KR20210139315A - 뎅기 바이러스 백신 - Google Patents

Abstract

임상에 있어서 사용 가능한 치료 또는 예방약이 될 수 있는 뎅기 바이러스 백신으로서의 재조합 백시니아 바이러스 등을 제공한다. 본 발명에 관련된 재조합 백시니아 바이러스는, 뎅기 바이러스 유래의 비구조 단백질을 코드하는 cDNA 의 전부 또는 일부와, 발현 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 한다.

Description

뎅기 바이러스 백신

본 발명은, 뎅기 바이러스 백신으로서의 재조합 백시니아 바이러스 등에 관한 것이다.

뎅기 바이러스는, 열대 지역을 중심으로 상주하고, 세계에서는 연간 약 4 억명이 감염되어, 약 1 억명이 뎅기 열을 발증하고 있는 것으로 일컬어지고 있고, 발증 지역은, 확대 경향에 있으며 (도 1), 중국 (광둥성) 에서도 대규모의 감염 (1 만명을 초과하는 감염자수) 이 보고되어 있다. 일본에서는 2014년 (헤세이 26년) 의 감염 피해는 종식되기는 했지만, 매년 감염 상주국으로부터 도항자 등을 통하여 바이러스가 반입되고 있는 것으로부터, 일본 국내에서의 감염 피해가 만성적으로 일어날 위험성에 노출되어 있다. 2010년 이후에 보고된 연간 수입 증례 수는, 200 예를 초과하고 있다.

현재, 임상에 사용 가능한 치료약은 개발이 성공되어 있지 않아, 대처 요법이 실시되고 있다. 한편으로, 임상 치험이 진행되고 있는 뎅기 백신이 여러 예 보고되어 있다. 그 중에서, 가장 개발이 진행되어 있던, 사노피 파스퇴르사의 4 가 뎅기·황열 키메라 백신에 대해서는, 헤세이 27년 (2015년) 12월에 멕시코에 있어서 백신이 인가된 것을 시작으로, 세계 10 개국 이상에서 승인되어 있다 (도 2). 그러나, 동사의 4 가 뎅기·황열 키메라 백신 (CYD) 에 대해서는, 헤세이 29년 (2017년) 11월 29일자로, 비감염자에게 백신 접종하면 뎅기 열이나 뎅기 출혈열의 발증 리스크가 높아진다는 보고 및 사용 상의 주의 환기가, 동사 및 WHO 로부터 이루어졌다 (비특허문헌 1).

The World Health Organization (WHO), "WHO advises Dengvaxia be used only in people previously infected with dengue", 2017 (URL : https : //www.who.int/medicines/news/2017/WHO-advises-dengvaxia-used-only-in-people-previously-infected/en/)

이와 같은 상황하에 있어서, 임상에 있어서 사용 가능한 치료 또는 예방약이 될 수 있는 뎅기 바이러스 백신, 상세하게는, 당해 바이러스 비감염자에게 접종했을 경우에도 뎅기 열이나 뎅기 출혈열의 발증 리스크를 억제할 수 있는 뎅기 바이러스 백신 등의 개발이 요망되고 있었다.

본 발명은, 상기 상황을 고려하여 이루어진 것으로, 이하에 나타내는, 재조합 백시니아 바이러스나 의약 조성물 등을 제공하는 것이다.

(1) 뎅기 바이러스 유래의 비구조 단백질을 코드하는 cDNA 의 전부 또는 일부와, 발현 프로모터를 포함하는, 재조합 백시니아 바이러스.

(2) 백시니아 바이러스가 DIs 주인, 상기 (1) 에 기재된 재조합 백시니아 바이러스.

(3) 상기 비구조 단백질을 코드하는 cDNA 가, 뎅기 바이러스 유래의 비구조 단백질 중의 NS1 영역을 코드하는 cDNA 인, 상기 (1) 또는 (2) 에 기재된 재조합 백시니아 바이러스.

(4) 상기 비구조 단백질을 코드하는 cDNA 가, 뎅기 바이러스 유래의 비구조 단백질 중의 NS1 영역 이외의 영역을 코드하는 cDNA 인, 상기 (1) 또는 (2) 에 기재된 재조합 백시니아 바이러스.

(5) 상기 비구조 단백질 중의 NS1 영역 이외의 영역이, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B 및 NS5 영역으로 이루어지는 영역인, 상기 (4) 에 기재된 재조합 백시니아 바이러스.

(6) 상기 뎅기 바이러스가, 2 형의 혈청형의 것인, 상기 (1) ∼ (5) 중 어느 하나에 기재된 재조합 백시니아 바이러스.

