JPH07111426B2 - ヒトインターロイキン―２の測定法および測定用試薬 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はヒトインターロイキン−２の測定法および測定
用試薬に関する。

従来の技術 インターロイキン−２（以下（おいて、「IL−２」と略
称することもある。）はレクチンや抗原の刺激を受けた
Ｔリンパ球が生産するリンホカインの一種である。IL−
２にはin vitroにおけるＴ細胞の長期増殖促進以外に、
細胞障害性Ｔ細胞の誘導，脾細胞中のＢ細胞の抗体産生
の誘導,NK細胞の活性化などの生物活性が報告されてい
る。また一方、このような生理作用から、IL−２には、
近年免疫不全症や癌の治療への臨床応用の期待がかか
り、注目を浴びている。しかしながら、その大量投与に
よる臨床効果の検討は培養細胞での生産量がきわめて少
ないため、遅れていた。最近、組換えDNA技術が急速に
進歩し、組換え型IL−２（以下において、「rIL−２」
と略称することもある。）の大量供給への道が拓かれ、
その効果の検討が開始されている。

発明が解決しようとする問題点 IL−２の生物活性は、従来、バイオアッセイ法［バイオ
ケミカル・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケー
ションズ（Biochem.Biophys.Res.Commun.），109,363
（1982）］で測定されて来たが、本法によるIL−２の血
中濃度の測定限界は１〜10μg/mlである。しかしなが
ら、IL−２は超微量でその生物活性を示すことから、バ
イオアッセイ法以上の精度を持つ測定法の開発が急がれ
ている。

本発明者らは、このような情勢に鑑み、ヒトIL−２のよ
り高感度，高精度の測定法の研究を鋭意行ったところ、
組換え型ヒトインターロイキン−２を温血動物に接種し
て得られた抗体を用い、サンドイッチ法による酵素免疫
測定法（EIA,Enzyme-immunoassay）でヒトインターロイ
キン−２を測定すると、バイオアッセイ法に比し顕著に
高感度でIL−２を測定できることを見い出した。

本発明者らは、これらの知見にもとづき、さらに研究し
た結果、本発明を完成した。

本発明は、 （１）、担体に保持された抗体，抗原および標識抗体を
用いるサンドイッチ法によるヒトインターロイキン−２
の酵素免疫測定法において、担体に保持された抗体が温
血動物起源の抗組換え型ヒトインターロイキン−２抗体
であり、標識抗体が温血動物起源の抗組換え型ヒトイン
ターロイキン−２抗体のフラグメントであり、組換え型
ヒトインターロイキン−２のアミノ酸配列が X-Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu As
n Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Me
t Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Gl
u Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pr
o Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Ph
e His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Va
l Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Me
t Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Ph
e Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Se
r Thr Leu Thr （式中、Ｘは水素またはMetを示す。）で表されること
を特徴とするヒトインターロイキン−２の測定法，およ
び （２）、（ａ）温血動物起源の抗組換え型ヒトインター
ロイキン−２抗体，および（ｂ）温血動物起源の抗組換
え型ヒトインターロイキン−２抗体のフラグメントと標
識剤との複合体からなり、組換え型ヒトインターロイキ
ン−２のアミノ酸配列が X-Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu As
n Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Me
t Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Gl
u Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pr
o Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Ph
e His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Va
l Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Me
t Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Ph
e Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Se
r Thr Leu Thr （式中、Ｘは水素またはMetを示す。）で表されるヒト
インターロイキン−２のサンドイッチ法による免疫化学
的測定用キットである。

本発明のサンドイッチ法において用いられる温血動物起
源の抗組換え型ヒトインターロイキン−２抗体は、組換
え型ヒトIL−２を抗原として温血動物に接種して製造さ
れる。

本明細書においては、担体に保持される抗体を第一抗体
と、標識剤と結合される抗体を第二抗体とそれぞれ称す
ることもある。

抗原として用いられる組換え型ヒトIL−２としては、遺
伝子組換え技術により製造され、天然のヒトインターロ
イキン−２と同様の生物学的もしくは免疫学的活性、た
とえばIL−２レセプターや抗IL−２抗体との結合能、を
有するものであればいずれでもよい。

