CN114831945B - 养心解郁配方颗粒、制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种养心解郁配方颗粒,包括人参、麦冬、五味子、淫羊藿、薤白、玫瑰花、合欢花、郁金、石菖蒲、青皮,所述人参、麦冬、五味子、淫羊藿、薤白、玫瑰花、合欢花、郁金、石菖蒲、青皮的重量比为3:3:3:3:3:3:3:3:3:2。本发明养心解郁配方颗粒能有效降低青少年抑郁患者的皮质醇含量,改善青少年抑郁患者抑郁样行为,增加青少年患者的体重,增加青少年抑郁患者的食欲,调节患者肠道菌群组成和机体代谢,从而治愈青少年抑郁症问题,同时,该药物对青少年成长发育无副作用。
Description
技术领域
本发明涉及中药技术领域,特别涉及一种养心解郁配方颗粒及其制备方 法。
背景技术
青少年时期是一个人身体和心理发展的高速阶段,也是出现抑郁症的最 高发阶段。
青少年抑郁症是以情绪低落为主要表现的一种精神障碍,表现形式主要 包括突然沉默寡言、学习成绩骤降、容易与他人起争执、脾气暴躁、注意力 不集中、睡眠障碍、食欲下降等,而导致青少年抑郁症原因有多种,如学习 压力、虚拟网络、经济压力、情感纠葛、心里脆弱等,青少年抑郁如果不进 行及时治疗或干预,很容易愈演愈烈,严重影响患者的健康成长,可能造成自杀等严重不良后果。
目前资料青少年抑郁症主要治疗手段为病情严重时药物治疗为主,心理 辅导为辅,待病情好转后以心理治疗为主,药物为辅,而现在的治疗抑郁症 的药物有如盐酸氟西丁胶囊适应症为抑郁发作、强迫症、神经性贪食症等, 然而该药物对青少年的抑郁副作用大,可用于青少年的抗抑郁药物种类较少, 临床应用受到一定限制,因此急需专门针对青少年抑郁症的中药。
发明内容
本发明的目的在于提供一种养心解郁配方颗粒,该颗粒通过改善肠道菌 群和代谢来治疗青少年抑郁症,效果显著、疗效可靠、副作用小。
本发明的另一个目的在于提供养心解郁配方颗粒的制备方法。
为实现上述目的,本发明提供了一种养心解郁配方颗粒,主要由以下原 料制成:人参、麦冬、五味子、淫羊藿、薤白、玫瑰花、合欢花、郁金、石 菖蒲、青皮,所述人参、麦冬、五味子、淫羊藿、薤白、玫瑰花、合欢花、 郁金、石菖蒲、青皮的重量比为3:3:3:3:3:3:3:3:3:2。
优选地,上述技术方案中,按重量计,所述颗粒的原料包括:人参9~ 30g、麦冬9~30g、五味子9~30g、淫羊藿9~30g、薤白9~30g、玫瑰花9~ 30g、合欢花9~30g、郁金9~30g、石菖蒲9~30g、青皮9~30g。
优选地,上述技术方案中,按重量计,所述颗粒的原料包括:人参9g、 麦冬9g、五味子9g、淫羊藿9g、薤白9g、玫瑰花9g、合欢花9g、郁金9g、 石菖蒲9g、青皮6g。
优选地,上述技术方案中,按重量份数计,所述辅料的原料包括:人参 30g、麦冬30g、五味子30g、淫羊藿30g、薤白30g、玫瑰花30g、合欢花 30g、郁金30g、石菖蒲30g、青皮20g。
优选地,上述技术方案中,按重量计,所述颗粒的原料包括:人参15g、 麦冬15g、五味子15g、淫羊藿15g、薤白15g、玫瑰花15g、合欢花15g、郁 金15g、石菖蒲15g、青皮10g。
本申请还提供一种养心解郁配方颗粒的制备方法,包括以下步骤:
(1)准备原料:按重量配比称取参、麦冬、五味子、淫羊藿、薤白、玫 瑰花、合欢花、郁金、石菖蒲、青皮分别冲洗晾干备用;(2)将上述原料浸 泡于8~12倍量蒸馏水中0.8~1.2h,熬到水沸后25~30min,倒出,再加6~ 9倍量的蒸馏水进行第二次煎煮,最后将两次所煮汤药混合浓缩至40ml,制 成颗粒。
本发明用到的药物原料药物机理如下:
人参:性温,味甘、微苦、微温。归脾,肺经;主治,大补元气,复脉固脱, 补脾益肺,生津,安神。用于体虚欲脱、肢冷脉微、脾虚食少、肺虚喘咳、津 伤口渴。
苍术:性味,性微寒,味甘、味微苦,归经入肺经、心经、胃经(脏腑 归属:归肺经、心经、胃经中药)。
五味子:性味归经,性温,味酸、甘。归肺经、心经、肾经;功效,收 敛固涩、益气生津、补肾宁心。属收涩药分类下的敛肺涩肠药,五味子有促 进机体免疫功能与作用;抗氧化及抗衰老;护肝、诱导肝脏药物代谢酶;镇 咳祛痰,抗肿瘤;降血糖;强心;增强机体适应能力;抗溃疡;抗肾病变; 抗菌等作用。据报导,五味子煎剂静脉注射,对正常兔子都有呼吸兴奋作用,使吸收加深、加快,并能对抗吗啡的呼吸抑制作用,酊剂亦有同样效果。
淫羊藿:性味归经:辛、甘,温。归肝、肾经,补肾壮阳,祛风除湿, 用于肾虚阳痿、腰膝无力,风寒湿痹,筋骨酸痛
薤白:味与归经:味辛、苦,温。归肺、心、胃、大肠经;功能主治, 通阳散结,行气导滞。用于胸痹心痛,脘腹痞满胀痛,泻痢后重。
玫瑰花:性味归经是甘、微苦、性温,主要归肝经和脾经。玫瑰花的功 效主要是疏肝解郁,行气活血和止痛。一般适用于肝气犯胃的胸胁、脘腹胀 痛,呃逆食少、肝郁气滞之月经不调,及经前乳房胀痛、跌打损伤,瘀血肿 痛等。
合欢花:性味甘,平,舒郁、理气、安神、活络、养血、滋阴肾、清心 明目,合欢花含有合欢甙,鞣质,解郁安神,滋阴补阳,理气开胃,活络止 痛,用于心神不安、忧郁失眠。治郁结胸闷,失眠,健忘,风火眼,能安五 脏,和心志,悦颜色,有较好的强身、镇静、安神、美容的作用,也是治疗 神经衰弱的佳品。也具有清热解暑,养颜祛斑解酒等功效。
