DE68916822T2

DE68916822T2 - Agens zur Hemmung von nichtspezifischer Adsorption, Verfahren zu seiner Herstellung und Verfahren zur Hemmung von nichtspezifischer Adsorption.

Info

Publication number: DE68916822T2
Application number: DE68916822T
Authority: DE
Inventors: Shunichi Dosako; Hiroshi Shinmoto
Original assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Current assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Priority date: 1988-02-26
Filing date: 1989-02-22
Publication date: 1994-11-10
Anticipated expiration: 2009-02-23
Also published as: EP0331327A3; US5017559A; DE68916822D1; EP0331327A2; EP0331327B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Agens, welches für immunologische Analysen im medizinischen Bereich zur Verhinderung nichtspezifischer Adsorption benutzt wird, ein Verfahren zur Herstellung desselben und ein Verfahren zur Verhinderung nichtspezifischer Adsorption.
In den letzten Jahren sind bei klinischen Untersuchungen in der Immunologie, der Biochemie, der Molekularbiologie und dergleichen immunologische Techniken wie zum Beispiel die auf Enzymbindung beruhende Immunsorbensanalyse (ELISA) , die Radioimmunanalyse (RIA), die Western Blot Technik und dergleichen oft benutzt worden.
Bei diesen Techniken wird das gewünschte Material fixiert und untersucht, indem dieses mit einer festen Phase wie zum Beispiel einer Platte, einer Nitrocellulosemembran und dergleichen verbunden wird, wobei ein Isotop oder ein durch ein Enzym markierter Antikörper, (eine Sonde) der eine spezifische Bindung mit dem Material eingeht und wobei anschließend das Strahlungsniveau oder die Enzymaktivität bestimmt wird. Es ist dann wichtig, daß die Sonde nur mit dem zu untersuchenden Material reagiert und insbesondere nicht an der festen Phase adsorbiert wird.
Es muß deshalb der Adsorptionspunkt auf der festen Phase nach Anbringung des jeweiligen Materials durch Hinzufügung eines Sperrmittels abgedeckt werden (ein Mittel zur Verhinderung einer nichtspezifischen Adsorption) . Im Falle beispielsweise von ELISA wird das Sperrmittel hinzugefügt, nachdem ein Antigen an der Platte angebracht ist und es wird anschließend die Sonde hinzugefügt. Das Sperrmittel dient dazu, eine nichtspezifische Adsorption der Sonde an der Platte zu verhindern.
Als Sperrmittel wird üblicherweise eine Lösung von Rinder-Albumin-Serum (BSA) benutzt. BSA muß im allgemeinen in einer Konzentration von mehr als 1 % gelöst werden, und zwar in einer Konzentration von mehr als 2 %, vorzugsweise ungefähr 5 %, um eine nichtspezifische Adsorption vollkommen zu verhindern. BSA ist ein Protein, welches in relativ großen Mengen leicht erhältlich ist. BSA trägt jedoch zu den hohen Analysekosten bei, weil eine lange Zeit zur Auflösung des BSA in der Lösung benötigt wird und sein Preis hoch ist.
Es kann jedoch theoretisch jedes Material, welches in keine Wechselwirkung gegenüber dem zu untersuchenden Material oder der Sonde tritt und an einer festen Phase gut adsorbierbar ist, als Sperrmittel benutzt werden. Es ist demzufolge erwünscht, ein preiswertes und ausgezeichnetes Sperrmittel zu entwickeln.
Johnson et al berichteten 1984, daß eine nicht fette, trockene Milch (SMP) gegenüber BSA als Mittel zur Verhinderung nichtspezifischer Adsorption bei Southern Blot Analysen überlegen war und eine Lösung von 5 % SMP wirkte bei ELISA als wirksames Sperrmittel (Gene-Anal.- Techn. Vol. 1, Seiten 3 - 8, 1984). Darüberhinaus berichteten Miskimins et al, daß eine Lösung von 5 % SMP ein wirksames Sperrmittel sein könnte (Proc. Natl. Acad. Sci. USA Band 82, Seiten 6741 - 6744, Oktober 1985). Ohta beschrieb dann die Wirksamkeit von SMP bei der Einführung der Klon-Technik, bei welcher ein Vector λgt11 benutzt wurde (Saibo Kogaku, Band 5, Nr. 3, Seiten 264 - 270, 1986).