抗原として用いられる組換え型ヒトIL−２としては、次
のものが挙げられる。

遺伝子工学技術により製造される第１図で示されるアミ
ノ酸配列を有するポリペプチド（Ｉ）［PCT/JP84/00460
明細書実施例１（1984年９月26日出願）。特開昭61-787
99号公報に対応する。］，その生物学的もしくは免疫学
的活性に必要な一部分のアミノ酸配列からなるフラグメ
ントでもよい。上記フラグメントとしては、例えばポリ
ペプチド（Ｉ）のアミノ末端から１個のアミノ酸（EPC
公開91539号公報）または４個のアミノ酸を欠くフラグ
メント（特開昭60-126088号公報）やカルボキシル末端
部の数個のアミノ酸を欠くフラグメントなどが挙げられ
る。さらに上記ポリペプチド（Ｉ）の構成アミノ酸の一
部が欠損しているか他のアミノ酸に置換されたもの、例
えば125位のシスティン残基がセリン残基に置換された
もの（特開昭59-93093号公報）でもよい。

上記遺伝子工学技術と製造されるIL−２（rIL−２）
は、ポリペプチド（Ｉ）のアミノ末端にさらにMetを有
していてもよく［PCT/JP84/00460明細書実施例１（1984
年９月26日出願）。特開昭61-78799号公報に対応す
る。］、またポリペプチド（Ｉ）とそのアミノ末端にさ
らにMetを有するポリペプチド（Ｉ）の混合物でもよい
［特開昭60-115528号公報］。

抗原として用いるrIL−２は、とりわけポリペプチド
（Ｉ）、あるいはそのアミノ末端にMetを有するポリペ
プチド（Ｉ）またはそれらの混合物が好ましい。

抗原が接種される温血動物としては、ヒト以外のものが
用いられ、その例としては、ウサギ，ヒツジ，ヤギ，ラ
ット，マウス，モルモット，ウシ，ウマ，ブタなどの哺
乳動物、ニワトリ，ハト，アヒル，ガチョウ，ウズラな
どの鳥類等などが挙げられる。rIL−２の接種量は該動
物に抗体を産生させるに有効な量であればよいが、通常
１回約0.1〜10mg程度、例えばウサギならば１回約1mg,
ヤギならば１回約4mgを、フロインドの完全アジュバン
トとともに、背部皮内，筋肉内，後肢掌皮内等に２週間
ごとに１〜10回投与する。生成したIL−２に特異的な抗
体は、採血（たとえば、ウサギであれば通常、最終接種
後７〜12日の間に耳静脈から採血する。）し、遠心分離
した血清より得ることができる。すなわち、例えば血清
をまず硫安で塩析し、沈殿を遠心でとり、沈殿を例えば
ホウ酸緩衝液にとかし、ついでrIL−２を担体に固定化
したカラム［特願昭59-176306号明細書（昭和59年８月2
3日出願）。特開昭61-53300号公報に対応する。］を用
いるアフィニティクロマトグラフィーによって精製を行
い、IL−２に特異的な抗体を取得する。

上記の操作により本発明の第一抗体および第二抗体がそ
れぞれ得られる。第一抗体取得および第二抗体取得のた
めに免疫する温血動物は、それぞれ異なる種の動物を用
いることが好ましく、とりわけ第一抗体取得のために
は、比較的大量の抗体が得られるヤギなどが好ましく、
他方第二抗体取得のためには、ウサギなどが好ましい。

本発明に用いる抗IL−２抗体のうち、上記遺伝子工学技
術で製造されるIL−２を抗原として、温血動物に接種し
て得られる抗体は新規であり、EIA法による測定で10⁴〜
10⁶以上の抗体価を有する。

このようにして得られた抗体は、天然型ヒトIL−２をも
認識する。

標識体として用いる本発明の第二抗体は、上記で得られ
る抗体を、例えば公知の方法に従い、ペプシンで部分消
化し、抗体フラグメントＦ（ab′）₂として抗体のＣ領
域を削除し、ついで還元により抗体フラグメントFab′
に変換して用いることが好ましい。

本発明における抗体のフラグメントとしては、Ｆ（a
b′）₂,Fab′が挙げられる。

上記ペプシンによる部分消化および還元は、自体公知の
常套手段、たとえばジャーナル・オブ・アプライド・バ
イオケミストリー（Journal of Applied Biochemistr
y）４,41−57（1982）に従って行なえばよい。

本サンドイッチ法に用いられる抗体と標識剤との複合体
は、たとえば両者をpH約６〜８の緩衝液中で、約10℃〜
50℃で、約10分ないし24時間反応させることにより行な
われる。