郁金:性味归经:辛、苦,寒。归心、肝、胆经;功效:活血止痛,行 气解郁,清热凉血,清心开窍,利湿退黄;主治:用于胸胁疼痛,月经不调, 癥瘕痞块,吐血,衄血,妇女倒经,温病神昏,痰热癫痫,温热黄疸。
石菖蒲:性味,性温,味辛;归经,入心经、胃经;功效,祛痰开窍, 化湿开胃,宁神益智;主治,用于神志昏迷,惊悸,失眠,痴呆,健忘,胸 腹胀痛,风寒湿痹,疥癣。
青皮:性味与归经,苦、辛,温。归肝、胆、胃经;功能主治,疏肝破 气,消积化滞。用于胸胁胀痛,疝气疼痛,乳癖,乳痈,食积气滞,脘腹胀 痛。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
本发明养心解郁配方颗粒有效降低青少年抑郁患者的皮质醇含量,减少 青少年患者的抑郁样行为,改善青少年患者的食欲,增加青少年患者的体重, 调节青少年患者的肠道菌群结构和机体代谢,从而治愈青少年抑郁症,同时, 该药物对青少年成长发育无副作用。
说明书附图
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实 施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面 描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲, 在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图示出的结构获得其他的 附图。
图1为本申请养心解郁方配方颗粒可改善抑郁模型大鼠食欲、增加抑郁模型大鼠的体重;
图2为本申请养心解郁方配方颗粒可提高抑郁模型大鼠的糖水偏嗜度;
图3为本申请养心解郁方配方颗粒可提高抑郁模型大鼠的自发行为活动 次数;
图4为本申请养心解郁方配方颗粒可降低抑郁模型大鼠在强迫游泳中的 不动时间(s);
图5为本申请养心解郁方配方颗粒可降低抑郁模型大鼠血清中的皮质醇 含量;
图6及图7分别为本申请正离子模式下BPI图和负离子模式下BPI图;
图8为本申请不同组别大鼠盲肠内容物样本稀释曲线图;
图9为本申请不同组别大鼠肠道微生物多样性;
图10为本申请不同组别大鼠肠道微生物组成PCoA分析;
图11为本申请不同组别大鼠肠道微生物门水平群落柱形图(注:横坐标 /纵坐标为样本名,纵坐标/横坐标为物种在该样本中所占的比例,不同颜色 的柱子代表不同的物种,柱子的长短代表该物种所占比例的大小);
图12为本申请不同组别大鼠肠道微生物属水平群落柱形图(注:横坐标 /纵坐标为样本名,纵坐标/横坐标为物种在该样本中所占的比例,不同颜色 的柱子代表不同的物种,柱子的长短代表该物种所占比例的大小);
图13为本申请不同组别之间物种差异分析。
具体实施方式
下面结合具体实施例,对本发明的具体实施方式进行详细描述,但应当 理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
实施例1
一种养心解郁配方颗粒,按重量计,所述颗粒的原料包括:人参9g、麦 冬9g、五味子9g、淫羊藿9g、薤白9g、玫瑰花9g、合欢花9g、郁金9g、石 菖蒲9g、青皮6g。
一种养心解郁配方颗粒的制备方法,包括以下步骤:
(1)准备原料:按重量配比称取参、麦冬、五味子、淫羊藿、薤白、玫 瑰花、合欢花、郁金、石菖蒲、青皮分别冲洗晾干备用;
(2)将上述原料浸泡于8~12倍量蒸馏水中0.8~1.2h,熬到水沸后25~ 30min,倒出,再加6~9倍量的蒸馏水进行第二次煎煮,最后将两次所煮汤 药混合浓缩至40ml,制成颗粒。
本发明养心解郁配方颗粒,使用方法为每次1份,每日两次。
实施例2
本实施例与实施例1的制备方法基本相同,不同在于养心解郁配方颗粒 中的原料重量不同。
按重量计,所述颗粒的原料包括:人参9g、麦冬9g、五味子9g、淫羊 藿9g、薤白9g、玫瑰花9g、合欢花9g、郁金9g、石菖蒲9g、青皮6g。
实施例3
本实施例与实施例1的制备方法基本相同,不同在于养心解郁配方颗粒 中的原料重量不同。
按重量计,所述颗粒的原料包括:人参30g、麦冬30g、五味子30g、淫 羊藿30g、薤白30g、玫瑰花30g、合欢花30g、郁金30g、石菖蒲30g、青皮 20g。
实施例4
本实施例与实施例1的制备方法基本相同,不同在于养心解郁配方颗粒 的原料重量不同。
按重量计,所述颗粒的原料包括:人参15g、麦冬15g、五味子15g、淫 羊藿15g、薤白15g、玫瑰花15g、合欢花15g、郁金15g、石菖蒲15g、青皮 10g。
实施例5
本实施例与实施例1的制备方法基本相同,不同在于养心解郁配方颗粒 中的原料重量不同。
按重量计,所述颗粒的原料包括:人参15g、麦冬15g、五味子15g、淫 羊藿15g、薤白15g、玫瑰花15g、合欢花15g、郁金15g、石菖蒲15g、青皮 10g。
实施例6
本实施例与实施例1的制备方法基本相同,不同在于养心解郁配方颗粒 中的原料重量不同。
按重量计,所述颗粒的原料包括:人参27g、麦冬27g、五味子27g、淫 羊藿27g、薤白27g、玫瑰花27g、合欢花27g、郁金27g、石菖蒲27g、青皮 18g。