(7) 상기 비구조 단백질을 코드하는 cDNA 가, 이하의 (a) ∼ (d) 의 DNA 인, 상기 (1) ∼ (6) 중 어느 하나에 기재된 재조합 백시니아 바이러스.

(a) 서열 번호 1 에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 DNA

(b) 서열 번호 1 에 나타내는 염기 서열과 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 80 ％ 이상의 동일성을 갖고, 또한, 뎅기 바이러스 유래의 비구조 단백질을 코드하는 DNA

(c) 서열 번호 2 에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 DNA

(d) 서열 번호 2 에 나타내는 염기 서열과 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 80 ％ 이상의 동일성을 갖고, 또한, 뎅기 바이러스 유래의 비구조 단백질을 코드하는 DNA

(e) 서열 번호 3 에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 DNA

(f) 서열 번호 3 에 나타내는 염기 서열과 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 80 ％ 이상의 동일성을 갖고, 또한, 뎅기 바이러스 유래의 비구조 단백질을 코드하는 DNA

(8) 상기 (1) ∼ (7) 중 어느 하나에 기재된 재조합 백시니아 바이러스를 포함하는, 의약 조성물.

(9) 뎅기 바이러스 감염증의 예방약인, 상기 (8) 에 기재된 의약 조성물.

(10) 뎅기 바이러스 감염증의 치료약인, 상기 (8) 에 기재된 의약 조성물.

본 발명에 의하면, 임상에 있어서 사용 가능한 치료 또는 예방약이 될 수 있는 뎅기 바이러스 백신으로서의 재조합 백시니아 바이러스, 및 그것을 사용한 의약 조성물 등을 제공할 수 있다.

본 발명의 재조합 백시니아 바이러스는, 뎅기 바이러스 백신으로서, 당해 바이러스 비감염자에게 접종했을 경우에도, 그 후, 뎅기 열이나 뎅기 출혈열 (특히 중증도가 높은 뎅기 출혈열) 의 발증 리스크를 억제할 수 있는 (예를 들어, antibody-dependent enhancement (ADE) 의 현상에 의한 중증 질환 (뎅기 출혈열 등) 의 병태의 유발을 억제할 수 있는) 것인 점에서 매우 유용하다.

도 1 은, 세계에 있어서의 뎅기 바이러스 감염의 현 상황을 나타내는 도면이다.
도 2 는, 임상 개발이 진행되고 있는 뎅기 백신의 일람을 나타내는 도면이다.
도 3 은, 뎅기 바이러스 유전자 재조합 백시니아 바이러스의 유전자 구성을 나타내는 도면이다.
도 4 는, 본 발명에 있어서 개발될 수 있는 백신의 종류를 나타내는 도면이다.
도 5 는, 뎅기 바이러스 NS1 단백질 발현의 동정의 결과를 나타내는 도면이다.
도 6 은, 뎅기 바이러스 NS2B, NS3, NS4A, NS4B 및 NS5 단백질 발현의 동정의 결과를 나타내는 도면이다.
도 7 은, rDIs-DENV2C-NS25 의 바이러스 역가를 보다 높이기 위해서, 그 NS5 영역에 아미노산 치환 변이를 가한 변이주 (rDIs-DENV2C-NS25-GND) 를 제작한 것을 나타내는 도면이다.
도 8 은, rDIs-DENV2C-NS25-GND 의 변이주로 하는 것 등에 의해 바이러스 증식률이 높아진 것을 나타내는 도면이다.
도 9 는, rDIs-DENV2C-NS1 백신 접종에 의한 항체 유도의 결과를 나타내는 도면이다.
도 10 은, rDIs-DENV2C-NS1 접종 마우스에 있어서의 세포성 면역 유도의 결과를 나타내는 도면이다.
도 11 은, rDIs-DENV2C-NS25-GND 백신 접종에 의한 항체 유도의 결과를 나타내는 도면이다.
도 12 는, rDIs-DENV2C-NS25 접종 마우스에 있어서의 세포성 면역 유도의 결과를 나타내는 도면이다.
도 13 은, AG129 마우스를 사용한, 백신 접종에 의한 발증 방어 효과의 평가 방법을 나타내는 도면이다.
도 14 는, AG129 마우스를 사용한, 백신 접종에 의한 발증 방어 효과의 평가 결과를 나타내는 도면이다.
도 15 는, AG129 마우스를 사용한, 백신 접종에 의한 발증 방어 효과의 평가 결과를 나타내는 도면이다.
도 16 은, AG129 마우스를 사용한, 백신 접종에 의한 발증 방어 효과의 평가 결과를 나타내는 도면이다.
도 17 은, (A) 는, AG129 마우스를 사용한, 백신 접종에 의한 발증 방어 효과 (구체적으로는, 백신이 직접 대상으로 하는 혈청형과는 상이한 혈청형의 뎅기 바이러스에 대한 배제 효과 (발증 방어 효과)) 의 평가 방법을 나타내는 도면이다. (B) 는, 당해 마우스를 사용한, 백신 접종에 의한 상기 발증 방어 효과의 평가 결과 (간장 및 비장 중의 바이러스량의 억제) 를 나타내는 도면이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다. 본 발명의 범위는 이들 설명에 구속되는 것은 아니고, 이하의 예시 이외에 대해서도, 본 발명의 취지를 저해하지 않는 범위에서 적절히 변경하여 실시할 수 있다. 또한, 본 명세서는, 본원 우선권 주장의 기초가 되는 일본 특허출원 2019-047582호 명세서 (헤세이 31년 (2019년) 3월 14일 출원) 의 전체를 포함한다. 본 명세서에 있어서 인용된 모든 간행물, 예를 들어 선행 기술 문헌, 및 공개 공보, 특허 공보 그 밖의 특허문헌은, 참조로서 본 명세서에 받아들여진다.