該標識剤としては、標識酵素が好ましい。該標識酵素の
例としては、たとえばペルオキシダーゼ［例、西洋わさ
びペルオキシダーゼ（HRP,horse radish peroxidas
e）］，マレートデヒドロゲナーゼ，β−ガラクトシダ
ーゼなどが挙げられる。該標識酵素としては、なかでも
HRPが好ましい。

標識酵素は、マレイミド化されたものを用いると、複合
体の形成を行ない易い［特開昭59−90054号公報］。

マレイミド化された酵素を用いて複合体を形成する方法
を次に述べる。まず、標識酵素と、一般式 ［式中、ｎは０〜５の整数を、Ｒは化学結合または二価
の６員環状炭化水素残基（例、1,2−,1,3−または1,4−
シクロヘキシレン,1,2−,1,3−または1,4−フェニレ
ン）を示す。］ で表わされる化合物とを、pH約６ないし８の緩衝液中で
約10ないし50℃の温度で約10分ないし24時間反応させる
ことによって行なわれる。該緩衝液としては、たとえば
pH7.0の0.1Mリン酸緩衝液,pH6.3の0.05Mリン酸緩衝液な
どが挙げられる。

このようにして得られたマレイミド化標識剤の精製は、
たとえばゲルクロマトグラフィーなどにより行なうこと
ができる。該ゲルクロマトグラフィーを行なう際に用い
られる担体としてはたとえばセファデックスＧ−25［フ
ァルマシア・ファインケミカル社（スエーデン）製］，
バイオゲルＰ−２［バイオ・ラッド・ラボラトリーズ社
（米国）製］などが挙げられる。

マレイミド化標識剤を第二抗体と反応させる場合、第二
抗体あるいはそのフラグメントを、メルカプトエチルア
ミン類の存在下で還元し、ゲルクロマトグラフィーによ
って精製された第二抗体もしくはそのフラグメントとマ
レイミド化標識剤を反応させる。

該反応は、両者を緩衝液中で約０℃ないし40℃の温度
で、約１ないし48時間反応させることにより行なうこと
ができる。該緩衝液としては、たとえばpH6.0の5mMエチ
レンジアミン四酢酸ナトリウム塩を含む0.1Mリン酸緩衝
液などが挙げられる。

このようにして得られた標識抗体は、たとえばゲルクロ
マトグラフィーなどにより精製することができる。該ゲ
ルクロマトグラフィーに用いられる担体としては、たと
えばウルトロゲルAcA44［LKB社（スエーデン）製］，セ
ファクリルＳ−200［ファルマシア・ファインケミカル
社（スエーデン）製］などが挙げられる。とりわけマレ
イミド化ペルオキシダーゼ［特開昭59-90054号公報］を
用いてペルオキシダーゼを結合させることが好ましい。

該反応は、上記抗体に重量比として２〜20倍量のペルオ
キシダーゼ（西洋ワサビペルオキシダーゼなど）を加
え、緩衝液中で約０°〜40℃の温度で、約１〜48時間反
応させることにより行なうことができる。緩衝液として
は、たとえばpH6.0の5mMエチレンジエミン四酢酸ナトリ
ウムを含む0.1Mリン酸緩衝液などが使用できる。このよ
うにして得られたペルオキシダーゼ標識抗体は、たとえ
ばゲルろ過法などにより精製し、第二抗体として使用す
る。

本発明のIL−２の測定法は、公知のサンドイッチ法の原
理，手段［メソッズ・イン・エンザイモロジー（Method
s in Enzym.），84,26（1982）；ジャーナル・オブ・イ
ムノロジカル・メソッズ（J.Immun.Methods），８,223
（1975）］ EPC公開第49898公報,EPC公開第88368号公報，特開昭59
−90054公報に基づき行なうことができる。

本発明のIL−２の測定は、まずイムノプレートに第一抗
体を吸着させ、ウシ血清アルブミンで処理したあと、検
体溶液（例えば血液，血清，血漿，尿，胸水，髄液ある
いは各種臓器抽出物など）を加え、ついで第二抗体と標
識剤との複合体を加えて反応させる。反応生成物に標識
となる酵素（ペルオキシダーゼなど）の基質（例えば過
酸化水素水を含んだＯ−フェニレンジアミンなど）を加
え、生じた物質の吸光度を測定する。この吸光度を予め
作成しておいて標準曲線（第２図）にあてはめ、検体溶
液中のIL−２含量を算出する。本法によればIL−２の10
〜40pg/mlまで測定できる。