为了证明本发明颗粒的有效性,做了以下研究,具体如下:
第一、养心解郁方对慢性不可预测轻度应激青少年大鼠模型的抗抑郁作用研究
1实验目的
通过慢性不可预测轻度应激模式建立青少年抑郁症模型大鼠,以期探索 养心解郁配方颗粒对青少年抑郁症模型大鼠的改善作用及其相关机制。
2实验材料
2.1实验动物
健康青少年Sprague~DawLey雄性大鼠(约50g)90只,购自广西医科 大学实验动物中心(实验动物生产许可证:SCXK桂2020~0003;实验动物 使用许可证:SYXK桂2020~0004),饲养在标准12h光/暗循环的房间内, 适应性喂养一周。给予适量的饮用水和鼠粮,垫料一天一换,保持环境干净。动物房的温度和湿度分别维持在22±3℃和55±15%。动物实验程序符合《动 物实验管理条例》。
2.2实验药材和试剂
采用本申请实施例4的养心解郁配方颗粒。盐酸氟西丁胶囊(Patheon France,法国,批号:21201A),皮质醇试剂盒(上海酶联生物科技有限公司, 12/2021)。
2.3实验仪器
电子天平(EL602,梅特勒~托利多仪器(上海)有限公司);超纯水制 造系统MiLLi~Q(美国MiLLipore公司);自制束缚装置;自制旷场箱;自 制游泳池;一字夹;高速离心机(上海知信实验仪器技术有限公司);酶标仪 (Multiskan FC,Thermo)。
3实验方法
3.1实验动物分组及给药方法
将所有大鼠适应性喂养7天后,随机分成6个组,每组15只:空白组、 模型组、阳性药组、养心解郁配方颗粒高剂量组、养心解郁配方颗粒中剂量 组、养心解郁配方颗粒低剂量组,造模前一周开始给药,阳性药组给予盐酸 氟西汀,剂量为2.1mg/kg,养心解郁配方颗粒高中低剂量分别为2.1g/kg、 1.05g/kg、0.525g/kg,空白组和模型组给予相应体积的蒸馏水,给药体积为 0.01ml/g。
3.2慢性不可预测轻度应激模型的构建
慢性不可预测轻度应激(CUMS)建立的抑郁症模型大鼠是一种经典造模方 式,也是目前国际上认同度较为普通的抑郁模型,CUMS模拟了社会人抑郁后 出现的快感缺失,活动减少等核心症状,其采用的刺激因子与社会人在平时生活中所经历到的应急事件也更接近且模型稳定,能有效模拟抑郁症的临床 症状。故本课题选用慢性不可预测轻度应激进行模型制备。在整个实验过程 中,空白组大鼠不给予任何刺激,模型组及各给药组的大鼠均应单笼饲养, 且同时给予不同的连续5周(共35天,从开始实验第7天给予刺激)的慢性 不可预测轻度应激刺激,每天1~2种刺激,每天更换不同的刺激方式,三天 内不重复且无规律。具体刺激方式包括45°倾斜笼子24小时,束缚2小时, 禁水24小时,禁食24小时,夹尾5分钟,潮湿垫料24小时,冷水游泳5分钟,明暗颠倒及整夜光照等,每种刺激至少重复3次,具体安排见表1。
表1慢性不可预知刺激方式及安排时间
具体操作如下:禁食24小时:禁食后给予少量碎食;
夹尾10分钟:用一字夹夹在大鼠尾部1厘米处,保持10分钟;
明暗颠倒:夜间开灯,白天拉窗帘保持黑暗;
笼倾斜24小时:45度倾斜;
冷水游泳5分钟:在冷水中加入少量的冰,使水温保持在10℃以下,游 泳5分钟;
束缚3小时:自制束缚装置,把大鼠装在装置内,两端开口,一端给大 鼠呼吸,另一端与大鼠尾巴捆绑在一起,使大鼠不能自由进出束缚装置和弯 曲身体;
潮湿垫料24小时:200ml水/100g垫料;
禁水24小时:禁水后给予空瓶刺激1小时;摇晃鼠笼15分钟:强度以 大鼠不能站稳为准;
整夜照明:连续照明36小时。
表2慢性不可预知刺激时间安排
3.3体重变化
造模期间每天用电子秤称量并记录各组大鼠的体重,观察记录大鼠体重 改变情况。
3.4慢性不可预测轻度应激模型的行为学指标测定
3.4.1糖水偏嗜度试验
糖水偏好实验在造模前先进行为期三天的糖水训练,每个笼子放置两个 相同大小的瓶子,一个瓶子装入清水,一个瓶子装入1%的糖水,使大鼠适应放 置两个饮水瓶的饲养环境。第一天两瓶均为1%的糖水,第二天换成一瓶1%糖 水,一瓶清水,隔2h交换瓶子的位置,防止其形成习惯性记忆,第三天为禁 食禁水。24h后进行测试,同时给予大鼠一瓶清水和一瓶1%蔗糖水,经过大 鼠饮用1h以后,取下两个瓶子,需要注意的是在测试前放置瓶子和测试结束 后取下瓶子时要轻拿轻放,避免人为因素造成液体漏出。然后称量1h后的瓶子重量(g),测试前和测试后的重量差就是大鼠所消耗的糖水与纯水量,用糖水消耗量/(糖水+清水消耗量)来表示大鼠消耗糖水的百分比。
3.4.2旷场试验
旷场实验是在大鼠造模35d后,每次把一只大鼠放到自制的旷场箱内, 进行旷场实验。为避免大鼠受外界影响,箱子底面和四壁均为PC不透明材质, 旷场箱的面积尺寸为50×50cm,内绘制有尺寸为5×5cm的小方格,共100 个,测试当天,在一个安静的房间内,轻轻将大鼠放置在底部中心方格内,首先让大鼠适应其陌生环境1min,然后用摄像头记录大鼠在5min内的自主 活动,包括水平穿格次数(前肢和其中一只后肢同时越过方格线算1次)和 垂直站立次数(前肢离开箱子底面算1次)。每次实验结束后,用75%酒精溶 液彻底擦拭观察箱的底部,以消除之前动物留下的气味痕迹。
3.4.3强迫游泳试验
