CN115927017B

CN115927017B - 一株红平菇高产真菌及其在产纤维素酶中的应用

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Publication number: CN115927017B
Application number: CN202310030705.7A
Authority: CN
Inventors: 应汉杰; 魏荷芬; 潘晶; 陈勇; 刘庆国; 温庆仕; 项玲; 余斌; 周萍; 袁童; 徐雯晖; 张宁
Original assignee: Nanjing Institute Of White Biotech Co ltd; Nanjing Tech University
Current assignee: Nanjing Institute Of White Biotech Co ltd; Nanjing Tech University
Priority date: 2023-01-10
Filing date: 2023-01-10
Publication date: 2023-11-28
Anticipated expiration: 2043-01-10
Also published as: CN115927017A

Abstract

本发明属于食用菌选育技术领域，具体涉及一株红平菇高产真菌及其在产纤维素酶中的应用。本发明通过从已知15株大型真菌筛选出生长速率和纤维素酶活最高的一株红平菇作为出发菌株，经过尖端分离驯化进一步提升其生长速率，生物量及蛋白产量。从5种酶体系中筛选出原生质体数量最多的、再生率最高的、再生时间最短的酶系M2，并对ARTP诱变技术条件进行探究，筛选最佳诱变时间等条件。最后，采用酶系M2制备原生质体联合ARTP诱变技术，选育出了一株生长速度快、高纤维素酶活和高产蛋白的红平菇菌株GXGD‑EF‑13‑JD‑1，其分类命名为红平菇Pleurotus djamor，菌株号GXGD‑EF‑13‑JD‑1，已于2022年11月09日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62953。

Description

一株红平菇高产真菌及其在产纤维素酶中的应用

技术领域

本发明属于食用菌选育技术领域，具体涉及一株红平菇高产真菌及其在产纤维素酶中的应用。

背景技术

全世界每年可产生秸秆约20亿t，而我国农作物秸秆年产量约为7-7.2亿t，其中以玉米、小麦和稻谷秸秆为主，占总秸秆产量的80％。农作物秸秆是自然界中最为丰富的可再生资源之一，是潜在的动物饲料资源。秸秆用作饲料的限制因素，主要是原因它的木质素、纤维素含量高、蛋白质含量低，所以消化率和适口性都差。而利用微生物功能破坏秸秆饲料中木质素、纤维素、半纤维素等结构，提高动物对其利用效果，对秸秆资源的高效利用和转化，降低饲料成本，缓解饲料供给压力等方面都具有一定的现实意义。大量研究表明，白腐真菌在处理秸秆饲料时能普遍提高其粗纤维降解率和粗蛋白质含量，白腐真菌是生物圈中木质素、纤维素和半纤维素的重要降解者，白腐真菌能分泌锰过氧化物酶(Mnps)、木质素过氧化物酶(LIPs)、漆酶(Lacs)和半纤维素酶(Hcels)。其在降解秸秆时可破坏秸秆中难以消化的细胞壁结构，将秸秆中的纤维素、半纤维素，在发酵过程中被纤维素酶破坏，分解为多种糖类物质，最终被转化为可挥发性脂肪酸、CO2等物质。国内外目前研究的白腐菌主要有金孢展齿革菌(Phanerochaete chrysosporium)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)、云芝栓菌(Trametes versicolor)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、金针菇(Flammulina velutipes)等。

在秸秆饲料的处理过程中，纤维素的降解速率是食用菌生长的最关键的限速步骤之一。纤维素是以β-1，4糖苷键连接的葡萄糖残基为单位组成的长链高分子聚合物，其分解产物是葡萄糖，是体现木质纤维素原料生物学价值的主要成分，也是用于动物饲料的主要营养成分，可以替代饲料中常规的能量原料及提供畜禽日粮膳食纤维。因此，关于秸秆饲料的菌种提出了具体要求，一方面要求选育纤维素酶产量高的菌株分解纤维素；另一方面能够利用有机氮转化为菌体蛋白合成和分泌更多的营养物质；同时能够改变原料的适口性，能够产生多种分解酶，不产生有毒物质，具有促生长快的优势特性。还需要经过严格的审查，谨防对蓄禽和人造成危害。因此，大型食用真菌成为解决这一难题的首选菌株。其产生的纤维素酶将粗饲料秸秆中的糖类转化为乳酸等物质，形成酸性环境，抑制有害微生物的生长，使pH值降低至4.5-5.0，从而保存秸秆中的营养成分。不仅提高粗蛋白含量，还能够有效改善纤维表面结构和饲料的适口性，同时菌体自身生物量的增长又可以提高蛋白含量。