Gemäß obiger Veröffentlichungen wird SMP als Sperrmittel benutzt, welches in einer Tris Pufferlösung aufgelöst ist. Falls die SMP-Lösung so benutzt wird wie sie ist, mindert sich ihr Handelswert als Reagenz beträchtlich aufgrund der milchigen Trübung der Lösung. Wird das Sperrmittel im Rahmen einer Massenproduktion hergestellt und als Handelsware auf dem Markt gebracht, ist seine Wirtschaftlichkeit unter normalen Temperaturen größer als unter niedrigen Temperaturen. Bei normalen Temperaturen sollte die SMP-Lösung mittels eines Autoklaven oder dergleichen sterilisiert werden. Wenn jedoch SMP lediglich in Wasser oder einer Pufferlösung aus Tris oder Phosphat gelöst wurde, wurde festgestellt, daß sein Handelswert verloren war, weil die Lösung sich unter Erhitzung braun färbte, die Trübung der Lösung erhöht wurde und gelegentlich aus der Lösung ein Fällprodukt ausfiel.
Das erste Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein flüssiges Mittel zur Verhinderung einer nichtspezifischen Adsorption bereitzustellen, welches transparent ist, ohne Entfärbung sterilisierbar ist, und welches ausgezeichnete Sperrwirkungen mit sich bringt.
Nach Öffnung des Verschlusses sollte ferner das bekannte flüssige Mittel zur Verhinderung nichtspezifischer Adsorption so rasch wie möglich gebraucht oder durch Gefrierung konserviert werden. Ein weiterer Nachteil besteht in den hohen Kosten des Transports. Ein Mittel zur Verhinderung nichtspezifischer Adsorption, welches in Pulverform vorliegt und nur durch Auflösung eines gewissen Volumens in entionisiertem Wasser gebrauchsfähig ist, ist erwünscht.
Das einfachste Verfahren zur Herstellung eines pulverförmigen Mittels zur Verhinderung nichtspezifischer Adsorption ist ein solches, bei welchem pulverförmige Rohmaterialien so wie sie sind gemischt werden. In diesem Fall löst sich der Puffer in kaltem Wassser leicht auf, - die Löslichkeit des Milchproteins ist jedoch nicht gut. In anderen Fällen, einschließlich der Verfahren, bei denen ein flüssiges Mittel zur Verhinderung einer nichtspezifischen Adsorption nach Konzentrierung getrocknet wird, ist festgestellt worden, daß ein Fällprodukt entsteht, sobald eine gewisse Konzentration der Flüssigkeit erreicht ist.
Es ist demzufolge das zweite Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung eines pulverförmigen Mittels zur Verhinderung nichtspezifischer Adsorption bereitzustellen, wobei das Mittel in kaltem Wasser leicht lösbar ist, ausgezeichnete Eigenschaften hinsichtlich des Effekts der Verhinderung nichtspezifischer Adsorption aufweist und die gleiche Sperrfähigkeit wie dasjenige des oben dargelegten sterilisierten flüssigen Mittels zur Verhinderung nichtspezifischer Adsorption aufweist.
Die vorliegende Erfindung besteht in einem flüssigen oder pulverförmigen Mittel zur Verhinderung nichtspezifischer Adsorption, welches zu einem niedrigen Preis gewonnen werden kann und welches bei normalen Temperaturen für eine lange Zeit konserviert werden kann, wobei das Mittel eine Kombination von Milchproteinen als Wirkstoff und eine Pufferlösung enthält, welch letztere als wesentliche Bestandteile ein oder mehrere organische Säuren oder organische saure Salze enthält.
Fig. 1 ist eine graphische Darstellung, welche Standardkurven von ELISA bezüglich menschlichem IgG zeigt, und zwar im Falle der Verwendung von 2 % BSA/PBS (A) und im Fall von 1 % SMP/0,1 M Natrium Citrat (pH-Wert 6,2) (B) als Mittel zur Verhinderung nichtspezifischer Adsorption in Beispiel 2.
Fig. 2 ist eine graphische Darstellung, welche die Beziehung zwischen der Konzentration an menschlichem IgG und der Absorbtion gemäß Beispiel 7 zeigt. Die Bedingungen des Sperrens, des Verdünnens und des Waschens der Platten sind im Fall von (1) durch einen Kreis, im Fall von (2) durch ein Dreieck, im Fall von (3) durch ein Quadrat und im Fall von (4) durch ein Kreuz wiedergegeben.
