フ
ラグメントＦ ａｂ’に変換して用いろことが好ましい
。
ラグメントＦ ａｂ’に変換して用いろことが好ましい
。
本発明における抗体のフラグメントとしては、Ｆ （ａ
ｂ’）ｔ、 ｒ；’ ａｂ’が挙げられる。
ｂ’）ｔ、 ｒ；’ ａｂ’が挙げられる。
上記ペプシンによる部分消化および還元は、自体公知の
常套手段、たとえばジャーナル・オブ・アプライド・バ
イオケミストリー（Ｊｏａｒｎａｌ ｏｒＡｐｐｌｉｅ
ｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）４．４１−５７ （
＋９８２）に従って行なえばよい。
常套手段、たとえばジャーナル・オブ・アプライド・バ
イオケミストリー（Ｊｏａｒｎａｌ ｏｒＡｐｐｌｉｅ
ｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）４．４１−５７ （
＋９８２）に従って行なえばよい。
太田パノ１ノ＋、壬１↓ｌ−田１）ふハス片ｔｋｋ五輝
１勲１〕・の複合体は、たとえば両者をｐＨ約６〜８の
緩衝液中で、約ｌＯ℃〜５０℃で、約１０分ないし２４
時間反応させることにより行なわれる。
１勲１〕・の複合体は、たとえば両者をｐＨ約６〜８の
緩衝液中で、約ｌＯ℃〜５０℃で、約１０分ないし２４
時間反応させることにより行なわれる。
該標識剤としては、標識酵素が好ましい。該標識酵素の
例としては、たとえばペルオキシダーゼ［例、西洋わさ
びペルオキシダーゼ（Ｈｎ Ｐ 、ｈｏｒｓｅｒａｄｉ
ｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）］、マレートデヒドロゲ
ナーゼ。
例としては、たとえばペルオキシダーゼ［例、西洋わさ
びペルオキシダーゼ（Ｈｎ Ｐ 、ｈｏｒｓｅｒａｄｉ
ｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）］、マレートデヒドロゲ
ナーゼ。
β−ガラクトシダーゼなどが挙シられる。該標識酵素と
しては、なかでらＨＲＰが好ましい。
しては、なかでらＨＲＰが好ましい。
標識酵素は、マレイミド化された乙のを用いると、複合
体の形成を行ない易い［特開昭５９−９００５４号公報
］。
体の形成を行ない易い［特開昭５９−９００５４号公報
］。
マレイミド化された酵素を用いて複合体を形成する方法
を次に述べる。まず、標識酵素と、一般式 ［式中、ｎは０〜５の整数を、Ｒは化学結合まｆこは二
価の６員環状炭化水素残店（例、１．２−．１．３−ま
たは１．４−シクロヘキシレン、１．２−．１゜３−ま
たは１．４−フェニレン）を示す。］で表わされる化合
物とを、ｐＦｔ約６ないし８の緩衝液中で約ＩＯないし
５０℃の温度で約１０分ないし２４時間反応させること
によって行なわれる。
を次に述べる。まず、標識酵素と、一般式 ［式中、ｎは０〜５の整数を、Ｒは化学結合まｆこは二
価の６員環状炭化水素残店（例、１．２−．１．３−ま
たは１．４−シクロヘキシレン、１．２−．１゜３−ま
たは１．４−フェニレン）を示す。］で表わされる化合
物とを、ｐＦｔ約６ないし８の緩衝液中で約ＩＯないし
５０℃の温度で約１０分ないし２４時間反応させること
によって行なわれる。
該緩衝液としては、たとえば叶Ｉ７．０の０．１Ｍリン
酸緩衝液、ｐＩ−Ｉ ６ 、３の０．０５Ｍリン酸緩衝
液などが挙げられる。
酸緩衝液、ｐＩ−Ｉ ６ 、３の０．０５Ｍリン酸緩衝
液などが挙げられる。
このようにして得られたマレイミド化標識剤の精製は、
たとえばゲルクロマトグラフィーなどにより行なうこと
ができる。該ゲルクロマトグラフィーを行なう際に用い
られる担体としてはたとえばセファデックスＧ−２５［
ファルマシア・ファインケミカル社（スエーデン）製］
、バイオゲルＰ−２［バイオ・ラット・ラボラトリーズ
社（米国）製コなとが挙げられる。
たとえばゲルクロマトグラフィーなどにより行なうこと
ができる。該ゲルクロマトグラフィーを行なう際に用い
られる担体としてはたとえばセファデックスＧ−２５［
ファルマシア・ファインケミカル社（スエーデン）製］
、バイオゲルＰ−２［バイオ・ラット・ラボラトリーズ
社（米国）製コなとが挙げられる。
マレイミド化標識剤を第二抗体と反応させる場合、第二
抗体あるいはそのフラグメントを、メルカプトエチルア
ミン類の存在下で還元し、ゲルクロマトグラフィーによ
って精製された第二抗体もしくはそのフラグメントとマ
レイミド化標識剤を反応させる。
抗体あるいはそのフラグメントを、メルカプトエチルア
ミン類の存在下で還元し、ゲルクロマトグラフィーによ
って精製された第二抗体もしくはそのフラグメントとマ
レイミド化標識剤を反応させる。
該反応は、両者を緩衝液中で約０°Ｃないし・１０℃の
温度で、約１ないし４８時間反応させることにより行な
うことができる。該緩衝液としては、たとえばｐ）Ｉ６
．Ｏの５ｍＭエチレンノアミン四酢酸ナトリウム塩を含
む０．１Ｍリン酸緩衝液などが挙げられろ。
温度で、約１ないし４８時間反応させることにより行な
うことができる。該緩衝液としては、たとえばｐ）Ｉ６
．Ｏの５ｍＭエチレンノアミン四酢酸ナトリウム塩を含
む０．１Ｍリン酸緩衝液などが挙げられろ。
このようにして得られた標識抗体は、たとえばゲルクロ
マトグラフィーなどにより精製することができる。該ゲ
ルクロマトグラフィーに用いられる担体としては、たと
えばウルトロゲルΔｃＡ４４［ＬＫＢ社（スエーデン）
製］、セファクリルＳ−２００［ファルマシア・ファイ
ンケミカル社（スエーデン）製］などが挙げられる。と
りわけマレイミド化ペルオキシダーゼ［特開昭５９−９
００５４号公報］を用いてペルオキシダーゼを結合させ
ることが好ましい。
マトグラフィーなどにより精製することができる。該ゲ
ルクロマトグラフィーに用いられる担体としては、たと
えばウルトロゲルΔｃＡ４４［ＬＫＢ社（スエーデン）
製］、セファクリルＳ−２００［ファルマシア・ファイ
ンケミカル社（スエーデン）製］などが挙げられる。と
りわけマレイミド化ペルオキシダーゼ［特開昭５９−９
００５４号公報］を用いてペルオキシダーゼを結合させ
ることが好ましい。
該反応は、上記抗体に重量比として２〜２０倍虫のペル
オキシダーゼ（西洋ワサビペルオキシダーゼなど）を加
え、緩衝液中で約 ０８〜４０°Ｃの温度で、約１〜４
８時間反応させることにより行なうことができる。緩衝
液としては、たとえばｐＨ６，０の ５ｍＭエチレンジ
アミン四酢酸ナトリウムを含むＯ，１Ｍリン酸緩衝液な
どが使用できる。
