CN102690839B - 烟草普通花叶病毒抗性的种内基因改良方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种烟草普通花叶病毒抗性的种内基因改良方法，属于生物技术领域，包括下列步骤：（1）构建普通烟草来源的Pubi.u4启动子驱动TMV-N基因表达且被Tubi.u4终止表达的烟草种内基因表达载体pSH-P-N-T；（2）将种内基因表达载体pSH-P-N-T和仅含标记基因的表达载体pSH737通过农杆菌介导法，对烟草外植体进行共转化，筛选获得T0代转化烟株；（3）通过T1代遗传分离和筛选验证，获得无标记基因的烟草普通花叶病毒（TMV）抗性的种内基因改良植株。本发明对普通烟草既实现了无标记转化，也消除了非烟草源基因序列的影响，从而更大程度上实现了转基因安全。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地说是涉及一种利用普通烟草种内的基因表达调控序列和功能基因对普通烟草种质进行改良的方法。
背景技术
转基因技术打破了物种界限，使不同物种间的基因可以进行前所未有的新组合，但是在转基因作物育种中，往往既引入了其他物种的功能基因、启动子、终止子等表达调控序列，也转入了β-葡萄糖苷酸酶（GUS）基因、绿色荧光蛋白（GFP）基因、抗生素或除草剂抗性基因等选择标记。这些转基因作物在展现优异特性的同时，也给社会大众带来环境安全和食品安全等多方面忧虑，尤其是转基因植物用来生产功能食品、药品和工业原料，人们担心这些分子及其产物可能会污染环境和人类的食物链。
这些顾虑延滞了转基因作物的生产和应用，因此转基因安全研究也成为新的科学热点领域，国际上就转基因的安全性方面也进行了许多研究和探索，新一代植物转基因技术不断涌现，如采用全植物源启动子和基因进行转化植物，而不采用微生物或动物来源DNA的转化法（All-native DNA transformation）、用一系列分子策略阻止转基因运动的基因利用限制技术（Genetic use restriction technology，GURT）、无标记共转化技术（Marker free co-transformation）、转化基因表达功能后诱导删除技术（gene-deletor）等。
这些研究主要通过各种技术手段对转入作物的外源DNA序列的迁移，实现绝大部分的限制或删除，但依然难以消除转基因作物给食品安全和环境安全带来的顾虑，而种内基因转移是容易被公众接受的，有助于消除以上一些安全方面的顾虑。如果将种内基因转移与无标记基因转化相结合，获得的改良作物将非常接近传统杂交育种的产物，但这种策略在烟草上的研究和应用还没有报道。
烟草普通花叶病毒（Tobacco mosaic virus, TMV）是目前世界上研究较为深入的模式病毒，是单链RNA（ssRNA）病毒。TMV具有寄主范围广、抗逆性强、生产危害大等特点，可侵染十字花科、茄科、菊科、藜科和苋科等多种植物，在全世界主要烟草产区均有分布，使烟草和其他农作物的产量和品质大大降低。据报道全世界每年仅TMV 造成的危害就超过1 亿美元。抗TMV烟草种质的培育主要通过传统杂交育种，但很难有效打破抗性基因与不利性状基因的连锁，再加上杂交育种周期长，导致优质可用的种质材料较难培育，因此采用烟草TMV抗性的种内基因转化与无标记基因选择相结合，以改良烟草将具有广阔的应用潜力。
发明内容
本发明目的是克服上述缺点而提供的一种对烟草进行基因工程改良中，同时避免非烟草源基因污染和标记基因引起的环境风险，实现转基因安全的烟草普通花叶病毒抗性的种内基因改良方法。
本发明的一种烟草普通花叶病毒（TMV）抗性的种内基因改良方法，包括以下步骤：
（1）克隆烟草Ubi.u4基因的组成型表达启动子Pubi.u4：
烟草组成型表达启动子Pubi.u4是根据基因银行登记号(Genbank Accession)：X77456中提供的Pubi.u4启动子序列特点，设计和合成扩增引物，上游引物Ubi-1引入HindIII酶切位点，下游引物Ubi-2引入XbaI酶切位点。用PCR方法克隆烟草Ubi.u4 基因796 bp的 Pubi.u4启动子。
