CN105412843B - 具有增强记忆，改善抑郁情绪作用的中药组合物及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有增强记忆，改善抑郁情绪作用的中药组合物及其制备方法和应用，它由下列重量份数的原料制成：人参2～5份，远志1～5份，石菖蒲1～5份，茯苓2～5份，麦冬1～5份，五味子1～5份，郁金1～5份，栀子1～5份，银杏叶提取物0.1～0.5份。本发明提供的具有抗神经退行性痴呆与改善抑郁情绪作用的中药组合物，具有延缓与改善神经退行性痴呆症患者记忆，改善抑郁情绪作用，疗效可靠，安全性好，不良反应低，可用于制备抗神经退行性痴呆与抗抑郁的药物。

Description

具有增强记忆，改善抑郁情绪作用的中药组合物及其制备方 法与应用
技术领域
本发明涉及一种天然产物组合物，特别是涉及一种具有增强记忆，改善抑郁情绪作用的中药组合物及其制备方法。
背景技术
各方面资料显示，中国已进入老龄化社会并呈加速态势发展。中国现有老龄人口已超过1.6亿，且每年以近800万的速度增加。预计到2050年，中国老龄人口将达到总人口的三分之一。老年人口的快速增加，特别是80岁以上的高龄老人和失能老人年均100万的增长速度，对老年人的生活照料、康复护理、医疗保健、精神文化等需求日益凸显，养老问题日趋严峻。
在老龄化疾病中，神经退行性痴呆症，又称阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease，AD)或神经退行性痴呆症，是一类高发疾病。临床早期最显著的症状为以记忆力受损的记忆障碍、掌握运用新知识与社交能力下降等认知障碍、并伴随有抑郁、情感淡漠或焦躁不安、注意力涣散等精神障碍。据统计，1990年，中国人群中AD患者为193万，2000年为380万，2010年统计数字已上升为568万，发病增长率惊人。因此，神经退行性痴呆症已成为老龄化社会中危害公众健康的重大公共卫生问题，迫切需要低毒高效创新药物。
神经退行性痴呆症的神经病理变化主要有：大脑皮质、海马中存在大量的老年斑(senile plaque,SP),尤其是神经炎症老年斑，同时存在大量神经原纤维缠结(neurofibril tangle,NFT)。伴随上述改变的是大量的神经细胞脱失与星型胶质细胞增生。对于其具体的发病机制主要有以下几点认识：(1)神经损伤加剧：AD患者脑内β-淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)沉积，通过氧自由基、刺激胶质细胞产生炎症因子，加剧神经元死亡。同时Aβ的聚集导致神经元钙摄取增加，引发兴奋型神经递质谷氨酸释放增加，产生兴奋性中毒(excitotoxicity)，加剧神经元死亡。(2)神经生长受损：在诸多损伤因素下，神经可塑性降低。患者脑内神经营养因子(Neurotrophins)分泌不足，导致神经元无法抵御损害，生长异常，构成轴突的Tau蛋白过度磷酸化，形成NFT，导致神经元退化死亡；(3)神经传导阻滞：患者脑内胆碱能神经受损，乙酰胆碱含量不足，同时伴有多巴胺、去甲肾上腺素、5-羟色胺和γ-氨基丁酸含量下降，相应受体表达降低，导致神经传导阻滞；(4)血管病变：脑部血管粥样硬化，导致脑梗死，脑血流量下降，能量供给不足，导致神经元损害和认知功能损害。脑部血管病变原是血管性痴呆的发病机制，但是目前AD发病原因中，该因素已居第2位。总之，神经退行性痴呆症的发病机制可归结为因衰老所致的脑内种种损伤因素增加，导致神经生长受损，影响神经传导功能的正常发挥，产生意识障碍。
神经退行性痴呆症无法彻底根治，有效的前期预防，或延缓疾病进程，显得尤其重要。临床主要有(1)胆碱酯酶抑制剂，如多奈哌齐(donepezil)，加兰他敏(galanthamine)、石杉碱甲(huperzine)等，他克林(tacrine),旨在抑制乙酰胆碱酯酶活性，改善神经递质传递功能；(2)谷氨酸受体阻断剂，如美金刚(memantine)等,旨在减少谷氨酸的神经毒性；(3)自由基清除剂和抗氧剂，如司来吉兰(selegiline)，旨在对抗氧自由基神经毒性；(4)雌激素：用于更年期妇女，改善海马细胞的糖转运，促进胆碱吸收转运，促进神经元及神经突触完整性；另有钙拮抗剂，脑活素等。可是这些药物的副作用常为人诟病，除了常见的眩晕、恶心呕吐等消化不良现象，常会引发失眠等睡眠障碍等。同时，司来吉兰还具有心毒性。雌激素替代疗法也有罹患乳腺癌的风险。因此，寻找更为安全有效的神经退行性痴呆症治疗药物迫在眉睫。
