CN117417407A - 一种在微生物中形成可逆无膜细胞器的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种在微生物中形成可逆无膜细胞器的方法。本发明为了在宿主细胞中形成无膜细胞器，在固有无需蛋白RGG的基础上融合了人工短肽序列WRG‑1，融合1个或2个WGR‑1串联序列都可以有效促进RGG的相分离，在酿酒酵母中形成无膜细胞器，其中无膜细胞器RGG‑(WGR‑1)2具有更好的液体流动性。本发明进一步通过在RGG‑(WGR‑1)2系统中引入酶切位点x，构建RGG‑x‑(WGR‑1)2，在诱导蛋白酶表达后，实现了无膜细胞器的可逆形成。本发明的方法在定制和控制细胞功能等方面具有重要价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种在微生物中形成可逆无膜细胞器的方法，属于生物技术领域。
背景技术
通过细胞器工程提高微生物细胞工厂产物合成效率是目前常用的合成生物学手段，主要集中在改造内源性细胞器和构建人工细胞器。其中，改造内源性细胞器存在物质难以跨膜等问题，且由于无法进行组装或拆卸，难以实现对代谢网络的快速、可逆控制。而基于固有无序蛋白的液液相分离形成的无膜细胞器有效地避免了上述问题。具有动态液体流动性的无膜细胞器可以充当细胞内的化学反应器，实现物质的有限渗透，并且可以通过对化学信号的响应，实现无膜细胞器的可逆相分离。
单个固有无序蛋白RGG蛋白在酿酒酵母中很难形成无膜细胞器，通过串联表达多个RGG，可以促进RGG相分离，在酿酒酵母中形成无膜细胞器。或是通过在酿酒酵母中表达FUSN、A-IDPs等已报导固有无序蛋白形成无膜细胞器。RGG(168个氨基酸)、FUSN(216个氨基酸)、A-IDPs(175个氨基酸)等这些固有无序蛋白本身序列较长，重复串联多个固有无序蛋白可以有效提高其相分离的能力，但是由于这些固有蛋白长度较长，重复串联的构建过程较难。因此需要寻找一种新的改造内源性细胞器的方法。
发明内容
为解决上述问题，本发明通过对无膜细胞器形成过程中的蛋白序列进行改造，提高了相分离效果，得到具有较高液体流动性的无膜细胞器，并在此基础上开发了一种胞内可逆无膜细胞器的构建方法，在不同宿主细胞中实现了无膜细胞器的可逆形成。
本发明的第一个目的是提供一种在微生物中形成无膜细胞器的方法，包括以下步骤：
将用于无膜细胞器形成的蛋白序列导入宿主细胞中，其中，用于无膜细胞器形成的蛋白序列包括：氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的固有无序蛋白、位于所述固有无序蛋白下游的短肽，所述短肽为SEQ ID NO.7所示的序列或两个串联的SEQ ID NO.7序列(两个重复序列直接连接)。
进一步地，本发明中所述微生物可为任意需要在活细胞内合成蛋白质的宿主细胞，包括但不限于肠杆菌(如大肠杆菌)、酵母菌(如酿酒酵母)等。
本发明的第二个目的是提供一种在微生物中形成可逆无膜细胞器的方法，包括以下步骤：
将含有酶切位点的用于无膜细胞器形成的蛋白序列和编码切割酶的基因序列导入宿主细胞中，其中，
含有酶切位点的用于无膜细胞器形成的蛋白序列包括：氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的固有无序蛋白、位于所述固有无序蛋白下游的短肽以及位于所述固有无序蛋白与短肽之间的酶切位点，所述短肽为SEQ ID NO.7所示的序列或两个串联的SEQ ID NO.7序列；
切割酶特异性切割酶切位点。
进一步地，编码切割酶的基因序列受第一启动子调控，含有酶切位点的用于无膜细胞器形成的蛋白序列受第二启动子调控，所述第一启动子为诱导型启动子，且第一启动子与第二启动子不同，第二启动子可为诱导型启动子或组成型启动子。
进一步地，切割酶与酶切位点可根据需要任意选择，可在活细胞中实现特异性切割即可，如本发明切割酶选择TEV蛋白酶(氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示)，TEV酶的酶切位点在谷氨酰胺和甘氨酸/丝氨酸之间，因此酶切位点的序列可为SEQ ID NO.4或SEQ IDNO.6。