Pubi.u4启动子的扩增引物为：
Ubi -1：5’- CCC AAG CTT GGA GGC TAA CTA CGT TAG AGC-3’；
Ubi- 2：5’-TGC TCT AGA TCT GTA TAT ACA GAA AAG GTT-3’；
（2）人工合成终止子Tubi.u4和LB-MCS-RB序列:
烟草终止子Tubi.u4序列为基因银行登记号(Genbank Accession)：X77456中提供的终止序列；LB-MCS-RB序列由多克隆位点（HindIII、XbaI、KpnI、SmaI、BamHI、EcoRI）序列和基因银行登记号(Genbank Accession): HM036220登录的左右边界序列组成；
常规方法合成两端添加BamHI和EcoRI酶切位点的Tubi.u4序列，以及合成两端添加BglII酶切位点的LB-MCS-RB序列备用;
（3）克隆烟草功能基因TMV-N：
根据基因银行登记号（Genbank Accession）: EF091690登录的烟草TMV-N基因的完整序列（CDS）特点，设计和合成扩增引物，上游引物N-1引入KpnI酶切位点，下游引物N-2引入SmaI酶切位点，用反转录PCR方法从普通烟草RNA中克隆3426 bp的烟草普通花叶病毒（TMV）抗性基因TMV-N；
TMV-N基因的扩增引物为：
N-1：5’-CGG GGT ACC ATG GCA TCT TCT TCT TCT TC-3’；
N-2：5’-TCC CCC GGG TCA CCC ATT GAT GAG CTC AT-3’；
（4）构建烟草种内基因表达载体：
将克隆的Pubi.u4启动子、TMV-N基因序列和人工合成的Tubi.u4终止子、LB-MCS-RB序列分别连接到常规载体pGEM-T easy上，构建出pGEM-P、pGEM-N、pGEM-T和pGEM-LB-RB，并转化大肠杆菌感受态，通过蓝白斑筛选获得阳性克隆，测序，以获得正确的Pubi.u4启动子、TMV-N基因、Tubi.u4终止子和LB-MCS-RB序列。
用BglII单酶切pSH737和pGEM-LB-RB，把回收的LB-MCS-RB小片段构建到pSH737大片段上形成pSH-LB-RB；然后用HindIII和XbaI双酶切pSH-LB-RB和pGEM-P，把回收的Pubi.u4小片段构建到pSH-LB-RB上形成pSH-P；用BamHI和EcoRI双酶切pSH-P和pGEM-T，把回收的Tubi.u4小片段构建到pSH-P，从而获得烟草种内基因表达母载体pSH-P-T。
用KpnI和SmaI双酶切pSH-P-T和pGEM-N，把回收的TMV-N小片段构建到pSH-P-T形成pSH-P-N-T，从而得到由烟草组成型启动子Pubi.u4驱动烟草TMV抗性基因TMV-N表达，由烟草终止子Tubi.u4终止基因表达的烟草TMV-N种内基因表达载体pSH-P-N-T。
（5）共转化烟草外植体
将种内基因表达载体pSH-P-N-T与含β-葡萄糖苷酸酶（GUS）基因和新霉素磷酸转移酶（NptII）基因的表达载体pSH737分别用冻融法转化到土壤农杆菌LBA4404，分别挑取含有表达载体pSH-P-N-T或表达载体pSH737的农杆菌单菌落，在含100mg·L-1 卡那霉素和20 mg·L-1 利福平的常规YEP培养基中28℃震荡培养至OD600为0.5~0.7，6000rpm离心5min收集菌体，用重悬培养基重悬菌体后，按照1:1的体积比混合两载体的重悬液；挑选鲜嫩的烟草外植体于混合的重悬菌液中浸泡10min，用无菌滤纸吸干菌液后转接于共培养基上，共培养2天后转入含头孢霉素 300mg·L-1的脱菌培养基上，保持选择压继代2次，直至脱菌完全；将脱菌完全的外植体接于分化培养基上光照培养，光强为3000~4000lux，12~14h/d；每15~20天继代一次，当分化的幼苗长至3~5cm时转移至生根培养基中培养，待苗长至5~10cm时打开瓶盖，炼苗3~5d后移植到土壤中；
（6）子代分离筛选
