CN111549075A - 一株无痕删除桔青霉素合成基因的红曲霉工业菌株 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一株不产桔青霉素的红曲霉工业菌株。通过CRISPR/Cas9介导的无痕敲除技术对红曲霉基因组上的桔青霉素生物合成基因簇完全删除，该方法不会在基因组中引入任何外源基因，由此获得的新菌株MP‑20完全丧失生产桔青霉素的能力。新菌株MP‑20的连续十次发酵结果显示产物中完全检测不到桔青霉素，且色素产量提高了2.33％。

Description

一株无痕删除桔青霉素合成基因的红曲霉工业菌株
技术领域
本发明属于食品生物技术领域，具体涉及一株不产桔青霉素的基因改造的红曲霉菌株，并涉及该红曲霉菌株的制备方法及其应用。
背景技术
红曲霉是一种工业上重要的多核丝状真菌，能够生产天然有机的红曲色素，其混合物在亚洲国家被广泛用作食品着色剂。但是，红曲霉也会产生桔青霉素，这是一种霉菌毒素，由于抑制呼吸复合物III而具有肾毒性，极大地限制了红曲色素的应用。许多国家已经颁布了法规，以严格限制红曲霉及其相关食品中的桔青霉素含量。目前中国的工业红曲色素中桔青霉素含量普遍超标，严重影响产品出口。而且，随着人们对食品健康的愈发重视，降低红曲色素中桔青霉素的含量势在必行。
目前，在工业过程中减少桔青霉素的产量仍然依赖于传统方法，包括物理诱变、化学诱变以及优化培养条件等。但是，诱变所得菌株在遗传上是不稳定的，并且在连续的发酵过程中经常会恢复桔青霉素的产生。
此外，基因工程手段也被用于桔青霉素的消除。由于红曲霉是一种多核真菌，传统的基因编辑工具无法一次性删除细胞中所有多个拷贝基因，细胞内的桔青霉素生物合成基因没有完全删除，因此得到工程菌株是异核体，遗传是极端不稳定的，仍然检测到桔青霉素的生成。此外由于红曲霉体内存在多个备用基因或同工酶，敲除某些桔青霉素生物合成基因只会导致减少，而不能完全消除citrinin的产生。这些结果表明，为了永久和稳定地消除工业真菌中桔青霉素的产生，必须删除包含桔青霉素合成所有必需基因的整个生物合成基因簇。
发明内容
本发明的目的是通过无痕敲除技术获得一株不产桔青霉素的红曲霉工业菌株。
本发明经过实验发现，在红曲霉中，桔青霉素生物合成基因簇包括6个功能基因。首先，在聚酮合酶citS的催化下,一分子乙酰辅酶A(acetyl-CoA)与七分子丙二单酰辅酶A(malonyl-CoA)通过反复缩合和延伸形成聚酮前体，然后依次在水解酶citA、加氧酶citB、氧化还原酶citC和醛脱氢酶citD的作用下生成羧基衍生物，最后在短链脱氢酶citE的作用下脱水成环，生成桔青霉素。
本发明涉及一种红曲色素的制备方法，其特征在于通过发酵基因工程改造的红曲霉制备得到，所述红曲霉删除了包含桔青霉素合成所有必需基因的整个生物合成基因簇。
如上所述的制备方法，其特征在于发酵红曲霉过程中不产生桔青霉素。
本发明还涉及一种基因工程改造的红曲霉(Monascus purpureus)，其特征在于其删除了包含桔青霉素合成所有必需基因的整个生物合成基因簇。
如上所述的生物合成基因簇，包括编码生成聚酮合酶CitS、水解酶CitA、加氧酶CitB、氧化还原酶CitC、醛脱氢酶CitD和短链脱氢酶CitE。
如上所述的一种基因工程改造的红曲霉，其特征在于发酵红曲霉过程中不产生桔青霉素。
如上所述的一种基因工程改造的红曲霉，其特征在于所删除的桔青霉素生物合成基因簇序列如SEQIDNO.1所示。
如上所述的一种基因工程改造的红曲霉，其特征在于包含如SEQIDNO.2所示的基因序列。
本发明还涉及如上所述的基因工程改造的红曲霉(Monascus purpureus)的方法，其特征在于以野生型红曲霉为原料，步骤如下：构建CRISPR/Cas9介导的无痕敲除技术所需质粒，将野生型红曲霉菌株上桔青霉素生物合成基因簇完全删除，利用Cas9质粒上的潮霉素抗性基因以及PCR验证，得到正确敲除的克隆子，进一步在无抗培养基上培养多次直至质粒丢失，得到无任何外源基因的克隆子，即所述的不产桔青霉素的红曲霉基因工程菌株。
如上所述的野生型，可以为如下所述的红曲霉：
CGMCC 中文译名 拉丁学名
3.15548 紫红曲霉 Monascus purpureus
3.15547 紫红曲霉 Monascus purpureus
3.15546 紫红曲霉 Monascus purpureus
3.15544 紫红曲霉 Monascus purpureus
3.15543 紫红曲霉 Monascus purpureus
3.15542 紫红曲霉 Monascus purpureus
3.15541 紫红曲霉 Monascus purpureus
3.4577 紫红曲霉 Monascus purpureus
3.898 紫红曲霉 Monascus purpureus
3.896 紫红曲霉 Monascus purpureus
3.894 紫红曲霉 Monascus purpureus
3.884 紫红曲霉 Monascus purpureus
上述红曲霉可以从中国科学院微生物研究所购买得到。
本发明还涉及如上所述的基因工程改造的红曲霉(Monascus purpureus)的方法，其特征在于以野生型红曲霉为原料，具体包括以下步骤：
提取野生型红曲霉基因组DNA；
根据野生型红曲霉桔青霉素生物合成基因簇上下游序列设计扩增up和down片段的引物：以红曲霉的基因组DNA为模板，cit-up-F/R和cit-dn-F/R分别做为引物扩增得到pKL-03质粒上的up和down片段；Pgpda-F/sgRNA-R和sgRNA-F/TtrpC-R以pFC333质粒为模板扩增得到组装pKL-05质粒所需的片段sgRNA-1和sgRNA-2；
提取pFC-333和pUC-57载体；
pFC333载体使用BglII和PacI两种内切酶酶切；
pUC57载体使用EcoRI和HindIII双酶切；
回收酶切后的载体和目的片段；
酶切后的pFC-333和pUC-57载体与目的片段连接：pUC57载体和up以及down片段通过吉布森组装得到pKL-03质粒，酶切后的pFC333载体和sgRNA-1以及sgRNA-2通过吉布森组装得到pKL-05质粒；
制备野生型红曲霉原生质体；
将pKL-03和pKL-05质粒共同转化原生质体；
制备得到基因工程改造的红曲霉。
如上所述的制备方法，其特征在于：吉布森组装体系如下：Gisbon溶液15uL，载体加片段共5uL，其中载体与片段摩尔比为1∶1。
如上所述的制备方法，其特征在于：野生型红曲霉原生质体的制作方法如下：
a.将野生型红曲霉接种平板上，培养7天；
b.接种到液体培养基中，培养30h；
c.离心收集菌丝；
d.加入酶解液摇床中培养；
e.轻轻滴加等体积trapping buffer，离心，收集中间层的原生质体；
f.加入STC buffer，离心，去除液体；
g.加入STC buffer重悬。
如上所述的制备方法，其特征在于：所述将pKL-03和pKL-05质粒共同转化原生质体，步骤如下：
a.取pKL-03和pKL-05质粒，加入到原生质体中；
b.加入60％PEG Solution，混匀；
c.与不含抗性的PDA-Sorbitol培养基混合后，培养，在表面再倒一层含有100μg/mL潮霉素的PDA-Sorbitol培养基。
本发明所述的一株不产桔青霉素的红曲霉工业菌株，命名为红曲霉MP-20，即Monascus purpureus MP-20。该菌株的桔青霉素生物合成基因簇被完全删除，且基因组中没有引入任何外源基因，发酵产物中的桔青霉素被完全消除。本发明所删除的桔青霉素生物合成基因簇序列如SEQIDNO.1所示。
本发明还描述了一种制备不产桔青霉素的红曲霉的方法。
本发明所述的不产桔青霉素的红曲霉的制备方法，步骤如下：构建不引入外源抗性基因的CRISPR/Cas9敲除技术所需质粒，将野生型红曲霉菌株上桔青霉素生物合成基因簇完全删除，利用Cas9质粒上的潮霉素抗性基因以及PCR验证，得到正确敲除的克隆子，进一步在无抗培养基上培养多次直至质粒丢失，得到无任何外源基因的克隆子，即所述的不产桔青霉素的红曲霉工业菌株。
本发明还提供了一种制备不产桔青霉素的红曲霉工业菌株的试剂盒，其具体包括cit-up-F、cit-up-R、cit-dn-F、cit-dn-R、Pgpda-F、sgRNA-R、sgRNA-F和TtrpC-R引物，其序列如本发明中所述。
优选的，该试剂盒中还包括：puc57-SF、puc57-SR、pFC333-SF、和pFC333-SR引物，其序列如本发明中所述。
优选的，该试剂盒中还包括：test-F和test-R序列，其序列如本发明中所述。
优选的，该试剂盒中还包括：本发明实施例中所用到的任意一种或多种试剂或溶剂。
本发明通过生物信息学分析，注释了野生型红曲霉菌株中的桔青霉素生物合成基因簇，通过PCR技术获得桔青霉素生物合成基因簇及上下游的序列。利用PEG介导的红曲霉原生质体转化技术，将CRISPR/Cas9质粒与同源重组donor质粒转入原生质体细胞内；在Cas9蛋白对DNA双链的进行切割后，利用donor质粒的同源重组修复功能实现对桔青霉素生物合成基因簇的完全删除，且不引入外源基因。