强迫游泳实验是将实验大鼠放入一个高为50cm,直径为30cm的相对比较 狭窄局限的圆柱形容器内,确保大鼠在挣扎游动时四肢触碰不到容器底部, 使大鼠处于深水环境中拼命向上挣扎试图逃离却又无法逃离的环境中,四肢 不动或者两前肢轻微浮动(身体不动)即视作大鼠的不动时间。测试时前1min 不计时,记录后5min内的不动时间,将水的温度控制在24℃左右为宜,每测 试完一只大鼠后,需重新更换干净的水再进行下一只的试验,以避免上一只的排泄物造成水质变化而对下一只大鼠造成干扰影响测试结果。每只大鼠游泳结束后需及时用毛巾将其擦干,并置于温暖环境中,避免大鼠受凉。
3.5皮质醇含量的测定
3.5.1血液样本采集和处理
血液样本采集在行为学实验测试之后进行,通过腹腔注射20%乌拉坦溶 液将大鼠麻醉,并马上进行腹主动脉取血,血液样本采集于5mL无抗凝剂的 真空采血管中,静置于室温下2h,在4℃,3000rpm条件下离心10min, 收集上层的血清并分装于新的离心管中,置于~80℃冰箱保存。
3.5.2血清中皮质醇含量的测定
根据皮质醇检测试剂盒提供的说明书进行操作。具体操作如下:(1)标 准品的加样:设置标准品孔和样本孔,标准品孔各加不同浓度的标准品 50μL。(2)加样:分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各 步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液 40μl,然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于 酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀。(3)加酶:每孔加入酶标 试剂100μl,空白孔除外。(4)温育:用封板膜封板后置37℃温育60分钟。 (5)配液:将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。(6)洗涤:小心 揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30秒后弃去,如此重复5次,拍干。(7)显色:每孔先加入显色剂A50μl,再加入显色剂 B50μl,轻轻震荡混匀,37℃避光显色15分钟。(8)终止:每孔加终止液 50μl,终止反应(此时蓝色立转黄色)。(9)测定:以空白孔调零,450nm波 长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定在加终止液后15分钟以内进行。
3.6数据分析
所有数据统计分析均使用SPSS 20.0软件进行,数据用平均值±标准差使用绘图统计软件GraphPad Prism 9.0进行图形演示。多 组间的数据比较采用单因素方差分析(one~way ANOVA),使用Levene分析 进行方差齐性检验,若数据显示方差齐,使用最小显著性差异检验(LSD~t) 进行统计分析;若数据显示方差不齐,则使用Dunnett’s T3进行统计分析 以P<0.05被认为具有显著性统计学差异,P<0.01被认为具有极显著性统 计学差异。
4实验结果与讨论
4.1养心解郁配方颗粒对青少年抑郁症模型大鼠体重的影响
在临床中发现,抑郁症患者除了情绪低落、面容憔悴等典型症状外,常 常也表现出食欲下降,体型渐瘦,体重减轻。因此,本实验对大鼠在不同阶 段的体重也进行了观察和记录。结果见图1(*p<0.05vs空白组,#p<0.05vs模 型组)所示,在造模前,各组大鼠体重无明显差异。经过5周刺激后,造模各组大鼠体重均显著性低于空白组。与模型组比较,养心解郁配方颗粒治疗组 和阳性药组大鼠体重显著性增加。同时,发现在每次添加鼠粮时给药组也表 现出更强的进食欲望。
4.2养心解郁配方颗粒对青少年抑郁症模型大鼠行为学的影响
4.2.1糖水偏嗜度试验结果
快感缺失是抑郁症患者其中一个重要的临床表现。糖水偏好试验是根 据啮齿类动物对甜味溶液有独特嗜好的天性而设计的行为学方法,通过检测 实验大鼠糖水饮用量占总饮用量的百分比来评价其快感缺失的程度。而快感 缺失导致的糖水消耗百分比下降被认为是抑郁模型大鼠的核心症状,可以很 好的反映出大鼠的抑郁程度。研究者对不同阶段的大鼠进行糖水偏好测试后发现(见图2,*p<0.05vs空白组,#p<0.05vs模型组),在没有给予大鼠 应激前,各组大鼠对糖水的偏好度无明显改变;经过5周应激后,与空白组 对比,模型组、低剂量组和中剂量组大鼠对糖水偏好度明显下降,表明通过 应激可降低大鼠对糖水的兴趣,而且低剂量和中剂量的养心解郁配方颗粒并 没有显著性改善大鼠对糖水的兴趣,造成快感缺失;高剂量组和阳性药组在与模型组比较时,大鼠对糖水偏好有了明显提升,提示以上用药组可以改善 抑郁大鼠的快感缺失程度。
4.2.2旷场试验结果