Das bei der vorliegenden Erfindung benutzte Milchprotein kann in Kombination mit einer oder mehreren Materialien benutzt werden, die aus Casein, Molkenproteinkonzentrat (WPC), nicht fetter trockener Milch und Magermilch ausgewählt werden. Falls WPC kombiniert wird, ist eine Konzentration von weniger als 50 % in den Milchfeststoffen wünschenswert. Falls WPC in einer Konzentration von mehr als 50 % kombiniert wird, treten bei Erhitzung manchmal Fällprodukte auf. Das Milchprotein kann durch Protease beschränkt zersetzt werden, es muß aber die Zersetzung teilweise geführt werden, weil stark zersetztes Protein bei der Sterilisation unstabil wird.
Die wesentlichen Bestandteile des in der vorliegenden Erfindung benutzten Puffers sind ein oder zwei Verbindungen, die aus organischen Säuren wie Zitronensäure, Maleinsäure, Apfelsäure, Bernsteinsäure, Malonsäure und dergleichen und ihren Salzen ausgewählt sind.
Die Herstellung des flüssigen Mittels zur Verhinderung nichtspezifischer Adsorption entsprechend der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß Milchprotein als Wirkstoff und eine Pufferlösung, die eine oder mehrere Hauptbestandteile aufweist, die aus organischen Säuren und ihren Salzen ausgewählt sind, kombiniert werden.
Ein pulverförmiges Mittel entsprechend der vorliegenden Erfindung kann aus einer Lösung (A) hergestellt werden, welche 10 bis 40 % Milchrohstoffe umfaßt, einschließlich des Milchproteins als Wirkstoff, welches in einer Pufferlösung aufgelöst ist, welche als Hauptbestandteil ein oder mehrere organische Säuren oder organische saure Salze in einer 0,1 bis 0,3 molaren Konzentration enthält und zu einem Pulver getrocknet wird und einer Pufferlösung (B), welche als Hauptbestandteile ein oder mehrere organische Säuren oder organische saure Salze enthält und zu einem anderen Pulver getrocknet wird, wobei die beiden Pulver gemischt werden.
Der pH-Wert des Puffers liegt vorzugsweise im Bereich von 5,3 bis 7,0. Nachdem die Wirkstoffe in einem Puffer, dessen pH-Wert bei weniger als 5,3 eingestellt ist, schwierig aufzulösen sind, wird der pH-Wert bei 5,3 oder einem höheren Wert eingestellt, und zwar vorzugsweise bei 5,5 oder mehr. Die obere Grenze des pH-Wertes beträgt vorzugsweise 7,0, wobei ein Wert von 6,5 oder weniger bevorzugt wird. Liegt der pH-Wert oberhalb von 7, vermindert sich die Pufferfähigkeit der organischen Säure und das Produkt erfährt als Folge der Sterisilationsbehandlung eine merkliche Braunfärbung. Der pH-Wert kann durch Hinzufügen einer Laugenlösung wie zum Beispiel Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid, einer Säurelösung wie zum Beispiel Salzsäure, Schwefelsäure, Essigsäure oder einer oder mehrerer Kombinationen der genannten organischen Säuren und ihren Salzen eingestellt werden
Bei allen erfindungsgemäßen Agentien und Verfahren zu ihrer Herstellung beträgt das Verhältnis der Konzentration (%) an Milchfeststoffen zu der Konzentration (mM) an organischen Säuren und/oder sauren Salzen 0,1 oder weniger, vorzugsweise 0,02 oder weniger.
Falls das Verhältnis größer als 0,1, zum Beispiel 0,2 ist, ergibt sich ein transparentes Produkt als Folge der Sterilisation - die Produkte unterliegen aber einer Braunfärbung. Beträgt beispielsweise des Verhältnis 2,0, ist die Transparenz des Produktes verloren.
Nachdem die Wirkstoffe unter obigen Bedingungen zubereitet worden sind, kann das Produkt sterilisiert werden. Die Sterilisationsbedingungen werden üblicherweise in einem Autoklaven durch Beheizung hergestellt, zum Beispiel bei 121º C während 10 Minuten. Zusätzlich können die Sterilisationsbedingungen unter den gleichen Beheizungbedingungen erreicht werden, die denjenigen der Produktion von langlebigen Getränken entsprechen, zum Beispiel bei 140º C bis 150º C während 2 bis 4 Sekunden.
Im Falle eines pulverförmigen Mittels zur Verhinderung nichtspezifischer Adsorption werden die Rohmaterialien, welche die Hauptbestandteile an Milchprotein zur Auflösung in dem Puffer enthalten in einer Menge von 10 Gew.- % bis 40 Gew. -%, bezogen auf eine Trockenbasis zubereitet. Beträgt die Menge nicht mehr als 10 Gew.-% ist die Wirksamkeit des Trocknungsprozesses nicht gut. Beträgt die Menge über 40 Gew. -%, wird es schwierig, diese Materialien aufzulösen. Die am meisten bevorzugte Menge liegt im Bereich von 20 Gew.-% bis 30 Gew.-%.