进一步地，含有酶切位点的用于无膜细胞器形成的蛋白序列如SEQ ID NO.2或SEQID NO.3所示。具体地，
SEQ ID NO.2：RGG-(WGR-1)1氨基酸序列
MESNQSNNGGSGNAALNRGGRYVPPHLRGGDGGAAAAASAGGDDRRGGAGGGGYRRGGGNSGGGGGGGYDRGYNDNRDDRDNRGGSGGYGRDRNYEDRGYNGGGGGGGNRGYNNNRGGGGGGYNRQDRGDGGSSNFSRGGYNNRDEGSDNRGSGRSYNNDRRDNGGDGENLYFQGMSKGPWGRGRGRGWPGVGYGY
SEQ ID NO.3：RGG-(WGR-1)2氨基酸序列
MESNQSNNGGSGNAALNRGGRYVPPHLRGGDGGAAAAASAGGDDRRGGAGGGGYRRGGGNSGGGGGGGYDRGYNDNRDDRDNRGGSGGYGRDRNYEDRGYNGGGGGGGNRGYNNNRGGGGGGYNRQDRGDGGSSNFSRGGYNNRDEGSDNRGSGRSYNNDRRDNGGDGENLYFQGMSKGPWGRGRGRGWPGVGYWGRGRGRGWPGVGYGY
本发明的第三个目的是提供一种用于构建无膜细胞器的重组蛋白，所述重组蛋白包括：氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的固有无序蛋白、位于所述固有无序蛋白下游的短肽，所述短肽为SEQ ID NO.7所示的序列或两个串联的SEQ ID NO.7序列。
本发明的第四个目的是提供一种含有无膜细胞器形成蛋白的重组菌，所述重组菌中含有上述重组蛋白。
本发明的第五个目的是提供一种用于构建可逆无膜细胞器的系统，所述系统包括两部分：含有酶切位点的用于无膜细胞器形成的蛋白序列，以及编码切割酶的基因序列，其中，
含有酶切位点的用于无膜细胞器形成的蛋白序列包括：氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的固有无序蛋白、位于所述固有无序蛋白下游的短肽以及位于所述固有无序蛋白与短肽之间的酶切位点，所述短肽为SEQ ID NO.7所示的序列或两个串联的SEQ ID NO.7序列；
切割酶特异性切割酶切位点。
进一步地，上述的两部分可分别由质粒作为载体。
本发明的第六个目的是提供一种含有可逆的无膜细胞器的重组菌，所述重组菌中含有上述系统。
本发明的第七个目的是提供一种在活细胞中制造蛋白质的方法，包括以下步骤：
在活细胞中导入上述重组蛋白或系统。
进一步地，所述活细胞为微生物细胞或动植物离体细胞(即使是干细胞，也是经伦理审查批准获得的商业化干细胞)。
本发明的第八个目的是提供上述重组蛋白或系统、重组菌在制备细胞药物或蛋白药物中的应用。具体地，用于在制药过程中的蛋白定制改造。
本发明的有益效果：
(1)本发明在固有无序蛋白RGG的基础上，进一步串联表达人工序列WGR-1后，有效增强了RGG相分离的能力，最终得到具有较高液体流动性的无膜细胞器RGG-(WGR-1)2。在体外，RGG-(WGR-1)2的流动性达到89％。相比较于现有的串联多个固有无序蛋白的长的重复序列而言，本发明的无膜细胞器系统更易于构建。
(2)本发明进一步在无膜细胞器RGG-(WGR-1)2中引入酶切位点x，构建RGG-x-(WGR-1)n，在诱导切割酶表达后，成功实现无膜细胞器的可逆形成，提供了一种方便快捷的无膜细胞器调控策略。
附图说明
图1为无膜细胞器RGG-x-(WGR-1)n-EGFP的体内验证结果。
图2为RGG-x-(WGR-1)n-EGFP无膜细胞器的体外验证结果。
图3为酿酒酵母诱导无膜细胞器系统RGG-x-(WGR-1)2-EGFP的可逆形成结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
本发明涉及的方案如下：
本发明以酵母菌作为出发菌株，考察长度仅为14个氨基酸的人工短肽序列WGR-1(SEQ ID NO.7)对RGG相分离的影响，构建RGG-(WRG-1)n-EGFP无膜细胞器(n表示重复个数)；
另外，本发明在RGG-(WRG-1)n-EGFP形成的相分离系统中引入酶切位点x，通过诱导特异性切割位点x的酶表达，构建RGG-x-(WRG-1)n-EGFP可控无膜细胞器系统。