旷场试验是用于观察实验大鼠处于一个陌生的新环境后自发表现的行为 活动及探索意识,对抑郁大鼠而言,其精神状态的异常使其快感缺失并导致 在陌生环境中自发行为活动减少以及好奇的探索意识降低,以此来对抑郁模 型动物的抑郁程度进行评价。根据图3(a~垂直得分,b~水平得分。*p< 0.05vs空白组,#p<0.05vs模型组)测试结果显示,没有给予大鼠应激前,各组大鼠的运动得分和一般情况相差无异;经过造模后,各造模组大鼠 在旷场试验中表现出自我清洁意识较差,排泄物也相对增加,其水平得分和 垂直得分均明显低于空白组大鼠;在经过给药处理后,水平得分和垂直得分 相比模型组均有了明显增加,自我清洁意识增加,排泄物较之前减少,提高 了大鼠在陌生环境下的自发探索好奇度和活动频率,一定程度上改善了其抑 郁样行为。
4.2.3强迫游泳试验结果
强迫游泳作为评估抑郁模型动物的实验方法,己广泛应用于抗抑郁药物 的筛选。该实验方法是通过将实验大鼠放于圆柱形水环境中,使其后肢无法 触碰底部,又无法逃离水环境的行为学实验。随着时间延长,大鼠会因无法 逃离厌恶的水环境而表现出绝望状态,在通过一段时间的挣扎后,大鼠会渐 渐失去反抗,四肢的挣扎减弱或停止而漂浮于水面,即为不动时间。根据测试结果显示(见图4,*p<0.05vs空白组,#p<0.05vs模型组),造模前, 各组大鼠的在强迫游泳中的不动时间无明显差异;经过5周应激造模后,模 型组大鼠在强迫游泳测试中表现的绝望状态更为显著,水中挣扎持续时间减 少,其不动时间均明显长于空白组;在经过给药后,大鼠不动的时间于模型 组对比均有了明显缩短,挣扎时间延长,对求生欲望明显增强,说明养心解郁配方颗粒改善了其抑郁绝望程度。
4.3皮质醇含量
血清中皮质醇含量的测定是从病理生理学层面对评价模型的指标之一。 研究发现下丘脑~垂体~肾上腺轴(HPA)功能亢进是抑郁症患者常见的神经 生物学异常表现之一,当HPA持续兴奋,促使皮质醇为主的糖皮质激素过度 释放,过多的糖皮质激素具有明显的神经毒性。图5(*p<0.05vs空白组, #p<0.05vs模型组)表示各组大鼠血清中皮质醇的含量水平,从图中可知,模型组大鼠血清中皮质醇含量较空白组大鼠显著增高;高剂量组大鼠和阳性 药组大鼠血清中皮质醇水平趋于空白组,与模型组比较均具有显著性差异; 低剂量组和中剂量组大鼠血清中的皮质醇水平也明显低于模型组,说明养心 解郁配方颗粒可降低抑郁模型大鼠血清中的皮质醇含量。
第二、养心解郁配方颗粒的表征结果
1.1仪器
超纯水制造系统Milli~Q(美国Millipore公司);电子天平(宁波市 鄞州华丰电子仪器厂);旋转蒸发仪(R~1001~VN,郑州长城科工贸有限公 司);液体加热器(L50A6,潮州市一壶百饮电器有限公司);UPLC AcquityTM超高效液相色谱系统(Waters Corp,Milford,MA/USA),ACQUITY UPLC HSS T3 C18 column(100mm×2.1mm,1.8μm i.d.,Waters,USA);XEVO G2~ S Q~TOF MS质谱分析仪(Waters Corp.,Manchester,UnitedKingdom)。
1.2试药
实施例2的养心解郁配方颗粒
2实验方法
2.1样品制备
用开水冲泡配方颗粒,制成含生药1.5g/ml药液。将所得分别用蒸馏水 稀释10倍、100倍、1000倍,0.22μm滤膜过滤,待测。
2.2质谱条件
质谱分析在装备电喷雾离子源(ESI)的XEVO G2~S QTOF MS质谱分析 仪(WatersCorp.,Manchester,United Kingdom)。质谱检测参数设置为: 碰撞电压(capillaryvoltage),3.0kV(负离子:1.8kV);样本孔及提 取锥孔电压(sample and extraction conevoltage),40V(负离子:40V) 和4.0V;脱溶剂气速度及温度(desolvation gas rate andtemperature),600L/h和350℃(负离子:150℃);锥孔气流速度(cone gas rate),50L/h;离子源温度(source temperature),100℃(负离 子:100℃);扫描时间(scan time),0.2s;扫描间隔延迟(interscan delay),0.02s.选用亮氨酸~脑啡肽(正离子模式下质荷比:556.2771, 负离子模式下质荷比:554.2615)作为实时校正物质,其浓度与流速分别为:500ng/ml及10μl/min。一级质谱数据质荷比采集范围为100~1500,二级 质谱数据质荷比采集范围为50~1500。
2.3色谱条件
样本的色谱分析在超高效液相色谱分析系统(Waters)中进行,柱温:30℃, 流动相分别为1%甲酸水(A)和乙腈(B),洗脱条件为:0~0.5min:98%A; 0.5~5.0min:98%~70%A;5.0~15.0min:70%~60%A;15.0~20.0min: 60%~40%A;20.0~21.0min:40%~15%A;21.0~23.0min:15%~60%A;24.0~ 25.0min:60%~98%A。
3实验结果
请参见图表3和表4,该结果表明该抗抑郁药的有效性与以下正离子和负 离子成分有关,通过这些成分可有效治疗青少年的抑郁症。
表3正离子模式鉴定结果
表4负离子模式鉴定结果
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第三、养心解郁配方颗粒改善肠道菌群和代谢的实验
1.样本信息
表5样本信息
2.实验方法
2.1. 16S rRNA测序实验流程
