CN108575738A - 甘蓝型油菜游离小孢子培养微波诱变方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于油菜育种技术领域，具体涉及甘蓝型油菜游离小孢子培养微波诱变方法，小孢子提取、灭菌后培养，离心留下层沉淀，再次培养、清洗离心，进行低温热分散间歇微波辐照处理；将处理后培养液离心沉淀，32℃下暗培养，换液培养，然后转入25℃暗培养；待长胚状体后，振荡暗培养；长出子叶型胚状体在MS培养基成苗；成苗材料进行继代培养，10月初炼苗移栽入大田。本发明用微波作诱变剂，具实验设备简单、对环境无危害等突出优势；在小孢子培养过程中增加步骤，可操作性强；诱变对象为单倍体敏感期的单一细胞，其诱变效率较诱变种子高；小孢子培养产生的DH系为纯合双二倍体，隐性突变性状当代可表达，变异性状筛选快捷、高效。
Description
技术领域
本发明属于油菜育种技术领域，具体涉及甘蓝型油菜游离小孢子培养微波诱变方法。
背景技术
油菜是我国最重要的油料作物之一，产量和播种面积均居世界首位。目前，甘蓝型油菜在我国广泛种植，其种质资源主要来自欧洲，遗传背景比芸薹属其他作物狭窄，遗传基础薄弱，所育成品种利用的基因集中到少数有利用价值和适应优势的种质上，制约了我国甘蓝型油菜的育种工作。因此，利用先进技术对现有的种质资源进行创新，拓宽遗传基础在当今油菜研究领域具有重大意义。
诱变育种作为种质资源创新和农艺性状改良的重要手段之一，已在油菜育种中发挥重要作用。国内外众多学者(Thuling，1992；Tonnemake，1992；董遵等，2003；石淑稳等，1995；李加纳等，1997；周永明等，1998；曲高平等，2014)曾用X、射线、中子、β射线、UV紫外线、离子束和热中子以及各种化学诱变剂处理种子，分别获得了早熟、长角果、高含油量、低亚麻酸、低硫苷、低芥酸、高油酸和抗除草剂等突变体。
诱变种子是最简便的诱变方法，但突变体的选择只能在M2代后进行。由多基因控制的性状需要多代自交后方能稳定，隐性突变基因易丢失，且突变体的获得需要的年限长，田间鉴定所需群体大、效率较低。而单倍体离体诱变很好解决了上述问题，日益成熟的油菜小孢子培养更是促进了诱变育种技术发展。小孢子培养时选取的材料正处于细胞旺盛分裂和对环境敏感阶段，其诱变率是诱变种子的数十倍；所需诱变剂浓度较低，降低了诱变剂对细胞的生理毒害；小孢子培养获得的双单倍体植株基因纯合，隐性变异当代表现，可对变异进行当代选择，降低了选择成本，可针对突变方向难以掌握的问题采取增加诱变群体大小的方法，且小孢子作为实验材料本身就具有群体大、个体小，易于试验操作等优点。
石淑稳等(1997)把甘蓝型油菜小孢子培养的次生胚性物切块接种在EMS液体培养基后进行分化培养获得特矮型突变体植株。Barro等(2001)用EMS诱变埃塞俄比亚芥，使再生植株的种子芥酸和油酸含量变异很大。和江明等(2003,2004)用EMS诱变甘蓝型油菜小孢子获得了高油酸材料(油酸含量＞80％)。谢艳平(2008)用EMS诱变甘蓝型油菜小孢子获得了矮化、粉色花瓣、白色花瓣等突变体。万光龙(2010)基于油菜小孢子高效胚胎发生技术，利用EMS诱变与ZJ0273选择培养，筛选到抗除草剂植株。
由此可见，油菜小孢子离体诱变的成功，为遗传背景狭窄的油菜育种提供了拓宽种质资源的巨大潜力。在过去研究中，研究者多数选择EMS为诱变剂，EMS诱变效果较好，但其价格较高、对环境污染大，故研究者希望找到一种更为安全高效的诱变方式。
发明内容
针对上技术问题，本发明提供一种甘蓝型油菜游离小孢子培养微波诱变方法，在已有完善的小孢子培养技术体系上，引入微波诱变技术，构建甘蓝型油菜小孢子微波诱变方法。
具体技术方案为：
甘蓝型油菜游离小孢子培养微波诱变方法，包括以下步骤：
(1)小孢子提取，于田间选取被培养材料3-4mm大小花蕾30个，将花蕾装在球形茶叶滤器中放入10-15％NaCLO液体中，再加2-3滴吐温20灭菌20分钟，无菌水清洗3次；