通过液体培养基发酵和高效液相色谱-质谱联用仪(LC-MS)检测发现，与野生型菌株相比基因工程改造菌株的桔青霉素完全消失，且色素产量增加2.33％。
本发明还提供了一种不产桔青霉素的红曲霉的用途，即所述菌株用于工业生产红曲色素。
本发明涉及一株不产桔青霉素的红曲霉工业菌株。通过CRISPR/Cas9介导的无痕敲除技术对红曲霉基因组上的桔青霉素生物合成基因簇完全删除，该方法不会在基因组中引入任何外源基因，由此获得的新菌株MP-20完全丧失生产桔青霉素的能力。
新菌株MP-20的连续十次发酵结果显示产物中完全检测不到桔青霉素，且色素产量提高了2.33％。
附图说明
图1为Monascus purpureus KL-001桔青霉素生物合成基因簇及桔青霉素生物合成途径。
图2为本发明所述的CRISPR/Cas9介导的无痕删除红曲霉桔青霉素生物合成基因簇的原理和流程示意图。
图3为本发明所述基因工程菌株MP-20和红曲霉野生型菌株KL-001的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图谱。引物扩增片段为up和down的部分序列，片段大小约为450bp。图中MP-20的PCR检测结果表明15kb的桔青霉素生物合成基因簇被完全删除。
图4为本发明所述基因工程菌株MP-20和红曲霉野生型菌株KL-001的桔青霉素的液相检测结果。
图5为LC-MS检测结果，分别为桔青霉素的紫外吸收和质谱碎片峰。
图6为本发明所述基因工程菌株MP-20和红曲霉野生型菌株KL-001的色素含量检测结果。
具体实施方式
为了理解本发明的内容，下面结合实施例来对本发明做进一步的说明，但不能以实施例来限制本发明的保护范围。
本发明使用红曲霉野生型菌株KL-001为出发菌株，该菌株购自中国科学院微生物研究所，对应编号为：CGMCC 3.15548。
实施例1、构建无痕删除红曲霉桔青霉素生物合成基因簇的CRISPR/Cas9质粒pKL-03和donor质粒pKL-05
(1)红曲霉基因组DNA的提取
取红曲霉菌株KL-001培养7天的PDA平板，放置于-80℃冻20min，取出后刮取表面菌丝，无菌水洗涤两次后冷冻干燥并保存于-20℃。使用液氮预冷的研钵将冻干的菌丝体研磨成细粉，重悬于500μL的裂解缓冲液(40μmol/L Tris-乙酸盐，20μmol/L乙酸钠，1μmol/LEDTA，1％w/v SDS，pH 7.8)中，移液枪吸打直至悬浮液的粘度显着降低且形成泡沫。加入RNA酶A并在37℃孵育5分钟，再加入165μL的5μmol/L NaCl溶液并混合。13 000rpm离心20min，立即将上清液转移至新试管中，并加入400μL的氯仿和400μL的苯酚。轻轻颠倒试管直至溶液变成乳状。离心20分钟后以去除水相，并用等体积的氯仿萃取。用两个体积的95％乙醇沉淀上清液中的DNA。沉淀的DNA用70％冰冷的乙醇洗涤3次，干燥并溶解在50μL TE缓冲液(10μmmol/L Tris-HCl，0.1μmmol/L EDTA pH 7.8)中，并保存在-20℃。
(2)目的片段的扩增
根据红曲霉KL-001桔青霉素生物合成基因簇上下游序列设计扩增up和down片段的引物，用于后续pKL-03质粒的构建。根据桔青霉素生物合成基因簇的基因序列，在CHOPCHOP网站(http://chopchop.cbu.uib.no)检索并选择最优的sgRNA序列，设计相应的引物扩增片段并用于构建pKL-05质粒。引物序列如下：
Figure BDA0002501051650000071
以红曲霉KL-001的基因组DNA为模板，cit-up-F/R和cit-dn-F/R分别做为引物扩增得到图1中pKL-03质粒上的up和down片段。Pgpda-F/sgRNA-R和sgRNA-F/TtrpC-R以实验室已有的pFC333质粒为模板扩增得到组装pKL-05质粒所需的片段sgRNA-1和sgRNA-2。PCR扩增体系如下：
Figure BDA0002501051650000072
PCR扩增条件如下：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，33个循环后，72℃延伸10min，4℃保存。
(3)pFC-333和pUC-57载体的提取
使用全式金质粒小提试剂盒(Trans EasyPure Plasmid MiniPrep Kit)提取pFC-333和pUC-57载体，具体步骤如下：
a.含有pFC-333或pUC-57载体大肠杆菌分别过夜培养，取2-4ml菌液，10000rpm离心1min，尽可能倒干净上清液。
b.向收集的菌体中加入250μL的RB溶液(含RNase A)，漩涡震荡直至菌体完全重悬。
c.向离心管中再加入250μL的LB溶液，离心管上下颠倒5-6次，室温静置3-5min。
d.向离心管中加入350μL的NB溶液，离心管上下颠倒4-6次，室温静置2min。
e.最大转速离心10min，小心吸取上清加入到离心柱中，10000×g离心1min，倒掉收集管废液。
f.向离心柱中加入650μL的WB溶液(使用前需先加入80mL无水乙醇)，12000×g离心1min，倒掉收集管废液。重复一次。
g.将离心柱放入干净的1.5mL离心管中向离心柱中加入40μL的EB溶液或无菌水(60-70℃下预热)，室温静置2min。
h.12000×g离心1min，将装有载体的离心管放于-20℃保存。
(4)载体的酶切以及载体和目的片段的回收
pFC333载体使用BglII和PacI两种内切酶酶切，酶切缓冲液分别为CutSmartBuffer和NEBuffer 3.1。pUC57载体使用EcoRI和HindIII双酶切，酶切缓冲液为NEBuffer3.1。酶切温度均为37℃，酶切时间均为4h。酶切体系如下：
Figure BDA0002501051650000081
酶切后的载体和目的片段均使用OMEGA胶回收试剂盒(Gel Extraction Kit)回收。具体步骤如下：
a.将切下的凝胶块放入2mL离心管中，加入等体积的Binding buffer(XP2)，在60℃下加热直至凝胶完全溶解。
b.将溶液转移至DNA结合柱中，12000×g离心1min，倒掉收集管废液。
c.向DNA结合柱中加700μL SPW Wash Buffer(使用前需加100mL乙醇)，12000×g离心1min，倒掉收集管废液。重复一次。
d.空的DNA结合柱放入收集管，12000×g离心2min。
f.将DNA结合柱放入干净的1.5mL离心管中，加入15-30mL的EB缓冲液或蒸馏水(65℃预热)，室温静置2min。
g.12000×g离心1min，装有DNA的离心管放于-20℃保存。
(5)酶切后的pFC-333和pUC-57载体与目的片段连接
pUC57载体和up以及down片段通过吉布森组装得到pKL-03质粒，酶切后的pFC333载体和sgRNA-1以及sgRNA-2通过吉布森组装得到pKL-05质粒。
吉布森组装液使用PCR管分装(15μL×40个)，配置方法如下：
Figure BDA0002501051650000091
IRB Buffer(6mL)配置方法：
Figure BDA0002501051650000092
吉布森组装体系如下：Gisbon溶液15uL，载体加片段共5uL，其中载体与片段摩尔比为1∶1。
吉布森组装反应条件(PCR仪)：25℃5min，50℃1h。
使用商业化化学感受态将组装转化到大肠杆杆菌中，转化方法如下：
a.从-80℃冰箱中取出商业化化学感受态，放到冰上解冻。
b.加入10μL组装液，轻轻晃动混匀，冰上放置30min。
c.放入42℃水浴中60-90s，取出后放到冰上2min。
d.加入200μL的LB培养基(10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L NaCl)，放到37℃的摇床中孵育1h。
e.将培养基涂布到含100μg/mL氨苄抗性的LB固体平板上，过夜培养。
f.将长出来的克隆用含100μg/mL氨苄抗性的LB液体培养基培养12h，提质粒pKL-03和pKL-05。
pKL-03和pKL-05质粒的验证。将提取的质粒送到测序公司测序，pKL-03和pKL-05质粒分别使用pUC57-SF/SR和pFC333-SF/SR引物测序，引物序列如下：
Figure BDA0002501051650000101
将测序得到的序列与目标序列比对，序列一致则表示构建的质粒正确。
实施例2、红曲霉桔青霉素生物合成基因簇的完全删除
(1)pKL-03和pKL-05质粒转化红曲霉
红曲霉原生质体的制作方法如下：
a.将红曲霉KL-001接种至PDA平板上，30℃培养箱中培养7天。
b.用无菌小刀切下菌丝块，接种到200mL YEME液体培养基(酵母粉3g/L,蛋白胨5g/L,麦芽提取物3g/L,葡萄糖10g/L,蔗糖130g/L和蒸馏水1L；高压灭菌后加入MgCl2·6H2O(2.5M)2mL/L和glycine(10％)100mL/L)中，30℃培养30h。
c.10000×g离心收集培养基中的菌丝，加入15mL Osmotic Medium洗涤3次。