环境样品DNA抽提->设计合成引物接头->PCR扩增与产物纯化->PCR产 物定量均一化->构建PE文库->Illumina测序
(1)DNA抽提
完成基因组DNA抽提后,利用1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA。
(2)PCR扩增
①按指定测序区域,合成带有barcode的特异引物。②为保证后续数据 分析的准确性及可靠性,需满足两个条件,1)尽可能使用低循环数扩增;2) 保证每个样本扩增的循环数一致。随机选取具有代表性的样本进行预实验,确保在最低循环数中使绝大多数样本能够扩增出浓度合适的产物。③PCR采 用TransGen AP221-02:TransStart Fastpfu DNAPolymerase;④PCR仪:ABI 9700型;⑤全部样本按照正式实验条件进行,每个样本3个重复, 将同一样本的PCR产物混合后用2%琼脂糖凝胶电泳检测,使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)切胶回收PCR产物,Tris_HCl洗脱;2%琼脂 糖电泳检测。
(3)荧光定量
参照电泳初步定量结果,将PCR产物用QuantiFluorTM-ST蓝色荧光定 量系统(Promega公司)进行检测定量,之后按照每个样本的测序量要求,进 行相应比例的混合。
(4)Miseq文库构建
①通过PCR将Illumina官方接头序列添加至目标区域外端;②使用凝胶 回收试剂盒切胶回收PCR产物;③Tris-HCl缓冲液洗脱,2%琼脂糖电泳检测;④ 氢氧化钠变性,产生单链DNA片段。
试剂:TruSeqTM DNA Sample Prep Kit
(5)Miseq测序
①DNA片段的一端与引物碱基互补,固定在芯片上;
②以DNA片段为模板,芯片上固定的碱基序列为引物进行PCR合成,在 芯片上合成目标待测DNA片段;
③变性、退火后,芯片上DNA片段的另一端随机与附近的另外一个引物 互补,也被固定住,形成“桥(bridge)”;④PCR扩增,产生DNA簇;⑤DNA 扩增子线性化成为单链。⑥加入改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的dNTP,每次循环只合成一个碱基;⑦用激光扫描反应板表面,读取每条模板 序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类;⑧将“荧光基团”和“终止基团” 化学切割,恢复3'端粘性,继续聚合第二个核苷酸;⑨统计每轮收集到的荧 光信号结果,获知模板DNA片段的序列。
2.2.生物信息分析流程
Miseq测序得到的PE reads首先根据overlap关系进行拼接,同时对序 列质量进行质控和过滤,区分样本后进行OTU聚类分析和物种分类学分析, 基于OTU可以进行多种多样性指数分析,基于OTU聚类分析结果,可以对OTU 进行多种多样性指数分析,以及对测序深度的检测;基于分类学信息,可以 在各个分类水平上进行群落结构的统计分析。在上述分析的基础上,可以对 多样本的群落组成和系统发育信息进行多元分析和差异显著性检验等一系列 深入的统计学和可视化分析。
2.3. 1H NMR样本前处理
粪便样本:取解冻后的粪便100mg至10mL EP管中,加入10倍体积(1 mL)的PBS缓冲液(pH=7.4),冰水浴上匀浆,每次研磨15s,共进行2次, 中间暂停10s,混合物漩涡1min,冰水浴超声30min,离心去沉淀(14000 g,15min,4℃),取450μL上清液至新的1.0mL EP管,加入50μL的TSP 氘带水溶液(2mg/ml),漩涡1min,转移至直径5mm的核磁管中待分析。
尿液样本:取解冻后的尿液500μL至2mL EP管中,离心去沉淀(3500 rpm,15min,4℃),取450μL上清液至新的1.0mL EP管,加入50μL的PBS 缓冲液(pH=7.4),漩涡1min,离心去沉淀(12000rpm,15min,4℃), 取450μL上清液至新的1.0mL EP管,加入50μL的TSP氘带水溶液(2 mg/ml),漩涡1min,转移至直径5mm的核磁管中待分析。
血清样本:取解冻后的血清250μL至2mL EP管中,加入250μL的PBS 缓冲液(pH=7.4),漩涡1min,离心去沉淀(14000g,15min,4℃),取450 μL上清液至新的1.0mL EP管,加入50μL的TSP氘带水溶液(2mg/ml), 漩涡1min,转移至直径5mm的核磁管中待分析。
2.4. 1H NMR样本检测
样本的1H NMR分析在600M核磁共振波谱仪(Bruker)中进行,测试温 度为25℃,粪便与血清测试为CPMGpr1d Bruker标准序列扫描次数为64次。 尿液为NOSEY gppr1dBruker标准序列,扫描次数为32次,固定接收器增益, 弛豫延迟5s,光谱宽度为20ppm,以0.3Hz线宽进行处理。
2.5. 1H NMR数据处理
