JPS6259783B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は人リンパ球により産生される遊走阻止
フアクターおよび関連メデイエーターのラジオイ
ムノアツセーに関する。

遊走阻止フアクター（MIF）はマクロフアージ
の遊走を阻止する高分子生成物である。感作リン
パ球により産生されるMIFの生物化学的性質は
「Proc.Nat.Acad.Sci.、U.S.」第56巻第72〜77頁
（1966）、「Fed.Proceedings」第30巻第1730〜35
頁（1971）および「J.Immunol.」第112巻第1461
〜66頁（1974）に説明されている。

感作リンパ球は遅延形過敏症、ある種の微生物
および腫瘍に対する抵抗性、移植組織拒絶反応お
よび自己免疫疾患さえも包含する多数の生物学的
反応に重要な役割を演ずると信じられている。こ
れら感作リンパ球は抗原またはマイトジエン
（mitogen）により刺戟された際にMIFおよびそ
の他の可溶性媒体を合成しそして分泌させる。

MIFおよびMIF様物質は細胞性免疫のメデイエ
ーターとして重要な役割を演ずると信じられてい
るのであるから、それらの評価または定量はかな
りの関心事である。リンパ球により産生されるこ
れらメデイエーターの評価に対しては、現在種々
の技術が利用可能である。これらの方法はすべて
複雑なインビトロバイオアツセー法であつて、こ
れらはそのメデイエーターの存在または不存在下
における細胞の遊走面積を測定することを包含す
る〔「Acta Allergol.」第26巻第56〜80頁
（1971）、および同第28巻第145〜58頁および第351
〜64頁（1973）参照〕。結論として、それらは病
院または臨床実験室での常法的使用に対しては不
適当でありそして一般にこれらは基礎および応用
研究実験室においてのみ実施されている。MIFお
よびMIF様メデイエーターの測定のための非バイ
オアツセー法は、臨床実験室での使用に対してそ
れがあまり厄介でないということ、そしてより定
量的であるということの故に、現在のバイオアツ
セー法に比して有意の利点を有している。

本発明によれば、人リンパ球により産生される
MIFおよびMIF様メデイエーターを測定するため
のラジオイムノアツセー（RIA）が開発された。

RIAの重要なそして実際的利点は、非常に低い
水準のホルモンおよびその他の抗原（または抗
体）の定量のためのこの一般タイプの試験が10年
以上の間病院および臨床実験室で利用可能であつ
たということである。医師および医療技師はRIA
の一般原則をよく知つており、そして従つてより
厄介なそして複雑なバイオアツセーよりも一層容
易にこのRIA試験の受入れに適応することが可能
である。

RIAを含む一般的診断法においては、非標識抗
原を放射能標識抗原への前もつて定めた量の特異
抗原の結合に及ぼす効果により判定している。こ
れらRIA法は、抗原の産生、精製および放射能標
識、抗原に対して高い特異性および親和性を有す
る抗体の誘発、および結合および非結合抗原の分
離に依存している。一般的なRIA実施法は周知で
あり、そしてRIAに包含される一般原則を考察し
たこの主題に関する多数の総説が入手可能であ
る。多数の有用な参照文献が引用されているその
ような総説の二つは「Clin.Chem.」第19(2)巻第
146〜186頁（1973）および「J.Immunological
Methods」第７巻第１〜24頁（1975）である。

RIA分野の現状にもかかわらず、細胞性免疫の
MIFおよびMIFメデイエーターのRIA試験はこれ
まで開発されていない。しかしながらそのような
試験の可能性は「Cell Immunol.」第32巻第370
〜84頁（1977）に提案されている。これらメデイ
エーターに対するここに開示のRIA試験の開発の
ためには、本発明者らによつて多数の困難な技術
的問題が克服されなくてはならなかつた。

第一に、MIF抗原産生のためには連続培養、変
形人リンパ球細胞系統の開発が望ましいことが発
見された。人の診断法の開発のためには、連続培
養リンパ球の使用は抗原またはマイトジエン刺戟
された正常人細胞または例えばモルモツトおよび
他の動物種から得られた動物リンパ球に比して有
利性を与える。連続培養人リンパ球は精製法に対
して充分な量で人リンホキンの再現性ある産生を
なすための信頼性のある原材料を提供する。

懸濁培養条件下にこれら人リンパ球細胞を生長
させて、信頼性ある大量のMIF抗原材料を提供す
ることは有利であると決定された。

この開発のその他の難点は、MIFに対する抗体
すなわちMIF抗原に対して高い特異性を有する抗
体の誘発を可能なさしめるためのMIF抗原の精製
であつた。フコサミン−アガロース樹脂によるア
フイニテイークロマトグラフイーによるMIF抗原
の精製が有利である。