本发明形成可逆无膜细胞器的原理如下：多价相互作用介导的液-液相分离是无膜细胞器形成的基础。蛋白酶切位点的引入可以改变多价相互作用，实现无膜细胞器的可逆形成。因此，同时向宿主细胞中导入酶切位点及其对应的酶后，诱导酶表达之前，WRG-1能够促进RGG的相分离从而形成无膜细胞器；当诱导酶表达并对酶切位点进行切割后，RGG蛋白与WRG-1短肽断开，RGG-(WRG-1)n形成的相分离系统受到破坏，无膜细胞器消失，通过此种方式可实现无膜细胞器的可控构建。
实施例1：基于人工序列RGG-x-(WGR-1)n-EGFP的酿酒酵母无膜细胞器的构建
a)人工合成基因片段RGG(氨基酸序列SEQ ID NO.1)、RGG-x-(WGR-1)(氨基酸序列SEQ ID NO.2)、RGG-x-(WGR-1)2(氨基酸序列SEQ ID NO.3)，其中x为TEV蛋白酶特异性识别酶切位点(氨基酸序列SEQ ID NO.4)，使用引物RG-F、RG-R分别扩增氨基酸序列1、2、3得到目的基因片段RG、RG1和RG2。
b)以pESC-TEF1-EGFP-CYC1质粒为模板，使用引物pESC-F、pESC-R扩增得到含有启动子TEF1、绿色荧光蛋白EGFP以及终止子CYC1的载体片段pESC。
c)将目的基因片段RG、RG1和RG2分别与pESC融合表达，得到质粒pESC-TEF1-RGG-EGFP-CYC1、pESC-TEF1-RGG-(WGR-1)1-EGFP-CYC1和pESC-TEF1-RGG-(WGR-1)2-EGFP-CYC1。
引物序列
RG-F：ATGGAATCAAATCAATCAAATAATGGCGGAA
RG-R：GCTGCCGCTGCCGCTACCATAGCCGTAGCCGACTCCAG
pESC-F：ATTATTTGATTGATTTGATTCCATGGCCGCGCTAGTTCTAGA AAACTTAG
pESC-R：GGTAGCGGCAGCGGCAGCATGAGCAAAGGAGAAGAACTT TTCACTG
实施例2：无膜细胞器RGG-x-(WGR-1)n-EGFP的体内验证
a)分别将质粒pESC-TEF1-RGG-EGFP-CYC1、pESC-TEF1-RGG-(WGR-1)1-EGFP-CYC1和pESC-TEF1-RGG-(WGR-1)2-EGFP-CYC1转化入酿酒酵母S288C中，涂布在G418抗性平板上，在30℃培养2天，得到菌株R-EGFP、RW1-EGFP、RW2-EGFP。
b)分别挑取R-EGFP、RW1-EGFP、RW2-EGFP单菌落于2mL的YPD液体培养基中，培养24h。
c)使用荧光显微镜对R-EGFP、RW1-EGFP、RW2-EGFP进行观察，观察结果如图1-A所示，RGG在酿酒酵母中不能形成聚集物，如图1-B和图1-C所示，RW1-EGFP、RW2-EGFP均在胞内形成了球状聚集物(图1-3中标尺长度均为5um)。
实施例3：基于人工序列RGG-x-(WGR-1)n-EGFP无膜细胞器的体外验证
a)使用引物ERG-F、ERG-R扩增氨基酸序列1、2、3，得到目的基因片段ER、ERG1、ERG2。
b)以pET28a-T7-His质粒为模板，使用引物pET-F、pET-R扩增，得到含有启动子T7，以及6×His标签的载体片段pET。
c)将目的基因片段ER、ERG1、ERG2分别与pET融合表达，得到质粒pET-RGG、pET-RGG-(WGR-1)1-EGFP-His和pET-RGG-(WGR-1)2-EGFP-His。
d)分别将质粒pET-RGG、pET-RGG-(WGR-1)1-EGFP和pET-RGG-(WGR-1)2-EGFP转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布在Kana抗性平板上，37℃过夜培养，得到菌株ER-EGFP-His、ERW1-EGFP-His、EWR2-EGFP-His。
e)挑取ER-EGFP-His、ERW1-EGFP-His、EWR2-EGFP-His单菌落于2mL的LB液体培养基中，培养8-10小时后，以1-5％转接至TB培养基中，培养至OD600为0.6～1时，加入终浓度为0.5mM的IPTG，于25℃培养24h。
