JPH01217266A - 非特異的吸着防止剤および非特異的吸着防止方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は医薬分野等において免疫学的測定に用いられる
非特異的吸着防止剤および非特異的吸着防止方法に関す
るものである。

（従来の技術） 近年、臨床検査、免疫学、生化学、分子生物学等の分野
において酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫測
定法（ＲＩＡ）、或いはウェスタンブロッティング法等
の免疫学的手法が多用されるようになった。

これらの測定においては、プレートやニトロセルロース
膜のような同相に目的物質を固定し、次いでそれらの物
質と特異的に結合するアイソトープ又は酵素標識抗体（
プローベ）を加え、放射線レベルや酵素活性を測定する
ことによって、目的物質を固定したり、定量したりする
。この時、プローへが目的物質とのみ反応することが重
要であリ、固相に非特異的に吸着してはならない。

そのため、同相に目的物質を固定化した後に、ブロッキ
ング剤（非特異的吸着防止剤）を添加し、固相上の吸着
点を封鎖しなければならない。例えばＥＬＩＳＡにおい
ては、抗原をプレートに固定化した後にブロッキング剤
を添加し、その後にプローぺを加える。ブロッキング剤
は抗原に特異的でない抗体がプレートに吸着したり、プ
ローベがプレートに非特異的に吸着するのを防ぐ働きを
している。

通常、ブロッキング剤として牛血清アルブミン（ＢＳＡ
）？容液が用いられている。一般にはＢＳＡを１％以上
の濃度に、非特異的吸着を完全に防止するには２％以上
、好ましくは５％程度の濃度に熔解して用いなければな
らない。ＢＳＡは比較的大量に入手し得る蛋白質ではあ
るが、溶解に時間がかかること、さらには価格が高いこ
と等の理由で、分析コストを引き上げる要因の一つにな
っている。

しかし、理論的には目的物質やブローへとの相互作用が
なく、しかも同相によく吸着する物質であれば、どのよ
うな物質でもブロッキング剤となり得る訳であり、より
安価でかつ優れたブロッキング剤の開発が望まれていた
。

１９８４年ジョンソンらはサザンブロソテイング法にお
いて、ＢＳＡのかわりに脱脂粉乳（ＳＭＰ）が有効であ
り、また、ＥＬ　Ｉ　ＳＡにおいても５％ＳＭＰ溶液が
効果的にブロッキング作用をすることを幸Ｒ告した（ジ
ーン・アナリテイカル・テクノロジー；Ｇｅｎｅ　Ａｎ
ａｌ、　Ｔｅｃｈｎｏｌ、＋　１＋　３−８＋　１９８
４）。

また、ミスキミンズらも５％ＳＭＰ溶液が有効なブロッ
キング剤となることを示しており　（プロシーディング
・オブ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンス：
　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　
８２＋６７４１−６７４４．１９８５）　、さらに、太
田も発現ヘクターλｇｔｌｌを用いたクローニング法の
紹介の中でＳＭＰの有効性を述べている（細胞工学、５
．２６４−２７０、１９８６）。

（発明が解決しようとする課題） これらの例ではＳＭＰをトリス緩衝液に溶解してブロッ
キング剤として用いているが、このままでは白濁がひど
く研究用試薬としての商品価値を著しく損なう。また、
商品として大量に製造し流通させる際には、低温流通よ
りも常温流通させた方がコスト面から見てはるかに有利
である。常温流通させるためには、ＳＭＰ溶液をオート
クレーブ等の滅菌処理しなければならないが、ＳＭＰを
単に水やトリスあるいはリン酸緩衝液に溶解しただけで
は、熱によって著しく褐変したり濁度が増したり、ある
いは時には沈澱を生成したりし、商品価値がなくなって
しまうことが分かった。

本発明は、透明感があり、滅菌処理しても褐変せず、か
つ、ブロッキング効果も極めてすぐれたブロッキング剤
を提供することを目的とする。

（課題を解決するための手段） 本発明は安価な、さらには常温で長期に保存し得る非特
異的吸着防止剤に関するものであって、乳蛋白質を有効
成分とし、有機酸および有機酸塩から選ばれる１種以上
を主成分とする緩衝液とを組合せたことを特徴とする。