目前报道的大型食用真菌的纤维素酶活情况为双孢蘑菇(戴建清)、黑木耳(韩增华)、红平菇(查磊)、灵芝、银耳、平菇(子实体)、猴头菌、巴西蘑菇的纤维素酶活(U/mL)分别为0.69、0.45、4.56、0.45、5.87、1.47、3.89、1.21。其中红平菇(Pleurotus diamor)的纤维素酶活在报道的几种纤维素酶活中属于较高水平，因此本案例将以该菌株为出发菌株，对其进行相关选育提升工作。据报道红平菇又名红侧耳、桃红平菇，属真菌门、担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、侧耳科、侧耳属，是一种木腐性真菌，对纤维素、木质素等有较强的分解能力，菌丝生长快，产量高。该红侧耳菌株具有很强的纤维素、木质素降解能力和特别强的抗杂菌能力，其菌丝体生长速度快，抗虫害，能够在玉米、小麦等各种植物的秸秆上快速生长，并使之快速降解。Claydon等研究发现胞外纤维素酶活性峰值的高低与子实体生物量多少呈正相关。因此，关于如何提高菌丝的生长速度、生物量和提高纤维酶活性成为本研究的方向。

关于自然界里筛选出的菌株，其所产纤维素酶的酶活力通常比较低，诱导筛选高效纤维降解菌株越来越受到研究者的关注。传统的大型食用菌育种方法包括自然驯化选育、诱变育种、杂交育种、基因工程育种和原生质体融合等。自然驯化选育方法简单，但筛选周期很长；杂交育种中单孢菌株、单核菌株获得比较困难，工作量大，周期长；转基因技术有在大型食用真菌中比较成功，但是存在遗传的稳定性问题。和传统诱变方法相比，常压室温等离子体诱变ARTP对遗传物质的损伤机制多样，因此获得突变型多样性的可能性增大，大大加速了自然驯化的选育周期，对于代谢网络复杂的微生物的诱变育种时，显示出其独特的优势。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一株红平菇高产真菌。

本发明还要解决的技术问题是提供上述红平菇高产真菌在产纤维素酶中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一株红平菇高产真菌，分类命名为红平菇Pleurotus djamor，菌株号GXGD-EF-13-JD-1，已于2022年11月09日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62953，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

其中，所述的红平菇高产真菌，其生长速度为15.12mm/d，生物量为20.43g/L，粗蛋白含量为6.80g/L。

其中，所述的红平菇高产真菌是先由出发菌株GXGD-13经尖端分离复壮选育得到GXGD-13-1菌株，再以菌株GXGD-13-1为出发菌株，通过制备原生质体联合ARTP诱变法筛选得到的。

具体的，上述红平菇高产真菌的选育方法，包括如下步骤：

(1)出发菌株初筛：通过在PDA平板和刚果红平板上，对15株大型食用真菌进行初筛，获得出发菌株GXGD-13；

(2)尖端分离复壮驯化：将步骤(1)获得的出发菌株GXGD-13依次在纯琼脂培养基、PDA培养基、PDA加富1、PDA加富2、改良PDA培养基上进行尖端菌丝体分离复壮，获得优选菌株GXGD-13-1；

(3)突变菌株的选育：以步骤(2)优选的菌株GXGD-13-1为出发菌株，通过制备原生质体联合ARTP诱变法，获得优良的突变菌株10株，再结合平板观察验证法和液体验证培养法，对10株突变菌株的生长速度，生物量，粗蛋白及纤维素酶活情况进行表征，筛选得到一株高纤维素酶活，生长快，生物量大，蛋白含量高的红平菇突变菌株GXGD-EF-13-JD-1；