f)使用镍柱纯化发酵液。缓冲液A为pH＝7.4的40mM的Tris-HCl(40mM，pH7.4)。缓冲液B为A液配置的500mM咪唑溶液。采用线性洗脱(0～100％缓冲液B)，收集目的样品RGG-EGFP、RGG-(WGR-1)1-EGFP、RGG-(WGR-1)2-EGFP。
g)荧光漂白恢复可用于分析蛋白凝聚物的流动性，通过将纯化后的目的样品置于激光共聚焦显微镜下进行荧光漂白恢复实验，结果如图2所示。RGG-EGFP液滴内部的荧光可恢复到未漂白前的54％(图2-A)，RGG-(WGR-1)1-EG FP可以达到65％，RGG-(WGR-1)2-EGFP最高，可达到89％，说明RGG-(WGR-1)2-EGFP液滴内部具有流动性，且流动性最好。
ERG-F：ATGGAATCAAATCAATCAAATAATGGCGGAA
ERG-R：TACACATGGCATGGATGAGCTCTACAAACACCACCACCACC ACCACTGA
pET-F：CCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCC
pET-R：TTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATATGGAATCAAATCAATCAAAT
实施例4：可逆无膜细胞器的构建
a)人工合成基因片段TEV蛋白酶(氨基酸序列SEQ ID NO.5)，使用引物TEV-F、TEV-R进行扩增，得到目的基因片段TEV。
b)以酿酒酵母S288C基因组为模板，使用引物GAL-F、GAL-R扩增得到启动子基因片段GAL；使用CYC1-F、CYC1-R引物扩增，达到终止子基因片段CYC1；使用引物UP-F、UP-R扩增得到目的基因片段1021b-UP；使用引物DOWN-F、DOWN-R扩增得到目的基因片段1021b-DOWN。
c)人工合成基因片段LOXP-LEU，使用引物LOXP-F、LOXP-R扩增得到目的基因片段LOXP。
d)将基因片段TEV、1021b-UP、1021b-DOWN、LOXP采用PCR进行融合PCR，跑胶得到的正确条带进行柱回收后得到融合基因片段1021b-GAL1-TEV-CYC1。
e)将融合基因片段1021b-GAL1-TEV-CYC1转化入实施例2中得到的菌株RW2-EGFP中，涂布在SD-His平板上，30℃培养2天，使用引物YZ-TEV-F、YZ-TEV-R进行菌落PCR，验证得到菌株TEV-RW2-EGFP。
TEV-F：GTCAAGGAGAAAAAACTATAGGTGAATCTTTATTTAAGGGT CCTCGTGACTA
TEV-R：AGTCAAGGAAGCCACTCAATTGATGAACGGGCTATTGATCA TGTAATTAGTTATGTCAC
GAL1-F：TGGCACTGGCCGTCGTTTTAACATGGCATTACCACCATATA CATATCCAT
GAL1-R：AATTGTTAATATACCTCTATACTTTAACGTCAAGGAGAAAA AACTATAGGTGAATCTTT
CYC1-F：ACTCAATTGATGAACGGGCTATTGATCATGTAATTAGTTAT GTCACGCTTACATTCACG
CYC1-R：CGTGCGTATTATCTCTTAACTCATAATGCCGGCCGCAAATT AAAGCCTTcg
UP-F：TTGGTAACAGAAGATGGCAGTATTTCCA
UP-R：GCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGGGAGATGCGACGAA TTACTGGC
LOXP-F：GCCAGTAATTCGTCGCATCTCCCAGGAAACAGCTATGACC ATGATTACGC
LOXP-R：ATGGATATGTATATGGTGGTAATGCCATGTTAAAACGACGG CCAGTGCCA
DOWN-F：GAAGGCTTTAATTTGCGGCCGGCATTATGAGTTAAGAGAT AATACGCACG