本発明のIL−２の測定法を、より具体的に説明するた
め、一例としてカニクイザル静脈の血中ヒトIL−２濃度
の測定につき下記する。

カニクイザル（雌性,2.5〜4kg,一群３頭）へrIL−２を
0.2〜100μg/0.5ml/kgとなるように静脈内投与し、投与
後5,15,30分,1,2,4,6および24時間に１〜5mlずつ採血
し、室温に３〜５時間静置したのち3000rpm,10分間遠心
して血清を分離し検体とする。次いで、検体は5,10,50,
100,300および1000倍となるように仔ウシ血清溶液で希
釈したのち測定する。すなわち、anti−rIL−2goatIgG
溶液（蛋白量15μg/ml）100μｌをイムノプレート（Nun
c社）のウエル内に加え、４℃に16〜20時間静置する。
ウエル内の溶液を捨て、300μｌのPBSを加えて洗浄す
る。この操作を３回繰り返す。次に200μｌの１％ウシ
アルブミン溶液を加え、４℃で16〜20時間静置後、PBS
で５回洗浄する。100μｌのrIL−２溶液，または希釈し
た検体溶液をウエル内に加えて４℃,16〜20時間静置し
たのち、PBSでよく洗浄する。次に、anti−rIL−2rabbi
t Fab′−HRP溶液100μｌを加えて、室温に４時間静置
後、PBSでよく洗浄する。そして100μｌの基質溶液をウ
エル内に加えて室温，暗所にて、20〜40分間反応させ
る。100μｌの2M硫酸溶液を添加して反応を停止させ、
タイターテックマルチスキャンMCにより492nmの吸光度
の変化を測定し、第２図に示すごとくrIL−２の標準曲
線からそれぞれの検体中のrIL−２濃度を算出する。な
お、100μg/0.5ml/kg投与の結果を第４図に示す。

この結果は、本法によれば、バイオアッセイ法の少なく
とも100倍以上の感度で、かつ正確にrIL−２の血中濃度
を測定できることを示している。従って、本法は今後、
臨床検体（血液，血清，血漿，尿、胸水，髄液など）中
のIL−２の測定や、IL−２の組織内，臓器内分布の検討
に有力な手段を提供するものである。

とりわけrIL−２を免疫原として得られる抗IL−２抗体
を用いる場合は、抗体の性状が明確でより正確なIL−２
の測定を行なうことができる。

本発明のサンドイッチ法によるヒトIL−２測定用試薬キ
ットの例としては、次のものが挙げられる。

1.測定用試薬 （１）溶解用緩衝液 新生牛血清（56℃,30分処理）100ml チメロサール これらを、0.02Mリン酸緩衝液−生理食塩水,pH7.0,（PB
S）に１リットルになるように希釈し、４℃で保存す
る。

（２）牛血清アルブミン（BSA）溶液 牛血清アルブミン 10g チメロサール 0.01g これらを、１のPBSに溶解し、56℃30分処理し、４℃
で保存する。

（３）抗rIL−２ヤギIgG（第一抗体） 抗体溶液を、使用前に、緩衝液で15μgIgG/mlとなるよ
うに希釈する。

（４）ペルオキシダーゼと抗rIL−２ウサギFab′（第二
抗体）との複合体 複合体溶液を、使用前に、緩衝液で3.5μｇ蛋白/mlとな
るように希釈する。

（５）基質溶液 0.01％チメロサールを含む0.1Mクエン酸緩衝液（pH5.
5）100mlに、30％過酸化水素溶液66μｌを加え、得られ
た溶液を４℃に保存する。基質溶液は、使用直前に、ｏ
−フェニレンジアミン44mgを該溶液10mlに溶解する。

（６）rIL−２標準溶液 rIL−２溶液を、緩衝液で0.04unit/mlになるように希釈
する。希釈液をピペットで小バイアル（各1ml）に分注
し、−20℃で保存する。

2.測定法 （１）PBSで1:25に希釈された抗rIL−２ヤギIgG溶液（1
5μg/ml）100μｌをピペットでとり、ヌンクイムノプレ
ートの各ウエルに分注し、該プレートを４℃,16〜24時
間保存する。