发明内容
发明目的：本发明的目的在于提供一种疗效可靠，安全性好，具有很好的增强记忆，改善抑郁情绪作用的中药组合物。本发明的另一目的是提供上述组合物的制备方法和应用。
技术方案：为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：
一种具有增强记忆，改善抑郁情绪作用的中药组合物，它包括下列重量份数的原料：人参1～10份，远志1～5份，石菖蒲1～10份，茯苓1～10份，麦冬2～10份，五味子1～10份，郁金0.5～5份，栀子0.5～5份，银杏叶提取物0.1～1份。
作为优选方案，以上所述的具有增强记忆，改善抑郁情绪作用的中药组合物，它包括下列重量份数的原料：人参3份，远志2份，石菖蒲2份，茯苓3份，麦冬3份，五味子2份，郁金1份，栀子2份，银杏叶提取物0.1份。
作为优选方案，以上所述的具有增强记忆，改善抑郁情绪作用的中药组合物，所述的银杏叶提取物通过以下方法制备得到的：取银杏叶，粉碎，用50％乙醇加热回流提取2次，合并提取液，回收乙醇，浓缩成稠膏，真空干燥，粉碎，即得。优选6～15倍量的50％乙醇加热回流提取2次，每次1～3小时。
本发明所述的具有增强记忆，改善抑郁情绪作用的中药组合物的制备方法，还包括以下步骤：
(1)取上述药材，混合，以乙醇回流提取，过滤，收集滤液。
(2)取步骤(1)中的药渣，以乙醇回流提取，过滤，收集滤液。
(3)取步骤(1)滤液，减压浓缩得浸膏。取(2)中所得滤液，减压浓缩得浸膏。按重量比(1份浸膏加0.1份银杏叶提取物)混合。低温减压制得提取物。
作为优选方案，步骤(1)所述的回流提取条件为：首先加入药材重量8倍体积量的提取溶剂乙醇，100℃回流提取120min。步骤(2)回流条件为：加入药材重量10倍体积量的提取溶剂乙醇，100℃回流提取120min，所述的乙醇为：60％乙醇。
本发明提供的中药组合物，通过中医临床大量实验筛选得到。动物模型实验结果表明：本发明提供的中药组合物可有效改善神经退行性痴呆症与抑郁症的主要病理环节，增强动物记忆能力，改善抑郁情绪降低血液中β淀粉样蛋白含量，降低tau蛋白的磷酸化水平，增强皮层神经营养因子的表达，修复胆碱能神经系统，提高脑组织SOD水平。细胞模型实验结果表明，本发明提供的中药组合物可提高神经细胞抗氧化损伤能力，抑制乙酰胆碱酯酶活性，增加神经胶质细胞内神经营养因子的表达。
上述研究表明本发明提供的中药组合物对神经退行性痴呆与抑郁症有显著的改善作用，可用于制备具有改善神经退行性痴呆症与抑郁症的药品或保健品，适合神经退行性痴呆症与抑郁症的患者。
本发明所述的具有增强记忆，改善抑郁情绪作用的中药组合物在制备神经退行性痴呆症与抑郁症中的应用，将此中药组合物和药学上可接受的载体制成片剂、丸剂、散剂、汤剂、颗粒剂、煎膏剂或浸膏剂剂型的药物，临床服用方便，并且本发明提供的中药组合物，实验过程中未发现明显毒副作用，安全性好。
附图说明
图1为中药组合物对小鼠潜伏期影响的柱状图。
图2为中药组合物对小鼠上台次数影响的柱状图。
图3为中药组合物对痴呆症模型小鼠脑内SOD活力影响的柱状图。
图4为中药组合物对痴呆症模型小鼠脑内神经营养因子表达影响的柱状图。
图5为中药组合物对悬尾小鼠不动时间影响的柱状图。
图6为中药组合物对强迫游泳小鼠不动时间影响的柱状图。
图7为中药组合物对大鼠皮层星型胶质细胞内BDNF表达影响的柱状图。
图8为中药组合物对H2O2损伤PC12细胞存活率影响的柱状图。
图9为中药组合物对Aβ损伤大鼠原代皮层神经元细胞存活率影响的柱状图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