部分精製されたMIF抗原の開発の次に、抗体産
生のための既知の方法と一般的に同様の方法によ
つて、例えばホスト（宿主）動物例えば兎、モル
モツトおよびその他の動物をアジユバント例えば
フロインドのコンプリートアジユバントと組合わ
せた少量のMIF抗原の反復注射によつて免疫する
ことによつて、この抗原に対する抗体が産生され
る。次い適当な免疫期間後にその動物内で産生さ
れた抗体を動物の血清から回収する。血清中の抗
体の存在は、寒天ゲル中の二重拡散ゲル沈殿、電
気泳動および免疫電気泳動の標準的な免疫学的技
術によつて測定される。

MIF抗原の放射能標識は本質的には当技術に既
知の標準法により実施される。 ¹²⁵I（沃素）を使
用したハンター・グリーンウツド放射能標識法が
特に有用である〔「Biochem.J.」第89巻第114頁
（1963）および同第91巻第46頁（1964）参照〕。そ
の他の同位元素例えば ¹³¹I、 ¹⁴Cおよび ³Hもま
た使用しうるが、 ¹²⁵I程には好ましくはない。

次いで拮抗的阻害法によつてMIFのRIAを実施
して抗体滴定曲線および標準阻害曲線を準備す
る。この方法においては、 ¹²⁵I放射能標識された
MIF抗原が非標識MIFと物理化学的に拮抗する。
適当な培養時間後、抗原−抗体コンプレツクス、
または結合抗原を非結合抗原から分別し、そして
そのどちらかまたは両方の放射能を測定する。

添付図面は種々の量の非標識MIF抗原による兎
の抗MIF血清と ¹²⁵I−MIFとの間の反応の阻害を
示すグラフ的表示すなわち標準曲線である。

本発明によれば、MIF抗原の好ましい人細胞材
料は、P.グレートから得られた変形リンパ球細胞
系統PGLC−33Hである。これは良く特性づけさ
れ、そして確立された細胞系統である〔「In
Vitro」第９巻第202〜15頁（1973）および「J.
Immunol.」第112巻第675〜82頁（1974）参照〕。

MIF抗原の材料として使用できるその他の確立
された人リンパ球細胞系は例えば「J.Immunol.
」第104巻第1476〜85頁（1970）および「J.
Immunol.」第108巻第494〜504頁（1972）に開示
のように周知である。

リンパ球細胞を、同化可能な窒素源、炭素源お
よび無機塩を含有する血清不含栄養培地中で約37
℃で適当な培養期間例えば24〜48時間の間生長さ
せる。好ましい培地は、RPMI−1640培地であつ
て、これはグランド・アイランド・バイオロジカ
ル・カンパニー（米国ニユーヨーク州グランドア
イランド在）（GIBCO）から入手可能であり、そ
して「In Vitro」第６巻第89〜108頁（1970）に
記載されている。次いで細胞を遠心により沈降さ
せ、そして細胞不含（セルフリー）上澄み媒体を
活性MIF抗原含有材料物質として保存する。

MIF抗原含有細胞培養上澄みを次いで数回とり
かえた大量（例えば４）の生理食塩水（0.15N
NaCl）に対して透析し、蔗糖濃縮し、そしてク
ロマトグラフイー法で分離することによつて部分
精製する。親水性、水不溶性交叉結合デキストラ
ン重合体ゲルカラムが好ましい。フアルマシア・
フアイン・ケミカルズ社（スエーデン国ウプサ
ラ）から市場的に入手可能なセフアデツクスＧ
−100がこの目的に対して特に有用なデキストラ
ン重合体ゲルである。

ゲル過からの25000の分子量分画が活性MIF
抗原分画として保有される。MIFは本性上約
25000ドルトンの分子量を有する糖蛋白（グリコ
プロテイン）であり、そしてPH9.1のアクリルア
ミドゲル電気泳動ではアルブミン含有分画と共に
移動する。

MIF抗原に対する抗体の産生においては、宿主
動物の抗MIF抗体産生を刺戟するために有効MIF
抗原の抗原性を増幅するのが有用であることが見
出されている。この目的のためには、抗原を好ま
しくはフコサミン−アガロース樹脂（イスラエル
国Miles−Yeda社より市場的に入手可能能）に結
合させる。フコサミン−アガロース樹脂とのアフ
イニテイークロマトグラフイーにおいては、MIF
抗原は樹脂に結合し、そしてこれは遠心によつて
可溶性の非結合蛋白から分離することができる。
MIF活性蛋白は、0.1Mフコーズ溶液で溶出させ
ることにより樹脂から除去することができる
〔「Immunological Communications」第３巻第
375〜89頁（1974）参照〕。