（２）溶液を捨て、該プレートをPBS（各ウエルに300μ
ｌ）で３回洗う。

（３）各ウエルにBSA溶液200μｌを加え、４℃,16〜24
時間保存する。

（４）溶液を捨て、該プレートをPBS（300μｌ）で３回
洗う。

（５）100μｌの被検血清又はrIL−２標準溶液（0.001,
0.002,0.004,0.008,0.012,0.016又は0.02unit/ml）を加
え、該プレートを４℃,16〜24時間保存する。被検血清
およびrIL−２標準溶液を希釈用緩衝液で希釈する。

（６）溶液を捨て、該プレートをPBS（300μｌ）で５回
洗う。

（７）希釈用緩衝液で1:50に希釈されたペルオキシダー
ゼと抗rIL−２ウサギFab′複合体（100μｌ）を加え、
該プレートを室温で４時間保存する。

（８）溶液を捨て、該プレートをPBS（300μｌ）で５回
洗う。

（９）基質溶液（100μｌ）を加え、該プレートを室温
暗所で30分保存する。

（10）2MH₂SO₄（100μｌ）を加え、酵素反応を停止させ
る。

（11）タイターテツク・マルチスキャンにより492nmの
吸光度を測定する。

（12）被検血清中のrIL−２の濃度を、標準測定曲線か
ら計算する。

本発明の測定法は、バイオアッセイ法よりも顕著に高感
度である。たとえば、本発明の測定法は、バイオアッセ
イ法の約100倍高感度である。また本法とバイオアッセ
イ法との相関係数は0.999と高く、得られる測定値が生
物活性をよく反映していると判定できる。（第３図） また、IL−２の血清への添加回収実験を行って本法での
検体溶液中の血清量の影響を調べたところ、血清が40％
以下であれば測定に影響のないことが判明した。

本発明の測定法は、天然型ヒトインターロイキン−２を
も測定することができる。

実施例 以下に参考例および実施例を挙げて、本発明をさらに具
体的に説明するが、これらが本発明の範囲を限定するも
のではない。

実験材料としては下記のものを使用した。

rIL−2:特開昭60−115528号公報実施例６記載の方法に
従って製造した。蛋白濃度0.75,1.25,1.195mg/ml（5mM
酢酸アンモニウム,pH5.0）のものを製造し、使用した。

ウシアルブミン溶液：ウシアルブミン（Cohn Fraction
V,第１化学）を0.145M食塩含有0.02Mリン酸緩衝液,pH6.
8（以下PBSと略す）に１％となるように溶解し、56℃で
30分間処理したのち、チメロザール（Sigma社）を0.001
％となるように加えて、４℃に保存した。

仔ウシ血清溶液：新生仔ウシ血清（M.A.Bioproduct社）
を56℃で30分間処理したのち、ただちにろ紙（東洋ろ紙
NO.5C）ろ過し、0.02M PBSに10％となるように溶解し、
チメロザールを0.001％になるように加え４℃で保存し
た。

西洋ワサビペルオキシダーゼ−抗ウサギ抗体複合体（an
ti−rabbit IgG−HRPと略す）：抗ウサギIgG−HRP（Mil
es−Yeda社）を仔ウシ血清溶液で４万倍に希釈して用い
た。

西洋ワサビペルオキシダーゼ−抗ヤギ抗体（anti−goat
IgG−HRPと略す）：抗ヤギIgG−HRP（Cappel社）を仔
ウシ血清溶液で４万倍に希釈して用いた。

蛋白質量の測定：蛋白質の濃度はウシ血清アルブミン
（Sigma社）を標準としてプロテインアッセイキット（B
io−Rad社）を使用して求めた。

基質溶液:0.01％チメロザール含有0.1Mクエン酸緩衝液,
pH5.5に30％過酸化水素水溶液を0.066％となるように加
えて、冷蔵庫に保存し、実験に用いる直前にｏ−フェニ
レンジアミンを40mMとなるように溶解して用いた。