本発明で用いる乳蛋白質はカゼイン、ホエー蛋白質濃縮
物（ＷＰＣ）、脱脂粉乳、或いは脱脂乳のうち１種類、
或いは２種類以上組合せて用いることができる。ｗｐｃ
を配合する場合は、乳固型分中、５０％以下とすること
が望ましい。５０％以上配合すると、加熱処理後に沈澱
を生じる場合がある。また、これらの乳蛋白質はプロテ
アーゼで限定分解をして用いてもよいが、分解度が高す
ぎると滅菌時に不安定となるので、部分加水分解にとど
めるべきである。

本発明で用いる緩衝液は、例えばクエン酸、マレイン酸
、リンゴ酸、コハク酸、マロン酸等の有機酸および有機
酸塩から選ばれる１種以上を主成分とする。

緩衝液のｐＨは５．３〜７．０であることが好ましい。

ｐｎの調整は、例えばアルカリ溶液、例えば水酸化すｉ
・リウム、水酸化カリウム等で行うか、酸溶液、例えば
塩酸、硫酸、酢酸等で行うか、あるいは上記の有機酸と
その塩基との組合せのうち１種又は２種以上を組み合わ
せて行うことができる。ｐＨが５．３以下では有効成分
が溶解しにくいため、５．３以上、特に好ましくは５．
５以上に調整する。ｐＨの上限は７．０が好ましく、特
に好ましくは６．５以下である。ｐＨが７を超えると、
前記有機酸の緩衝能力がなくなるばかりでなく、滅菌処
理を行うと褐変がひどくなる。

乳固形分濃度（％）／有機酸濃度（ｍＭ）の比は０．１
以下が好ましく、特に好ましくは０．０２以下である。

０．１以上、例えば０．２では滅菌後透明感はあるもの
の褐変を防くことはできず、例えば２．０では透明感も
消える。

前記のような条件下で有効成分を調製した後に、滅菌す
ることができる。滅菌条件は通常のオートクレーブの条
件、例えば１２１　℃、１０分間で良く、また、通常の
ロングライフ飲料製造時に用いられる条件、例えば１４
０〜１５０℃、２〜４秒間で充分である。

さらに本発明の非特異的吸着防止方法は、乳蛋白質を有
効成分として、有機酸および有機酸塩から選ばれる１種
以上を主成分とする緩衝液とから成る溶液を用いること
を特徴とする。

（発明の効果） 本発明によると、従来から使用されているＢＳＡにかえ
て、透明感があり、安価で、且つ、滅菌処理しても褐変
しない非特異的吸着防止剤を提供することができる。し
かも、免疫学的測定において極めてずくれたブロッキン
グ効果を得ることができる。さらに、常温で流通するこ
とが可能であり、取り扱いが簡便であると言う利点を有
する。

（実施例） 実施例１ ９６穴ＥＬ　Ｉ　ＳＡプレー１−（住人ヘークライト社
製）の各ウェルに、非特異的吸着防止剤を４００ｐｌず
つ分注し、室温にて１時間放置してブロッキングを行っ
た。次いで、パーオキシダーゼラヘル抗ヒ）ＩｇＧ　（
タボ社製）を、非特異的吸着防止剤で１　、０００倍に
希釈し、各ウェルに５０μｌずつ分注した。

室温で１時間静置後、０．０５％トウイーン２０を含む
リン酸緩衝液（Ｐ　Ｂ　Ｓ　−Ｔｗｅｅｎ　）でプレー
トを６回洗浄後、ＡＢＴＳ　（２，２’−アジノビスー
（３−エチルベンゾチオアゾリン−６−スルホン酸））
を基質として加えた。１０分後の４０５ｎｍにおける吸
光度をタイターチックマルチスキャン（フロラ社製）で
測定した。いずれも３連で実施した。