1. 본 발명의 개요

뎅기 바이러스 (이하, DENV 라고도 한다) 에 감염 후, 상이한 혈청형에 속하는 뎅기 바이러스가 2 번째로 감염되었을 경우에, 최초의 바이러스에 대한 항체가, 2 번째의 바이러스의 감염을 돕는, antibody-dependent enhancement (이하, ADE) 라는 현상을 통하여 과잉의 바이러스 산생이 일어나, 뎅기 출혈열 등의 중증 질환의 발증으로 연결된다. 그래서, 이들 병태를 유발하지 않는, 4 개의 혈청 아형 바이러스에 유효한 백신을 필요로 하고 있다.

구조 단백질에 대한 항체는 ADE 를 유발할 가능성이 있기 때문에, 이 가능성이 없는 비구조 단백질의 NS1 영역이나 NS2-5 영역 (NS1 영역 이외의 영역 ; 구체적으로는 NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B 및 NS5 영역으로 이루어지는 영역) 의 유전자를 DIs 재조합 백신 제작용의 재조합 벡터에 삽입하였다. 이들 재조합 벡터를 사용하여 재조합 백시니아 바이러스 (rDIs-DENV2C-NS1 및 rDIs-DENV2C-NS25) 의 수립을 진행시켰다. 수립한 백시니아 바이러스를 동물에게 접종한 결과, 세포성 면역의 유도가 확인되었다. 또한, 백신으로서 당해 백시니아 바이러스를 접종한 동물에, 뎅기 바이러스를 공격 감염시킨 결과, 혈청 중 또는 장기 (간장이나 비장 등) 중의 바이러스량의 감소·억제가 확인되고 (도 14, 도 17), 체중 감소의 저해 (도 15) 나, 생존률의 상승 (도 16) 등, 동일 혈청형에 더하여 상이한 혈청형 뎅기 바이러스 (예를 들어 혈청형 1 형 등) 에 대해서도 현저한 발증 방어 (저해) 효과가 확인되었다.

본 발명은, 이상과 같이 하여 완성되었다.

2. 뎅기 바이러스 (DENV) 재조합 백시니아 바이러스의 제작

뎅기 바이러스 (DENV) 의 단백질을 코드하고 있는 모든 유전자, 외각 단백질 영역을 코드하는 유전자, 및 복제에 관여하고 있는 비구조 단백질 영역을 코드하는 유전자는, 이미 클로닝되어, 플라스미드의 상태로 보존되고 있다. 따라서, 본 발명의 재조합 백시니아 바이러스에 포함되는 유전자, 즉 DENV 의 비구조 단백질 영역을 포함하는 유전자는, 통상적인 유전자 공학적 수법에 의해 얻을 수 있다. 예를 들어, 유전자 공학적 수법으로서 일반적으로 이용되고 있는 DNA 합성 장치를 사용한 핵산 합성법을 사용할 수 있다. 또한, 주형이 되는 유전자 서열을 단리 또는 합성한 후에, 각각의 유전자에 특이적인 프라이머를 설계하고, PCR 장치를 사용하여 그 유전자 서열을 증폭하는 PCR 법, 또는 클로닝 벡터를 사용한 유전자 증폭법을 사용할 수 있다. 상기 방법은, 당업자이면, 「Moleculer cloning 4th Edt. Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012)」 등에 따라, 실시할 수 있다. 얻어진 PCR 산물의 정제에는 공지된 방법을 사용할 수 있다. 바람직한 양태로는, 상기 플라스미드에 삽입되어 있는 DENV 유전자를 주형에 이용하고, DENV 유전자의 원하는 영역 (비구조 단백질 영역) 에 특이적인 프라이머를 사용하여 PCR 을 실시함으로써, DENV 의 각 유전자 영역을 코드하는 DNA 를 조제할 수 있다.