参考例１（固定化rIL−２の製造） 臭化シアン活性化セファロース4B（ファルマシア社）1g
をグラスフィルターに移し、20mlの0.001N塩酸を加えて
充分に膨潤させたのち、200mlの同塩酸溶液でよく洗浄
した。一方、10mlのrIL−２溶液（蛋白質1.25mg/ml）へ
1mlの1M重炭酸ナトリウム溶液を加えたのち、1N水酸化
ナトリウム溶液でpHを8.4に調整した。この溶液へ上記
臭化シアン活性化セファロース4Bを加え、４℃で16時間
反応した。反応後、ゲルをグラスフィルターに移し、10
0mlの0.1M重炭酸ナトリウム溶液で洗浄した。ついで、1
0mlの1Mエタノールアミン含有0.1M重炭酸ナトリウム溶
液中へゲルを加え、ゆっくり攪拌しながら４℃で２時間
反応させて、残存活性基をマスクした。ゲルは0.1M重炭
酸ナトリウム溶液,1M食塩含有0.1M酢酸（pH4.0）,1M食
塩含有0.1Mホウ酸緩衝液（pH8.0）各100mlで順次洗浄し
た。本品を0.02Mホウ酸緩衝液（pH8.0）に懸濁してカラ
ムにつめ、４℃に保存した。なお、rIL−２のカラムへ
の結合量は約11mgであった。

実施例１ 抗rIL−２ヤギ抗体（anti−rIL−2 goat Ig
G）の製造 （ａ）抗rIL−２ヤギ血清の製造 4mlのrIL−２含有溶液（蛋白質0.75mg/ml）と4mlのフロ
インドの完全アジュバント（Difco社）とを混合し、ヤ
ギの筋肉内へ２週間毎７回投与して得られた血液を室温
に５時間静置後、４℃に16時間放置したのち3000rpm,10
分間遠心し、その上清を抗rIL−２ヤギ血清として用い
た。

（ｂ）anti−rIL−2 goat IgGの製造 上記（ａ）で得た抗rIL−２ヤギ血清20mlをビーカーに
取り、硫安を40％飽和となるように加え、攪拌しながら
４℃に16時間放置した。次いで10,000rpm,10分間遠心
し、その上清をすてたのち、35mlの0.02Mホウ酸緩衝液,
pH8.0を加えて溶解し、スペクトロポア膜（Spectrum Me
dical社）に入れ、同緩衝液に対して４℃で16時間透析
した。透析後10,000rpm,10分間遠心して沈殿物を除去
し、得られた上清液の50mlを２等分し、その25mlを参考
例１で製造した固定化rIL−２カラム（1.2×4cm）にか
けた。カラムは280nmの吸収がなくなるまで0.02Mホウ酸
緩衝液（pH8.0），ついで0.1M酢酸緩衝液（pH4.5）で十
分に洗浄した。ついで0.2Mグリシン塩酸緩衝液（pH2.
0）で溶出を行い、溶出画分に、すぐ1/10量の1M Na₂HPO
₄を添加し、1N水酸化ナトリウム溶液でpHを7.0に調整し
たこの溶液を0.02Mホウ酸緩衝液（pH8.0）に対して４℃
で16時間透析した。透析後10,000rpm,10分間遠心し、そ
の上清液をanti−rIL−2 goat IgGとして用いた。な
お、この溶液には0.001％になるようにチメロザールを
添加して４℃に保存した。

（ｃ）anti−rIL−2 goat IgGの性状 （１）蛋白質濃度は0.1〜0.8mg/mlである。

（２）EIA法による測定で10⁴〜10⁶以上の抗体価を有す
る。

（３）純度は80〜90％以上である。

実施例２ ［抗rIL−２ウサギ抗体（anti−rIL−2 rabb
it IgG）の製造］ （ａ）抗rIL−２ウサギ血清の製造 1klのrIL−２（蛋白量1.195mg/ml）と1mlのフロインド
の完全アジュバントとを混合し、NIBSウサギ（ラビトン
牧場，雄性）の背部皮内および太ももの筋肉内に２週間
毎３回投与した。３回目投与の１週間後に耳介静脈から
採血し、室温に３時間,4℃に16時間放置後3000rpmで、1
0分間遠心し、その上清を抗rIL−２ウサギ血清として用
いた。