DOWN-R：GAGAAAGGACTTAATCCGTACACAATGAtt
YZ-TEV-F：AACAATGGGTTTCTGGCTGGAG
YZ-TEV-R：CCATCAATGGCTTCTAAAAGTTTTCAAAGAAGTG
实施例5：诱导无膜细胞器系统RGG-x-(WGR-1)2-EGFP的可逆形成
a)挑取实施例4中TEV-RW2-EGFP菌株的单菌落于2mL的YPD液体培养基中，在培养24h后，如图3所示，胞内已经形成了无膜细胞器；
b)在培养基中加入终浓度为20g/L的半乳糖诱导TEV蛋白酶的表达，24h后，无膜细胞器消失，实现了RGG-(WGR-1)2相分离的逆转，从而扩展了RGG-(WGR-1)2的应用普适性。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种在微生物中形成无膜细胞器的方法，其特征在于，包括以下步骤：将用于无膜细胞器形成的蛋白序列导入宿主细胞中，其中，用于无膜细胞器形成的蛋白序列包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的固有无序蛋白、位于所述固有无序蛋白下游的短肽，所述短肽为SEQ ID NO.7所示的序列或两个串联的SEQ ID NO.7序列。
2.一种在微生物中形成可逆无膜细胞器的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将含有酶切位点的用于无膜细胞器形成的蛋白序列和编码切割酶的基因序列导入宿主细胞中，其中，
含有酶切位点的用于无膜细胞器形成的蛋白序列包括：氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的固有无序蛋白、位于所述固有无序蛋白下游的短肽以及位于所述固有无序蛋白与短肽之间的酶切位点，所述短肽为SEQ ID NO.7所示的序列或两个串联的SEQ ID NO.7序列；
切割酶特异性切割酶切位点。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，编码切割酶的基因序列受第一启动子调控，含有酶切位点的用于无膜细胞器形成的蛋白序列受第二启动子调控，所述第一启动子为诱导型启动子，且第一启动子与第二启动子不同。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，含有酶切位点的用于无膜细胞器形成的蛋白序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。
5.一种用于构建无膜细胞器的重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白包括：氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的固有无序蛋白、位于所述固有无序蛋白下游的短肽，所述短肽为SEQID NO.7所示的序列或两个串联的SEQ IDNO.7序列。
6.一种含有无膜细胞器形成蛋白的重组菌，其特征在于，所述重组菌中含有权利要求5所述的重组蛋白。
7.一种用于构建可逆无膜细胞器的系统，其特征在于，所述系统至少包括两部分：含有酶切位点的用于无膜细胞器形成的蛋白序列，以及编码切割酶的基因序列，其中，
含有酶切位点的用于无膜细胞器形成的蛋白序列包括：氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的固有无序蛋白、位于所述固有无序蛋白下游的短肽以及位于所述固有无序蛋白与短肽之间的酶切位点，所述短肽为SEQ ID NO.7所示的序列或两个串联的SEQ ID NO.7序列；
切割酶特异性切割酶切位点。
8.一种含有可逆的无膜细胞器的重组菌，其特征在于，所述重组菌中含有权利要求7所述的系统。
9.一种在活细胞中制造蛋白质的方法，其特征在于，包括以下步骤：在活细胞中导入权利要求5所述的重组蛋白或权利要求7所述的系统。
10.权利要求5所述的重组蛋白、权利要求7所述的系统或权利要求6或8所述的重组菌在制备细胞药物或蛋白药物中的应用。
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