オキシダーゼ（西洋ワサビペルオキシダーゼなど）を加
え、緩衝液中で約 ０８〜４０°Ｃの温度で、約１〜４
８時間反応させることにより行なうことができる。緩衝
液としては、たとえばｐＨ６，０の ５ｍＭエチレンジ
アミン四酢酸ナトリウムを含むＯ，１Ｍリン酸緩衝液な
どが使用できる。
このようにして得られたペルオキシダーゼ標識抗体は、
たとえばゲルろ適法などにより精製し、第二抗体として
使用する。
たとえばゲルろ適法などにより精製し、第二抗体として
使用する。
本発明のＩＬ−２の測定法は、公知のサンドイッチ法の
原理１手段［メソッズ・イン・エンザイモロノー（Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ、 ）、８４．２６
（１９８２）；ジャーナル・オプ・イムノロジカル・メ
ソッズ（Ｊ、Ｉｍｍｕｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ）、８．２２
３（１９７５）］ＥＰＣ公開第４公開４４母８９８ に基づき行なうことができろ。
原理１手段［メソッズ・イン・エンザイモロノー（Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ、 ）、８４．２６
（１９８２）；ジャーナル・オプ・イムノロジカル・メ
ソッズ（Ｊ、Ｉｍｍｕｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ）、８．２２
３（１９７５）］ＥＰＣ公開第４公開４４母８９８ に基づき行なうことができろ。
本発明のＩＬ−２の測定は、まずイムノプレートに第一
抗体を吸若させ、ラン血清アルブミンで尿．胸水，髄液
あるいは各種臓器抽出物など）を加え、ついで第二抗体
と標識剤との複合体を加えて反応させる。反応生成物に
標識となる酵素（ペルオキシダーゼなど）の基質（例え
ば過酸化水素水を含んだ０−フェニレンジアミンなど）
を加え、生じた物質の吸光度を測定する。この吸光度を
予め作成しておいた標県曲線（第２図）にあてはめ、検
体溶液中のＩＬ−２含量を算出する。本性によればＩ
Ｌ’− ２のｌθ〜４０ｐｇ／ｄまで測定できろ。
抗体を吸若させ、ラン血清アルブミンで尿．胸水，髄液
あるいは各種臓器抽出物など）を加え、ついで第二抗体
と標識剤との複合体を加えて反応させる。反応生成物に
標識となる酵素（ペルオキシダーゼなど）の基質（例え
ば過酸化水素水を含んだ０−フェニレンジアミンなど）
を加え、生じた物質の吸光度を測定する。この吸光度を
予め作成しておいた標県曲線（第２図）にあてはめ、検
体溶液中のＩＬ−２含量を算出する。本性によればＩ
Ｌ’− ２のｌθ〜４０ｐｇ／ｄまで測定できろ。
本発明のＴＬ−２の測定法を、より具体的に説明するた
め、−例としてカニクイザル静脈の血中ヒトＩＬ−２ａ
度の測定につき下記ずろ。
め、−例としてカニクイザル静脈の血中ヒトＩＬ−２ａ
度の測定につき下記ずろ。
カニクイザル（雌性．２．５〜４ｋｇ，一群３頭）へｒ
ｌＬ−２を０．２〜１００μｇ／ ０ 、 ５ｙＪ ／
ｋｇとなるように静脈内投与し、投与後５，１５．３
０分．１，２。
ｌＬ−２を０．２〜１００μｇ／ ０ 、 ５ｙＪ ／
ｋｇとなるように静脈内投与し、投与後５，１５．３
０分．１，２。
・１．６および２４時間に１〜５蔵ずつ採血し、室温に
３〜５時間静置したのち３ ０ ０ ０ ｒｐｍ， Ｌ
０分間遠心して血清を分離し検体とする。次いで、検
体は５，１ ０，５ ０，１ ０ ０，３ ０ ０およ
び１０００ノケシｔ，・ストろにｒ？− ｆｒ・ノ面ン
３浪訪１ｒ県俯１ン・の枳：■１１定する。すなわち、
ａｎｔｉ −ｒ Ｉ Ｌ −２ｇｏａｔ Ｉ ｇＧ溶ｉ
（＆（蛋白ｍ １５ μｇ／＋Ｊ）Ｉ ＯＯμＱをイム
ノブレー） （Ｎ ｕｎｃ社）のウェル内に加え、４℃
に１６〜２０時間静置する。ウェル内の溶液を捨て、３
００μＱのＰＢＳを加えて洗浄する。この操作を３回繰
り返す。次に２００μｇの１％ウシアルブミン溶液を加
え、４°Ｃで１６〜２０時間静置後、ＰＢＳで５回洗浄
する。１００μＱのｒｒＬ−２溶液、または希釈した検
体溶液をウェル内に加えて４°０゜１６〜２０時間静置
したのち、ＰＢＳでよく洗浄する。次に、ａｎｔｉ−ｒ
ｌ Ｌ −２ｒａｂｂｉｔ Ｆａｂ’ −ＨＲＰ溶液１
００μＱを加えて、室温に４時間静置後、ＰＢＳでよく
洗浄する。そして１００μＱの店賃溶液をウェル内に加
えて室温、暗所にて、２０〜４０分間反応させる。１０
０μＱの２Ｍ硫酸溶液を添加して反応を停止させ、タイ
ターチックマルチスキャンＭＣにより４９２ｎｍの吸光
度の変化を測定し、第２図に示すごと＜ｒｌＬ−２の標
孕曲線からそれぞれの検体中のｒＩＬ−２ａ度を算出す
る。なお、１００μｇ１０．５＋Ｊ／ｋｇ投与の結果を
第４図に示す。
３〜５時間静置したのち３ ０ ０ ０ ｒｐｍ， Ｌ
０分間遠心して血清を分離し検体とする。次いで、検
体は５，１ ０，５ ０，１ ０ ０，３ ０ ０およ
び１０００ノケシｔ，・ストろにｒ？− ｆｒ・ノ面ン
３浪訪１ｒ県俯１ン・の枳：■１１定する。すなわち、
ａｎｔｉ −ｒ Ｉ Ｌ −２ｇｏａｔ Ｉ ｇＧ溶ｉ
（＆（蛋白ｍ １５ μｇ／＋Ｊ）Ｉ ＯＯμＱをイム
ノブレー） （Ｎ ｕｎｃ社）のウェル内に加え、４℃
に１６〜２０時間静置する。ウェル内の溶液を捨て、３
００μＱのＰＢＳを加えて洗浄する。この操作を３回繰
り返す。次に２００μｇの１％ウシアルブミン溶液を加
え、４°Ｃで１６〜２０時間静置後、ＰＢＳで５回洗浄
する。１００μＱのｒｒＬ−２溶液、または希釈した検
体溶液をウェル内に加えて４°０゜１６〜２０時間静置
したのち、ＰＢＳでよく洗浄する。次に、ａｎｔｉ−ｒ
ｌ Ｌ −２ｒａｂｂｉｔ Ｆａｂ’ −ＨＲＰ溶液１
００μＱを加えて、室温に４時間静置後、ＰＢＳでよく
洗浄する。そして１００μＱの店賃溶液をウェル内に加
えて室温、暗所にて、２０〜４０分間反応させる。１０
０μＱの２Ｍ硫酸溶液を添加して反応を停止させ、タイ
ターチックマルチスキャンＭＣにより４９２ｎｍの吸光
度の変化を測定し、第２図に示すごと＜ｒｌＬ−２の標
孕曲線からそれぞれの検体中のｒＩＬ−２ａ度を算出す
る。なお、１００μｇ１０．５＋Ｊ／ｋｇ投与の結果を
第４図に示す。
この結果は、本状によれば、バイオアッセイ法の少なく
とも１００倍以上の感度で、かつ正確にｒｌＬ−２の血
中濃度を測定できることを示している。従って、本状は
今後、臨床検体（血液、血清。
とも１００倍以上の感度で、かつ正確にｒｌＬ−２の血