使用MestReNove软件对原始数据进行将TSP峰定为0ppm,剪切水峰(粪 便(4.24-6.00ppm),尿液(4.28-6.00ppm),血清(4.12-7.08ppm)),基 线和峰提取、峰积分自动化调整。为了减少基线噪音被识别为变量信息,随 后进行总面积归一化,并相隔0.04ppm进行峰面积切分,导出.txt格式文件, 同时采用已鉴定的部分作为待筛选差异物质的变量,编辑好固定格式导入 SIMCA-P 14.1软件进行多元统计学分析,包括主成分分析(Principalcomponent analysis,PCA),最小偏二乘判别分析(Partial least squares-discriminantanalysis,PLS-DA)和正交偏最小二乘判别分析(Orthogonal partial least squares-discriminant analysis,OPLS-DA)。 对于所建立的用于潜在生物标记物筛选的OPLS-DA数学模型,经过200次置 换检验确认模型不存在过拟合后,以变量重要性投影(Variableimportance on projection,VIP)绝对值>1及p<0.05为标准,在导出的结果中进行潜 在生物标记物筛选,使用MestReNove软件导出.mnova格式文件,利用 Chenomx NMR suite8.6软件对不同ppm下的峰进行鉴定,并利用化合物上的1H-1H耦关系与2D核磁共振图谱1H-1H COSY耦合信息对鉴定结果进行验证。
3.统计学分析
使用SPSS Statistical 23.0进行统计学差异分析。基于未配对独立样 本t检验(用于两组之间的比较)或单因素方差分析(用于三组之间的比较); 数据分布不符合正态性则使用秩和检验。所有结果在p<0.05时均认为具有 统计学意义。
实验结果
1. 16S rRNA测序结果
1.1.分类学分析结果
对OTU进行物种分类学注释,并统计各OTU注释结果在每个样本中对应 的丰度信息;稀释曲线是从样本中随机抽取一定数量的序列,统计这些序列 对应样本的Alpha多样性指数,以抽取的数据量为横坐标,以Alpha多样性 指数值为纵坐标绘制曲线,根据曲线是否达到平缓来判断本次测序数据量是 否足够。
请参照图8提示,空白组、模型组和养心解郁配方颗粒给药高剂量组大 鼠盲肠内容样本的稀释曲线逐渐平缓表明本次测序样本量是达到16S r RNA 测序要求。
1.2.肠道微生物多样性结果
Alpha多样性是指一个特定区域或者生态系统内的多样性,常用的度量标 准有Chao、Shannon、Simpson指数分析。图9展示的是空白组、模型组和养 心解郁配方颗粒给药高剂量组肠道微生物多样性的情况。图9A为Shannon指 数图(微生物多样性指标)养心解郁配方颗粒高剂量组和模型组相比显 著性升高,图9B(Chao 1指数,微生物丰富度指标)空白组和模型组以 及养心解郁配方颗粒高剂量组和模型组相比均有显著性升高,图9C为Simpson指数(微生物多样性指标)空白组和模型组以及养心解郁配方颗粒高剂量组和模型组相比均无显著性变化。
Beta多样性分析通过对不同生境或微生物群落间的物种多样性进行组间 比较分析,探索不同分组样本间群落组成的相似性或差异性。PCoA分析,即 主坐标分析(Principal co-ordinates analysis),是一种非约束性的数据 降维分析方法,与PCA分析类似。X轴和Y轴表示两个选定的主坐标轴,百分比表示主坐标轴对样本组成差异的解释度值;X轴和Y轴的刻度是相对距离, 无实际意义;不同颜色或形状的点代表不同分组的样本,两样本点越接近, 表明两样本物种组成越相似。从PCoA分析图(图10)可以看出空白组、模型 组和养心解郁配方颗粒给药高剂量组大鼠的肠道微生物组成是有不同的,表示抑郁症大鼠的肠道微生物组成和正常大鼠的发生了明显的改变,给予养心 解郁配方颗粒后大鼠的肠道微生物组成发生了一定的变化。
1.3.物种组成分析结果
在不同分类学水平上统计各样本的物种丰度,通过柱状图、热图一系列 可视化方法直观研究群落组成。根据群落Bar图,可以直观呈现两方面信息: (1)各样本在某一分类学水平上含有哪些优势物种;(2)样本中各优势物种的 相对丰度(所占比重)。在属水平上观察不同组别大鼠肠道微生物柱形图,图11 提示在空白组、模型组和养心解郁配方颗粒给药高剂量组大鼠的肠道微生物 中丰度最大的菌为Firmicutes和Bacteroidota。模型组大鼠与空白组大鼠及养心解郁配方颗粒给药高剂量组大鼠相比,Firmicutes/Bacteroidota(F/B) 的比值明显下降。这也表明抑郁症会导致F/B的比值下降,经过给予养心解 郁配方颗粒会有一定回调F/B比值的能力。
请参阅图12,在属水平上观察不同组别大鼠肠道微生物群落柱形图,我 们可以看出丰度较大的优势菌有Lactobacillus、Romboutsia、 norank_f__Muribaculaceae、Escherichia-Shigella。模型组大鼠与空白组和配方颗粒高剂量给药组相比,Lactobacillus和Romboutsia的丰度是降低 的,表明模型组大鼠产生抑郁的情况后,这两个菌有降低的趋势,并在配方 颗粒高剂量给药后有回调的趋势。同时,模型组大鼠与空白组和配方颗粒高 剂量给药组相比,norank_f__Muribaculaceae和Escherichia-Shigella的丰度升高,并在配方颗粒高剂量给药后有下调的趋势。