d.加入10mL的混合酶解液(100mg Lysing Enzyme，30mg Yatalase，30mg纤维素酶和40mg蜗牛酶)，30℃、80rpm摇床中培养，显微镜观察菌丝酶解情况，酶解好的原生质体约为孢子体积的两倍，形态均一且呈现薄壁状态。酶解时间一般在约2.5h。
e.轻轻滴加等体积trapping buffer，2000rpm离心10min，收集中间层的原生质体。
f.加入3倍体积STC buffer，5000rpm离心10min，去除液体。
g.加入少量STC buffer重悬，使原生质体浓度约为108-109个/mL，分装到1.5mL离心管中，每管100μL。以上所有操作均在冰上或4℃进行。
将pKL-03和pKL-05质粒共同转化原生质体，步骤如下：
a.取pKL-03和pKL-05质粒各5μg，加入到100μL原生质体中，轻轻混匀，于冰上放置60min。
b.加入1.25mL 60％PEG Solution，用移液枪轻轻混匀，室温放置20min。
c.与不含抗性的PDA-Sorbitol培养基混合后倒培养基，30℃过夜培养，在表面再倒一层含有100μg/mL潮霉素的PDA-Sorbitol培养基。培养5天后长出克隆。
(2)转化子的验证
将初筛板上长出来的克隆挑到含有100μg/mL潮霉素的PDA-Sorbitol培养基上，能再次生长的克隆，进一步做PCR验证。
提取基因工程菌株的基因组作为模板，使用引物test-F/R做PCR验证。
验证引物test-F和test-R分别在桔青霉素生物合成基因簇的前后序列，基因工程菌株的片段约450bp，测序结果如SEQIDNO.2所示；野生型菌株的片段约16k，PCR不会出现条带。
Figure BDA0002501051650000111
实施例3、红曲霉工程菌株MP-20检测桔青霉素和色素
(1)工程菌株MP-20桔青霉素的检测
将验证正确的工程菌株MP-20和野生型菌株KL-001接种到PDB培养基进行发酵，30℃、200rpm摇床培养7天取样。
取30mL发酵液，用HCl将发酵液调节至pH 4.0，菌丝和上清液分别用乙酸乙酯萃取检测3次，合并有机相。30℃旋转蒸发至完全干燥，加入300μL甲醇溶解。0.22μm滤膜过滤，使用液相色谱-质谱联用仪(LC-MS)检测桔青霉素。
桔青霉素LC-MS检测条件：在Agilent-1200HPLC/6520QTOFMS(USA)系统上进行LC-MS分析，流动相为乙腈(v/v，0.1％甲酸)和水(v/v，0.1％甲酸)，流速0.8mL/min。0-15min，5％-95％乙腈；15-20min，95％乙腈。进样量20μL。Q-TOF使用双重ESI作为离子源接口，并且ESI源以正电离模式运行。扫描范围是m/z 100-1000。
连续十次发酵的LC-MS检测结果显示，红曲霉野生型菌株KL-001产生了桔青霉素，而工程菌株MP-20中完全不能检测到桔青霉素。
(2)工程菌株MP-20红曲红色素的检测
工程菌株MP-20的发酵与提取流程与前面所述一致。对于每个测量样品，取1.5mL样品和9mL 75％乙醇混合，并进一步用0.22μm滤膜过滤。将1mL用去离子水稀释100倍，通过酶标仪在505nm下进行测量。样品的色值为A505×稀释倍数。
三轮发酵结果显示，红曲霉野生型菌株KL-001的红曲色素平均色价为885.30u/mL，工程菌株MP-20的平均色价为905.00u/mL，增加了2.33％。
以上描述是本发明的一般性描述。根据情况或实际需要，可进行形式的变化和等值的替代，虽然本文采用特定的术语，但这些术语意在描述，而不是为了限制的目的。本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明所附权利要求书所限定的范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东科隆生物科技有限公司
<120> 一株无痕删除桔青霉素合成基因的红曲霉工业菌株
<130> 20P0466C1
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 15000
<212> DNA
<213> Monascus purpureus
<400> 1
tggcatttaa tgtgctggtg gactcttgct ctgttgctct ttcaagctta atcgtcggct 60
ccttgaacct gataccttgt cccagactct ctaggtcatc aatcaacgcg tcaacgagaa 120
ccgaatggaa ggcgttggtg acgttcagtc ttttatatct tattcctgag aagtctgggt 180
catttttcag caagttctcg gcatggtcca cgtctttcgt gggcccagcc aatgtgaagc 240
tttttgatgc attatagcag gcgattgcaa gtcccgtttc agatcccatc tgtgatttca 300
ccttggccaa caaagcttcc acatcggaaa ggtccgcctc gacagcgatc atggacccct 360
tgtcagcgcc ccagcgctcc ttaataaggc gggctcgacc ggaaatcatc ttgacagcat 420
ccttcaacga tacagcattg gagacacata gagctatcaa ctcaccaaag ctgtgcccga 480
cgaccgaggc aaccttcagt ccgctatcta tccatgcctt ggcgcaggaa tactgcatcg 540
caaacagcgc tgtttgaagc tgaacaatat cctcgattgg ggaccgttgg aaaatagccg 600
ggtagatact ttgcaggcct agcgaaaggc acatggcatc gcactgatct aagtaatgtc 660
tcaaaatcgc agtgctgtta tagacctctt gatccaaacc aacataggtg gaaacttgcc 720
ctccaaagca taggatgacg ggcttcggat ccggaagctg gacagatggg aaatccgtgc 780
tgcctttctc aaaagatgca agggccctat tcagctcctc ctttgtgctg gcactgaata 840
ccagggcttg gggaagagac cagtttgatt gacaagcaac ttggaaagac aagtttgcga 900
cgcttaggtt tttgtctgcc gcatgttttt cgagaaattg gcgcaacctc cgaacgtaac 960
tttgaaggct ctgttggtca aatgcactga tccagaatgg atagcttttc cctggcaacg 1020
gtgtcgaggg ggtctccgtc agatttggtg gttgcgtaac aaccatggag gcattggacc 1080
cggaagcacc gtagttgttg atgagtgcag ctctgaaagg tgcatcccaa ggctttaaac 1140
gggtcgagat ctctattttt tcctcagcct ttgcattgag tgaagggttg atgcttgaaa 1200
agctggcctg gggtgggata aagccttgct ggatcataag gagggtcttt atcaaagaga 1260
ccacacctga agcgcattcg gtgtgaccga caaggccctt cacggatcct agcgacagaa 1320
catcggagcg tatagggcct ccaaagacag ctcgaatgcc atcgtattca gctgggtccc 1380
cgactgcagt tcctgttccg tgtgcctcaa caagagtaat gtccttaggc tcaagccttg 1440
cttgacgcac gacatccgta aagagctccg acagagatat tgcgttagga acagtgattg 1500
cagtacaatt ctgattttga taaaccttcg tactcgcgat cacaccaaat acctggtcac 1560
catctgcgat tgcagaggaa agccgtttca aaaacacggc accaacacct tcacctctgc 1620
agtacccatc ccccttagcg tcaaacggct tgcattgacc agtagggctg aggaaagatg 1680
cgccggctag gttatgatac cagttgggac tcgttataac gttgacacct ccggcgagtg 1740
ccccgttaca ttccccgcta aggatggaac ggcatgcctg gtgaatagcc acactggatg 1800