(2)将灭菌后花蕾转入蒸发皿中，加入少量NLN-13液体培养基，用玻棒捣碎，转入带滤网的漏斗中过滤至10ml离心管；
(3)将此10ml离心管1000转离心5分钟，留下层沉淀，再次加入NLN-13液体培养基，清洗离心，共清洗2次；
(4)将清洗后小孢子细胞进行低温热分散间歇微波辐照处理；即将装有小孢子细胞培养液的离心管放入装有冰水混合物的不透明盒子内，将盒子整个放入微波炉内进行微波辐照，辐照到冰水混合物中冰全部融化为止，再更换新的冰水混合物盒子，继续辐照处理，处理时长累计200S。
(5)将处理后培养液离心沉淀，再加入含200-300mg/L秋水仙碱NLN-13液体培养基20ml，分装到三角瓶，每瓶10ml；
(6)32℃下暗培养24小时；
(7)换液培养，收集前一天培养的小孢子，500转离心5分钟并清洗1-2次，分装到无秋水仙碱的NLN-13液体培养基20ml中，用d＝90mm培养皿存装，5ml/皿，放入32℃培养箱中培养2天；
(8)转入25℃暗培养；
(9)待长出肉眼可见胚状体后，25℃、60转/min振荡暗培养；
(10)长出子叶型胚状体在MS培养基成苗；
(11)成苗材料进行继代培养，10月初炼苗移栽入大田。
本发明提供的甘蓝型油菜游离小孢子培养微波诱变方法，用微波作诱变剂，具实验设备简单、对环境无危害等突出优势；在小孢子培养过程中增加步骤，可操作性强；诱变对象为单倍体敏感期的单一细胞，其诱变效率较诱变种子高；小孢子培养产生的DH系为纯合双二倍体，隐性突变性状当代可表达，变异性状筛选快捷、高效。该方法将微波诱变和油菜游离小孢子培养技术融为一体，可广泛应用于甘蓝型油菜种质创新与材料选育，加速育种进程。
具体实施方式
结合实施例说明本发明的具体技术方案。
甘蓝型油菜游离小孢子培养微波诱变方法，包括以下步骤：
被诱变材料为23R，系甘蓝型油菜波里马细胞质雄性不育杂交油菜品种德恒油900的恢复系，为小孢子培养获得的再生植株后代。运用微波诱变处理方法对其进行诱变处理。
(1)材料23R于2月底进入初花期，于初花期选取主花序上3-4mm大小花蕾30个，将其冷藏带回实验室进行灭菌处理。灭菌采用10-15％NaCLO液体，再加2-3滴吐温20灭菌20分钟，无菌水清洗3次；
(2)将灭菌后花蕾转入蒸发皿中，加入少量NLN-13液体培养基，用玻棒捣碎，转入带滤网的漏斗中过滤至10ml离心管；
(3)将此10ml离心管1000转离心5分钟，留下层沉淀，再次加入NLN-13液体培养基，清洗离心，共清洗2次；
(4)将清洗后小孢子细胞进行低温热分散间歇微波辐照处理；即将装有小孢子细胞培养液的离心管放入装有冰水混合物的不透明盒子内，将盒子整个放入微波炉内进行微波辐照，辐照到冰水混合物中冰全部融化为止，再更换新的冰水混合物盒子，继续辐照处理，处理时长累计200S。
(5)将处理后培养液离心沉淀，再加入含200-300mg/L秋水仙碱NLN-13液体培养基20ml，分装到三角瓶，每瓶10ml；
(6)32℃下暗培养24小时；
(7)换液培养，收集前一天培养的小孢子，500转离心5分钟并清洗1-2次，分装到无秋水仙碱的NLN-13液体培养基20ml中，用d＝90mm培养皿存装，5ml/皿，放入32℃培养箱中培养2天；
(8)转入25℃暗培养；
(9)待长出肉眼可见胚状体后，25℃、60转/min振荡暗培养；
(10)长出子叶型胚状体在MS培养基成苗；
(11)成苗材料进行继代培养，10月初炼苗移栽入大田。
(12)微波诱变处理后突变材料筛选：
对诱变所得材料进行田间表型观察记载，其套袋自交种子进行近红外品质测试，与未处理后代植株对比，标记变异农艺性状，最终确定变异材料6份。
1、微波诱变材料田间表型变异
田间观察记载过程中，发现2份变异材料(wb1和wb2)。wb1为花形态变异材料，表现为花药肥大，花瓣变厚。对其进行套袋自交，结实率较差，所得种子形状不规则，多为胎萌。wb2植株形态无差异，但该材料及其自交后代株系初花期均明显晚于对照材料。2016-2017年度种植时，wb2株系初花期为2月23日，明显晚于原始供体材料初花期(2月15日)。