（ｂ）anti−rIL−2 rabbit IgGの製造 実施例１（ｂ）のanti−rIL−2 goat IgGと同様の方法
で製造した。

（ｃ）anti−rIL−2 rabbit IgGの性状 （１）蛋白質濃度は、0.1〜0.8mg/mlである。

（２）EIA法による測定で10⁴〜10⁶以上の抗体価を有す
る。

（３）純度は80〜90％以上である。

実施例３（ペルオキシダーゼ結合抗体複合体の製造） （ａ）抗rIL−２ウサギ抗体フラグメンツト（anti−rIL
−2 rabbit Fab′）の製造 実施例２（ｂ）で得たanti−rIL−２−rabbit IgG 28ml
（蛋白量0.23mg/ml）をコロジオンバッグ（Sartorius
社）を用いて４℃で、約1.5mlまで濃縮し、0.1M酢酸緩
衝液（pH4.5）に対して４℃で16時間透析した。透析
後、10,000rpm,10分間遠心し、沈殿物を除去し、その上
清液へ120μｇのペプシン（Sigma社,4500単位/mg）を加
えて、37℃で16時間反応させた。ついで、200μｌの0.2
M Na₂PO₄を加え、1N水酸化ナトリウム溶液でpH8.0に調
整したのち、セファデックスＧ−150のゲルろ過（カラ
ム:1.5×45cm）を行い、抗体フラグメントＦ（ab′）₂
を得た。この溶液を再びコロジオンバッグにとり、４℃
で、約1.5mlまで濃縮した。この濃縮液を0.1M酢酸緩衝
液（pH5.0）に対して、４℃で２時間透析した。この透
析液へ終濃度20mMとなるように0.4M2−メルカプトエチ
ールアミンを加えて、37℃,90分間反応させた、反応
後、セファデックスＧ−25（ファルマシア社）のカラム
（1.0×80cm）にかけ、5mMエチレンジアミン四酢酸ナト
リウム塩含有0.1Mリン酸緩衝液（pH6.0）で展開し、280
nmの吸収を持つ画分を集めてanti−rIL−2 rabbit Fa
b′を得、４℃に保存した。

（ｂ）マレイミド化西洋ワサビペルオキシダーゼの製造 10mgの西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRPと略す。Boehr
inger Mannhein社）を1.4mlの0.1Mリン酸緩衝液,pH6.8
に溶解し、これにＮ−シクロヘキシルメチルマレイミド
カルボン酸 Ｎ−ハイドロキシコハク酸イミドエステル
4.18mgのN,N−ジメチルホルムアミド（100μｌ）溶液を
加えて、室温で１時間反応した。反応液を2500rpm,10分
間遠心し、その上清液をセファデックスＧ−25のカラム
（1.0×80cm）に注ぎ込み、0.1Mリン酸緩衝液,pH6.8で
展開した。主溶出画分を集めて、マレイミド化西洋ワサ
ビペルオキシダーゼを得た。

（ｃ）anti−rIL−2 rabbit Fab′と西洋ワサビペルオ
キシダーゼとの複合体（anti−rIL−2 rabbit Fab′−H
RP）の製造 上記（ａ），（ｂ）で得たanti−rIL−2 rabbit Fab′
とマレイミド化西洋ワサビペルオキシダーゼとを混合
し、コロジオンバッグにより、４℃で約1mlにまで濃縮
したのち、さらに４℃で20時間反応させた。反応後、ウ
ルトロゲルAcA44（LKB社）のカラム（1.0×80cm）に注
ぎ込み、0.1Mリン酸緩衝液で展開した。活性画分を集め
て0.1ウシアルブミンおよび0.001％チメロザールを加え
て４℃に保存した。

実施例４（血清中のrIL−２濃度の測定） 実施例１（ｂ）で得たanti−rIL−2 goat IgG溶液（蛋
白量15μg/ml）100μｌをイムノプレート（Nunc社）の
ウエル内に加え、４℃に16〜20時間静置した。ウエル内
の溶液を捨て、300μｌのPBSを加えて洗浄した。この操
作を３回繰り返した。つぎに200μｌの１％ウシアルブ
ミン溶液を加え、４℃で16〜20時間静置後、PBSで洗浄
した。100μｌのrIL−２溶液または仔ウシ血清溶液で希
釈した検体溶液をウエルに加えて４℃で16〜20時間静置
したのち、PBSでよく洗浄した。つぎに実施例３（ｃ）
で得たanti−rIL−2 rabbit Fab′−HRP溶液100μｌを
加えて室温に４時間静置後、PBSでよく洗浄した。そし
て100μｌの基質溶液をウエル内に加えて室温，暗所に
て20〜40分間反応させた。100μｌの2M硫酸溶液を添加
して反応を停止させ、タイターテックマルチスキャンMC
（Flow Laborarories社）により492nmの吸光度の変化を
測定した。その結果を第２図に として示す。