Die Konzentration organischer Säuren oder ihrer Salze in der Pufferlösung, welche das Rohmaterial auflöst, welches das Milchprotein als Hauptbestandteil aufweist, liegt in dem Bereich von 0,1 molar bis 0,3 molar. Liegt die Konzentration nicht über 0,1 molar, bestehen Schwierigkeiten, die Milchproteinbestandteile in kaltem Wasser aufzulösen und liegt die Konzentration über 0,3 molar, wird ein Fällprodukt beobachtet.
Die Trocknung kann über eine Gefriertrocknung, Sprühtrocknung oder dergleichen durchgeführt werden. Obwohl es keine spezifischen Beschränkungen gibt, wird der Sprühtrocknung mit Hinblick auf die Produktionskosten der Vorzug gegeben. Die Trocknungsbedingungen sind nicht spezifisch begrenzt und gewöhnliche Bedingungen wie zum Beispiel eine Blastemperatur von 180º C und eine am Ausgang der Düse anstehende Ausgangstemperatur von 96º C können benutzt werden. Nachdem das getrocknete Pulver (abgekürzt als A Pulver) selbst im entionisiertem Wasser aufgelöst wird, und zwar in einer Menge von über 0,1 Gew.-% des Milchproteinbestandteils, zeigt die erhaltene Lösung eine ausgezeichnete Sperrwirkung für eine nichtspezifische Adsorption. Es ist jedoch festgestellt worden, daß die Farbentwicklung der Enzym-Substrat Reaktion wie in Tabelle 1 gezeigt in der, auf Enzymbindung beruhenden Immunsorbensanalye (ELISA) , deutlich beschränkt ist. Dies ist darauf zurückzuführen, daß die Konzentration organischer Säuren oder ihrer Salze niedrig ist. Das Pulver, welches als Hauptbestandteile solche enthält, die aus den unzureichenden organischen Säuren oder ihren Salzen ausgewählt sind, sollte besonders zubereitet werden (das Pulver wird als B Pulver abgekürzt) . Die organischen Säuren und ihre Salze können bei einem festen pH-Wert kombiniert werden oder es können die organischen Salze und starke Basen bei einem festen pH-Wert kombiniert werden. Wird die Mischung aus A Pulver und B Pulver in Wasser in einer Menge von 0,1 Gew.-% bis 20 Gew.-% aufgelöst, beträgt der pH-Wert 5,3 bis 7,0.
Das Mischungsverhältnis des A Pulvers und des B Pulvers in Wasser wird durch die folgende Formel wiedergegeben:
Milchfeststoffkonzentration (%) / Konzentrationswert, bezogen auf organische Säuren (mM) ≤ 0,1
(In der Formel ist die Konzentration bezogen auf organische Säuren ≤ 500 mM)
Darüberhinaus können Laktose, Stärke, gewöhnliche Salze oder dergleichen dem B Pulver hinzugefügt werden. Nachdem das A Pulver und das B Pulver gemischt worden sind, wird die Mischung in Wasser bei einer festen Konzentration aufgelöst und sterilisiert. Bei diesem Verfahren gibt es kein Problem.
Es ist ferner das Verfahren zur Verhinderung nichtspezifischer Adsorption gemäß der vorliegenden Erfindung dadurch gekennzeichnet, daß es die Verwendung einer Lösung umfaßt, welche eine Kombination von Milchprotein als Wirkstoff und eine Pufferlösung umfaßt, welche wenigstens eine Verbindung enthält, die aus organischen Säuren und ihren Salzen als wesentliche Bestandteile ausgewählt ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann das Agens zur Verhinderung nichtspezifischer Adsorption anstelle von herkömmlichem BSA bereitgestellt werden, wobei das Mittel transparent ist, zu niedrigen Kosten erhalten wird und ohne Entfärbung sterilisiert wird. Diese Agentien weisen eine ausgezeichnete Sperrwirkung bei immunologischen Analysen auf. Es können diese Agentien ferner auf den Markt gebracht werden unter normalen Temperaturbedingungen. Der Vorzug besteht darin, daß das Agens leicht handhabbar ist.
Anhand der folgenden Beispiele wird die vorliegende Erfindung weiter verdeutlicht werden - diese Beispiele werden jedoch bei praktischen Anwendungen nicht immer genau sein.