acgagcatgc cgtgtcaagt gtcagactag gtcctgtcca gccgaaatgg tggctaatct 1860
tgccagcaag aaaactcttc aggttgccgg tagccgaata cgcattggca gggtaacacg 1920
caatgttgtc ctcgtaatcg acattgccga cacccatgaa gcatccaatg cgccgattcg 1980
taccattatt tctgaagtac ccggattgtt cgacggcctg atatgctacc tgcaacatca 2040
ggcggtgttg agggtccgtg gatgccattt ctcggggact cttcttgaag aatttatgat 2100
cgaaggtgtc gtaattgtcg atgaaattcc cgtaccattt gcgtttgtcc gcttctcgcc 2160
aggccgtcgc catgccgaac cgatcttcgg gcacctctct atgctgcgac tgacccgttt 2220
tcaggatctc ccagaatccc tcgtggtctt cggcacccgg tagccgacac gccattccaa 2280
taacagcgat gcgctcatcg ggtaggtctg tgaggttcag cttttgcgtt ccaccgagaa 2340
gctgcccggg tactcgtgac gatgagatat caatctcgga tacgtatgtc aggcgtggac 2400
caagttttcg tgcaagcgtt ggtggcatgc acctctccgg cccgaaacaa atcaccgctg 2460
catcgtccat gatgaacttt gacaagtagg aaatgcggca tgtcttgtac cactcagact 2520
gttccaagag aattgcccgc aaagctagct cgtggagttt tccagtagtg atatattgcc 2580
catcggagct ggatcgacta ggcagtaaca tcttcgtcgc atcagccaat tgcaagtctg 2640
gatcaagtcc acaaaactga atgagactcg atacggcatc ctgatgcttc ttccagtgga 2700
atcgtcccga aagcgcaatt gacgtgacat gagcgccttc ttgtttcaac cgctcaataa 2760
tagctggcgc cgtcttcttc gacgccgtca acgtcgcacg tctctggtca acgatgacag 2820
acacatatgc ctgtagaacg atggttagcg tttgctctgg tcttggtgcg aattgtgagg 2880
acgtacatca gggaatgtct cgagaacgtg ggtgaatgag tcactgaatt cggcgctatt 2940
ccacgacgct gaaaaactca ctgactttcc ttccggatca gatagtacct cttcggtatc 3000
gacgatggct ccaaccaaca tcgccagtct cgcagctacc gcgccgtaat gttgaatatc 3060
ggctatgttg gaagagcagg ctactgcaaa agcacacagg gtgccggtgc agaggccgaa 3120
ggtctccgta tcttccttaa ttgatatggg caggtcatgt ttctttccta ggtctgggaa 3180
tgccgctttg agaaaagtca tgtattcaac caactgtcct atgaccacga gcggggaaag 3240
aagcacattt ggcaaaggaa atgcctcctc tggggctacc ccactggaaa tccatgcatt 3300
caagttctca agcagcttcc cagtgttgga ttgctgtacc ttttggtcac tggcggcaaa 3360
gttgtcccaa agctttggca ggctggcgag cgcatcaaga acccattggt gattttggag 3420
ctggctgtga agcttgttga aggacctgac atcgaaagac aaatcctgcg ggccgaatat 3480
aaacgccttt gatctcagat ttgagtgcga agttgagtca atcataactt atagccgcaa 3540
ttgaaactgc cgtccttggt cacgttgaag ctgaccgatg ggaaatcgta ttgaaaatga 3600
tagggtactg gtaggtatat cacacaaaca cggtatatac tgccatgcga gaccgtttgc 3660
tgatctcgtg gatagtagca actatatatg agtctgatgg agtgcccact gcacctgcct 3720
gtgaggctga actgaaaatc cacagcagaa cattattccg gacagttacc tcgcgcccct 3780
ccccactctt cttgcttgtg tcggatattc tcagatgttg gtattcgcca gccgtcccgc 3840
tcgcttgtgc ttccgctata cgggcttcat agatgatatg ggctgcggaa gtacagatcc 3900
tgaaggattt acttcgcaag gatgaagtta ctccgataaa taatcccgaa agcttgcacc 3960
tcagcgccta gcttctgcct ccaacaacag gcgttgatga gatgtaggct agcgtgtaga 4020
agtacggacg gtccccaacc ctgctgtacg agcttggacc agaatgcgtg tcggcgcacg 4080
tcctttcttc aagaatactg tttgccgatc tttagccaag ttcaaatgag tggttgcgaa 4140
tcacatcggc atgccagctt atatagagta atcttgcatc tgacaagggt gtaaggttgc 4200
atctattcat ggtgcatagt ggtcgccgga tataccatac tcggaaaaaa cgtccactat 4260
attgattcca tacaattcga cgcgccataa tgccaccaat tcgcgatgga cctttaaata 4320
atctcgctga gcacgagggt cgagtcttat tagccatttc tgatttaaaa aatgggaaaa 4380
tccccatatc aatcatgctg caactgcaaa attccttttg caaatggact caaactttca 4440
gaatttgaag aggaatcact tgccaagtgg atactggatc atgtaagagg ttggacgcaa 4500
ctttgttcaa ttgggtggca cttatgtata cgaaggaatc gctggagaag agaaagtaca 4560
aaagcactgg ctgaagaaaa aagggaagtt ggtaagaagc atgtgatcgg cgctgaaccc 4620
atgacagatc tatagatgtt ggtggctctc actgtttatc tccttcctat ttaggatagc 4680
ccatattagt cagcatcagt gtaaatagtc aacgatctag atcccagata tctcgttatt 4740
ctcatgggcc aagccttacc agggaagaag ctcaggcact tatagagagt caagttgaag 4800
catctcagcc tgttattgct actccagtcc gggctgggct tcgtgcctct caatcacttg 4860
tacgacgcag atttcgctgc agtgactgta atattcttgg gcatagaagg agtcaaggcc 4920
ctgattgtgc tgcgaattaa gtttttgcat ataaatattg ttatggttag aaatggagtc 4980
ttcaaatcaa tatagcagat gcgcttggag gaaaactggc gggtgagtgg tggattacaa 5040
ttaactatga gtgtgcctgc gactagggca gagatcatca tgcaagagtc gttaataaag 5100