移栽成活的T0代抗性转化苗切取叶片组织对β-葡萄糖苷酸酶（GUS）进行染色检测，对染色呈蓝色的阳性烟株提取DNA，对嵌合序列Pubi.u4-TMV-N的497 bp进行PCR扩增检测和测序验证，对PCR检测阳性的转基因烟株套袋留种，然后种植T1代，并对T1代继续进行GUS染色和PCR检测，最后从子代中筛选出GUS染色为阴性，但嵌合序列PCR阳性的烟株，从而获得无标记基因的烟草TMV抗性种内基因改良植株。
嵌合序列Pubi.u4-TMV-N的PCR检测引物：
Test-1：5’-TTGATTTTGTTGTACCTGGTTGA-3’；
Test -2：5’-TCTGAGAAAACGACGATGGA-3’，
上述的一种烟草普通花叶病毒抗性的种内基因改良方法，其中植物组织培养各个阶段的培养条件为：诱导、转化为暗培养；脱菌、分化、生根为光培养，光强为3000~4000lux，12~14h/d。重悬培养基中含有100 mg·L-1乙酰丁香酮及20 g·L-1蔗糖；共培养基中含有2.0mg·L-1 6-BA、0.2 mg·L-1 IAA、100 mg·L-1乙酰丁香酮及20g·L-1蔗糖；脱菌培养基中含有2.0mg·L-1 6-BA、0.2 mg·L-1 IAA、300mg·L-1 头孢霉素及30 g·L-1蔗糖；分化培养基含有2.0mg·L-1 6-BA、0.2 mg·L-1IAA、300mg·L-1 头孢霉素、100mg·L-1 卡那霉素及30g·L-1蔗糖；生根培养基中含有0.1 mg·L-1 IAA、300 mg·L-1头孢霉素、70mg·L-1 卡那霉素及20 g·L-1蔗糖。除生根培养基以1/2浓度的MS（MURASHIGE & SKOOG）培养基为基础培养基外，其余培养基均以常规MS培养基为基础培养基。
上述的一种烟草普通花叶病毒抗性的种内基因改良方法，其中1L MS培养基中包含：硝酸钾（KNO3）1900mg，硝酸铵（NH4NO3）1650mg，氯化钙（CaCl2·2H2O）440mg，硫酸镁（MgSO4·7H2O）370mg，磷酸二氢钾（KH2PO4）170mg，硫酸锰（MnSO4·4H2O）22.3mg，硫酸锌（ZnSO4·7H2O）8.6mg，硼酸（H2BO3）6.2mg，碘化钾（KI）0.83mg，钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）0.25mg，乙二胺四乙酸二钠（Na2-EDTA.2H2O）37.25mg，硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）27.8mg，硫酸铜（CuSO4·5H2O）0.025mg，氯化钴（CoCl2·6H2O）0.025mg，肌醇100mg，烟酸0.5mg，维生素B1 0.1mg，维生素B6 0.5mg，甘氨酸2mg，PH值5.80。1L YEP培养基中包含：蛋白胨5.0g，酵母提取物5.0g，氯化钠（NaCl）2.5g，PH值7.20。
本发明的方法与现有技术相比，具有明显的有益效果，由上可知，本发明使用的种内基因表达载体pSH-P-N-T完全采用了普通烟草来源的组成型表达启动子Pubi.u4、终止子Tubi.u4和功能基因序列TMV-N，同时在转化重组的边界序列内没有其他标记基因；当与仅含标记基因的表达载体共转化烟草外植体后，再通过子代分离筛选，即可获得没有任何标记基因的烟草TMV抗性种内基因改良株系，从而实现了对烟草进行基因工程改良中，同时避免非烟草源基因污染和标记基因引起的环境风险，实现了转基因安全。以下通过具体实施方式来进一步说明本发明的有益效果。
附图说明
附图为烟草种内基因表达载体pSH-P-N-T的结构示意图；
具体实施方式
一种烟草普通花叶病毒抗性的种内基因改良方法，包括以下步骤：
（1）克隆烟草Ubi.u4基因的组成型表达启动子Pubi.u4：
从普通烟草品种K326叶片中提取基因组DNA，根据基因银行登记号（Genbank Accession）：X77456中提供的Pubi.u4启动子序列特点，设计和合成扩增引物，上游引物Ubi-1引入HindIII酶切位点，下游引物Ubi-2引入XbaI酶切位点。用PCR方法克隆烟草Ubi.u4 基因796 bp的 Pubi.u4启动子。