Beispiel 1

Nichtspezifische Adsorption eines durch ein Enzym markierten Antikörpers auf einer 96 Bohrungen aufweisenden ELISA Platte

In jede Bohrung der 96 Bohrungen aufweisende ELISA Platte (hergestellt durch Sumitomo Bakelite Company), wird ein Agens zur Verhinderung einer nichtspezifischen Adsorption pipettiert, und zwar in einer Menge von 400 ul pro Bohrung, woraufhin die Platte unter Raumtemperatur während einer Stunde belassen und gesperrt wurde. Anschließend wurde ein durch Peroxidase markiertes anti- menschlisches IgG (hergestellt durch Tago Company) mittels des Agens zur Verhinderung nichtspezifischer Adsorption 1000-fach verdünnt und die verdünnte Lösung wurde mit einer Menge von 50 ul pro Bohrung pipettiert.
Nachdem die Platte bei Raumtemperatur während einer Stunde belassen wurde, wurde sie mittels einer, durch Phosphat gepufferten Saline, welche 0,05 % Tween 20 (PBS-Tween) enthielt, 6-fach gewaschen, und einer jeden Bohrung wurden als Substrat ABTSR (2,2'-Azinobis-(3- Ethylbenzothiazolin-6-Sulfonsäure)) als Substrat hinzugefügt. Nach 10 Minuten wurde die Absorbtion bei 450 nm mittels eines Titertek multiskan (hergestellt durch Flow Laboratory Company) bestimmt. Die Bestimmung wurde 3- fach kontinuierlich durchgeführt.
Als Agens zur Verhinderung nichtspezifischer Adsorption wurden die folgenden Lösungen benutzt; eine Lösung, die durch Auflösung von 2 % BSA in PBS erlangt wurde, woraufhin die BSA Lösung bis zu einer vorgeschriebenen Konzentration mit entionisiertem Wasser verdünnt wurde und eine Lösung, die durch Auflösung von SMP in einer Konzentration von 1 % mit 0,1 M Zitronensäure unter Einstellung eines pH-Wertes bei 6,2 mittel Natriumhydroxid, wobei die SMP Lösung in einem Autoklaven bei 121º C während zehn Minuten beheizt wurde, und wobei die SMP Lösung innerhalb einer vergeschriebenen Konzentration mit entionisiertem Wasser verdünnt wurde Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
Falls das Mittel zur Verhinderung nichtspezifischer Adsorption nicht benutzt wurde, ergab sich ein sehr hohes Ausmaß an nichtspezifischer Adsorption. Wurde hingegen BSA benutzt, wurde die Adsorption verhindert, und zwar innerhalb einer Konzentration oberhalb 1 % im Bereich experimenteller Fehler.
Wurde andererseits SMP benutzt, wurde die Adsorption verhindert, selbst wenn SMP auf 0,0625 % und Zitronensäure bis auf 6,25 mM verdünnt wurden. Tabelle 1 Sperrmittel Verdünnung Absorbtion (A405nm ± SD) 1%SMP/0,1M Zitronensäure 1 0 + 0 (In dieser Tabelle wurde BSA nicht sterilisiert)

Beispiel 2 Ausführung von ELISA

Eine gemischte Lösung von 50 ul anti-menschlichem K und anti-menschlichem λIgG (hergestellt durch Tago Company) wurde mittels einer 0,05M Natriumjcarbonatlösung 1000- fach verdünnt und in eine jede Bohrung einer ELISA Platte injiziert, welche 96 Bohrungen hatte, (hergestellt durch Sumitomo Bakelite Company) , woraufhin die Platte über Nacht bei 4º C stehengelassen wurde. Am nächsten Morgen wurde die Antikörperlösung verworfen und ein Agens zur Verhinderung nichtspezifischer Adsorption wurde in jede Bohrung eingebracht und in dieser eine Stunde belassen. Nachdem jede Bohrung mit PBS-Tween 2- fach gewaschen wurde, wurden 50 ul an menschlichem Serum IgG (hergestellt durch Midori Juji Company) mit Konzentrationen von 0 - 1000 ng/ml hinzugefügt und für eine Stunde stehengelassen. Nachdem jede Bohrung mit PBS-Tween sechsmal gewaschen wurde, wurde ABTS hinzugefügt und die Absorbtion bei 405 nm bestimmt.
Als Agens zur Verhinderung nichtspezifischer Adsorption wurde eine Lösung benutzt, welche durch Behandlung von 2 % BSA/PBS und 1 % SMP/0,1 M Zitronensäure-Na (pH-Wert 6,2) in einem Autoklaven - wie in Beispiel 1 gezeigt - und durch Verdünnung des sich ergebenden Materials mit entionisiertem Wasser auf das 10-fache erhalten wurde.
Die Ergebnisse sind in Fig. 1 gezeigt und kein Unterschied wurde zwischen (A) und (B) festgestellt.