实施例1一种具有增强记忆，改善抑郁情绪作用的中药组合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)取人参1份，远志1份，石菖蒲1份，茯苓1份，麦冬2份，五味子1份，郁金0.5份，栀子0.5份，混合。加入药材重量8倍量的60％乙醇回流提取120min，过滤，收集滤液和滤渣。
(2)取步骤(1)中的药渣，加入药材重量10倍体积量的60％乙醇回流提取120min，过滤，收集滤液。
(3)合并步骤(1)与步骤(2)中所得滤液，减压浓缩得浸膏，加入银杏叶提取物0.1份，低温减压制得提取物。
实施例2一种具有增强记忆，改善抑郁情绪作用的中药组合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)取人参5份，远志3份，石菖蒲5份，茯苓8份，麦冬5份，五味子5份，郁金2份，栀子2份，混合。加入药材重量8倍量的60％乙醇回流提取120min，过滤，收集滤液和滤渣。
(2)取步骤(1)中的药渣，加入药材重量10倍体积量的60％乙醇回流提取120min，过滤，收集滤液。
(3)合并步骤(1)与步骤(2)中所得滤液，减压浓缩得浸膏，加入银杏叶提取物0.5份，低温减压制得提取物。
实施例3一种具有增强记忆，改善抑郁情绪作用的中药组合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)取人参3份，远志2份，石菖蒲2份，茯苓3份，麦冬3份，五味子2份，郁金1份，栀子2份，混合。加入药材重量8倍量的60％乙醇回流提取120min，过滤，收集滤液和滤渣。
(2)取步骤(1)中的药渣，加入药材重量10倍体积量的60％乙醇回流提取120min，过滤，收集滤液。
(3)合并步骤(1)与步骤(2)中所得滤液，减压浓缩得浸膏，加入银杏叶提取物0.1份，低温减压制得提取物。
实施例4抗神经退行性痴呆症实验研究
一、实验材料与药物
1.药物和试剂
氯化铝、硫酸亚铁、氢溴酸东莨菪碱、D-半乳糖酶，石杉碱甲均购自阿拉丁试剂(上海)有限公司。胆碱酯酶，SOD试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
2.实验仪器
水迷宫行为测试仪(上海吉量仪器有限公司)；酶标仪(美国Perkin-Elmer公司)；BT125型电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；KQ-250E型超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)；Anke GL-16GII型离心机(上海安亭科学仪器厂)。
3.实验动物
SPF级雄性昆明种小鼠，体重18～22g，购自南京中医药大学实验动物中心，合格证号SCXK(浙)2008-0033。
二、实验方法
1.小鼠多因素复合型神经退行性疾病模型的建立与中药组合物给药
健康小鼠适应性喂养5d后，随机分为空白组、模型组、阳性对照组和受试中药组合物(实施例3)低剂量组(2g/kg)、中剂量组(4g/kg)、高剂量组(8g/kg)，每组8只，经称重显示各组间体重差异无统计学意义。除空白组外，其余各组用多因素损伤造成记忆损伤，具体方式为小鼠每天腹腔注射D-半乳糖(120mg/kg)与东莨菪碱(1.0mg/kg)，口服灌胃氯化铝(10mg/kg)与硫酸亚铁(150mg/kg)，连续4周。模型组给以等体积生理盐水。阳性对照组给以石杉碱甲(4mg/kg)。其余各组给以中药组合物10d，进行系列测试。然后利用水迷宫实验进行行为学测试后，
2.药效评价方法
(1)行为学测试方法
30d多因素复合损伤造模结束后，进行连续4天的Morris水迷宫定位航行实验，以测试其空间记忆能力。将水迷宫内水温调到25±℃，水深约20cm，保持学习、训练和测试时水迷宫平台和周围物体位置固定不变。让小鼠在水迷宫内自由游120s,然后引导其找到水下平台，让其处于平台上10s。此操作一天进行2次，时间间隔2h以上。每天训练2个象限，训练共4天。第5天开始正式测试。让小鼠从平台所在象限对侧象限的最远点背对平台入睡，拍摄记录小鼠找到平台的全过程。共测试2天，每天测试2次。以各组小鼠自水迷宫起点游至平台终点所需的时间(潜伏期)与上台次数为衡量小鼠学习获得与记忆巩固能力的指标。