免疫法においては、好ましくは宿主動物に２〜
４週間間隔で次のようにしてフロインドのコンプ
リートアジユバント中の抗原を注射する。すなわ
ち可溶性MIF抗原を皮内に注射しそして同時にフ
コサミン−アガロース樹脂に結合したMIFを皮内
経路で注射する。

次の実施例は更に本発明を説明するものである
がしかし本発明はこの特定例またはそこに記載の
詳細に限定されるものではないことを理解された
い。

例 PGLC−33H細胞を、胎児仔牛血清を含有しな
いRPMI−1640培地（グランド・アイランド・バ
イオロジカル社製品）を使用してスピナーフラス
コ中で培養する。細胞は約５×10⁶個／mlの細胞
濃度で24〜48時間培養される。24〜48時間の培養
期間後、細胞を遠心により分離し、そして細胞の
上澄みを活性MIF抗原含有物質として保存する。

保存した上澄みを、セルロース透析チユーブに
入れ、そして15〜20の生理的食塩水（0.15N、
NaCl）に対して４℃で24〜48時間透析する。透
析した上澄みを50％蔗糖溶液中で20倍に濃縮し、
0.15N NaClに対して透析し、そして次いで次の
ようにしてMIF抗原を更に精製するために種々の
クロマトグラフイー的および電気泳動手法にかけ
る。

セフアデツクスＧ−100カラムについて既知
の分子量の純蛋白質マーカー（アルブミンでは
6900MW、卵アルブミンでは45000MW、キモト
リプシノーゲンでは25000MW、チトクロームＣ
では12400MW）を使用して標準曲線を作製す
る。透析し且つ濃縮した上澄みをこのカラムに適
用し、そして25000MWのキモトリプシノーゲン
マーカーの位置の溶出液を活性MIF抗原分画とし
て保存した。カラムに適用された全蛋白の約３％
がこの分画に回収された。この活性MIF抗原（分
子量25000分画）を ¹²³I−放射能標識の前および
後にアガロースフイルム電気泳動にかけ、そして
正常人血清電気泳動基準パターンと比較した。全
活性MIF抗原（25000MW分画）のわずかな部分
（約３〜４％）が電気泳動的にアルブミン様に移
動した。人MIFの等電点はPH4.0〜5.5の範囲であ
りこれはアルブミンに非常に近似している。MIF
の生活性は ¹²⁵I放射能標識後にクロマトグラフイ
ー的に精製された分画中に保持されていることが
見出された。

樹脂および上澄みを１晩（約15時間）４℃で混
合（バツチ法）することによつて透析細胞上澄み
中のMIFをフコサミン−アガロース樹脂に結合さ
せた。樹脂−MIFコンプレツクスを遠心により沈
降させ、そして少量（約５〜10ml）の0.1Mフコ
ースを使用して樹脂−MIFコンプレツクスの残余
のものはそのまま残留させつつMIFの一部を樹脂
から溶出させた。

雌のニユージーランド白兎（各々８〜10ポン
ド）を、２〜４週間ごとに、腹腔内的にフコサミ
ン−アガロース樹脂結合MIF抗原を与え、そして
同時に皮内に、フロインドのコンプリートアジユ
バントと共に乳化させた可溶性非結合MIF抗原
（前記精製）で免疫した〔「Ann.Rev.Microbiol.」
第１巻291頁（1947）および「Amer.J.Clin.
Pathol.」第21巻第645頁（1951）参照〕。非免疫
血清対照試料を与えるために、免疫プロトコール
開始前の兎から、そして免疫スケジユールの間規
則的間隔で兎から血液試料を採取した。すべての
兎血清の人MIFに対する抗体活性を試験した。免
疫の約70〜80日後、兎はその血清中に細胞移動バ
イオアツセー試験でMIF活性をブロツクさせうる
抗体を発現させた。予備免疫対照血清は抗MIF抗
体を含有しておらず、そして従つてMIF活性をブ
ロツクさせなかつた。

¹²⁵I−放射能標識は実質的には「Biochem.J.」
第91巻第46頁（1946）のクロラミンＴ法により実
施された。MIF抗原および ¹²⁵I−同位元素を混合
し、そして酸化剤たるクロラミン−Ｔの存在下に
約30秒間培養した。この時間の間に ¹²⁵I−同位元
素は化学的にMIF蛋白のチロシン残基の酸化ヒド
ロキシル基に結合する。メタ基亜硫酸ナトリウム
の添加はこの沃素化を停止させる。この蛋白溶液
は ¹²⁵I−標識蛋白および未反応 ¹²⁵I−同位元素を
含有しているが、後者はセフアデツクスＧ−75
樹脂上でのカラムクロマトグラフイーにより相互
に分別される。