Beispiel 3

Bräunungsgrad nach Sterilisierung

Nach Auflösung von 1 % SMP in jeder Pufferlösung (pH- Wert 6,1) wurde die Lösung in einem Autoklaven bei 121º C während 10 Minuten behandelt und ihre Trübung, die Gegenwart von Fällprodukten und der Bräunungsgrad wurden mit dem bloßen Auge beurteilt.
Wie in Tabelle 2 gezeigt waren die Puffer transparent, wobei kein Fällprodukt und keine Bräunung beobachtet wurde, falls Zitronensäure, Maleinsäure, Bernsteinsäure, Apfelsäure oder Malonsäure benutzt wurden. Tabelle 2 Trübung, Fällprodukte und Bräunungsgrad nach Sterilisierung von 1 % SMP in jeder Pufferlösung Puffer Trübung Fällprodukt Bräunungsgrad Wasser PBS (pH-Wert 7,2) 1M Tris-HCl (pH-Wert 7,4) Wasser+0,1 % EDTA (pH-Wert 6,0) 0,2M Zitronensäure -Na Citrat (pH-Wert 6,0) 0, 2M Zitronensäure -NaOH (pH-Wert 6,0) 0,2M Essigsäure -NaOH (pH-Wert 6,0) 0,2M Oxalsäure -NaOH (pH-Wert 6,0) 0,2M Maleinsäure -NaOH (pH-Wert 6,0) 0,2M Bernsteinsäure -NaOH (pH-Wert 6,0) 0,2M Apfelsäure -NaOH (pH-Wert 6,0) 0,2 M Weinsäure -NAOH (pH-Wert 6,0) 0,2M Malonsäure -NaOH (pH-Wert 6,0) 0,2M Propionsäure -NaOH (pH-Wert 6,0)

Beispiel 4

Milchproteinarten und die Sperrwirkung

Die folgenden Agentien zur Verhinderung nichtspezifischer Adsorption wurden zubereitet.
1. 1 % BSA/PBS (pH-Wert 7,2)
2. 1 % Nichtfette trockene Milch/50 mM Zitronensäure + 50 mM Maleinsäure (pH-Wert 6,3)
3. 0,5 % Casein/100mM Maleinsäure (pH-Wert6,1)
4. 7 % Casein + 0,3 % WPC/100 mM Zitronensäure (pH-Wert 6,2)
5. 0,5 % Nichtfette trockene Milch + 0,5 % Casein/50 mM Maleinsäure und 50 mM Malonsäure (pH-Wert 6,1)
Die Agentien gemäß 2. bis 5. wurden indirekt bei 140º C während zwei Sekunden sterilisiert.
Der gleiche Test der Sperrwirkung wie in Beispiel 1 wurde durchgeführt, außer daß durch Peroxidase markierte Anti-Maus IgG (hergestellt durch Tago Company) benutzt wurden anstelle der durch Peroxidase markierten antimenschlichen IgG. Nachdem weiterhin ABTSR hinzugefügt wurde und bei Raumtemperatur während 15 Minuten belassen wurde, wurde die Absorbtion bei 405 nm bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3 Sperrmittel Absorption (A 405 nm ± SD)
Wurde Milchprotein benutzt, war der Hintergrund gering und eine bessere Wirkung als bei BSA wurde erzielt. In diesem Fall, 4., bei welchem mit WPC gemischt wurde, ergab sich zwar eine geringere Sperrwirkung, praktisch gab es jedoch keine Probleme.

Beispiel 5

Herstellung eines pulverförmigen Agens zur Verhinderung nichtspezifischer Adsorption

Natriumcaseinat wurde in einer Menge von 15 Gew.-% in zehn Litern 0,2 Mol Maleinsäure-Natriumhydroxid (pH- Wert 6,1) aufgelöst. Die Lösung wurde einer Sprühtrocknung bei einer Blastemperatur von 160º C und einer Düsenaustrittstemperatur von 90º C unterzogen, woraufhin 1,2 kg an Pulver erhalten wurde. Dann wurden Maleinsäure und Natriumhydroxid mit einem Gewichtsverhältnis von 5:3 gemischt und zu einem Pulver vermahlen. 1,15 kg des früheren Pulvers und 1,6 kg des letztgenannten Pulvers wurden gemischt und das pulverförmige Agens zur Verhinderung nichtspezifischer Adsorption zubereitet.

Beispiel 6

384 g Zitronenanhydrid und 718 ml einer 25 Gew. -% Natriumhydroxid enthaltenen Lösung wurden in zehn Liter Wasser aufgelöst. Der pH-Wert betrug 6,2. 2 kg nicht fetter trockener Milch wurden in der Lösung aufgelöst, wobei die erhaltene Lösung einer Sprühtrocknung mit einer Blastemperatur von 180º C und einer Düsenaustriebstemperatur von 95º C unterzogen wurde und wobei 2 kg Pulver erhalten wurde. Anschließend wurden 57,5 g wasserfreier Zitronensäure, 1,235 kg Natriumcitrat (Zwei- Hydrat) und 67 g gewöhnliches Salz zu einem Pulver gemischt. 512,4 g des früheren Pulvers und 1,09 kg des letztgenannten Pulvers wurden gemischt und das pulverförmige Agens zur Verhinderung nichtspezifischer Adsorption zubereitet.