(2)生化指标测试
水迷宫测试结束后，取脑组织匀浆测定胆碱酯酶(ChE)和超氧化物歧化酶(SOD)活性，另测定皮层神经营养因子的表达。
3.统计学处理
所有实验数据均采用SPSS18.0统计处理软件进行统计学处理，结果以表示，组间差异采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
三、实验结果
1.行为学测试结果
多因素复合损伤30d后，进行水迷宫实验测试。由图1与2可以看出小鼠经多重因素损伤后，潜伏期显著延长(P<0.01)，上台次数显著减少，经灌胃本发明提供的中药组合物后，潜伏期显著缩短(见图1)，上台次数显著增加(见图2)。表明本发明所提供的中药组合物具有很好的对抗损伤因素，改善记忆的功效。
2.胆碱酯酶活性测试结果
小鼠进行完行为学测试后，处死取脑，制得匀浆，依据胆碱酯酶试剂盒的操作方法，测量小鼠脑内胆碱酯酶活性。模型组小鼠经多重因素损伤后，脑内胆碱酯酶活性显著增高(P<0.01)。给予本发明实施例3中药组合物后，胆碱酯酶活性显著降低(P<0.01)，其作用趋势与阳性药石杉碱甲作用相当。表明本发明所提供的中药组合物具有很好的降低胆碱酯酶活性，改善受损胆碱能神经功能的作用。
3.SOD活性测试结果
小鼠进行完行为学测试后，处死取脑，制得匀浆，依据SOD试剂盒的操作方法，测量小鼠脑内SOD活性。由图3可以看出，模型组小鼠经多重因素损伤后，脑内SOD活性显著降低(P<0.01)。给予实施例3中药组合物后，SOD活性显著增加(P<0.01)，其作用趋势与阳性药石杉碱甲作用相当。表明本发明所提供的中药组合物具有很好的抗氧化作用。
4.NGF测试结果
小鼠进行完行为学测试后，处死取脑，分取大脑皮层，制得匀浆，利用westernblotting技术，测量小鼠大脑皮层神经营养因子(NGF)表达。由图4可以看出，模型组小鼠经多重因素损伤后，大脑皮层NGF表达显著降低(P<0.01)。给予实施例3中药组合物后，NGF表达显著增加(P<0.01)，其作用趋势与阳性药石杉碱甲作用相当。表明本发明所提供的中药组合物具有很好的增强NGF表达，营养胆碱能神经元，对抗神经退行性痴呆的作用。
实施例5抗抑郁实验研究
一、实验材料与药物
1.实验仪器
动物多重行为测试仪(上海吉量仪器有限公司)；BT125型电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；KQ-250E型超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)。
2.药物
氟西汀购自TCI(上海)化成工业发展有限公司。
受试药物：本发明实施例3制备得到的中药组合物。
3.实验动物
SPF级雄性ICR种小鼠，体重18～22g，购自南京中医药大学实验动物中心，合格证号：SCXK(苏)2015-0001。
二、实验方法
1.小鼠悬尾实验
小鼠给以阳性药与中药组合提取物7天后，于末次给药30min后，用悬尾箱顶板中心绳连着的小夹子夹住小鼠尾尖，使小鼠成倒挂状态，其头部离箱底约5cm。小鼠悬挂2min后，立即开始观察，观察持续4min，累计此4min内小鼠的不动时间。
2.小鼠强迫游泳实验
小鼠给以阳性药与中药组合提取物7天后，于末次给药30min后，将小鼠放入高20cm，直径14cm的圆柱形玻璃缸中，每缸1只，缸中水深10cm，水温25℃。小鼠游泳2min后，立即开始观察，观察持续4min，累计此4min内的不动(小鼠在水中停止挣扎，或动物呈漂浮状态，仅有细小的肢体运动)时间。
3.统计学处理
所有实验数据均采用SPSS18.0统计处理软件进行统计学处理，结果以表示，组间差异采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
三、实验结果
1.小鼠悬尾实验测试结果