Pubi.u4启动子的扩增引物为：
Ubi-1：5’- CCC AAG CTT GGA GGC TAA CTA CGT TAG AGC-3’；
Ubi- 2：5’-TGC TCT AGA TCT GTA TAT ACA GAA AAG GTT-3’；
（2）人工合成终止子Tubi.u4和LB-MCS-RB序列:
根据基因银行登记号（Genbank Accession）：X77456中提供的Tubi.u4终止子序列信息，根据基因银行登记号（Genbank Accession）: HM036220提供的左右边界序列和多克隆位点（HindIII、XbaI、KpnI、SmaI、BamHI、EcoRI）序列信息。常规方法合成两端添加BamHI和EcoRI酶切位点的Tubi.u4序列，以及两端添加BglII酶切位点的LB-MCS-RB序列备用。
（3）克隆烟草功能基因TMV-N：
从普通烟草品种K326叶片中提取基因组RNA，根据基因银行登记号（Genbank Accession）: EF091690登录的TMV-N基因完整序列（CDS）的序列特点，设计和合成扩增引物，上游引物N-1引入KpnI酶切位点，下游引物N-2引入SmaI酶切位点，用反转录PCR方法克隆3426 bp的烟草TMV抗性基因TMV-N。
TMV-N基因的扩增引物为：
N-1：5’- CGG GGT ACC ATG GCA TCT TCT TCT TCT TC-3’；
N-2：5’-TCC CCC GGG TCA CCC ATT GAT GAG CTC AT-3’；
（4）构建烟草种内基因表达载体：
将克隆的Pubi.u4启动子、TMV-N基因序列和人工合成的Tubi.u4终止子、LB-MCS-RB序列分别连接到常规载体pGEM-T easy上，构建出pGEM-P、pGEM-N、pGEM-T和pGEM-LB-RB，并转化Escherichia. coli TG1，通过蓝白斑筛选获得阳性克隆，测序，以获得正确的Pubi.u4启动子、TMV-N基因、Tubi.u4终止子和LB-MCS-RB序列。
用BglII单酶切pSH737和pGEM-LB-RB，把回收的LB-MCS-RB小片段构建到pSH737大片段上形成pSH-LB-RB；然后用HindIII和XbaI双酶切pSH-LB-RB和pGEM-P，把回收的Pubi.u4小片段构建到pSH-LB-RB上形成pSH-P；用BamHI和EcoRI双酶切pSH-P和pGEM-T，把回收的Tubi.u4小片段构建到pSH-P，从而获得烟草种内基因表达母载体pSH-P-T。
用KpnI和SmaI双酶切pSH-P-T和pGEM-N，把回收的TMV-N小片段构建到pSH-P-T形成pSH-P-N-T，从而得到由烟草组成型启动子Pubi.u4驱动烟草TMV抗性基因TMV-N表达，由烟草终止子Tubi.u4终止基因表达的烟草TMV-N种内基因表达载体pSH-P-N-T。转化Escherichia. coli TG1后保存菌种备用。
质粒pGEM-T easy购自Promega公司，宿主菌Escherichia. coli TG1和Agrobacterium tumefaciens LBA4404由本室保存。LA Taq DNA聚合酶，以及各种限制性内切酶HindIII、XbaI、KpnI、SmaI、BamHI、EcoRI和T4 DNA连接酶均为TaKaRa 产品，其余试剂为分析纯。细菌增殖培养所用培养基为常规LB培养基，含质粒细菌的LB培养基中添加卡那霉素浓度为100mg·L-1。
（5）共转化烟草外植体
将种内基因表达载体pSH-P-N-T与含β-葡萄糖苷酸酶（GUS）基因和新霉素磷酸转移酶（NptII）基因的表达载体pSH737分别用冻融法转化到Agrobacterium tumefaciens LBA4404，分别挑取含有表达载体pSH-P-N-T或表达载体pSH737的农杆菌单菌落，在含100mg·L-1 卡那霉素和20 mg·L-1 利福平的常规YEP培养基中28℃震荡培养至OD600为0.5~0.7，6000rpm离心5min收集菌体，用重悬培养基重悬菌体后，按照1:1的体积比混合两载体的重悬液。