(4)菌株的鉴定与保藏：将步骤(3)获得的突变菌株GXGD-EF-13-JD-1进行平板对峙拮抗实验和分子鉴定后进行保藏。

其中，步骤(1)中，所述的PDA平板，其配方为：土豆汁200g/L、葡萄糖20g/L、磷酸二氢钾3g/L、硫酸镁1.5g/L、VB₁ 0.1g/L。

其中，步骤(1)中，所述的刚果红平板，其配方为：羧甲基纤维素钠10g/L、KH₂PO₄2g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/L、MnSO₄ 0.5g/L、刚果红0.4g/L、琼脂20g/L，加蒸馏水至1000mL，用醋酸调节pH值为6.0。

其中，步骤(1)中，所述的出发菌株GXGD-13，来源于江苏省农科院菌种保藏中心赠送，保藏中心的内部编号为NKY_H2020.15。

其中，步骤(2)中，所述的纯琼脂培养基配方为：琼脂20g/L、水1000mL；PDA培养基配方为：土豆200g/L(煮汁)、琼脂20g/L；PDA加富1培养基配方为：土豆200g/L(煮汁)、葡萄糖20g/L、琼脂20g/L；PDA加富2培养基配方为：土豆汁200g/L、葡萄糖20g/L、磷酸二氢钾3g/L、硫酸镁1.5g/L、VB1 0.1g/L、蛋白胨2g/L、酵母粉1.5g/L、琼脂20g/L；改良PDA培养基配方为：土豆汁200g/L、葡萄糖20g/L、磷酸二氢钾3g/L、硫酸镁1.5g/L、VB1 0.1g/L、琼脂20g/L。

其中，步骤(3)中，所述的原生质体的制备，采用的酶体系为：总酶量为0.67g/100mL的M1、总酶量为2.17g/100mL的M2、总酶量为1.83g/100mL的M3、总酶量为4.0g/100mL的M4、总酶量为3.17g/100mL的M5。

优选的，总酶量为2.17g/100mL的M2的酶体系，其原生质体的再生数量为4.65*10⁷个/mL，再生率为1.67％，再生时间为14d。

具体的，所述的M2的酶体系，其酶体系配方为：牛血清蛋白50mg、蜗牛酶50mg、崩溃酶50mg、Lysing enzymes 50mg、Yatalase 50mg、β-glucuronidase 100μL、果胶酶100mg、纤维素酶200μL、稳定剂30mL，pH 5.0-6.0；其中，所述的稳定剂配方为：10mM NaH₂PO₄、0.8MNaCl，pH6.0。

其中，步骤(3)中，所述的ARTP诱变，其参数设置为：工作功率100W、工作气流10SLM、照射距离2mm条件下，设置照射时间0-180s。

优选的，ARTP诱变，其参数设置为：工作功率100W、工作气流10SLM、照射距离2mm条件下，设置照射时间120s。

其中，步骤(3)中，所述的平板观察验证法，具体为：选取出发菌株GXGD-13-1与筛选出的10株菌同时接种于PDA平板和刚果红平板上，并进行对比观察、记录；

其中，步骤(3)中，所述的液体验证培养法，具体为：选取出发菌株GXGD-13-1与筛选出的10株菌，同时接种于一级种子液中，26℃、150rpm培养8d后，再按10％v/v的接种量转接至二级种子液中，进行对比观察，培养4d对样品进行指标检测。

具体的，所述的一级种子液和二级种子液其配方为：黄豆粉30g/L、葡萄糖30g/L、酵母膏3g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、无水硫酸镁0.5g/L、七水和硫酸亚铁0.18g/L、VB₁0.01g/L，pH6.0，装液量为150mL/500mL。

其中，步骤(4)中，所述的平板对峙拮抗实验，具体为：用移液器(打孔器)选取一致性相同的菌株GXGD-EF-13-JD-1与GXGD-13-1，同时点种于PDA平板上两侧，观察记录，发现新菌株与原始菌株产生拮抗，出现隆起现象。