给药7天后，进行小鼠悬尾实验测试。由图5可以看出小鼠经灌胃7天后，中药组合物可减少小鼠悬尾不动时间，与生理盐水组相比有显著性差异(P<0.05)，其趋势与阳性药氟西汀作用相当，显示出明显的抗抑郁作用。
2.小鼠强迫游泳实验测试结果
给药7天后，进行小鼠强迫游泳实验。由图6可以看出小鼠经灌胃7天后，本发明提供的中药组合物可减少小鼠强迫游泳的不动时间，与生理盐水组相比有显著性差异(P<0.05)，其趋势与阳性药氟西汀作用相当，显示出明显的抗抑郁作用。
实施例6体外神经营养实验研究
一、实验材料与药物
1.实验仪器
二氧化碳培养箱(Forma seriesⅡwaterjacket CO2incubator，Thermo公司)，1300series A2超净工作台(Thermo公司)，Auto Vert A1倒置荧光显微镜(ZEISS公司)，Nanodrop(DS11spectrophotometer，DeNovix公司)，ABI7500荧光实时定量PCR仪(Invitrogen公司)，高速离心机(Allegra X-12R Centrifuge和Microfuge 22RCentrifuge，Backman公司)，恒温水浴锅(Bluepard公司)，恒温振荡器(IS-RDV1incubatorshaker，CRYSTAL公司)，细胞培养器皿(CORNING公司)。
2.试剂
TRIzol RNA提取试剂盒(15596-026，Invitrogen)。RT-PCR反转录试剂盒(PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser,RR047A，TAKARA)；SYBR荧光定量PCR试剂(FastStart Universal SYBR Green Master(ROX),04913914001，Roche)。Bradford试剂盒(T9310A，TAKARA)。
二、实验方法
1.细胞培养与给药
取出生第一天的大鼠乳鼠，断头，取出脑组织。显微镜下分离出大脑皮层组织。DMEM基础培养基清洗两遍，加入0.25mg·ml-1胰酶消化。终止消化后，吹打分散细胞，至无明显团块。于800r·min-1，4℃，4min的条件下离心。离心完成后，弃去上清，加入新鲜完全培养基(H-DMEM+10％FBS+1％P/S)，分散沉淀，接种至75cm2培养瓶中，置于37℃，5.0％CO2的培养箱中培养。48h后换用新鲜完全培养基，每三天换液一次。培养一周后，置于恒温振荡器震荡(200r·min-1)24h，以1×106/皿的细胞密度接种于直径为60mm的培养皿中。
待培养皿中的细胞长至汇合度为90％时，给以实施例3中药组合物高剂量、中剂量、低剂量(10、3、1ug/mL)，阳性药cAMP(50μM)，培养24h。
2.实时定量荧光PCR仪测定神经营养因子转录水平表达
RNA提取：吸去细胞培养液，加入2mL的PBS冲洗，每盘细胞中加入500μL的TRIzol，按TRIzol RNA提取试剂盒所列步骤进行操作。所提取RNA于-80℃保存。
cDNA的制备：用Nanodrop测试RNA的浓度和纯度，根据TaKaRa逆转录试剂盒的说明，总计取用1μg的RNA来进行逆转录的操作。
依照SYBR荧光实时定量试剂盒操作步骤，利用荧光实时定量PCR仪测定神经营养因子的基因转录水平表达。所用引物序列如下：
表1引物序列
3.统计学处理
所有实验数据均采用SPSS18.0统计处理软件进行统计学处理，结果以表示，组间差异采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
三、实验结果
将体外培养的大鼠皮层星型胶质细胞，加以不同比例的中药组合物24h后，利用qPCR技术检测细胞内BDNF的表达。如图7所示，实施例3中各中药组合物可以显著促进大鼠皮层星型胶质细胞内BDNF的表达，表现出较好的神经营养活性。
实施例7体外抗氧化神经损伤实验研究
一、实验材料与药物
1.实验仪器