挑选新鲜幼嫩的烟草叶片，先用自来水清洗干净，再用75%酒精洗30 s，然后用0.1%的HgCl2浸泡15 min，接着用无菌水清洗4~5次，用灭菌吸水纸吸干水分后，避开主脉用解剖刀将叶片剪成约 0.5 cm×0.5 cm 的小块，在两载体混合的重悬菌液中浸泡10min，用无菌滤纸吸干菌液后转接于共培养基上，共培养2天后转入含头孢霉素 300mg·L-1的脱菌培养基上，保持选择压继代2次，直至脱菌完全。将脱菌完全的外植体接于分化培养基上光照培养，光强为3000~4000lux，12~14h/d。每15~20天继代一次，当分化的幼苗长至3~5cm时转移至生根培养基中培养，待苗长至5~10cm时打开瓶盖，炼苗3~5d后移植到土壤中。
植物组织培养各个阶段的培养条件为：诱导、转化为暗培养；脱菌、分化、生根为光培养，光强为3000~4000lux，12~14h/d。重悬培养基中含有100 mg·L-1乙酰丁香酮及20 g·L-1蔗糖；共培养基中含有2.0mg·L-1 6-BA、0.2 mg·L-1 IAA、100 mg·L-1乙酰丁香酮及20g·L-1蔗糖；脱菌培养基中含有2.0mg·L-1 6-BA、0.2 mg·L-1 IAA、300mg·L-1 头孢霉素及30 g·L-1蔗糖；分化培养基含有2.0mg·L-1 6-BA、0.2 mg·L-1IAA、300mg·L-1 头孢霉素、100mg·L-1 卡那霉素及30g·L-1蔗糖；生根培养基中含有0.1 mg·L-1 IAA、300 mg·L-1头孢霉素、70mg·L-1 卡那霉素及20 g·L-1蔗糖。除生根培养基以1/2浓度的常规MS（MURASHIGE & SKOOG）培养基为基础培养基外，其余培养基均以MS培养基为基础培养基。
其中1L MS培养基中包含：硝酸钾（KNO3）1900mg，硝酸铵（NH4NO3）1650mg，氯化钙（CaCl2·2H2O）440mg，硫酸镁（MgSO4·7H2O）370mg，磷酸二氢钾（KH2PO4）170mg，硫酸锰（MnSO4·4H2O）22.3mg，硫酸锌（ZnSO4·7H2O）8.6mg，硼酸（H2BO3）6.2mg，碘化钾（KI）0.83mg，钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）0.25mg，乙二胺四乙酸二钠（Na2-EDTA.2H2O）37.25mg，硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）27.8mg，硫酸铜（CuSO4·5H2O）0.025mg，氯化钴（CoCl2·6H2O）0.025mg，肌醇100mg，烟酸0.5mg，维生素B1 0.1mg，维生素B6 0.5mg，甘氨酸2mg，PH值5.80。1L YEP培养基中包含：蛋白胨5.0g，酵母提取物5.0g，氯化钠（NaCl）2.5g，PH值7.20。
（6）子代分离筛选
移栽成活的T0代抗性转化苗切取叶片组织对β-葡萄糖苷酸酶（GUS）进行染色检测，对染色呈蓝色的阳性烟株提取DNA，对嵌合序列Pubi.u4-TMV-N的497 bp进行PCR扩增检测和测序验证，对PCR检测阳性的转基因烟株套袋留种，然后种植T1代，并对T1代继续进行GUS染色和PCR检测，最后从子代中筛选出GUS染色为阴性，但嵌合序列PCR阳性的烟株，从而获得无标记基因的烟草TMV抗性种内基因改良植株。
嵌合序列Pubi.u4-TMV-N的PCR检测引物为：
Test-1：5’-TTGATTTTGTTGTACCTGGTTGA-3’；
Test -2：5’-TCTGAGAAAACGACGATGGA-3’；。
序列表
<110> 贵州省烟草科学研究所
<120> 烟草普通花叶病毒抗性的种内基因改良方法
<130> 0
<140> 201110323873.2
<141> 2011-10-24
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ubi-1 sequence