中濃度を測定できることを示している。従って、本状は
今後、臨床検体（血液、血清。
血漿、尿、膨水、髄液など）中のＩＬ−２の測定や、Ｉ
Ｌ−２の組織内、臓器内分布の検討に有力な手段を提供
するものである。
Ｌ−２の組織内、臓器内分布の検討に有力な手段を提供
するものである。
とりわけｒｌＬ−２を免疫原として得られる抗ＩＬ−２
抗体を用いろ場合は、抗体の性状が明確でより正確なＩ
Ｌ−２の測定を行なうことができろ。
抗体を用いろ場合は、抗体の性状が明確でより正確なＩ
Ｌ−２の測定を行なうことができろ。
本発明のサンドイッチ法によるヒトＩＬ−２測定用試薬
キットの例としては、次のらのが挙げられる。
キットの例としては、次のらのが挙げられる。
■、測定用試薬
（１）溶解用緩衝液
新生牛血清（５６°Ｃ１３０分処理） Ｉ００滅チメロ
サール ｏ、ｏ ｔｇこれらを、０．
０２Ｍリン酸緩衝液−生理食塩水、ｐＨ７，０，（ＰＢ
Ｓ）に１リツトルになるように希釈し、４°Ｃで保存す
る。
サール ｏ、ｏ ｔｇこれらを、０．
０２Ｍリン酸緩衝液−生理食塩水、ｐＨ７，０，（ＰＢ
Ｓ）に１リツトルになるように希釈し、４°Ｃで保存す
る。
（２）牛血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液牛血清アルブミ
ン １０ｇヂメロサール
０．０１ｇこれらを、１１２のＰＢＳに溶解し、
５６°Ｃ３０分処理し、４°Ｃで保存する。
ン １０ｇヂメロサール
０．０１ｇこれらを、１１２のＰＢＳに溶解し、
５６°Ｃ３０分処理し、４°Ｃで保存する。
（３）抗ｒｌＬ−２ヤギＩｇＧ（第一抗体）抗体溶液を
、使用前に、緩衝液で１５ｇｇ１ｇＧ／ｒｒ＆となるよ
うに希釈する。
、使用前に、緩衝液で１５ｇｇ１ｇＧ／ｒｒ＆となるよ
うに希釈する。
（４）ペルオキシダーゼと抗ｒＴＬ−２ウサギＦ ａｂ
’（第二抗体）との複合体 複合体溶液を、使用前に、緩衝液で３．５μｇ蛋白／滅
となるように希釈する。
’（第二抗体）との複合体 複合体溶液を、使用前に、緩衝液で３．５μｇ蛋白／滅
となるように希釈する。
（５）耗質溶液
０．０１％チメロサールを含む０．１Ｍクエン酸緩衝液
（＋）＋（５，５）１００滅に、３０％過酸化水素溶液
６６μＱを加え、得られた溶液を１１°Ｃに保存する。
（＋）＋（５，５）１００滅に、３０％過酸化水素溶液
６６μＱを加え、得られた溶液を１１°Ｃに保存する。
堰質溶液は、使用直前に、０−フェニレンジアミン４４
ｍｇを該溶液ＩＯ顧に溶解する。
ｍｇを該溶液ＩＯ顧に溶解する。
（６）ｒｌＬ−２標桑溶液
ｒｌＬ−２溶液を、緩衝液で０ 、０４ ｕｎｉｔ／滅
になるように希釈する。希釈液をピペ、ソトて小バイア
ル（各１滅）に分注し、−２０°Ｃて保存する。
になるように希釈する。希釈液をピペ、ソトて小バイア
ル（各１滅）に分注し、−２０°Ｃて保存する。
２、測定法
（１）ＰＢＳでｌ：２５に希釈された抗ｒＩＬ−２ヤギ
ＩｇＧ溶、夜（１５ｇｇ／＋＋Ｊ） １００μＱをピペ
ットでとり、ヌンクイムノプレートの各ウェルに分注し
、該プレートを４℃、１６〜２４時間保存する。
ＩｇＧ溶、夜（１５ｇｇ／＋＋Ｊ） １００μＱをピペ
ットでとり、ヌンクイムノプレートの各ウェルに分注し
、該プレートを４℃、１６〜２４時間保存する。
（２）溶液を捨て、該プレートをＰＩ３５（各ウェルに
３００μＱ）で３回洗う。
３００μＱ）で３回洗う。
（３）各ウェルにＢＳＡ溶液２００μＱを加え、４’Ｃ
，１６〜２・１時間保存する。
，１６〜２・１時間保存する。
（４）溶液を捨て、該プレートをＰＢＳ（３００μＱ）
で３回洗う。
で３回洗う。
（５）１００μＱの被検血清又はｒｌＬ−２標学溶液（
０，００１，０，００２，Ｏ，ＯＱ４．０．００ｇ、０
．０＋２．０．０１６又は０．０２ｕｎｉｔ／最）を加
え、該プレートを、１°Ｃ１１６〜２４時間保存する。
０，００１，０，００２，Ｏ，ＯＱ４．０．００ｇ、０
．０＋２．０．０１６又は０．０２ｕｎｉｔ／最）を加
え、該プレートを、１°Ｃ１１６〜２４時間保存する。
被検血清およびｒＩＬ−２標鵡溶液を希釈用緩衝液で希
釈する。
釈する。
（６）溶液を捨て、該プレートをＰＢＳ（３００μＱ）
で５回洗う。
で５回洗う。
（７）希釈用緩衝液で１：５０に希釈されたベルオキン
ダーゼと抗ｒＩＬ−２ウサギＦ ａｂ’複合体（１００
μρ）を加え、該プレートを室温で４時間保存する。
ダーゼと抗ｒＩＬ−２ウサギＦ ａｂ’複合体（１００
μρ）を加え、該プレートを室温で４時間保存する。
（８）溶液を捨て、該プレートをＰＢＳ（３００μｍ２
）で５回洗う。
）で５回洗う。
（９）基質溶液（１００μＱ、）を加え、該プレートを
室温暗所で３０分保存する。
室温暗所で３０分保存する。
（１０） ２Ｍｌ−１，Ｓｏ、（１００μＱ）を加え、
酵素反応を停止させる。
酵素反応を停止させる。
（１１）タイターチック・マルチスキャンにより４９２
ｎｍの吸光度を測定する。
ｎｍの吸光度を測定する。
（１２）被検血清中のｒＩＬ−２の濃度を、標準測定曲
線から計算する。
線から計算する。
本発明の測定法は、バイオアッセイ法よりも顕著に高感
度である。たとえば、本発明の測定法は、バイオアッセ
イ法の約１００倍高感度である。また末法とバイオアッ
セイ法との相関係数は０９９９と高く、得られる測定値
か生物活性をよく反映していると判定できろ。（第３図
） また、ＩＬ−２の血清への添加回収実験を行って末法で
の検体溶液中の血清量の影響を調べたところ、血清が４
０％以下であれば測定に影響のないことが判明した。
度である。たとえば、本発明の測定法は、バイオアッセ
イ法の約１００倍高感度である。また末法とバイオアッ
セイ法との相関係数は０９９９と高く、得られる測定値
か生物活性をよく反映していると判定できろ。（第３図
） また、ＩＬ−２の血清への添加回収実験を行って末法で
の検体溶液中の血清量の影響を調べたところ、血清が４
０％以下であれば測定に影響のないことが判明した。
本発明の測定法は、天然型ヒトインターロイキン−２を
も測定することができる。
も測定することができる。
実施例
以下に参考例および実施例を挙げて、本発明をさらに具
体的に説明するが、これらが本発明の範囲を限定するも
のではない。
体的に説明するが、これらが本発明の範囲を限定するも
のではない。
実験材料としては下記のらのを使用した。
ｒｌＬ−２：特開昭６０−１１５５２８号公報実施例６
記載の方法に従って製造した。蛋 白濃度０．７５．１．２５．１．１９５ｍｇ／７ｎ１．