二氧化碳培养箱(Forma seriesⅡwaterjacket CO2incubator，Thermo公司)，1300series A2超净工作台(Thermo公司)，Auto Vert A1倒置荧光显微镜(ZEISS公司)，恒温水浴锅(Bluepard公司)，多功能酶标仪(Enspire，Perkin Elmer公司)，细胞培养器皿(CORNING公司)。
2.试剂
MTT(Salibro公司)。双氧水(PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser,RR047A，TAKARA)；SYBR荧光定量PCR试剂(FastStart Universal SYBR Green Master(ROX),04913914001，Roche)。Bradford试剂盒(T9310A，TAKARA)。
3.细胞株
大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞(PC12)细胞株，来源于自ATCC细胞库，
二、实验方法
1.细胞培养与给药
将PC12细胞按接种量1×104个/孔接种于96孔板中培养24h后，对照组每24h换一次新鲜培养液，共培养48h。模型组按对照组的方法培养48小时后加H2O2继续培养1h。样品组加实施例3中中药组合物高剂量、中剂量、低剂量(10、3、1ug/mL)24h后，换液，重新加入上述中药组合物，培养24小时后，加H2O2培养1h。阳性药组：加维生素C(Vc)，按上述加药方法培养48小时后加H2O2继续培养1h。
2.MTT法测定细胞存活率
培养结束后，每孔加入10μL MTT溶液(5mg/mL))。3h后弃去培养液，加入150μL二甲亚砜溶解细胞，充分振荡30min后在570nm波长处测定各孔的吸收值。细胞存活率由以下公式计算：细胞存活率＝(实验组A570/对照组A570)×100％。
3.统计学处理
所有实验数据均采用SPSS18.0统计处理软件进行统计学处理，结果以表示，组间差异采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
三、实验结果
将体外培养的PC12，经过H2O2损伤，加以实施例3中的中药组合物培养后，如图8所示，各中药组合物可以显著对抗H2O2所致的细胞损伤，表现出较好的抗氧化损伤，保护神经的活性。
实施例8体外抗Aβ神经损伤实验研究
一、实验材料与药物
1.实验仪器
二氧化碳培养箱(Forma seriesⅡwaterjacket CO2incubator，Thermo公司)，1300series A2超净工作台(Thermo公司)，Auto Vert A1倒置荧光显微镜(ZEISS公司)，恒温水浴锅(Bluepard公司)，多功能酶标仪(Enspire，Perkin Elmer公司)，细胞培养器皿(CORNING公司)。
2.试剂
MTT(Salibro公司)。双氧水(PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser,RR047A，TAKARA)；SYBR荧光定量PCR试剂(FastStart Universal SYBR Green Master(ROX),04913914001，Roche)。Bradford试剂盒(T9310A，TAKARA)。细胞培养基购自Invitrogen公司。细胞培养所用试剂均购自Sigma公司。
二、实验方法
1.大鼠原代皮层神经元细胞培养与给药
培养前1天，将0.1g/L多聚赖氨酸滴加至培养器皿,37℃孵箱内放置过夜。第2天将多聚赖氨酸吸出，换为接种液。取第18天的怀孕Wistar大鼠1只，麻醉开腹，分离子宫，去除胎盘和脐带，断头取出脑组织置于HBSS平衡盐溶液中。在体视显微镜下用尖镊去除脑膜，分离皮层，剪成小碎块。胰蛋白酶37℃消化20min。室温1,000x g离心4min，弃上清；将20mL吹散液(DMEM+10％Horse serum+Msg+Glutamax)倒入50mL离心管，轻轻吹打6次，静置片刻后将上层细胞悬液移入新的50mL离心管，管底剩余的较大组织块用剩余吹散液继续吹打6次，静置后上层细胞悬液也转入50mL离心管，室温1,200x g离心5min。弃除上清，分散沉淀细胞。台盼蓝拒染试验，血细胞计数板镜下计数。以1x104/cm2的密度将细胞接种至预先处理过的60mm培养皿，6％(体积分数)CO2孵箱37℃孵育，24后全部换为神经细胞无血清培养基(Neurobasal+B27)。体外培养第2天(DIV2)以终浓度10μmol/L的阿糖胞苷(Ara-C)抑制胶质细胞增殖，作用24h后吸出。此后每3天半量换液1次，体外培养第7-21天(DIV7～DIV21)的细胞用于实验。