其中，步骤(4)中，所述的新菌株GXGD-EF-13-JD-1，经显微镜下分子鉴定，菌丝体直径2.73-3.16μm，菌丝体存在锁状联合结构。

上述选育的红平菇高产真菌在产纤维素酶中的应用也在本发明所保护的范围之内。

具体的，所述的纤维素酶，其酶活在14U/mL以上。

有益效果：本发明通过从已知15株大型真菌筛选出生长速率和纤维素酶活最高的一株红平菇作为出发菌株，经过尖端分离驯化进一步提升其生长速率，生物量及蛋白产量。从5种酶体系中筛选出原生质体数量最多的、再生率最高的、再生时间最短的酶系M2，并对ARTP诱变技术条件进行探究，筛选最佳诱变时间等条件。采用酶系M2制备原生质体联合ARTP诱变技术，选育出了一株生长速度快、高纤维素酶活和高产蛋白的红平菇菌株GXGD-EF-13-JD-1。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。

图1：关于15株大型食用真菌的纤维素酶活情况表征。

图2：尖端分离获得菌株与出发菌株对比图(左边GXGD-13、右边GXGD-13-1)。

图3：酶体系M2(明场)酶解3h的原生质体的制备情况(40*16倍)备注：原生质体的大小在4-8微米之间。

图4：酶体系M2(暗场)酶解3h的原生质体的制备情况(左边10*16倍、右边40*16倍)。

图5：ARTP诱变涂布情况。

图6：拮抗实验(左边GXGD-13-1、右边GXGD-EF-13-JD-1)。

图7：菌株GXGD-EF-13-JD-1的显微结构。

具体实施方式

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

下述实施例中，所述的出发菌株红平菇菌种(GXGD-13)：来源于江苏省农科院菌种保藏中心赠送，保藏中心的内部编号为NKY_H2020.15。

下述实施例中，所述的纤维素酶活，其定义为：纤维素酶活力单位是指55℃、pH5.0的条件下，以每分钟催化羧甲基纤维素钠水解生成1μmol还原糖所需的酶量定义为一个酶活力单位U。

下述实施例中，所述的酶体系中所用融壁酶Lywallzyme、几丁质酶、牛血清蛋白、蜗牛酶、崩溃酶、Lysing enzymes、Yatalase、β-glucuronidase、果胶酶、纤维素酶、壳聚糖酶均购自于美谷生物(Taka)。

实施例1：对菌库已有大型食用真菌进行初筛

从南京高新工大生物技术研究院有限公司大型食用真菌菌库中编号为GXGD-1至GXGD-15的15株菌株(GXGD-1为撕裂蜡孔菌、GXGD-2为灵芝、GXGD-3为红芝、GXGD-4为桑黄、GXGD-5为秀珍菇、GXGD-6为牛樟芝、GXGD-7为白参、GXGD-8为鸡腿菇、GXGD-9为茯苓、GXGD-10为羊肚菌、GXGD-11为赤芝、GXGD-12为金针菇、GXGD-13为红平菇、GXGD-14为大球盖菇、GXGD-15为蜜环菌)，筛选出生长速度长得快且纤维素酶活产量高的菌株为出发菌株。在PDA平板上，观察其生长速度，在刚果红平板上观察其纤维素酶活情况，具体实施步骤为：

(1)菌种活化：将15株大型食用菌菌种用接种铲转接至PDA平板培养基上，置于26℃恒温培养箱培养6-7d，待菌丝长满平板，备用。

(2)分别将菌株点种(牛津杯或枪头制备统一规格大小出发菌)于配方PDA平板上和刚果红平板上，每株3块板子。在PDA平板观察记录其生长情况；在刚果红平板上观察记录纤维素酶产生菌株周围是否有水解圈，然后测定产酶圈的大小，选择H/C值(透明圈与菌落直径大小之比)，在第6d观察并记录情况，如表1，图1。

其中，PDA平板配方为：土豆汁200g/L、葡萄糖20g/L、磷酸二氢钾3g/L、硫酸镁1.5g/L、VB₁ 0.1g/L。

其中，刚果红平板配方为：羧甲基纤维素钠10g/L、KH₂PO₄ 2g/L、MgSO₄·7H₂O0.5g/L、MnSO₄ 0.5g/L、刚果红0.4g/L、琼脂20g/L，加蒸馏水至1000mL、用醋酸调节pH值为6.0。