（５ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ５，０）のらのを製造
し、使用した。
記載の方法に従って製造した。蛋 白濃度０．７５．１．２５．１．１９５ｍｇ／７ｎ１．
（５ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ５，０）のらのを製造
し、使用した。
ウノアルブミン溶液：ウシアルブミン（ＣｏｈｎＦ ｒ
ａｃｔｉｏｎ Ｖ 、第１化学）をＯ，１４５Ｍ食塩
含有０．０２Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６，８（以下ＰＢＳ
と略す）に１％となるように 溶解し、５６℃で３０分間処理したの ら、チメロザール（Ｓｉｇｍａ社）を０．００１％とな
るように加えて、４℃に保存し た。
ａｃｔｉｏｎ Ｖ 、第１化学）をＯ，１４５Ｍ食塩
含有０．０２Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６，８（以下ＰＢＳ
と略す）に１％となるように 溶解し、５６℃で３０分間処理したの ら、チメロザール（Ｓｉｇｍａ社）を０．００１％とな
るように加えて、４℃に保存し た。
１丁−ウシ血清溶液：新生仔ウシ血清（Ｍ、Ａ。
Ｂ １ｏｐｒｏｄｕｃｔ社）を５６℃で３０分間処理し
たのち、ただちにろ紙（東洋ろ紙 Ｎ Ｏ、５Ｇ）ろ過し、０．０２Ｍ ＰＢＳに１０％
となるように溶解し、チメロザ ールを０．００１％になるように加え４°Ｃで保存した
。
たのち、ただちにろ紙（東洋ろ紙 Ｎ Ｏ、５Ｇ）ろ過し、０．０２Ｍ ＰＢＳに１０％
となるように溶解し、チメロザ ールを０．００１％になるように加え４°Ｃで保存した
。
西洋ワザビベルオキシダーゼー抗ウサギ抗体複合体（ａ
ｎｔｉ −ｒａｂｂｉｔ Ｌ ｇＧ −ＨＵＬ Ｐと略
す）：抗ウサギＩ ｇＧ −１−ｔ ＲＰ （Ｍ １ｌ
ｅｓ −Ｙｃｄａ社）を仔ウシ血清溶液で４万倍に希釈
）、て用いたへ 西洋ワザビペルオキシダーゼー抗ヤギ抗体（ａｎｔｉ−
ｇｏａｔ ＩｇＧ−ＨＲＰと略す）・抗ヤギ（ｇＧ
−１−Ｉ ＲＰ （ＣａＭｌｅ１社）を仔ウシ血清溶液
で４万（きに希釈して用いた。
ｎｔｉ −ｒａｂｂｉｔ Ｌ ｇＧ −ＨＵＬ Ｐと略
す）：抗ウサギＩ ｇＧ −１−ｔ ＲＰ （Ｍ １ｌ
ｅｓ −Ｙｃｄａ社）を仔ウシ血清溶液で４万倍に希釈
）、て用いたへ 西洋ワザビペルオキシダーゼー抗ヤギ抗体（ａｎｔｉ−
ｇｏａｔ ＩｇＧ−ＨＲＰと略す）・抗ヤギ（ｇＧ
−１−Ｉ ＲＰ （ＣａＭｌｅ１社）を仔ウシ血清溶液
で４万（きに希釈して用いた。
蛋白質ぷの測定：蛋白質の濃度はウシ血清アルブミン（
Ｓｉｇｍａ社）を標準としてプロティンアッセイキット
（Ｂ ｔｏ −Ｒａｄ社）を使用して求めた。
Ｓｉｇｍａ社）を標準としてプロティンアッセイキット
（Ｂ ｔｏ −Ｒａｄ社）を使用して求めた。
基質溶液：０．０１％チメロザール含有Ｑ 、 ｌ Ｍ
クエン酸緩衝液、ｐＨ５，５に３０％過酸化水素水溶液
を０．０６６％となるように加えて、冷蔵庫に保存し、
実験に用いる直前に ０−フェニレンジアミンを４０ｍＭとなるように溶解し
て用いた。
クエン酸緩衝液、ｐＨ５，５に３０％過酸化水素水溶液
を０．０６６％となるように加えて、冷蔵庫に保存し、
実験に用いる直前に ０−フェニレンジアミンを４０ｍＭとなるように溶解し
て用いた。
参考例１ （固定化ｒｌＬ−２の製造）臭化ンアン活性
化セファロース４Ｂ（ファルマシア社）１ｇをグラスフ
ィルターに移し、２０成のＱ、０（１１Ｎ塩酸を加えて
充分に膨潤させたのち、２００旙の同塩酸溶液でよく洗
浄した。一方、１ｏｎｅのｒｌＬ−２溶液（蛋白ｆｆ１
１．２５ｍｇ／ｌｈ１．）へｌ７Ｊの１〜１重炭酸ナト
リウム溶液を加えたのち、ＩＮ水酸化ナトリウム溶液で
Ｉ）Ｈを８．４に調整した。
化セファロース４Ｂ（ファルマシア社）１ｇをグラスフ
ィルターに移し、２０成のＱ、０（１１Ｎ塩酸を加えて
充分に膨潤させたのち、２００旙の同塩酸溶液でよく洗
浄した。一方、１ｏｎｅのｒｌＬ−２溶液（蛋白ｆｆ１
１．２５ｍｇ／ｌｈ１．）へｌ７Ｊの１〜１重炭酸ナト
リウム溶液を加えたのち、ＩＮ水酸化ナトリウム溶液で
Ｉ）Ｈを８．４に調整した。
この溶液へ上記臭化シアン活性化セファロース４Ｂを加
え、４°Ｃて１６時間反応した。反応後、ゲルをグラス
フィルターに移し、１００戒の０．１Ｍ重炭酸ナトリウ
ム溶液で洗浄した。ついで、ＩＯ−のＩ Ｍエタノール
アミン含有０．１Ｍ重重炭酸ナトリウム溶液中へルを加
え、ゆっくり攪拌しながら４°Ｃで２時間反応させて、
残存活性法をマスクした。ゲルはＯ，１Ｍ重炭酸ナトリ
ウム溶液、１Ｍ食塩含有０．１Ｍ酢酸（１）Ｉ（４，０
）、 ｌ Ｍ食塩含汀０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８，
０）各１００滅で順次洗浄した。
え、４°Ｃて１６時間反応した。反応後、ゲルをグラス
フィルターに移し、１００戒の０．１Ｍ重炭酸ナトリウ
ム溶液で洗浄した。ついで、ＩＯ−のＩ Ｍエタノール
アミン含有０．１Ｍ重重炭酸ナトリウム溶液中へルを加
え、ゆっくり攪拌しながら４°Ｃで２時間反応させて、
残存活性法をマスクした。ゲルはＯ，１Ｍ重炭酸ナトリ
ウム溶液、１Ｍ食塩含有０．１Ｍ酢酸（１）Ｉ（４，０
）、 ｌ Ｍ食塩含汀０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８，
０）各１００滅で順次洗浄した。
本島を０．０２Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８，０）に懸濁し
てカラムにつめ、４°Ｃに保存した。なお、ｒＩＬ−２
のカラムへの結合量は約１１ｍｇであった。
てカラムにつめ、４°Ｃに保存した。なお、ｒＩＬ−２
のカラムへの結合量は約１１ｍｇであった。
実施例１ 抗＋１Ｌ−２ヤギ抗体（ａｎｔｉ −ｒ ｒ
Ｌ −２ｇｏａｔ ＩｇＧ）の製造 （ａ）抗ｒｌＬ−２ヤギ血清の製造 ４成のｒｌＬ−２含有溶液（蛋白ｆｆｉ ０ 、７５ｍ
ｇ／ ７ ）と４蔵のフロイントの完全アジュバント（
［）ｉｆｃ。
Ｌ −２ｇｏａｔ ＩｇＧ）の製造 （ａ）抗ｒｌＬ−２ヤギ血清の製造 ４成のｒｌＬ−２含有溶液（蛋白ｆｆｉ ０ 、７５ｍ
ｇ／ ７ ）と４蔵のフロイントの完全アジュバント（
［）ｉｆｃ。
社）とを混合し、ヤギの筋肉内へ２週間毎７回投与して
得られた血液を室温に５時間静置後、４°Ｃに１６時間