通过可视化圈图反映了每个(或组)样本中优势物种分布比例,以及各 优势物种在不同样本(分组)中分布比例。Circos样本与物种关系图中,小 半圆(左半圈)表示样本中物种组成情况,外层彩带的颜色代表的是来自哪一分组,内层彩带的颜色代表物种,长度代表该物种在对应样本中的相对丰 度;大半圆(右半圈)表示该分类学水平下物种在不同样本中的分布比例情 况,外层彩带代表物种,内层彩带颜色代表不同分组,长度代表该样本在某 一物种中的分布比例。
1.4.物种差异分析结果
基于样本中群落丰度数据,运用统计学方法检测不同组(样本)微生物 群落中表现出的丰度差异的物种,进行假设性检验,评估观察到的差异的显 著性。X轴代表不同的分组,不同颜色的箱子表示不同的分组,Y轴代表某一物种在不同分组中的平均相对丰度。图13提示空白组和模型组之间的大鼠的 差异物种为Lactobacillus、norank_f__Muribaculaceae、Escherichia-Shigella、 norank_f__norank_o__Clostridia_UCG-014、Desulfovibrio、UCG-005、 Bifidobacterium、unclassified_f__Lachnospiraceae、Monoglobus、Bacteroides、 Lachnospiraceae_NK4A136_group、Ruminococcus_torques_group、 Parabacteroides、Enterorhabdus和Christensenellaceae_R-7_group。其中,模型组大鼠产生抑郁症症状后这些微生物(norank_f__Muribaculaceae、 Escherichia-Shigella、Bifidobacterium、Bacteroides和Parabacteroides)丰度都 有一定的回调;然而norank_f__norank_o__Clostridia_UCG-014、 Desulfovibrio、UCG-005、unclassified_f__Lachnospiraceae、Monoglobus、 Lachnospiraceae_NK4A136_group、Ruminococcus_torques_group、 Enterorhabdus和Christensenellaceae_R-7_group的丰度降低。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。 这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式,并且很显然,根据上述 教导,可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在 于解释本发明的特定原理及其实际应用,从而使得本领域的技术人员能够实 现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
Claims (5)
1.一种养心解郁配方颗粒,其特征在于,由以下原料制成:人参9~30g、麦冬9~30g、五味子9~30g、淫羊藿9~30g、薤白9~30g、玫瑰花9~30g、合欢花9~30g、郁金9~30g、石菖蒲9~30g、青皮9~20g,所述人参、麦冬、五味子、淫羊藿、薤白、玫瑰花、合欢花、郁金、石菖蒲、青皮的重量比为3:3:3:3:3:3:3:3:3:2。
2.根据权利要求1所述的养心解郁配方颗粒,其特征在于,按重量计,所述颗粒由以下原料制成:人参30g、麦冬30g、五味子 30g、淫羊藿30g、薤白30g、玫瑰花30g、合欢花30g、郁金30g、石菖蒲30g、青皮20g。
3.根据权利要求1所述的养心解郁配方颗粒,其特征在于,按重量计,所述颗粒由以下原料制成:人参15g、麦冬15g、五味子15g、淫羊藿15g、薤白15g、玫瑰花15g、合欢花15g、郁金15g、石菖蒲15g、青皮10g。
4.一种养心解郁配方颗粒,其特征在于,按重量计,所述颗粒由以下原料制成:人参9g、麦冬9g、五味子9g、淫羊藿9g、薤白9g、玫瑰花9g、合欢花9g、郁金9g、石菖蒲9g、青皮6g。
5.一种如权利要求1~4任一所述的养心解郁配方颗粒的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)准备原料:按重量配比称取人参、麦冬、五味子、淫羊藿、薤白、玫瑰花、合欢花、郁金、石菖蒲、青皮分别冲洗晾干备用;
(2)将上述原料浸泡于8~12倍量蒸馏水中0.8~1.2h,熬到水沸后25~30min,倒出,再加6~9倍量的蒸馏水进行第二次煎煮,最后将两次所煮汤药混合浓缩至40ml,制成颗粒。
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CN105412843B (zh) * | 2015-12-30 | 2019-07-16 | 南京中医药大学 | 具有增强记忆,改善抑郁情绪作用的中药组合物及其制备方法与应用 |
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