cgacaccagc tgtacaagat agtccctatt tatttctctc taacgcccgt gacaccaaaa 5160
caaacagtgt ctgcataatc taacccacgg agcaacaaag ttcaacgcag ttctgatgac 5220
tagggagcac ccgtctgcgt tgcaagttct cgaatctgat acgcaacgag cgagacatca 5280
ttgtacttca gcggaacccg atggtcacca tcccactcta ctagtctcct gctttccgga 5340
gcacagaact cttcaaacag ctgacggtga aggtccacgt ggggatctcg catcccgtgt 5400
acatgcacgg tgggaatgcg tagaacgtcc tggctcggac cgtggtactt cgcatccgtg 5460
atctgcgaca catcaggcaa agaagaattc agatccaggt ccggatccaa ggataccagc 5520
ggcgcacggc cagccagtag aactccaaaa cggtagtctg aaccggcgaa cgatcgtccc 5580
cgtagttcct ggcggatttg ttggcggtag aggagactgg cgcacatctt cgcgccttga 5640
ctaaatccaa gcaatccaac ccacgctcct gtggcaccct ttgcgtcgtc ttggcgtttc 5700
acatcctcca gacagtcatc aatcgctcgg atagcgtctt ccggccggat ttcagggtgg 5760
tccgggcacc agcgaagcca acgtctgaac gggccccatt gactgtacac tgacatcaca 5820
ttgggctcag catcagacaa gaacggtgcc tgtgcaaaga cgaagcgaaa ttcggatcgt 5880
agctgggcaa tgagtcggcg acattgggct tggaagatgg cagcattaga ccctcctcca 5940
tgaagacaga ggattcgggg cagatgtaaa gtgtcatcga ccacctctaa attcgtctgg 6000
accatggtga tagaagggta caaaggctca gtgggaacaa tgaagctgcc ccggacaacg 6060
agagtatcag gcgcggaaag ctttagagga agccgttcaa ggatgtatag gggggagata 6120
tagagcaagg ccagtgagcg aagccctgtc tgccctttca tgaggcaagg taaacaccaa 6180
gccccaatgc cactagacac tagttgctat tttcgaatcg tcaatgctcg ctccgatgaa 6240
ggattttccg atagagaata tccgatagct tttcccatct cacttgcatg ccgcttgtcc 6300
taccggtata ttgctctcag gcgtttctcc gacaggatca acccattcta gcatgtatcc 6360
ccatcaacca tttcggctgg tgatggccag aaagtggcgt ggcatgctag ctgaccctat 6420
atagcaagcg accactgcac tagacccggc tcgctttttg gctccttcca tagcctgaag 6480
cgtatttccg aacagctcaa tagaatgccc atctcaacca agtcatcttt ctatctcccg 6540
gctgttgata tcagtccgta tctgcaggac ccaaacagcg atgccgcgcg caaagtaatc 6600
gacgatgtgc gagctgcgtg cacctctaca gggttcttcc aactcctcgg gcatgggatt 6660
tccccagcac tgcagcagtc cgtcttcgcc gcagcggcca agttcttcgc gcttccctcc 6720
gacgtcaaat cacgctgcag gaacgtcggc ttccgagggt acgaccccat ggcctcgcag 6780
tcgtacgaac tgggagtcct cccagaccta aaagaaggct tcattgccgg gaaagacatt 6840
cccctcgacg atccacgagt ggcgagccag cggttcttca tgggacagaa cgcatggccg 6900
ccgagcgagc tgctgccgga ggcaaacttc cgccgcccca ttgaagaata ctaccaggcc 6960
atgctgaagc tgtgctgggt agtgttggac cttgtcgcgg ccacattgcc gtacgggccc 7020
catgtcttcg atgagttcaa ggaaaacgat cctgcatgcc cacttcgact gctccattat 7080
ccgcccgctc ccgcaccgga tgtggccaag ggtcgccagc tgggcagtag tgcgcatacg 7140
gactttggag ccatcacgct tctcttgcaa gatgatcatt ccgggcttga ggttcaggac 7200
tgcgaaacgg gggagtggat tggagttcct ccgaacaaag acgcttacgt ggtcaacctg 7260
ggagatatga tgagcagaat caccaggggt cattacaaga gtagcattca ccgcgtcatc 7320
aaccagaatc tgaccgatcg ttacagtgta gtgtttttct tcgatggcaa cctggactac 7380
aggctaaggc cgctggatcg cgttgggcag aattgggacg aggaagatac tctcactgtg 7440
gaggaacata tgttggagcg cacaaccacc acttacaatc tcaaagtaaa gtaatcgtag 7500
cgatctgctg ctctctactg gtctcttcct caggaagtgg aattccggag atgctatata 7560
ctttcagcgg aaaatgaaca taagtagaag ccatgccaat gataaccaac cttatgaacg 7620
caatcattta ttcattttga ccagtacatc atcataggac ccatatatat acaatcatgg 7680
tgcattagag tgttctctta ccaagctcat cgacgctgtg gtacatgaga gctctaataa 7740
atgtatataa cttcgacttg gatcgttggc atttttgagt tgacggaaaa tctgcaggag 7800
ctcttgaagc agagagttaa atgccgcatc cgatcctcga ttactgtata gaaattcggc 7860
gcagagcaac aatgggatgg gcatgagggg atggacctgc gcgtttccta gttaggtacc 7920
tccgcgatgc gaatgggata gtcacgcttc agtcattgca gggcagtgat gcagtgtggc 7980
ataccttgaa gaagttgaac tctgtcagcc cttttgctag cttgacgatc tcctgcgctg 8040
cacttagggc gcgccgttga tattccacca cccaagctcc gtcgtcgact gcccacacca 8100
ccgatgccat acccttgtag agatgaatca cactcgcctg tcccatgatg tgtgcgaacg 8160
agagcattgg atcgcagatt tgggttggcg atgggtagta ctgggagaga atctgaagcc 8220
ggttggtaag gacgttgtcc agccactggt gctgatcggt ccagttggga gccaactcgc 8280
cgtacacaaa gcgaacactg tattgctgag cgtgaaacag gctgcggccg cagatggtag 8340
ctaggatcac gcattcgttg aatggcgatg ttgtctgcgg cataacgtcc atgatcgctt 8400