非特異的吸着防止剤としては２％ＢＳＡをＰＢＳに溶解
し、所定の濃度に脱イオン水で希釈したもの、及び０．
１Ｍクエン酸を水酸化ナトリウムでｐＨを６．２に調整
後、ＳＭＰを１％となるように溶解し、１２１　℃１０
分間オートクレーブで処理し、脱イオン水で所定の濃度
に希釈したものを用いた。結果を表１に示す。

非特異的吸着防止剤を用いないと非常に高い非特異的吸
着が見られたが、ＢＳＡを用いると１．０％以上の濃度
で測定誤差範囲内に非特異的吸着を抑えることができた
。

一方、ＳＭＰを用いると、ＳＭＰｏ、０６２５％、クエ
ン酸６．２５ｍＭに希釈しても、非特異的吸着を完全に
抑制し得た。

表１ Ｐ　Ｂ　３　　　　　　　　　１．４２２±０．０４８
２χＢＳＡ／ＰＢＳ　　　１’　　　０．００４±０．
００３１／２　　０．００５±０．００７ １／４　　０．０２６±０．００７ １／８　　０．０８４±０．０３８ １／１６　　０．１４６±０．０２０ １／４　　０　±　０ １／８　　０　±　０ １／１０　　　０　　±　０ １／１６　　　０　　±　０ １／１００　０．１８９±０．０１７ （但し、ＢＳＡについては滅菌処理をしていない）実施
例２ た抗ヒトにおよび抗ヒトλＩ＆Ｇ　（タボ社製）混合液
５０μｌを９６穴ＥＬＩＳＡ用プレート（住人ベークラ
イト社製）に分注し、４°Ｃにて一晩静置した。

翌朝、抗体溶液を捨て非特異的吸着防止剤で各ウェルを
満たし１時間放置した。Ｐ　Ｂ　Ｓ−Ｔｗｅｅｎで２回
洗浄後、０〜１１０００ｎ　／　ｍｌ！のヒト血清Ｉｇ
Ｇ　（ミドリ十字社製）５０μｌを加え、１時間静置し
た。６回洗浄後、ＡＢＴＳを加え、４０５ｎｍにおける
吸光度を測定した。

非特異的吸着防止剤として、２％ＢＳＡ／ＰＢＳ、及び
実施例１に示した１％Ｓ　Ｍ　Ｐ　１０．１Ｍクエン酸
−Ｎａ　（ｐＨ６，２）をオートクレーブで処理した後
に脱イオン水で１０倍に希釈して用いた。

結果を第１図に示すが、両者に差は全く見られなかった
。

実施例３ 淑皿椹企揚変度 ＳＭＰを１％となるように各種緩衝液（ｐＨ６，１）に
溶解後、１２１　℃１０分間オートクレーブで処理し、
その濁りの程度、沈澱物の有無、及び褐変の程度を肉眼
的に判定した。

結果は表２に示す通り、透明感があり、沈澱生成もなく
、褐変右なかったものは、クエン酸、マレイン酸、コハ
ク酸、リンゴ酸、マロン酸を使用した場合であった。

表２ 各緩衝液に熔解した１％ＳＭＰの滅菌後の濁り度、沈澱
、褐変度緩衝液　　　　　　　　　　　濁り度　沈澱生
成　褐変炭水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
＋十→−−＋＋ＰＢＳ　（ｐＨ７，２）　　　　　　　
　　　　　十十＋　　　−１−十−１−１旧−リス−Ｉ
ＩＣＩ　（ｐｌ＋７．４）　　　　　　　　　＋→−＋
１　　＋→−」水＋０．１χ　ＥＤＴＡ　　（ｐＨ６，
０）　　　　　　　　　　　　　　　　＋　　　　　　
　十　　　　　　　　−０，２Ｍクエン酸−クエン酸Ｎ
ａ（ｐＨ６，０）−ｍ−〇、２Ｍクエン酸−ＮａＯｔｌ
　（ｐｆ１６．０）　　　　　　　−一−０，２Ｍ酢酸
−ＮａＯＨ（ｐ＋？６．０）　　　　　　　　＋　＋　
　　＋　十＋０．２Ｍ蓚酸−ＮａＯＨ（ｐＨ６，０）　
　　　　　　＋＋＋　　　−＋＋０．２Ｍ？レイン酸−
ＮａＯＨ（ｐＨ６，０）　　　　　　−−−０，２Ｍコ
ハク酸−ＮａＯＨ（ｐＨ６，０）　　　　　　　−−−
０，２Ｍリンゴ酸−ＮａＯＩＩ　（ｐＨ６，０）　　　
　　　　−−＋０．２Ｍ酒石酸−ＮａＯＨ（ｐＨ６，０
）　　　　　　＋　＋　＋　　　−＋　＋　＋０．２Ｍ
マロン酸−ＮａＯＩＩ　（ｐＨ６，０）−−−０，２Ｍ
プロピオン酸−ＮａＯＨ（ｐＨ６，０）　　　十＋＋　
　　＋　　　　　＋＋実施例４ 乳蛋白′の種類とブロッキング勺 非特異的吸着防止剤として以下のものを調製した。