表1关于15株大型食用真菌的生长速度及纤维素酶活情况表征

结果分析：表1为南京高新工大生物技术研究院有限公司大型食用真菌菌库中15株菌株，在PDA平板上和刚果红平板上，第6d的生长速度及纤维素酶活情况表征。根据表1结果表明，GXGD-13的生长速度达到7.8mm/d，具备较高生长速度，同时其在刚果红培养基上H/C值达到1.32，纤维素酶活力最大；因此选择GXGD-13为进一步研究的出发菌株。

实施例2：对GXGD-13菌株进行尖端分离复壮驯化法，具体实施步骤如下：

(1)将目标菌株GXGD-13在PDA平板上活化好(长到2/3平板即可)，将菌株尖端较薄的约1厘米的菌丝体，转接到纯琼脂平板上，挑选10-20个，培养长到2/3平板，长成新菌株。

(2)从步骤(1)培养的新菌株中挑选1株健壮的菌株，将其尖端1厘米的菌丝体进行分离，挑选10-20个，转接到PDA平板上，培养长到2/3平板，长成新菌株。

(3)再次从步骤(2)培养的新菌株中挑选1株健壮的菌株，将其尖端1厘米的菌丝体进行分离，挑选10-20个，转接到PDA加富1平板上，培养长到2/3平板，长成新菌株。

(4)再次从步骤(3)培养的新菌株中挑选1株健壮的菌株，将其尖端1厘米的菌丝体进行分离，挑选10-20各，转接到PDA加富2平板上，培养长到1/2平板，长成新菌株；同时转接出发菌株GXGD-13。

(5)最后从步骤(4)培养的新菌株中挑选1株健壮的菌株，将其尖端1厘米的菌丝体进行分离，转接到改良平板上，进行驯化培养获得菌株GXGD-13-1，同时转接出发菌株GXGD-13，对比其生长情况进行对比观察。

(6)将步骤(5)中获得的菌株GXGD-13-1与出发菌株GXGD-13同时接入PDA培养基平板上和PDA液体培养基中，置于26℃、150rpm下培养观察，观察其生长情况如图2，表2。

其中，纯琼脂培养基配方为：琼脂20g/L、水1000mL；

PDA培养基配方为：土豆200g/L(煮汁)、琼脂20g/L；

PDA加富1培养基配方为：土豆200g/L(煮汁)、葡萄糖20g/L、琼脂20g/L；

PDA加富2培养基配方为：土豆汁200g/L、葡萄糖20g/L、磷酸二氢钾3g/L、硫酸镁1.5g/L、VB1 0.1g/L、蛋白胨2g/L、酵母粉1.5g/L、琼脂20g/L；

改良PDA培养基配方为：土豆汁200g/L、葡萄糖20g/L、磷酸二氢钾3g/L、硫酸镁1.5g/L、VB1 0.1g/L、琼脂20g/L。

表2菌株GXGD-13与菌株GXGD-13-1的各指标对比情况

项目/编号	GXGD-13	GXGD-13-1	提升率(％)
				生长速率(mm/d)	7.80	8.80	12.82
干重(g/L)	14.83	16.46	10.99
				蛋白含量(g/L)	3.90	4.40	12.82
纤维素酶活(U/mL)	4.56	5.05	10.75

结果分析：尖端分离后的菌株GXGD-13-1生长速率为8.8mm/d，相对于出发菌株GXGD-13生长速率为7.8mm/d，生长速度提高了12.82％；GXGD-13-1干重为16.46g/L，相对于出发菌株GXGD-13干重为14.83g/L，干重提升了10.99％；GXGD-13-1蛋白含量4.40g/L，相对于出发菌株GXGD-13蛋白含量3.90g/L，蛋白含量提升了12.82％；GXGD-13-1的纤维素酶活为5.05U/mL，相对于出发菌株GXGD-13的纤维素酶活4.56g/L，纤维素酶活提升了10.75％。