ccgacaggaa ggcacctagc accggctgac cgctctggaa ttccatgtcc ggggctggaa 8460
gacgggtgca gatctggtca tgaagtattc ggtcagattc gattgatcta tttcaaactc 8520
actgtgtagg aaagacatcg gagccttacc acatgctcgt tcaaggtgat cggccaatta 8580
ttacgcatgc tgagcaggtg gtccaagaaa taggccatcc agaacacccg gcgcttttcc 8640
tctgtctcga ccaggtcagc ctcgggcact gggggtttcg taggactgtc gatttcatga 8700
agtcgcatta actgcaccag acgaaacgcg cgtccggcac tcatccacgc agagcgatgg 8760
aaagtccgca ttgactcata cgttgcgatc aagatccatg cttggatctc ttccgtgtca 8820
accggggcat tcgagtcgcc cgacaggtag gagaattcca acgtccgctt tgtttcctgg 8880
tagaaggagt cttgaagatg ttggaattgc gcggaaagga gggacgccag cgtccatacc 8940
gcgtactgca gacatcggcg agatgtcttc ttcgcggcat ttctggccca gcctagataa 9000
cgacgctggt gaagtatctg gatggacggg tgaactcgat caaagtacag ttggtttctg 9060
acacgaccat cagccatacc ttgccaacga gggggctcgc gccacttaca attctgcctg 9120
caccaattcc gttatcggtt cagctccacc gatgtccttg ctgcacgtcg cgaacgacgg 9180
agccgaactg acactcgtcg tcgtgttcgg caatgacatg tctggctcgg agaccgttgg 9240
aggcggattc gagtcggaac ggctcgacgc gctggagaca ctgcagccat catgatggtc 9300
gttggtcagg ggagttgaca atgggttgaa ctcggacaag ggcccaacga gatgctgggc 9360
cggcagacgc gtctcgagca tcgctgggat aaatctcaat taacacccgc gccataacag 9420
tctggaggca tcgcagatat accgactcga ttcctcaacg ccgtcaggta gcctttcttc 9480
gggcccctag gccgccgttg gctgttgacc tcgcaggtta cacccgaatc cacacaaact 9540
ccgcaccgcg gttgctgtcc gtcacagcgt agtttgcgtc gccggcattc ctcgcacgct 9600
cttcctgtcc gttgtcgctg tctcgtcgtg ggccgggagg gctgtcgatg tgcggtggag 9660
gccatctcgt gagagagcat cacgcgacga cttgagccaa gggagcaata tccttccaat 9720
cactggcagt ggatgcagcc gacgcctggc actgactttg cggactttat agatggagct 9780
agtatgatgg atgagctctg gggaatgtga gatctagatg ctgccaagaa aagcgcgccg 9840
gtgtactacg tgtccttcgg cgccgcccag gtgtgcacta gtgcttacct gctacgcgat 9900
gttacagaac ttgcatctgc atcgtgcaat ggaaggggaa tatatgcacg cttggtcgct 9960
cgcttcgaac tctgatcatc ttggtaggcg ggtattcccg ctgtccatca gagattgcta 10020
caacttgcat acatcgactg cgccccccca agctgggata ggactcagtc cactggggaa 10080
gcgaacgttt ttgacccggc tccattccct caaggtacca atccagtgct ccctaccata 10140
tccactgtcc ttgacgcctc cgaatggcgt ccccaagagg gcgcggaagt agttgttgac 10200
caacacaacg cccacgtcca atttccgagt cacacgcata gcgcgggtga agtcgctgga 10260
gtatacccct gcaaaaagtc cgtattggga ggagttgacg gtcttcacgg cttcctcctc 10320
cgtttcaaaa gaaccgacgg taacgacggg cccaaagatc tccctctgtg caatggtcat 10380
gtctgctgtc acgtcggtaa acagcgtagg agggacgaag aaccctcccg acagacggcc 10440
cgccgtgggc gggtctcctt gcgcagctag agtcgccccc tcgcgtttgc cttgctcgat 10500
gtacgacagg acctcctgct ggcgctcccg cgagaccacc gggccgatgt gtgtcgtctc 10560
gtcgaggccg tcgcccgttc gcagtttctt cacggcagcc gtcaggcgac tgacaagcgt 10620
cgggtaaaga tctttgtgca ccagaatccg cgatgcggcg gtgcacgatt cgcccttgtt 10680
gaagaaagcg ccatcgatgg cgtcgcgcac gaccaactcc aggtcggcgt cctcaaagac 10740
cacgaaggca ttcttcccgc ctagctcgag caccgtgggg gtcagggtca ccgcggccgt 10800
ttgggcagcc tgggagcccg atgccgtgga tcctgtcaac gagaccatct tgacaagcgg 10860
atggtttatc agggcctgcg gtatctccgg acccagtccc ggaactgcct ggacgacgtc 10920
ggcggggaag acggactgca agatctcaac gatgcgcatc agtgtcagcg gggcctgctc 10980
gccgggcttc agcaccatgg tgttgcccgc cgccagacaa ggcgccagtt tgcccccggc 11040
gtggaccggc ggccagttga acggcaggat gcccacgcac actccatggg gctcgtagat 11100
cacgctggag tagatgctac cctggtcgaa gaattccgac ggtagcttgt cgacaattga 11160
tccgaagtac cgaaacacct gcaccagaaa cccaacatca aaggacgcgt ctttgacggg 11220
tttcccgttc tcaaggcaca acaggacggc caattcatgg ctgtgcttct gaagctcatc 11280
ggccgcctgc aggagataga gtgaccgctc ctggcgagtc ttccatcgcc acgactcgaa 11340
cgccctgtgc gacgcctgga tggccccttg caccgtgtcg agatttccgg cctgaacgac 11400
agtgatgggc tctcctgtcg cagggttcac cactgtgaag cgcttggagg cgtccttgca 11460
ggaccagcga tattcgcaaa ctgcagggag ggcttctagg attctggctg ctgcttcggc 11520
catggtgctt catgtggttc tggtaatctt gcctgataaa gtctcaggat ggtgcatggg 11580
ttatagagac atgagatgtg gatttggtgg aagagacaag gtccccagcg agccggacga 11640
cggaactgaa ggatacaatc tggtcaggag caagcagaca tgcctccggg agatctccac 11700