１）１％Ｂ　Ｓ　Ａ　／　Ｐ　Ｂ　Ｓ　（ｐＨ７，２）
２）１％脱脂粉乳１５０酵ク工ン酸＋５０ｍＭマレイン
酸（ｐＨ６，３） ３）０．５％カゼイン／１００ｍＭマレイン酸（ｐＨ６
，１）４）０．７％カゼイン＋〇、３％Ｗ　Ｐ　Ｃ／　
１００ｍＭクエン酸（ｐＨ６，２） ５）０．５％脱脂粉乳＋０．５％カゼイン１５０ｍＭマ
レイン酸＋５０ｍＭマロン酸（ｐｉ（６，１）２）〜５
）については１４０°Ｃ１２秒間、間接滅菌した。

プロ・２キング効果のテストは、実施例１と同様に行っ
たが、バーオキシダーゼラヘル抗ヒ）ＩｇＧの代わりに
、パーオキシダーゼラヘル抗マウスＩｇＧ（タボ社製）
を用いた。また、４０５ｎｍにおける吸光度はＡＢＴＳ
添加後、１５分間室温放置の後、測定した。結果を表３
に示す。

表３ Ｐ　Ｂ　３　　　　　　　１．４９２±０．０４８１　
）　　　　　　　　０．０１１±０．００８２　）０．
０００±ｏ、ｏｏ。

３　）０．００２±０．００１ ４）　　　　　　　　０．００４±０．００２５　）　
　　　　　　　０．０００±ｏ、ｏｏ。

乳蛋白質を用いると、ハックグランドが低くＢＳＡより
も優れたブロッキング効果を示した。乳蛋白質の中では
ＷＰＣを配合した４）がやや悪かったが、実用的には全
く問題にならない。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明実施例２による非特異的吸着防止剤と
して、２％ＢＳＡ／ＰＢＳを用いた場合ＣＡ図）、およ
び１％Ｓ　Ｍ　Ｐ　１０．ＩＦクエン酸−Ｎａ（ｐＨ６
，，２）を用いた場合（Ｂ図）のヒｌ−１ｇＧのＥＬＩ
ＳＡによる標準曲線を示すグラフである。 第１図 ｆＡ）　　　　　　（Ｂ） ＩｇＧ　（ｎｇ／ｍｌｌ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、乳蛋白質を有効成分とし、有機酸および有機酸塩か
   ら選ばれる１種以上を主成分とする緩衝液とを組合せた
   ことを特徴とする非特異的吸着防止剤。 ２、乳蛋白質を有効成分とした殺菌および／または滅菌
   非特異的吸着防止剤を製造するに際し、有機酸および有
   機酸塩から選ばれる１種以上を主成分とする緩衝液と組
   合せることを特徴とする非特異的吸着防止剤の製造方法
   。 ３、緩衝液のｐＨが５．３〜７．０である請求項２記載
   の製造方法。 ４、乳固形分濃度（％）／有機酸濃度（ｍＭ）の比が０
   ．１以下である請求項２記載の製造方法。 ５、有効成分としての乳蛋白質と、有機酸および有機酸
   塩から選ばれる１種以上を主成分とする緩衝液とから成
   る溶液を用いることを特徴とする非特異的吸着防止方法
   。