天然型IL−２濃度の測定を、上記と同様の方法で行なっ
た。天然型IL−２は、バイオケミカル・アンド・バイオ
フイジカル・リサーチ・コミュニケーション（Biochemi
cal and Biophysical Researsh Communication）vol.12
7,No.1,pp.180−190（1985）に記載の方法で得たものを
使用した。

天然型IL−２の測定結果を第２図に として示す。

実施例５（rIL−２を静脈内投与したカニクイザルの血
中rIL−２濃度の測定） カニクイザル（雌性,2.5〜4kg,一群３頭）のrIL−２を1
00μg/0.5ml/kgとなるように静脈内投与し、投与後5,1
5,30分,1,2,4,6および24時間に3mlずつ採血し、室温に
３時間静置したのち、3000rpm,10分間遠心して血清を分
離し、検体とした。測定法は、実施例４と同様に行なっ
た。結果を第４図に示す。

参考例２（バイオアッセイ法との相関性） rIL−２を20％ウシ胎児血清含有RPM1−1640培地へ3.75,
7.5,15,30および60ng/mlとなるように加えたのち、その
rIL−２量を本発明の測定法（実施例４と同様の方法）
とバイオアッセイ法［バイオケミカル・アンド・バイオ
フイジカル・リサーチ・コミュニケーションvol.109,No
2,pp.363−369（1982）に記載の方法］により測定し
た。その結果を第３図に示す。

なお、各測定法によるそれぞれ実験回数５回の結果で
（ｎ＝５）、相関係数（ｒ）は0.999であった。また相
関性は一次方程式Ｙ＝1.02X＋1.04として表わされた。

参考例３ rIL−２を145〜170μg/ml含有する試料をpH12で37℃,5,
15,30分,1,2,3,時間，または75℃で0.5,1,2,5時間処理
した。

生成物を実施例４と同様の本発明のサンドイッチ法，参
考例２に示したのと同様のバイオアッセイ法に付した。

結果を第５図に示す。各測定法によるそれぞれ実験回数
５回の結果で（ｎ＝22）、相関係数（ｒ）は0.989であ
った。また相関性は一次方程式Ｙ＝1.06X＋3.74として
表わされた。

発明の効果 本発明のヒトIL−２測定法は、公知のヒトIL−２の測定
法に比べ感度が高く、IL−２を蛋白質として正確に認識
した上測定することができるので、とりわけ臨床検体な
ど微量のIL−２の測定に有用である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ヒトIL−２のアミノ酸配列の一例を示す。 第２図は、実施例４で得られたrIL−２および天然型IL
−２の測定結果を示す。 第３図は、参考例２で得られた本発明の測定法とバイオ
アッセイ法との相関性を示す。 第４図は、実施例５で得られたカニクイザルの血中のrI
L−２濃度の測定結果をそれぞれ示す。 第５図は、参考例３で得られたrIL−２を不活性化した
ものの測定結果を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏ ｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕ ＳＡ，Ｖｏｌ．81，Ｎｏ．１（1984）Ｐ. 2176−2180

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】担体に保持された抗体，抗原および標識抗
   体を用いるサンドイッチ法によるヒトインターロイキン
   −２の酵素免疫測定法において、担体に保持された抗体
   が温血動物起源の抗組換え型ヒトインターロイキン−２
   抗体であり、標識抗体が温血動物起源の抗組換え型ヒト
   インターロイキン−２抗体のフラグメントであり、組換
   え型ヒトインターロイキン−２のアミノ酸配列が X-Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
   Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu As
   n Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Me
   t Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Gl
   u Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pr
   o Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Ph
   e His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Va
   l Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Me
   t Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Ph
   e Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Se
   r Thr Leu Thr （式中、Ｘは水素またはMetを示す。）で表されること
   を特徴とするヒトインターロイキン−２の測定法。
2. 【請求項２】（ａ）温血動物起源の抗組換え型ヒトイン
   ターロイキン−２抗体，および（ｂ）温血動物起源の抗
   組換え型ヒトインターロイキン−２抗体のフラグメント
   と標識剤との複合体からなり、組換え型ヒトインターロ
   イキン−２のアミノ酸配列が X-Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
   Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu As
   n Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Me
   t Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Gl
   u Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pr
   o Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Ph
   e His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Va
   l Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Me
   t Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Ph
   e Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Se
   r Thr Leu Thr （式中、Ｘは水素またはMetを示す。）で表されるヒト
   インターロイキン−２のサンドイッチ法による免疫化学
   的測定用キット。