将大鼠原代神经元细胞按接种量1×104个/孔接种于96孔板中。对照组每24h换一次新鲜培养液。模型组按对照组的方法培养24小时后，加入Aβ25-35(10μM)继续培养24h。给药组加入实施例3中中药组合物高剂量、中剂量、低剂量(10、3、1ug/mL)培养24h后，加入Aβ25-35(10μM)培养24h。阳性药组，加入雌激素(10nM)培养24h后，加入Aβ25-35(10μM)培养24h。
培养结束后，每孔加入10μL MTT溶液(5mg/mL))。3h后弃去培养液，加入150μL二甲亚砜溶解细胞，充分振荡30min后在570nm波长处测定各孔的吸收值。细胞存活率由以下公式计算：细胞存活率＝(实验组A570/对照组A570)×100％。
3.统计学处理
所有实验数据均采用SPSS18.0统计处理软件进行统计学处理，结果以表示，组间差异采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
三、实验结果
将体外培养的大鼠原代皮层神经元细胞，经过Aβ损伤，加以实施例3中不同剂量的中药组合物培养后，如图9所示，各中药组合物可以显著对抗Aβ所致的细胞损伤，表现出较好的抗Aβ损伤，保护神经的活性。
以上实验结果表明，本发明提供的中药组合物具有显著的对抗多因素所致的记忆损伤、改善抑郁情绪、改善神经传导功能，营养神经元、对抗Aβ与氧化所致的神经损伤等功能，表明本发明提供的中药组合物具有很好的对抗神经退行性痴呆症与抑郁症的作用。与现有的对抗神经退行性痴呆症的化学药物相比，该组合物具有多靶点的作用特点，改变了以往药物仅作用于胆碱酯酶、Aβ或氧化损伤等单一靶点，尤其具有显著的神经营养功能。具有较高的药物开发价值。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种具有增强记忆，改善抑郁情绪作用的中药组合物的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤：
(1)按重量份数取人参3份，远志2份，石菖蒲2份，茯苓3份，麦冬3份，五味子2份，郁金1份，栀子2份，混合，加乙醇回流提取，得提取液，过滤，收集滤液和滤渣；
(2)取步骤(1)中的药渣，加乙醇回流提取，过滤，收集滤液；
(3)取步骤(1)滤液，减压浓缩得浸膏；取步骤(2)所得滤液，减压浓缩得浸膏，混合，加入银杏叶提取物0.1～0.5份，制得提取物；
所述的银杏叶提取物的制备方法为：取银杏叶，粉碎，用50％乙醇加热回流提取2次，合并提取液，回收乙醇，浓缩成稠膏，真空干燥，粉碎，即得。
2.根据权利要求1所述的具有增强记忆，改善抑郁情绪作用的中药组合物的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的回流提取条件为：加入药材重量8倍体积量的乙醇，100℃回流提取120min；步骤(2)所述的回流提取条件为：加入药材重量10倍体积量的乙醇，100℃回流提取120min；步骤(1)与(2)所述的乙醇为体积浓度为60％的乙醇。
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栀子粗提物对拟痴呆模型鼠学习记忆功能障碍的影响;杨楠等;《中国康复理论与实践》;20100430;第16卷(第4期);第308-310页，尤其是第310页第1-5段

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