放；１ツしたのち３０００ ｒｐｍ、 １０分間遠心し
、その上清を抗ｒ Ｉ Ｌ −２ヤギ血清として用いた
。
得られた血液を室温に５時間静置後、４°Ｃに１６時間
放；１ツしたのち３０００ ｒｐｍ、 １０分間遠心し
、その上清を抗ｒ Ｉ Ｌ −２ヤギ血清として用いた
。
（ｂ）ａｎｔｉ −ｒ ｌ Ｌ −２ｇｏａｔ Ｉ ｇ
Ｇの製造上記（ａ）で得た抗ｒｌＬ−２ヤギ血清２０藏
をビーカーに取り、硫安を４０％飽和となるように加え
、攪拌しながら４℃に１６時間放置した。次いでｌ Ｏ
，ＯＯＯｒｐｍ、１０分間遠心し、その上清をすてたの
ち、３５旋の０．０２Ｍホウ酸緩衝液、ｐＩ（８，０を
加えて溶解し、スペクトロボア膜（Ｓ ｐｅｃｔｒｕｍ
Ｍｅｄｉｃａ１社）に入れ、同緩衝液に対して４°Ｃで
１６時間透析した。透析後１０．００ Ｏｒｐｍ、Ｉ
０分間遠心して沈殿物を除去し、得られた上清液の５０
＋ｙ４を２等分し、その２５滅を参考例１で製造した固
定化ｒＩＬ−２カラム（１，２ｘ ４ ｃｍ）にかけた
。
Ｇの製造上記（ａ）で得た抗ｒｌＬ−２ヤギ血清２０藏
をビーカーに取り、硫安を４０％飽和となるように加え
、攪拌しながら４℃に１６時間放置した。次いでｌ Ｏ
，ＯＯＯｒｐｍ、１０分間遠心し、その上清をすてたの
ち、３５旋の０．０２Ｍホウ酸緩衝液、ｐＩ（８，０を
加えて溶解し、スペクトロボア膜（Ｓ ｐｅｃｔｒｕｍ
Ｍｅｄｉｃａ１社）に入れ、同緩衝液に対して４°Ｃで
１６時間透析した。透析後１０．００ Ｏｒｐｍ、Ｉ
０分間遠心して沈殿物を除去し、得られた上清液の５０
＋ｙ４を２等分し、その２５滅を参考例１で製造した固
定化ｒＩＬ−２カラム（１，２ｘ ４ ｃｍ）にかけた
。
カラムは２８０ｎｍの吸収がなくなるまで０．０２Ｍホ
ウ酸緩衝液（＋）８８．０）、ついで０．１Ｍ酢酸緩衝
液（ｐＨ４，５）で十分に洗浄した。ついで０．２Ｍグ
リシン塩酸緩衝液（ｐＨ２，０）で溶出を行い、溶出画
分に、すぐ１／１０量のＩ Ｍ Ｎ ａ２ＨＰ ０４を
添加し、ＩＮ水酸化ナトリウム溶液でｐＨを７．０に調
整した。この溶液を０．０２Ｍホウ酸緩衝液（ｐＩ−１
８，０）に対して４℃で１６時間透析した。透析後１０
、ＯＯＯｒｐｍ。
ウ酸緩衝液（＋）８８．０）、ついで０．１Ｍ酢酸緩衝
液（ｐＨ４，５）で十分に洗浄した。ついで０．２Ｍグ
リシン塩酸緩衝液（ｐＨ２，０）で溶出を行い、溶出画
分に、すぐ１／１０量のＩ Ｍ Ｎ ａ２ＨＰ ０４を
添加し、ＩＮ水酸化ナトリウム溶液でｐＨを７．０に調
整した。この溶液を０．０２Ｍホウ酸緩衝液（ｐＩ−１
８，０）に対して４℃で１６時間透析した。透析後１０
、ＯＯＯｒｐｍ。
１０分間遠心し、その上清液をａｎｔｉ−ｒｌ Ｌ −
２ｇｏａｔ１ｇＧとして用いた。なお、この溶液にはｏ
、ｏｏｔ％になるようにチメロザールを添加して４０Ｃ
に保存した。
２ｇｏａｔ１ｇＧとして用いた。なお、この溶液にはｏ
、ｏｏｔ％になるようにチメロザールを添加して４０Ｃ
に保存した。
（ｃ）ａｎｔｉ−ｒｌ Ｌ −２ｇｏａｔ Ｉ ｇＧの
性状（１）蛋白質濃度は０．１〜０．８ｍｇ／！である
。
性状（１）蛋白質濃度は０．１〜０．８ｍｇ／！である
。
（２）ＥＩ Ａ法による測定で１０’〜１０１１以上の
抗体価を有する。
抗体価を有する。
（３）純度は８０〜９０％以上である。
実施例２ ［抗ｒｌＬ−２ウサギ抗体（ａｎｔｉ−ｒＴ
Ｌ−２ｒａｂｂｉｔ Ｉ ｇＧ）の製造］（ａ）抗ｒｌ
Ｌ−２ウザギ血清の製造 ｌｄのｒｌＬ−２（蛋白ｍ１．’１９５ｍｇ／ｒＪ、）
と１ ｒｒｄｌのフロイントの完全アジュバントとを混
合し、ＮｌＢ５ウサギ（ラビトン牧場、雄性）の背部皮
内および太ももの筋肉内に２週間毎３回投与した。３回
目投与の１週間後に耳介静脈から採血し、室温に３時間
、４℃に１６時間放置後３０００ ｒｐｍで、１０分間
遠心し、その上清を抗ｒＩＬ−２ウサギ血清として用い
た。
Ｌ−２ｒａｂｂｉｔ Ｉ ｇＧ）の製造］（ａ）抗ｒｌ
Ｌ−２ウザギ血清の製造 ｌｄのｒｌＬ−２（蛋白ｍ１．’１９５ｍｇ／ｒＪ、）
と１ ｒｒｄｌのフロイントの完全アジュバントとを混
合し、ＮｌＢ５ウサギ（ラビトン牧場、雄性）の背部皮
内および太ももの筋肉内に２週間毎３回投与した。３回
目投与の１週間後に耳介静脈から採血し、室温に３時間
、４℃に１６時間放置後３０００ ｒｐｍで、１０分間
遠心し、その上清を抗ｒＩＬ−２ウサギ血清として用い
た。
（ｂ）ａｎｔｉ −ｒ Ｉ Ｌ −２ｒａｂｂｉｔ Ｉ
ｇＧの製造実施例１（ｂ）のａｎｔｉ−ｒＩ Ｌ −
２ｇｏａｔ Ｉ ｇＧと同様の方法で製造した。
ｇＧの製造実施例１（ｂ）のａｎｔｉ−ｒＩ Ｌ −
２ｇｏａｔ Ｉ ｇＧと同様の方法で製造した。
（ｃ）ａｒ＋ｔｉ−ｒｌ Ｌ −２ｔａｂｂｉｔ Ｉ
ｇＧの性状（１）蛋白質濃度は、０．１〜０．８ｍｇ、
／滅である。
ｇＧの性状（１）蛋白質濃度は、０．１〜０．８ｍｇ、
／滅である。
（２）ＥｌＡ法による測定で１０４〜１０’以上の抗体
価を有する。
価を有する。
（３）純度は８０〜９０％以上である。
実施例３ （ペルオキシダーゼ結合抗体複合体の製造）
（ａ）抗ｒｌＬ−２ウサギ抗体フラグメント（ａｎｔｉ
−ｒＩＬ −２’ｒａｂｂｉｔ Ｐ ａｂ’）の製造実
施例２（ｂ）で得ｒコａｎｔｉ −ｒ Ｉ Ｌ −２−
ｒａｂｂｉｔ［ｇＧ２８＋Ｊ！（蛋白ｆｆ１０．２３ｍ
ｇ／りをコロジオンバッグ（Ｓ ａｒｔｏｒｉｕｓ社）
を用いて４℃で、約１．５ｄまで濃縮し、Ｏ，１Ｍ酢酸
緩衝液（ｐＨ４，５）に対して１１℃で１６時間透析し
た。透析後、１０．００ Ｏｒｐｍ。
−ｒＩＬ −２’ｒａｂｂｉｔ Ｐ ａｂ’）の製造実
施例２（ｂ）で得ｒコａｎｔｉ −ｒ Ｉ Ｌ −２−
ｒａｂｂｉｔ［ｇＧ２８＋Ｊ！（蛋白ｆｆ１０．２３ｍ
ｇ／りをコロジオンバッグ（Ｓ ａｒｔｏｒｉｕｓ社）
を用いて４℃で、約１．５ｄまで濃縮し、Ｏ，１Ｍ酢酸
緩衝液（ｐＨ４，５）に対して１１℃で１６時間透析し
た。透析後、１０．００ Ｏｒｐｍ。
１０分間遠心し、沈殿物を除去し、その上清液へ１２０
μｇのペプシン（Ｓｉｇｍａ社、４５００単位／ｌＷｇ
）を加えて、３７℃で１６時間反応させた。ついで、２
００μ（！の０．２Ｍ ＮａｔＨＰ Ｏ４を加え、ＩＮ
水酸化ナトリウム溶液でＩ）Ｈ８，Ｏに調整したのち、
セファデックスＧ−１５０のゲルろ過（カラム・１．５
ｘ ４５ ｃｍ）を行い、抗体フラグメントＦ（ａｂ’
）。
μｇのペプシン（Ｓｉｇｍａ社、４５００単位／ｌＷｇ
）を加えて、３７℃で１６時間反応させた。ついで、２
００μ（！の０．２Ｍ ＮａｔＨＰ Ｏ４を加え、ＩＮ