实施例3：对菌株GXGD-13-1菌株进行原生质体制备，具体实施步骤如下：

(1)菌种活化：将菌株GXGD-13-1用接种铲转接至改良PDA培养基上，置于26℃恒温培养箱培养6-7d，待菌丝长满平板，备用。

(2)种子液的制备：将步骤(1)中长好的平板，按照每瓶接4-5个直径为0.5cm大小的菌块，接种于种子培养基中，每组两个平行，26℃、150rpm培养，培养5-8d，观察良好，备用。

(3)将酶体系用稳定剂溶解，离心后用孔径100μm的黄色水系滤膜过膜除菌得到酶解液，备用。

(4)将步骤(2)制备的种子液用mircloth神奇滤布过滤，刮取1-2g菌丝体，用稳定剂冲洗1-2遍，置于酶解液中30℃，200rpm酶解。在3h，采用血球计数法对酶解产生的原生质体进行观察，计数并计算(个/mL)，并观察记录结果如表3。

(5)原生质体纯化：将步骤(4)酶解后的酶液用mircloth神奇滤布过滤，除去没有酶解完全的菌丝体，滤液8000rpm、离心10分钟，弃上清，用稳定剂重悬一遍，8000rpm、离心10分钟，弃上清，最后用稳定剂重悬至0.5mL。吸取200μL涂布于再生平板2块，并做好标记，剩余100μL留作镜检，26℃静置培养。同时涂布同等条件下的种子液作为对照。

(6)荧光染色(FDA)：取步骤(5)洗涤重悬过的原生质体悬浮液0.1mL，置于2mL离心管中，加入FDA溶液使其最终浓度为0.01％(按照1:1体积比)，混匀置于室温条件下5min后，用显微镜观察。

(7)先观察明场(普通光学显微镜)再观察暗场(FDA荧光条件下)，发荧光的原生质体为有活力的，不产生荧光的为无活力的。由于叶绿素的关系，叶肉原生质发黄绿色荧光的为有活力的，发红色荧光的为无活力的。

其中，种子液配方为：黄豆粉30g/L、葡萄糖30g/L、酵母膏3g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、无水硫酸镁0.5g/L、七水和硫酸亚铁0.18g/L、VB1 0.01g/L。pH＝6.0，装液量150mL/500mL。26℃、150rpm培养5d。

其中，再生平板配方为：0.6mol/L蔗糖、抗生素50mg/L、土豆汁200g/L、葡萄糖20g/L、磷酸二氢钾3g/L、硫酸镁1.5g/L、VB₁ 0.1g/L。

其中，FDA试剂的配方为：2mg的FDA溶于1ml的丙酮中作为母液，冰箱保存。

其中，稳定剂配方为：10mM NaH₂PO₄+0.8M NaCl，pH 6.0。

其中，酶体系配方为如下：

M1(0.67g/100mL的酶浓度、pH 5.0-6.0)：融壁酶Lywallzyme 150mg、几丁质酶50mg、稳定剂30ml。

M2(2.17g/100mL的酶浓度、pH 5.0-6.0)：牛血清蛋白50mg、蜗牛酶50mg、崩溃酶50mg、Lysing enzymes 50mg、Yatalase 50mg、β-glucuronidase 100μL、果胶酶100mg、纤维素酶200μL、稳定剂30mL。

M3(1.83g/100mL的酶浓度、pH 5.0-6.0)：牛血清蛋白50mg、蜗牛酶50mg、崩溃酶50mg、Lysing enzymes 50mg、Yatalase 50mg、果胶酶100mg、纤维素酶200μL、稳定剂30mL。

M4(4.0g/100mL的酶浓度、pH 5.0-6.0)：牛血清蛋白50mg、蜗牛酶100mg、崩溃酶50mg、Lysing enzymes 100mg、果胶酶200mg、几丁质酶200mg、β-glucuronidase100μL、壳聚糖酶200mg、纤维素酶200μL、稳定剂30mL。

M5(3.17g/100mL的酶浓度、pH 5.0-6.0)：牛血清蛋白50mg、蜗牛酶100mg、果胶酶200mg、几丁质酶200mg、壳聚糖酶200mg、纤维素酶200μL、稳定剂30mL。