<400> 1
cccaagcttg gaggctaact acgttagagc 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ubi-2 sequence
<400> 2
tgctctagat ctgtatatac agaaaaggtt 30
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> N-1 sequence
<400> 3
cggggtacca tggcatcttc ttcttcttc 29
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> N-2 sequence
<400> 4
tcccccgggt cacccattga tgagctcat 29
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Test-1 sequence
<400> 5
ttgattttgt tgtacctggt tga 23
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Test-2 sequence
<400> 6
tctgagaaaa cgacgatgga 20
Claims (1)
1.一种烟草普通花叶病毒抗性的种内基因改良方法，包括以下步骤：
（1）克隆烟草Ubi.u4基因的组成型表达启动子Pubi.u4：
烟草组成型表达启动子Pubi.u4是根据基因银行登记号(Genbank Accession)：X77456中提供的Pubi.u4启动子序列特点，设计和合成扩增引物，上游引物Ubi-1引入HindIII酶切位点，下游引物Ubi-2引入XbaI酶切位点，用PCR方法克隆烟草Ubi.u4 基因的长度为796bp的 Pubi.u4启动子；
Pubi.u4启动子的扩增引物为：
Ubi -1：5’- CCC AAG CTT GGA GGC TAA CTA CGT TAG AGC-3’；
Ubi- 2：5’-TGC TCT AGA TCT GTA TAT ACA GAA AAG GTT-3’；
（2）人工合成终止子Tubi.u4和LB-MCS-RB序列:
烟草终止子Tubi.u4序列为基因银行登记号：X77456中提供的终止序列；LB-MCS-RB序列由多克隆位点HindIII、XbaI、KpnI、SmaI、BamHI、EcoRI序列和基因银行登记号: HM036220登录的左右边界序列组成；
常规方法合成两端添加BamHI和EcoRI酶切位点的Tubi.u4序列，以及合成两端添加BglII酶切位点的LB-MCS-RB序列备用;
（3）克隆烟草功能基因TMV-N：
根据基因银行登记号: EF091690登录的烟草TMV-N基因的完整序列特点，设计和合成扩增引物，上游引物N-1引入KpnI酶切位点，下游引物N-2引入SmaI酶切位点，用反转录PCR方法从普通烟草RNA中克隆3426 bp的烟草普通花叶病毒抗性基因TMV-N；
TMV-N基因的扩增引物为：
N-1：5’-CGG GGT ACC ATG GCA TCT TCT TCT TCT TC-3’；
N-2：5’-TCC CCC GGG TCA CCC ATT GAT GAG CTC AT-3’；
（4）构建烟草种内基因表达载体：
将克隆的Pubi.u4启动子、TMV-N基因序列和人工合成的Tubi.u4终止子、LB-MCS-RB序列分别连接到常规载体pGEM-T easy上，构建出pGEM-P、pGEM-N、pGEM-T和pGEM-LB-RB，并转化大肠杆菌感受态，通过蓝白斑筛选获得阳性克隆，测序，以获得正确的Pubi.u4启动子、TMV-N基因、Tubi.u4终止子和LB-MCS-RB序列；