兎抗MIF血清（１：25希釈）を ¹²⁵I−MIF生成
物（10000カウント／分）に加えた。これら条件
下には抗原−抗体結合は存在するがしかし免疫沈
降反応は生じない。すなわち〔抗体− ¹²⁵I−
MIF〕免疫コンプレツクスは存在する抗体量に比
して過剰の抗原（ ¹²⁵I−MIF）の故に完全に可溶
性である。この系に種々の量の非標識MIF（0.01
μｇ〜100μｇMIF蛋白）を加えそしてそのアツ
セー混合物を48時間４℃で培養する。第２の血
清、すなわち抗兎γ−グロブリン山羊血清をこの
系に加えそして〔兎抗MIF− ¹²⁵I−MIF〕免疫コ
ンプレツクスを溶液から沈殿させるために４℃で
48時間培養する。免疫沈殿物を遠心により集め、
そしてパツカードγ−カウンター中で（ ¹²⁵I）を
計数する。添加された非標識MIF蛋白標準の各量
に対して抗血清により結合された ¹²⁵Iのカウント
％を計算し、そしてその結果を半対数目盛を使用
してプロツトした。

RIA試験の ¹²⁵I−MIFの非特異的結合量を決定
するために、非免疫兎血清を使用した全RIA法も
また実施された。非免疫血清による非特異的結合
は有意ではなかつた（10％以下）。

前記の系を使用して得られた実際のMIF−RIA
標準曲線は添付図面に与えられている。0.1μｇ
程度の少量の非標識MIF製剤の系への添加が抗体
により結合された ¹²⁵I−MIFの％を低下させうる
ことを知ることができる。１〜10μｇMIFの間で
は、結合 ¹²⁵I−MIF％には直線的減少が存在す
る。このことはRIA試験が患者試料中の１μｇ
MIF蛋白の少量のものの測定に充分なだけの感度
を有することを示している。

本開示からすれば本発明の精神から逸脱するこ
となしに前記発明の変形が当業者には明白となる
であろうことが理解される。すべてのそのような
変形は本発明の範囲内に包含される。

【図面の簡単な説明】

添付図面は種々の量の非標識MIF抗原による兎
の抗MIF血清と ¹²⁵I−MIFとの間の反応の阻害を
示すグラフ的表示すなわち標準曲線である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 遊走阻止フアクター物質の存在を検出するに
   あたり、 (a) 未知量のMIF抗原を含有する試験溶液、 (b) 放射標識された既知量のMIF抗原、および (c) 既知量のMIFに対する抗体 を反応させ、そしてその後で得られる免疫コンプ
   レツクスを沈殿除去させ、そしてその放射能含量
   を測定することよりなり、しかも前記のMIFに対
   する抗体が組織培養条件下での人リンパ球の培養
   から得られたMIF抗原で動物を免疫することによ
   り産生されたものであることを特徴とする、方
   法。 ２ 人リンパ球細胞MIF抗原の材料が変形細胞系
   統PGLC−33Hであることを特徴とする、前記第
   １項記載の方法。 ３ MIF抗原をフコサミン−アガロース樹脂を使
   用したアフイニテイークロマトグラフイーにより
   精製することを特徴とする、前記第１項記載の方
   法。 ４ 免疫に使用するMIF抗原の実質的部分がフコ
   サミン−アガロース樹脂に結合されていることを
   特徴とする、前記第１項記載の方法。 ５ 免疫に使用されるMIF抗原がフコサミン−ア
   ガロース樹脂結合のMIF抗原の腹腔内投与と同時
   に投与される非結合形MIF抗原として皮下に投与
   されるものであることを特徴とする、前記第１項
   記載の方法。 ６ 免疫に使用されるMIF抗原が交叉結合デキス
   トランゲル重合体カラムクロマトグラフイーによ
   り精製された組織培養条件下の人リンパ球の培養
   の抽出物であることを特徴とする、前記第１項記
   載の方法。 ７ 放射能標織が ¹²⁵Iであることを特徴とする、
   前記第１項記載の方法。 ８ MIF抗原の人リンパ球細胞材料が変形細胞系
   統PGLC−33Hであり、そして免疫に使用される
   MIF抗原の実質的部分がフコサミン−アガロース
   樹脂に結合したものであることを特徴とする、前
   記第１項記載の方法。 ９ 免疫に使用されるMIF抗原が交叉結合デキス
   トランゲル重合体カラムクロマトグラフイーによ
   り精製された組織培養条件下のPGLC−33H細胞
   の培養抽出物であることを特徴とする、前記第８
   項記載の方法。 １０ 免疫に使用されるMIF抗原がフコサミン−
   アガロース樹脂結合のMIF抗原の腹腔内投与と同
   時に投与される非結合形MIF抗原として皮下に投
   与されるものであることを特徴とする、前記第９
   項記載の方法。