ggtgcgcgtt ttactccgaa ccggctacta tctccctgct ttgaaatgta aacccgcagc 11760
atccttgcat tgtactgtag gcttgtggaa ggatttgggc cgatctacgt gctggtctgg 11820
gaacagaaac atagtaggtc atcgatattg agccccttct ggcgtgaatt tttctctctg 11880
cgtctacaag acagcatgct tccaggtccc tcacagtctc gcgcttccat ctcataaaca 11940
tgtctccaca gcaccgcttc cagtcattca cttgtaagtg tagattgcat agttgttgcc 12000
ctcgctgtcc tcgaaatact ggaacagccc cttgttgcct tcggggataa catcgctcgc 12060
cttcttgccg ccgtgctttt caatggccta cccttcatta gccgatcagc ctctcgtgtc 12120
agggcatggg ccacccacct ccatcgcagc accgatgtcg ttcacgtaga ggtagagctt 12180
ggtggcgccc gtaccggccg ggatttcttc cgccagacgc atggcgcctc cgatggggaa 12240
aacgccgccg gggacttcga aggtttgaag cttgtgcgcg ggaaaaccca gagtggaggg 12300
agcaaaagtc cagttgaaga cctccttgta gaatgcagat cctgcggggc gctcgtctta 12360
ggttgcgttg tcggataatt gattaacata tgcagccggg acgacttacc gcgagccacg 12420
tccttggcgg ggatctcgag ccctacaggg gtgccagcag gagggatagc agacatgatg 12480
ccgagaatgg agtgttaaaa atcggggtgg tggttgaacg atgattgtac tgaggatcga 12540
gccaggtcca tctgcttgag gcagcttttt atatgcccgt gtcccaacga acctctttat 12600
cccccgcgct ttgtgccatc gcaatcattc gatgtaccca gtcgttccat ggtggacgaa 12660
cctatcaatt ggctccattc aaatgggcgg tcttgcgtcg tgtttcttta ttccatccag 12720
gccagagttt ctccgagtgt gatggcggaa tatctcactc ggatatcttt tatccgaatc 12780
ctccatggcc tagaaatggc atgaagttga cacgaccatc atggtattct ccgaaatata 12840
tttcctcccc acgtcaagat attccagacg gaaatattcg gttgtttcca gcaggaacca 12900
cgacctatgc accgtaagcg gctttatata agacacatgg aaacatgcgt gccatgccaa 12960
tgaccatcca ccccacattg caacccaacg agcatcatgg cctttccacc gtccgctggt 13020
agacctcgcc tccttgtcca gtgcgtacca gggaacagat cgttaacgtt cgacacaaat 13080
aggatttact tggatctcca agactcacaa tgacacctat ccaaccatca cagcggccaa 13140
gtgtaagcag catggacgag ccgtcttcgt gaccggcgca tcgaagggca tcggccgcgc 13200
gacagcggtt gcattcgctc aagccggcgc gccctccctt gcgctcggag cacgatcctc 13260
cctcgacgcc gctgagacgg cggtgctcga cgccgcgaag tccgcgggcc atccgccgcc 13320
gcaggtcctc aagctgacac tggatgtcgc ggatgagcag agtgtggccg atgcagccgc 13380
cagggtcgaa cgggcgttcg gccgtctcga catcctggtg aataatgccg gccgggtcga 13440
aaaatgggtc ccgcttgcgg agacggatcc caagtcctgg tgggcgacgt gggaggtcaa 13500
cctcaagggc acgtacctca tgacgagggc catgctgcct cttcttttga agggcggcga 13560
aaagaccatt gtcaatatga actccatcgg cgcccacctg acccggcctg gtgcctcggc 13620
ctatcaaacc gggaaattgg cgatgctgcg cttgacgcag ttcacttgtg tggagtacgc 13680
agcccagggc gttttggcct ttgccattca cccaggcgcc gtggataccg agttggcgtc 13740
caacttgccc gaagacacca aggcaaagtt ggtggattcg ccggaattgt gcgccgacac 13800
gattgtctgg ttgacgcagg agaaacagtc ctggctggcc ggacgctatt tgagtgccaa 13860
ctgggatgta gcagagttga tggctcggaa ggaggagatt ctccagggcg acaagctcaa 13920
ggtcaagttg gttctgtaga tagatcagaa ccaccgtagt catgttcctc catgttagca 13980
tgccggggaa atattcactc cgatggaata aatgtatagc cttgtccaga ccggacgttt 14040
gtacgtcgtt tcgtataaga accaggactg tctccgtcac atagagccat cagccgaact 14100
ctgtacttct ccggaatcga atatctgaca gacaagccct tgcaaatcat ggccacagtc 14160
aaggtcatcg atttcatcca aaccccattt gactttctta tcgtcggcgg tggaactgcc 14220
ggtctcgtcc tcgccgctcg tctttccgag gagccaggca tccaagttgg ggtaatcgaa 14280
gctgggtctc ttaggctggg ggatcccaag gtcgaccttc ctaccggacc gggtcagatg 14340
ctgggcgatc ccggctatga ctggaatttc gagagcatcc cacaggtgcg agacctcacg 14400
atgtcatgat gagccggtat tgatctctcc caggctggcg ccaatgcgaa agcgtatcat 14460
atcccacgag gcagaatgct gggcggctcg agtggaatca acttcatgtc ttacaaccga 14520
ccatcggccg aagacattga tgactgggcc aacaagctgg gtgtcaaagg atggacatgg 14580
tctgaactgc taccgtactt caaaagaagc gagaacttgg agcccatcga gcccagtgca 14640
agttgtccag tcagcccgaa agttcatggc accggcgggc caatccatac ttcgataggt 14700
ccctggcaag cgcccataga agaatcactc ttggctgcgt tcgatgaggc cgctcgtctg 14760
cagcggccgg cggagcccta tagcggtgcc catctgggat tctataggtc cttgttcaca 14820
ttagacagaa ccagcacgcc agtccggagc tatgcggtca gcggctacta cgcccccgtt 14880
atgggacgcc caaatctgaa ggtcctagaa aacgcacagg tgtgccgcat cttactctcc 14940
gatgcttcag acggaatacc cgtcgcggaa ggagttgaac tgcaccacgc gggagcccgc 15000