用BglII单酶切pSH737和pGEM-LB-RB，把回收的LB-MCS-RB小片段构建到pSH737大片段上形成pSH-LB-RB；然后用HindIII和XbaI双酶切pSH-LB-RB和pGEM-P，把回收的Pubi.u4小片段构建到pSH-LB-RB上形成pSH-P；用BamHI和EcoRI双酶切pSH-P和pGEM-T，把回收的Tubi.u4小片段构建到pSH-P，从而获得烟草种内基因表达母载体pSH-P-T；
用KpnI和SmaI双酶切pSH-P-T和pGEM-N，把回收的TMV-N小片段构建到pSH-P-T形成pSH-P-N-T，从而得到由烟草组成型启动子Pubi.u4驱动烟草TMV抗性基因TMV-N表达，由烟草终止子Tubi.u4终止基因表达的烟草TMV-N种内基因表达载体pSH-P-N-T；
（5）共转化烟草外植体
将种内基因表达载体pSH-P-N-T与含β-葡萄糖苷酸酶基因和新霉素磷酸转移酶基因的表达载体pSH737分别用冻融法转化到土壤农杆菌LBA4404，分别挑取含有表达载体pSH-P-N-T或表达载体pSH737的农杆菌单菌落，在含100mg·L-1 卡那霉素和20 mg·L-1 利福平的常规YEP培养基中28℃震荡培养至OD600为0.5~0.7，6000rpm离心5min收集菌体，用重悬培养基重悬菌体后，按照1:1的体积比混合两载体的重悬液；挑选鲜嫩的烟草外植体于混合的重悬菌液中浸泡10min，用无菌滤纸吸干菌液后转接于共培养基上，共培养2天后转入含头孢霉素 300mg·L-1的脱菌培养基上，保持选择压继代2次，直至脱菌完全；将脱菌完全的外植体接于分化培养基上光照培养，光强为3000~4000lux，12~14h/d；每15~20天继代一次，当分化的幼苗长至3~5cm时转移至生根培养基中培养，待苗长至5~10cm时打开瓶盖，炼苗3~5d后移植到土壤中；
（6）子代分离筛选
移栽成活的T0代抗性转化苗切取叶片组织对β-葡萄糖苷酸酶进行染色检测，对染色呈蓝色的阳性烟株提取DNA，对嵌合序列Pubi.u4-TMV-N的497 bp进行PCR扩增检测和测序验证，对PCR检测阳性的转基因烟株套袋留种，然后种植T1代，并对T1代继续进行GUS染色和PCR检测，最后从子代中筛选出GUS染色为阴性，但嵌合序列PCR阳性的烟株，从而获得无标记基因的烟草TMV抗性种内基因改良植株；
嵌合序列Pubi.u4-TMV-N的PCR检测引物：
Test-1：5’-TTGATTTTGTTGTACCTGGTTGA-3’；
Test -2：5’-TCTGAGAAAACGACGATGGA-3’；
其中植物组织培养各个阶段的培养条件为：诱导、转化为暗培养；脱菌、分化、生根为光培养，光强为3000~4000lux，12~14h/d；重悬培养基中含有100 mg·L-1乙酰丁香酮及20 g·L-1蔗糖；共培养基中含有2.0mg·L-1 6-BA、0.2 mg·L-1 IAA、100 mg·L-1乙酰丁香酮及20g·L-1蔗糖；脱菌培养基中含有2.0mg·L-1 6-BA、0.2 mg·L-1 IAA、300mg·L-1 头孢霉素及30 g·L-1蔗糖；分化培养基含有2.0mg·L-1 6-BA、0.2 mg·L-1IAA、300mg·L-1 头孢霉素、100mg·L-1 卡那霉素及30g·L-1蔗糖；生根培养基中含有0.1 mg·L-1 IAA、300 mg·L-1头孢霉素、70mg·L-1 卡那霉素及20 g·L-1蔗糖；除生根培养基以1/2浓度的MS（MURASHIGE & SKOOG）培养基为基础培养基外，其余培养基均以常规MS培养基为基础培养基；
1L MS培养基中包含：硝酸钾1900mg，硝酸铵1650mg，氯化钙440mg，硫酸镁370mg，磷酸二氢钾170mg，硫酸锰22.3mg，硫酸锌8.6mg，硼酸6.2mg，碘化钾0.83mg，钼酸钠0.25mg，乙二胺四乙酸二钠37.25mg，硫酸亚铁27.8mg，硫酸铜0.025mg，氯化钴0.025mg，肌醇100mg，烟酸0.5mg，维生素B1 0.1mg，维生素B6 0.5mg，甘氨酸2mg，PH值5.80；
1L YEP培养基中包含：蛋白胨5.0g，酵母提取物5.0g，氯化钠2.5g，PH值7.20。
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