水酸化ナトリウム溶液でＩ）Ｈ８，Ｏに調整したのち、
セファデックスＧ−１５０のゲルろ過（カラム・１．５
ｘ ４５ ｃｍ）を行い、抗体フラグメントＦ（ａｂ’
）。
を得た。この溶液を再びコロジオンバッグにとり、４℃
で、約１．５ｄまで濃縮した。この濃縮液をＱ、１Ｍ酢
酸緩衝液（＋）Ｈ５，０）に対して、４℃で２時間透析
した。この透析液へ終濃度２０＋ｎＭとなるように０．
４Ｍ ２−メルカブトエチールアミンを加えて、３７℃
、９０分間反応させた、反応後、セファデックスＧ−２
５（ファルマシア社）のカラム（１，０Ｘ８０ｃｍ）に
かけ、５ｍＭエチレンジアミン四酢酸ナトリウム塩含有
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）で展開し、２８０
ｎｍの吸収を持つ両分を集めてａｎｔ ｉ −ｒＩ Ｌ
−２ｒａｂｂｉｔ Ｆａｂ’を得、４℃に保存した。
で、約１．５ｄまで濃縮した。この濃縮液をＱ、１Ｍ酢
酸緩衝液（＋）Ｈ５，０）に対して、４℃で２時間透析
した。この透析液へ終濃度２０＋ｎＭとなるように０．
４Ｍ ２−メルカブトエチールアミンを加えて、３７℃
、９０分間反応させた、反応後、セファデックスＧ−２
５（ファルマシア社）のカラム（１，０Ｘ８０ｃｍ）に
かけ、５ｍＭエチレンジアミン四酢酸ナトリウム塩含有
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）で展開し、２８０
ｎｍの吸収を持つ両分を集めてａｎｔ ｉ −ｒＩ Ｌ
−２ｒａｂｂｉｔ Ｆａｂ’を得、４℃に保存した。
（ｂ）マレイミド化西洋ワサヒペルオキンダーゼの製造
１０ｍｇの西ｌ羊ワサビペルオキノグーセ（ＨＲＰと略
す。Ｂｏｃｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｎ社）を
１ 、４ ｖｄｌの０゜１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６，８
に溶解し、これにＮ−ンクヮヘキンルメチルマレイミド
カルボン酸 Ｎ−ハイドロキシコハク酸イミドエステル
４．１８ｍｇのＮ。
す。Ｂｏｃｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｎ社）を
１ 、４ ｖｄｌの０゜１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６，８
に溶解し、これにＮ−ンクヮヘキンルメチルマレイミド
カルボン酸 Ｎ−ハイドロキシコハク酸イミドエステル
４．１８ｍｇのＮ。
Ｎ−ツメチルホルムアミド（１００μＱ）溶液を加えて
、室温で１時間反応した。反応液を２５０Ｏｒｐｍ、
Ｌ ０分間遠心し、その上清液をセファデックスＧ−２
５のカラム（１，ＱＸ ８０ ｃｍ）に注ぎ込み、０゜
１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６，８で展開した。主溶出画分
を集めて、マレイミド化西洋ワサビペルオキンダーゼを
得た。
、室温で１時間反応した。反応液を２５０Ｏｒｐｍ、
Ｌ ０分間遠心し、その上清液をセファデックスＧ−２
５のカラム（１，ＱＸ ８０ ｃｍ）に注ぎ込み、０゜
１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６，８で展開した。主溶出画分
を集めて、マレイミド化西洋ワサビペルオキンダーゼを
得た。
（ｃ）ａｎｔｉ−ｒｌ Ｌ −２ｒａｂｂｉｔ Ｆａｂ
’と西洋ワサヒペルオキシダニゼとの複合体（ａｎｔｉ
−ｒ ｒ Ｌ −２ｒａｂｂｉｔ Ｆ ａｂ’ −Ｈ
ＲＰ ）の製造上記（ａ） 、 （ｂ）で得たａｎｔｉ
−ｒｌ Ｌ −２ｒａｂｂｉｔＦ ａｂ’とマレイミド
化西洋ワサビペルオキンダーゼとを混合し、コロジオン
バッグにより、４°Ｃで約１−にまで濃縮したのち、さ
らに４℃で２００時間反応せた。反応後、ウルトロゲル
ＡｃＡ４４（ＬＫＢ社）のカラム（１，Ｏｘ ８０ ｃ
ｍ）に注ぎ込み、０．１Ｍリン酸緩衝液で展開した。活
性画分を集めて０．１％ウシアルブミンおよびｏ、ｏｏ
ｔ％チメロザールを加えて４℃に保存した。
’と西洋ワサヒペルオキシダニゼとの複合体（ａｎｔｉ
−ｒ ｒ Ｌ −２ｒａｂｂｉｔ Ｆ ａｂ’ −Ｈ
ＲＰ ）の製造上記（ａ） 、 （ｂ）で得たａｎｔｉ
−ｒｌ Ｌ −２ｒａｂｂｉｔＦ ａｂ’とマレイミド
化西洋ワサビペルオキンダーゼとを混合し、コロジオン
バッグにより、４°Ｃで約１−にまで濃縮したのち、さ
らに４℃で２００時間反応せた。反応後、ウルトロゲル
ＡｃＡ４４（ＬＫＢ社）のカラム（１，Ｏｘ ８０ ｃ
ｍ）に注ぎ込み、０．１Ｍリン酸緩衝液で展開した。活
性画分を集めて０．１％ウシアルブミンおよびｏ、ｏｏ
ｔ％チメロザールを加えて４℃に保存した。
実施例４ （血清中のｒＩＬ−２ａ度の測定）実施例１
（ｂ）で得たａｎｔｉ −ｒ Ｉ Ｌ −２ｇｏａｔ
ｔｇＧ溶液（蛋白量１５μｇ／威）１００μＱをイムノ
プレート（Ｎｕｎｃ社）のウェル内に加え、４°Ｃに１
６〜２０時間静置した。ウェル内の溶液を捨て、３００
μＱのＰＢＳを加えて洗浄した。この操作を３回繰り返
した。つぎに２００μＱの１％ウシアルブミン溶液を加
え、４℃で１６〜２０時間静置後、ＰＢＳで洗浄した。
（ｂ）で得たａｎｔｉ −ｒ Ｉ Ｌ −２ｇｏａｔ
ｔｇＧ溶液（蛋白量１５μｇ／威）１００μＱをイムノ
プレート（Ｎｕｎｃ社）のウェル内に加え、４°Ｃに１
６〜２０時間静置した。ウェル内の溶液を捨て、３００
μＱのＰＢＳを加えて洗浄した。この操作を３回繰り返
した。つぎに２００μＱの１％ウシアルブミン溶液を加
え、４℃で１６〜２０時間静置後、ＰＢＳで洗浄した。
１００μ（のｒｌＬ−２溶液または仔ウシ血清溶液で希
釈した検体溶液をウェルに加えて４℃で１６〜２０時間
静置したのち、ＰＢＳでよく洗浄した。つぎに実施例３
（ｃ）で得たａｎｔｉ−ｒｌ Ｌ −２ｒａｂｂｉｔ
Ｆａｂ’−ＨｆｌＰ溶液１００μＱを加えて室温に４時
間静置後、ＰＢＳでよく洗浄した。そして１００μＱの
基質溶液をウェル内に加えて室温、暗所にて２０〜４０
分間反応させた。■００μＱの２Ｍ硫酸溶液を添加して
反応を停止させ、タイターチックマルチスキャンＭ Ｃ
（Ｆ ｌｏｗ Ｌ ａｂｏｒａｒｏｒｉｅｓ社）によ
り４９２ｎｍの吸光度の変化を測定した。その結果を第
２図に一〇−として示す。
釈した検体溶液をウェルに加えて４℃で１６〜２０時間
静置したのち、ＰＢＳでよく洗浄した。つぎに実施例３