Beispiel 7 Ausführung von ELISA

Eine Lösungsmischung aus 50 ul antimenschlichem K und λ IgG (hergestellt durch Tago Company) welche mittels 0,05 M Natriumbicarbonat 1000-fach verdünnt wurde, wurde in eine jede Bohrung einer ELISA Platte pipettiert, welche 96 Bohrungen hatte (hergestellt durch Sumitomo Bakelite Company), woraufhin die Platte über Nacht bei 4ºC stehengelassen wurde. Am nächsten Morgen wurde die Antikörperlösung verworfen und in eine jede Bohrung ein Agens zur Verhinderung nichtspezifischer Adsorption eingebracht und in dieser während einer Stunde belassen. Nachdem jede Bohrung mit einer Lösung zur Verhinderung nichtspezifischer Adsorption zweimal gewaschen wurde, wurden in eine jede Bohrung 50 ul an menschlichem Serum IgG (hergestellt durch Midori Juji Company) in Konzentrationen von 0 bis 1000 ng/ml eingebracht und während einer Stunde belassen. Nachdem jede Bohrung mit der obigen Lösung 6-fach gewaschen wurde, wurde ABTS hinzugefügt und die Absorption bei 405 nm bestimmt.
Zur Sperrung der Platten wurden die folgenden Agentien benutzt.
1. Eine Lösung, die durch 4-fache Verdünnung von 1 % SMP/0,1 M Zitronensäure (pH-Wert 6,2) - wie in Beispiel 1 gezeigt - mit entionisiertem Wasser gewonnen wurde.
2. Eine Lösung, die durch Auflösung von 0,7 g des gemäß Beispiel 5 zubereiteten Pulvers in 100 ml entionisiertem Wasser gewonnen wurde, pH-Wert 6,2.
3. Eine Lösung, die durch Auflösung von 1 g des gemäß Beispiel 6 zubereiteten Pulvers in 100 ml entionisiertem Wasser gewonnen wurde, pH-Wert 6,3.
4. Eine Lösung, bei der 1 % BSA in einem Puffer aus Phosphorsäure aufgelöst wurde, der 0,15 Mol gewöhnliches Salz enthielt, pH-Wert 7,2 (PBS).
Die folgenden Agentien wurden zur Verdünnung der Proben benutzt.
1. Eine Lösung, die durch 10-fache Verdünnung von 1 % SMP/0,1 M Zitronensäure (pH-Wert 6,2) - wie in Beispiel 1 gezeigt - in entionisiertem Wasser gewonnen wurde.
2. Eine Lösung, die durch Auflösung von 0,3 g des gemäß Beispiel 5 zubereiteten Pulvers in 100 ml entionisiertem Wasser gewonnen wurde.
3. Eine Lösung, die durch Auflösung von 0,4 g des gemäß Beispiel 6 zubereiteten Pulvers in 100 ml an entionisiertem Wasser gewonnen wurde.
4. 0,1 % BSA/PBS
Die folgenden Agentien wurden zum Waschen der Platten benutzt.
1. Eine Lösung, die durch 10-fache Verdünnung von 1 % SMP/0,1 M Zitronensäure (pH-Wert 6,2) - wie in Beispiel 1 gezeigt - in entionisiertem Wasser gewonnen wurde.
2. Eine Lösung, die 0,02 % Tween 20 und 0,3 g des gemäß Beispiel 5 zubereiteten Pulvers in 100 ml entionisiertem Wasser enthielt.
3. Eine Lösung, die 0,02 % Tween 20 und 0,4 g des gemäß Beispiel 6 zubereiteten Pulvers in 100 ml entionisiertem Wasser enthielt.
4. Eine Lösung, die 0,02 % Tween 20 enthielt.
Die Ergebnisse sind in Fig. 2 gezeigt. Bei Benutzung von von BSA ist die Absorption im Bereich einer niedrigen Konzentration außerordentlich hoch und dies zeigt, daß eine nichtspezifische Adsorptionsverhinderung unzureichend ist. Sobald jedoch die gemäß den Beispielen 5 und 6 zubereiteten Pulver aufgelöst werden, wird die gleiche Verhinderungswirkung wie bei der Lösung, die durch Verdünnung von 1 % SMP/0,1 M Zitronensäure (pH-Wert 6,2) - wie in Beispiel 1 gezeigt - in entionisiertem Wasser erlangt wurde, beobachtet. Der Einfluß der Konzentration an organischer Säure auf die Absorption von ELISA Konzentration organischer Säuren
A. Eine Probe (menschliches IgG 100 ng/ml, durch Peroxidase gebundene antimenschliche IgG Antikörper) wurde mit einer Lösung gesprerrt, in welcher das durch Sprühtrocknung gewonnene Pulver einer nicht fetten trockenen Milch, Zitronensäure und Natriumhydroxid gemäß Beispiel 6 aufgelöst war, und zwar bei einer Milchkonzentration von 0,4 % (4 mM Zitronensäure) und mit einer Lösung verdünnt wurde, in welcher das gleiche Pulver in einer Menge von 0,1 Gew.-% aufgelöst war (1 mM Zitronensäure)
B. Die Probe wurde mit einer Lösung gesperrt, in welcher das gleiche Pulver in einer Milchkonzentration von 0,4 % (40 mM Zitronensäure) aufgelöst wurde und mit einer Lösung verdünnt wurde, in welcher das gleiche Pulver in einer Menge von 0,1 Gew.-% (10 mM Zitronensäure) aufgelöst war.