表3关于不同酶系菌株GXGD-13-1的原生质体制备情况

酶系	原生质体数量(个/mL)	再生率％	再生时间(d)
				M1	5.10*10⁶	0.205％	18
M2	4.65*10⁷	1.67％	14
				M3	4.25*10⁶	5.45*10^-4％	22
M4	2.3*10⁶	8.5*10^-2	30
				M5	6*10⁵	1.67*10^-3	17

结果分析：根据表3结果表明，酶系M1、M2、M3、M4、M5均能够成功制备出原生质体，数量在6*10⁵-4.65*10⁷个/mL，但是其再生率有着较大差别，其中酶系M2的再生率最高，达到1.67％；再生时间酶系M2的时间也是最短为14d。综合考虑酶系M2作为后期诱变预处理的最优体系。酶系M2在3h原生质体制备情况(原生质体的数量及活力)如图3、图4。

实施例4：对菌株GXGD-13-1菌株进行ARTP诱变法，具体实施步骤如下：

(1)按照实施例3的步骤(1)和(2)对菌株GXGD-13-1菌种活化和种子液的制备。

(2)菌丝体悬液的制备：将步骤(1)培养好的种子液用玻璃珠摇匀打散，用神奇滤布过滤，制得菌丝悬液100-200mL，用10000rpm离心机离心10min，倒去上清液，沉淀用10％的甘油稀释至1mL，浓缩100-200倍后，备用。

(3)原生质体的制备：按照实施例3的方法步骤，采用酶系M2制备菌丝体原生质体，纯化后调整原生质体的数量为10⁵-10⁶CFU/mL，备用。

(4)ARTP诱变：分别吸取10-15μL步骤(2)制备的菌丝体悬液和步骤(3)制备的原生质体均匀涂布在小铁片上(多涂一些备用)，控制液层厚度为0.2-0.4cm，放在玻璃平板上盖好，备用。设置ARTP诱变仪的条件为：工作功率100W、工作气流10SLM、照射距离2mm条件下，设置照射时间0-180s。诱变结束将样品放置于装有150μL 0.85％生理盐水的2mL离心管中，用磁悬浮震荡仪洗脱震荡，洗脱震荡时间不少于1min，备用。

(5)涂布平板：将步骤(4)诱变的平板涂布于PDA平板上、26℃静置培养，平板上长出单菌落后，计算其诱变致死率情况，如表4。

表4菌丝体悬液与原生质体的诱变致死率情况

结果分析：根据表4菌丝体悬液与原生质体的诱变致死率情况分析，结果表明菌丝体存在诱变致死率不稳定，突变情况不可控等问题，原生质体诱变情况稳定、可控，且发现其致死率与诱变条件呈较好的正相关关系。发现在诱变时间为120S时，其致死率高，具备产生较优突变株的潜力，因此该条件作为进一步诱变筛选的条件。

实施例5：对菌株GXGD-13-1菌株进行原生质体联合ARTP诱变法，具体实施步骤如下：

(1)按照实施例3制备好原生质体，按照实施例4进行ARTP诱变，诱变时间设为120s。

(2)涂布平板：将诱变平板涂布于PDA平板和刚果红平板上，26℃静置培养，部分结果如图5；

(3)筛选：待PDA平板和刚果红平板上长出单菌落后，挑选10株，生长快速，菌落较大(或透明圈较大)的单菌落，并对其命名为GXGD-EF-13-JD-1至GXGD-EF-13-JD-10，对其进行转接PDA上培养，待菌丝生长至整个平板后，备用。

(4)验证：结合平板观察验证法和液体验证培养法，对其生长速度，生物量，粗蛋白及纤维素酶活情况进行表征。

其中，平板观察验证法：选取出发菌株GXGD-13-1与筛选出10株菌，保持菌株接种时间一致，同时接种于PDA平板上、刚果红平板上(每株2块平板)，进行对比观察、记录，如表5。

其中，液体验证培养法：同理同时接种于种子液中(为一级种子液)，26℃、150rpm培养8d。再转接一次种子液培养基中(为二级种子液，接2瓶)，接种量控制一致(摇晃均匀后，按照体积比10％)，进行对比观察，培养4d对样品进行指标检测，结果，如表5。