（ｃ）で得たａｎｔｉ−ｒｌ Ｌ −２ｒａｂｂｉｔ
Ｆａｂ’−ＨｆｌＰ溶液１００μＱを加えて室温に４時
間静置後、ＰＢＳでよく洗浄した。そして１００μＱの
基質溶液をウェル内に加えて室温、暗所にて２０〜４０
分間反応させた。■００μＱの２Ｍ硫酸溶液を添加して
反応を停止させ、タイターチックマルチスキャンＭ Ｃ
（Ｆ ｌｏｗ Ｌ ａｂｏｒａｒｏｒｉｅｓ社）によ
り４９２ｎｍの吸光度の変化を測定した。その結果を第
２図に一〇−として示す。
天然型ｌし一２濃度の測定を、上記と同様の方法で行な
った。天然型ＩＬ−２は、バイオケミカル・アンドφバ
イオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション（Ｂ４
ｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ
Ｒｅ５ｅａｒｓｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ）ｖ
ｏｌ、 １２７． Ｎｏ、 ｌ 、 ｐｐ、１８０−１
９０（１９８５）に記載の方法で得たものを使用した。
った。天然型ＩＬ−２は、バイオケミカル・アンドφバ
イオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション（Ｂ４
ｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ
Ｒｅ５ｅａｒｓｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ）ｖ
ｏｌ、 １２７． Ｎｏ、 ｌ 、 ｐｐ、１８０−１
９０（１９８５）に記載の方法で得たものを使用した。
天然型ＩＬ−２の測定結果を第２図に一童一として示す
。
。
実施例５（ｒｌＬ−２を静、派内投与したカニクイザル
の血中ｒｌＬ−２ａ度の測定） カニクイザル（雌性、２．５〜４ ｋｇ、 ＃Ｔ ３
頭）のｒ［Ｌ−２を１００μｇ１０．５産／ｋｇとなる
ように静脈内投与し、投与後５．１５．３０分、１．２
，４．６および２４時間に３滅ずつ採血し、室温に３時
間静置したのち、３０００ｒｐｍ、１０分間遠心して血
清を分離し、検体とした。測定法は、実施例４と同様に
行なった。結果を第４図に示す。
の血中ｒｌＬ−２ａ度の測定） カニクイザル（雌性、２．５〜４ ｋｇ、 ＃Ｔ ３
頭）のｒ［Ｌ−２を１００μｇ１０．５産／ｋｇとなる
ように静脈内投与し、投与後５．１５．３０分、１．２
，４．６および２４時間に３滅ずつ採血し、室温に３時
間静置したのち、３０００ｒｐｍ、１０分間遠心して血
清を分離し、検体とした。測定法は、実施例４と同様に
行なった。結果を第４図に示す。
参考例２ （バイオアッセイ法との相関性）ｒＩＬ−２
を２０％ウシ胎児血清含有ｎ Ｐ Ｍ Ｉ−１６４０培
地へ３．７５．７．５．１５．３０および６０ｎｇ／ｍ
１２となるように加えたのち、そのｒＩＬ−２量を本発
明の測定法（実施例４と同様の方法）とバイオアッセイ
法［バイオケミカル・アンド・パイオフイノカル・リサ
ーチ・コミュニケーションｖｏ１．１０９． Ｎｏ、２
． ｐｐ、３６３−３６９（１９８２）に記載の方法
］により測定した。その結果を第３図に示す。
を２０％ウシ胎児血清含有ｎ Ｐ Ｍ Ｉ−１６４０培
地へ３．７５．７．５．１５．３０および６０ｎｇ／ｍ
１２となるように加えたのち、そのｒＩＬ−２量を本発
明の測定法（実施例４と同様の方法）とバイオアッセイ
法［バイオケミカル・アンド・パイオフイノカル・リサ
ーチ・コミュニケーションｖｏ１．１０９． Ｎｏ、２
． ｐｐ、３６３−３６９（１９８２）に記載の方法
］により測定した。その結果を第３図に示す。
なお、各測定法によるそれぞれ実験回数５回の結果て（
ｎ−〜５）、相関係数（ｒ）は０．９９９であった。
ｎ−〜５）、相関係数（ｒ）は０．９９９であった。
また相関性は一次方程式Ｙ ＝ １．０２Ｘ ＋ １．
０４として表わされた。
０４として表わされた。
参考例３
ｒｌＬ−２を１４５〜１７０量ｇ／ｖｔｌ含有する試料
をｐＨ１２で３７６Ｃ，５，１５，３０分、ｌ、２．３
時間、または７５℃で０．５．ｌ、２．５時間処理した
。
をｐＨ１２で３７６Ｃ，５，１５，３０分、ｌ、２．３
時間、または７５℃で０．５．ｌ、２．５時間処理した
。
生成物を実施例４と同様の本発明のサンドイッヂ法、参
考例２に示したのと同様のバイオアッセイ法に付した。
考例２に示したのと同様のバイオアッセイ法に付した。
結果を第５図に示す。各測定法によるそれぞれ実験回数
５回の結果で（’ｎ＝２２）、相関係数（ｒ）は０．９
８９であった。また相関性は一次方程式Ｙ＝１．０６Ｘ
＋３．７４として表わされた。
５回の結果で（’ｎ＝２２）、相関係数（ｒ）は０．９
８９であった。また相関性は一次方程式Ｙ＝１．０６Ｘ
＋３．７４として表わされた。
発明の効果
本発明のヒトＩＬ−２測定法は、公知のヒトＩＬ−２の
測定法に比べ感度が高く、ＩＬ−２を蛋白質として正確
に認識した上測定することができるので、とりわけ臨床
検体など微量のＩＬ−２の測定に有用である。
測定法に比べ感度が高く、ＩＬ−２を蛋白質として正確
に認識した上測定することができるので、とりわけ臨床
検体など微量のＩＬ−２の測定に有用である。
第１図は、ヒトＩＬ−２のアミノ酸配列の一例を示す。
第２図は、実施例４で得られたｒＩＬ−２および天然型
ＩＬ−２の測定結果を示す。 第３図は、参考例２で得られた本発明の測定法とバイオ
アッセイ法との相関性を示す。 第４図は、実施例５で得られたカニクイザルの血中のｒ
ＩＬ−２量度の測定結果をそれぞれ示す。 第５図は、参考例３で得られたｒｌＬ−２を不活性化し
たものの測定結果を示す。 第２図 ００．１０．２０．３０．４０．５ ＩＬ−２のａＩ３ｊ（ｎｇ／ｍｌ） 第３図
ＩＬ−２の測定結果を示す。 第３図は、参考例２で得られた本発明の測定法とバイオ
アッセイ法との相関性を示す。 第４図は、実施例５で得られたカニクイザルの血中のｒ
ＩＬ−２量度の測定結果をそれぞれ示す。 第５図は、参考例３で得られたｒｌＬ−２を不活性化し
たものの測定結果を示す。 第２図 ００．１０．２０．３０．４０．５ ＩＬ−２のａＩ３ｊ（ｎｇ／ｍｌ） 第３図
Claims (4)
- （１）、担体に保持された抗体、抗原および標識抗体を
用いるサンドイッチ法による酵素免疫測定法において、
担体に保持された抗体および標識抗体の各抗体が、温血
動物起源の抗組換え型ヒトインターロイキン−２抗体又