Claims

1. Agens zur Hemmung nichtspezifischer Adsorption, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Kombinetion von Milchproteinen als Wirkstoff und eine Pufferlösung enthält, die als Hauptbestandteile eine oder mehrere organische Säuren oder organische saure Salze enthält, wobei das Verhältnis der Konzentration an Milchfeststoff (%) zu der Konzentration (mM) an organischen Säuren und/oder sauren Salzen 0,1 oder weniger beträgt.

2. Agens nach Anspruch 1 in flüssiger Form.

3. Agens nach Anspruch 1 in Pulverform.

4. Verfahren zur Herstellung eines Agens zur Hemmung nichtspezifischer Adsorption, dadurch gekennzeichnet, daß das Agens Milchprotein als Wirkstoff enthält, daß das Verfahren die Zusammenfassung des Milchproteins und einer Pufferlösung umfaßt, welche als Hauptbestandteile eine oder mehrere organische Säuren oder organische saure Salze enthält, wobei das Verhältnis der Konzentration (%) an Milchfeststoff zu der Konzentration (mM) an organischen Säuren und/oder sauren Salzen 0,1 oder weniger beträgt und daß das Produkt sterilisiert wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei der pH-Wert der Pufferlösung 5,3 bis 7,0 beträgt.

6. Verfahren zur Herstellung eines pulverförmigen Agens zur Hemmung nichtspezifischer Adsorption, dadurch gekennzeichnet, daß das Agens eine Kombination von Milchproteinen als Wirkstoff und eine Pufferlösung enthält, welche als Hauptbestandteile eine oder mehrere organische Säuren oder organische saure Salze enthält, wobei eine Verfahrenslösung (A), welche 10 bis 40 Gew.-% (Trockenbasis) an Milchrohstoffen enthält, einschließlich des Milchproteins als Wirkstoff in der Pufferlösung gelöst wird, die als Hauptbestandteile eine oder mehrere organische Säuren oder organische saure Salze in einer 0,1 molaren bis 0,3 molaren Konzentration enthält, zu einem Pulver getrocknet wird und wobei eine Pufferlösung (β) , welche als Hauptbestandteile eine oder mehrere organische Säuren oder saure organische Salze enthält, zu einem anderen Pulver getrocknet wird und wobei die Pulver gemischt werden.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei 0,1 % bis 10% der Pulvermischung in Wasser gelöst werden und wobei der pH-Wert der erhaltenen Lösung 5,3 bis 7,0 beträgt.

8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, wobei das Mischungsverhältnis der Pulver in Wasser durch die folgende Formel dargestellt wird: Konzentration (%) Milchfeststoff/Konzentration umgerechnet in den Wert anorganischer Säure in (mH) ≤ 0,1 (in der Formel beträgt der Konzentrationswert, der in den Wert an anorganischer Säure umgerechnet ist ≤ 500 mM).

9. Verfahren zur Hemmung nichtspezifischer Adsorption, dadurch gekennzeichnet, daß bei dem Verfahren eine Lösung benutzt wird, welche eine Kombination von Milchproteinen als Wirkstoff und eine Pufferlösung enthält, welche als Hauptbestandteile eine oder mehrere organische Säuren oder organische saure Salze enthält, wobei das Verhältnis der Konzentration (%) in Milchfeststoff zu der Konzentration (mM) organischer Säuren und/oder saurer Salze 0,1 oder weniger beträgt.