表5对出发菌株GXGD-13-1和10株突变菌株各指标检测情况

结果分析：通过原生质体联合ARTP诱变法的优选的10株长势优良的菌株，对其进行生长速度、生物量、粗蛋白及纤维素酶活情况进行表征如表5。根据表5结果表明，菌株GXGD-EF-13-JD-1的生长速度为15.12mm/d、生物量为20.43g/L、粗蛋白为6.80g/L，纤维素酶活更是达到了14.36U/mL，相对于出发菌株GXGD-13-1、GXGD-13各指标均有显著提升，且优于其他菌株。将获得的高性能菌种菌株编号为GXGD-EF-13-JD-1进行保藏。

实施例6：对新菌株GXGD-EF-13-JD-1的鉴定和保藏

(1)平板对峙法拮抗实验：用移液器(打孔器)选取一致性相同的菌株GXGD-EF-13-JD-1与GXGD-13-1，同时点种于PDA平板上两侧，观察记录结果如图6。图6结果表明新菌株与原始菌株产生拮抗，出现隆起现象。新菌株GXGD-EF-13-JD-1的菌丝形态特点如图7所示，菌丝体直径2.73-3.16μm，菌丝体存在锁状联合结构。

(2)分子鉴定：对新菌株GXGD-EF-13-JD-1菌丝体进行测序分析，引物ITS1(SEQ IDNo.:2)：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，引物ITS4(SEQ ID No.:3)：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。测序结果如SEQ ID No.:1所示，获得913bp大小的片段(由武汉擎科生物技术有限公司进行PCR扩增及测序)，具体序列如下。

GGCTGTCTACCTGATTTGAGGTCAATTGTCAAAGTAATTGTCCCTTGAGACGATTAGAAAGCTGGACAATATAAGAATTGCATGCGTCTAACGTAAAATATTTTCCC CCTATGGCCCGAAGGCACCAAGTCCCGCTAATGGCTTTAAGAAGAACCCAATTCCAAAGAAGAAGCCCGCCACCCCCCACAATCCCAACCGCTACCACCATAAAGTCCTAAAGTTTGAAAATTTAATGGCCCTCCAACCGGGATGGCCTTCCGAATACCCAAGGGCGCAAGGGGGGTTCCAAGAATCCAAGAATCCCTGGATTCTGGCATTCCCATTACTTTTCCCATTTCCCTGCCTTCCTCCTCCATGCCAGAACCCAGAAAACCGTTGGTGAAAGTTGGATTAAGTTTATAAAGGTCCTGGGCCTGGTTAATAAAAACCCCTTCCTTAATAAAACATACATTTGGGGGGGGGGATAGTATAGAAGTCCTTTAAGGGAACCCAAGGGCTTTTCTCAATTAAAAAAAAAAACCCAAGGGATACCCAAACCCAAACTTTTTCAAGGGGGCACGGGGGTTAAAAGGGAAAAAAAAAGGAGCGGGCCAAATGCCCCTAGAACCCCACAAAACCACCTAAAAAGCTTTGGAAATTCAAAAAGGACCCTTCCCCGGGTCCCCCCTACGGAAACCTTTTTCAAACTTTTACTTCCTAAAAAAAGCCCCAAAAAAAAATCTTTGCATCTTAGTCAGGGGGATCCTTACGAGGCAGCAGATGATAGAGCAGCTTTATTGTCCGACCATCGCCTCAATATCAGAATCCCACTGGTGTCTACTACATCTGTTATCATCCTCTCTTACGACTGATGTCGACATGCTGTATCATTGGGCATCTCATACATACAAGGAAGAATAGAAGTGCATTGACT

(3)送菌株保藏中心保藏

一株红平菇高产菌株，分类命名为红平菇(Pleurotus djamor)，菌株号GXGD-EF-13-JD-1，已于2022年11月09日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62953，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

本发明提供了一株红平菇高产真菌及其在产纤维素酶中的应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

Claims

1.一株红平菇高产真菌，分类命名为红平菇Pleurotus djamor，菌株号GXGD-EF-13-JD-1，已于2022年11月09日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62953。

2.权利要求1所述的红平菇高产真菌在产纤维素酶中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的纤维素酶，其酶活在14 U/mL以上。