<210> 2
<211> 451
<212> DNA
<213> Monascus purpureus MP-20
<400> 2
tacataggtg tctgcaggcg gtgatgagcc cagaagctga ctttctggcc ttccttccag 60
agtttcacgg tcgtgtcgca gaggaaccgg aatgcaccct cgctagtaat gttgacggcc 120
tggaaagagg agtttgatgt acccagagcc cggcttgcca tggccgtgat ggtggagttc 180
gatccggcct ctaaccaaat ggcaacaggg aatttgtctg acaacctctt gactgcctgg 240
gcaaagaaaa ctggctttct catgtgggtg gccacataat tacgccgtgt cagctagaag 300
agaagtgatt ctcagcgctg gatctgtcca gagtccccag ctcctggagc tttctggaat 360
tggagatccg agcgtcctcg aaggcgctgg gattgcttgt agagtggcca acaccgacgt 420
gggcagcaat ttacaagaac acaccatgtc a 451
<210> 3
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列 cit-up-F
<400> 3
gtcacgacgt tgtaaaacga cggccagtga attctgatca ggcgctgaat attggct 57
<210> 4
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列 cit-up-R
<400> 4
ctgagaatca cttctcttct agctgacacg gcgtaattat gtggccaccc acatgag 57
<210> 5
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列 cit-dn-F
<400> 5
gaaaactggc tttctcatgt gggtggccac ataattacgc cgtgtcagct agaagag 57
<210> 6
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列 cit-dn-R
<400> 6
caggaaacag ctatgaccat gattacgcca agcttgcagc agggcgtctg tgaaattc 58
<210> 7
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列 Pgpda-F
<400> 7
cagtcatctg cggaacatat actgggcccg ggaagatctg cgtaagctcc ctaattggc 59
<210> 8
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列 sgRNA-R
<400> 8
gacgagctta ctcgtttcgt cctcacggac tcatcaggct gagcggtgat gtctgctcaa 60
gc 62
<210> 9
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列 sgRNA-F
<400> 9
gatgagtccg tgaggacgaa acgagtaagc tcgtcgctga gcgtgaaaca ggctggtttt 60
agagctagaa atag 74
<210> 10
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列 TtrpC-R
<400> 10
gggcggtgat tctgctgtct cggctgaggt cttaattaag agccaagagc ggattcctc 59
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列 puc57-SF
<400> 11
tgctgcaagg cgattaagtt gg 22
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列 puc57-SR
<400> 12
ttacacttta tgcttccggc t 21
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列 pFC333-SF
<400> 13
gtaccctgtg agtcttgata ga 22
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列 pFC333-SR
<400> 14
ctaaacgctc ctttgctt 18
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列 test-F
<400> 15
cagtgcctcg acttctcgaa ttgat 25
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列 test-R
<400> 16
ataagacaca gctgacatgg tgtgt 25

Claims (10)

1.一种红曲色素的制备方法，其特征在于通过发酵基因工程改造的红曲霉制备得到，所述红曲霉删除了包含桔青霉素合成所有必需基因的整个生物合成基因簇。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于发酵红曲霉过程中不产生桔青霉素。
3.一种基因工程改造的红曲霉(Monascus purpureus)，其特征在于其删除了包含桔青霉素合成所有必需基因的整个生物合成基因簇。
4.如权利要求3所述的一种基因工程改造的红曲霉，其特征在于发酵红曲霉过程中不产生桔青霉素。
5.如权利要求3所述的一种基因工程改造的红曲霉，其特征在于所删除的桔青霉素生物合成基因簇序列如SEQ ID NO.1所示。
6.如权利要求3所述的一种基因工程改造的红曲霉，其特征在于包含如SEQ ID NO.2所示的基因序列。
7.一种制备权利要求3所述的基因工程改造的红曲霉(Monascus purpureus)的方法，其特征在于以野生型红曲霉为原料，具体包括以下步骤：
提取野生型红曲霉基因组DNA；
根据野生型红曲霉桔青霉素生物合成基因簇上下游序列设计扩增up和down片段的引物：以红曲霉的基因组DNA为模板，cit-up-F/R和cit-dn-F/R分别做为引物扩增得到pKL-03质粒上的up和down片段；Pgpda-F/sgRNA-R和sgRNA-F/TtrpC-R以pFC333质粒为模板扩增得到组装pKL-05质粒所需的片段sgRNA-1和sgRNA-2；
提取pFC-333和pUC-57载体；
pFC333载体使用BglII和PacI两种内切酶酶切；
pUC57载体使用EcoRI和HindIII双酶切；
回收酶切后的载体和目的片段；
酶切后的pFC-333和pUC-57载体与目的片段连接：pUC57载体和up以及down片段通过吉布森组装得到pKL-03质粒，酶切后的pFC333载体和sgRNA-1以及sgRNA-2通过吉布森组装得到pKL-05质粒；
制备野生型红曲霉原生质体；
将pKL-03和pKL-05质粒共同转化原生质体；
制备得到基因工程改造的红曲霉。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于：吉布森组装体系如下：Gisbon溶液15uL，载体加片段共5uL，其中载体与片段摩尔比为1∶1。
9.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于：野生型红曲霉原生质体的制作方法如下：
a.将野生型红曲霉接种平板上，培养；
b.接种到液体培养基中，培养；
c.离心收集菌丝；
d.加入酶解液摇床中培养；
e.轻轻滴加等体积trapping buffer，离心，收集中间层的原生质体；
f.加入STC buffer，离心，去除液体；
g.加入STC buffer重悬。
10.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述将pKL-03和pKL-05质粒共同转化原生质体，步骤如下：
a.取pKL-03和pKL-05质粒，加入到原生质体中；
b.加入60％PEG Solution，混匀；
c.与不含抗性的PDA-Sorbitol培养基混合后，培养，在表面再倒一层含有100μg/mL潮霉素的PDA-Sorbitol培养基。
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