はそれらのフラグメントであることを特徴とするヒトイ
ンターロイキン−２の測定法。 - （２）、（ａ）温血動物起源の抗組換え型ヒトインター
ロイキン−２抗体又はそのフラグメント、および（ｂ）
温血動物起源の抗組換え型ヒトインターロイキン−２抗
体又はそのフラグメントと標識剤との複合体。 からなるヒトインターロイキン−２のサンドイッチ法に
よる免疫化学的測定用キット。 - （３）、温血動物起源の抗組換え型ヒトインターロイキ
ン−２抗体又はそのフラグメント。 - （４）、温血動物起源の抗組換え型ヒトインターロイキ
ン−２抗体又はそのフラグメントと標識剤との複合体。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17052185 | 1985-07-31 | ||
| JP60-170521 | 1985-07-31 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62135770A true JPS62135770A (ja) | 1987-06-18 |
| JPH07111426B2 JPH07111426B2 (ja) | 1995-11-29 |
Family
ID=15906480
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61178403A Expired - Fee Related JPH07111426B2 (ja) | 1985-07-31 | 1986-07-29 | ヒトインターロイキン―２の測定法および測定用試薬 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0210839A1 (ja) |
| JP (1) | JPH07111426B2 (ja) |
| KR (1) | KR870001470A (ja) |
| CN (1) | CN86104525A (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2019714A1 (en) * | 1989-06-27 | 1990-12-27 | Richard A. Chizzonite | Process for the determination of interleukins |
| US5765289A (en) * | 1996-12-20 | 1998-06-16 | Fiskars Inc. | Rotary cutter |
| US11492384B2 (en) * | 2018-09-17 | 2022-11-08 | Gi Innovation, Inc. | Fusion protein comprising IL-2 protein and CD80 protein, and use thereof |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5939832A (ja) * | 1982-08-28 | 1984-03-05 | Ajinomoto Co Inc | モノクロ−ナル抗体ならびにその製法、使用法 |
| JPS5990054A (ja) * | 1982-11-15 | 1984-05-24 | Takeda Chem Ind Ltd | ヒト絨毛性ゴナドトロピンの免疫化学的測定法および試薬 |
| JPS61501912A (ja) * | 1984-04-05 | 1986-09-04 | スクリツプス クリニツク アンド リサ−チ フアウンデ−シヨン | 合成ポリペプチドにより誘発されたヒトインタ−ロイキン−２に対する抗体 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60115528A (ja) * | 1983-11-28 | 1985-06-22 | Takeda Chem Ind Ltd | ヒトインタ―ロイキン―２蛋白質を含有する抗腫瘍用または免疫機能低下疾患治療用組成物 |
| IL76360A0 (en) * | 1984-09-26 | 1986-01-31 | Takeda Chemical Industries Ltd | Mutual separation of proteins |
-
1986
- 1986-07-22 CN CN198686104525A patent/CN86104525A/zh active Pending
- 1986-07-23 EP EP86305667A patent/EP0210839A1/en not_active Withdrawn
- 1986-07-29 JP JP61178403A patent/JPH07111426B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1986-07-31 KR KR1019860006338A patent/KR870001470A/ko not_active Application Discontinuation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5939832A (ja) * | 1982-08-28 | 1984-03-05 | Ajinomoto Co Inc | モノクロ−ナル抗体ならびにその製法、使用法 |
| JPS5990054A (ja) * | 1982-11-15 | 1984-05-24 | Takeda Chem Ind Ltd | ヒト絨毛性ゴナドトロピンの免疫化学的測定法および試薬 |
| JPS61501912A (ja) * | 1984-04-05 | 1986-09-04 | スクリツプス クリニツク アンド リサ−チ フアウンデ−シヨン | 合成ポリペプチドにより誘発されたヒトインタ−ロイキン−２に対する抗体 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR870001470A (ko) | 1987-03-14 |
| JPH07111426B2 (ja) | 1995-11-29 |
| CN86104525A (zh) | 1987-02-25 |
| EP0210839A1 (en) | 1987-02-04 |
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