2、微波诱变材料经济性状变异
对所得材料套袋自交种子籽粒颜色、千粒重、胎萌情况观察测量，确定2份高千粒重材料(wb3和wb4)，籽粒颜色和胎萌情况上未见明显差异。
表1突变材料套袋结实情况及千粒重表现
3、微波诱变材料品质性状变异
对所得材料套袋自交种子进行近红外品质分析，确定亚麻酸减少、脂肪增加材料1份，亚麻酸减少、油酸和脂肪同时增加材料1份，分别定名为wb5和wb6。
该实施例获得高千粒重、花形变异、高油酸等稳定突变体材料共6份。
Claims (2)
1.甘蓝型油菜游离小孢子培养微波诱变方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)小孢子提取，于田间选取被培养材料3-4mm大小花蕾30个，将花蕾装在球形茶叶滤器中放入10-15％NaCLO液体中，再加2-3滴吐温20灭菌20分钟，无菌水清洗3次；
(2)将灭菌后花蕾转入蒸发皿中，加入少量NLN-13液体培养基，用玻棒捣碎，转入带滤网的漏斗中过滤至10ml离心管；
(3)将此10ml离心管1000转离心5分钟，留下层沉淀，再次加入NLN-13液体培养基，清洗离心，共清洗2次；
(4)将清洗后小孢子细胞进行低温热分散间歇微波辐照处理；
(5)将处理后培养液离心沉淀，再加入含200-300mg/L秋水仙碱NLN-13液体培养基20ml，分装到三角瓶，每瓶10ml；
(6)32℃下暗培养24小时；
(7)换液培养，收集前一天培养的小孢子，500转离心5分钟并清洗1-2次，分装到无秋水仙碱的NLN-13液体培养基20ml中，用d＝90mm培养皿存装，5ml/皿，放入32℃培养箱中培养2天；
(8)转入25℃暗培养；
(9)待长出肉眼可见胚状体后，25℃、60转/min振荡暗培养；
(10)长出子叶型胚状体在MS培养基成苗；
(11)成苗材料进行继代培养，10月初炼苗移栽入大田。
2.根据权利要求1所述的甘蓝型油菜游离小孢子培养微波诱变方法，其特征在于，步骤(4)低温热分散间歇微波辐照处理的方法为，将装有小孢子细胞培养液的离心管放入装有冰水混合物的不透明盒子内，将盒子整个放入微波炉内进行微波辐照，辐照到冰水混合物中冰全部融化为止，再更换新的冰水混合物盒子，继续辐照处理，处理时长累计200S。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115669536A (zh) * | 2022-11-11 | 2023-02-03 | 成都市农林科学院 | 一种双单倍体及化学诱导联合作用的甘蓝类蔬菜育种方法 |
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2018
- 2018-06-05 CN CN201810567576.4A patent/CN108575738A/zh active Pending
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| 和江明等: "用EMS诱变和小孢子培养快速获得甘蓝型油菜高油酸种质材料的研究", 《西南农业学报》 * |
| 林海: "《环境工程微生物学》", 31 May 2014 * |
| 贾红华等: "微波诱变育种研究及应用进展", 《工业微生物》 * |
| 马燕: "L-甲硫氨酸产生菌诱变育种和突变株发酵条件研究", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库（硕士）工程科技Ⅰ辑》 * |
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| CN115669536A (zh) * | 2022-11-11 | 2023-02-03 | 成都市农林科学院 | 一种双单倍体及化学诱导联合作用的甘蓝类蔬菜育种方法 |
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