본 발명에 있어서는, DENV 의 모든 유전자 영역 중 비구조 단백질 영역을 코드하는 유전자 DNA 를, 재조합 백시니아 바이러스의 제작에 사용한다. 당해 비구조 단백질 영역은, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B 및 NS5 영역으로 이루어지는 영역이고, 본 발명에 있어서는, 이 중 NS1 영역과, NS1 영역 이외의 영역 (즉, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B 및 NS5 영역으로 이루어지는 영역 ; NS2-5 영역) 을 각각 사용한다. 여기서, DENV 에는, 뎅기 1, 2, 3, 4 의 4 종류의 혈청형 (1 형, 2 형, 3 형 및 4 형) 이 존재한다. 그 중에서 뎅기 2 는 추가로 아시아형과 코스모폴리탄형으로 나뉘기 때문에, DENV 에는, 합계 5 종류의 주요한 형이 존재하게 된다. 어느 형의 DENV 에 있어서도, 비구조 단백질 영역은, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B 및 NS5 영역으로 이루어지는 영역이다. 본 발명의 재조합 백시니아 바이러스의 제작에 있어서는, 어느 형의 DENV 에서 유래하는 비구조 단백질 영역의 cDNA 를 사용해도 되고, 한정은 되지 않지만, 바람직하게는 뎅기 2 에서 유래하는 것이고, 보다 바람직하게는 뎅기 2 의 코스모폴리탄형에서 유래하는 것이다.

본 발명에 있어서는, 뎅기 2 의 코스모폴리탄형의 DENV 에서 유래하는 비구조 단백질 영역 중의 NS1 영역을 코드하는 염기 서열 DNA 를, 서열 번호 1 에 나타내고, NS2-5 영역을 코드하는 염기 서열 DNA 를, 서열 번호 2 에 나타낸다. 또한, NS2-5 영역을 코드하는 염기 서열 DNA 의 변이형 DNA (NS2-5 영역 중의 NS5 영역 부분에 변이 (상세하게는, NS5 의 효소 활성을 결실시키는 변이) 를 가한 영역을 코드하는 DNA) 를, 서열 번호 3 에 나타낸다. 단, 서열 번호 1, 2 및 3 에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 DNA 외에, 이하의 DNA 도, 본 발명에 있어서 사용할 수 있다.

서열 번호 1 에 나타내는 염기 서열에 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 80 ％ 이상, 90 ％ 이상, 95 ％ 이상, 98 ％ 이상 또는 99 ％ 이상의 동일성 (상동성) 을 갖고, 또한, 뎅기 바이러스 유래의 비구조 단백질을 코드하는 DNA (NS1 영역의 변이형 DNA).

서열 번호 2 에 나타내는 염기 서열에 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 80 ％ 이상, 90 ％ 이상, 95 ％ 이상, 98 ％ 이상 또는 99 ％ 이상의 동일성 (상동성) 을 갖고, 또한, 뎅기 바이러스 유래의 비구조 단백질을 코드하는 DNA (NS2-5 영역의 변이형 DNA).

서열 번호 3 에 나타내는 염기 서열에 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 80 ％ 이상, 90 ％ 이상, 95 ％ 이상, 98 ％ 이상 또는 99 ％ 이상의 동일성 (상동성) 을 갖고, 또한, 뎅기 바이러스 유래의 비구조 단백질을 코드하는 DNA (NS2-5 영역 중의 NS5 영역 부분에 변이를 가한 영역의 변이형 DNA).

서열 번호 1 에 나타내는 염기 서열에 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하고, 또한, 뎅기 바이러스 유래의 비구조 단백질을 코드하는 DNA (NS1 영역의 변이형 DNA).

서열 번호 2 에 나타내는 염기 서열에 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하고, 또한, 뎅기 바이러스 유래의 비구조 단백질을 코드하는 DNA (NS2-5 영역의 변이형 DNA).

서열 번호 3 에 나타내는 염기 서열에 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하고, 또한, 뎅기 바이러스 유래의 비구조 단백질을 코드하는 DNA (NS2-5 영역 중의 NS5 영역 부분에 변이 (상세하게는, NS5 의 효소 활성을 결실시키는 변이) 를 가한 영역의 변이형 DNA).

여기서, 「뎅기 바이러스 유래의 비구조 단백질을 코드하는」 이란, 바이러스가 증식할 때에 세포 중에 산생되는 단백질을 코드하는 것을 의미한다. 또한, 상기 비구조 단백질을 코드하는 유전자에는, 전체 길이 서열 외에, 그 일부의 서열도 포함된다.

상기 변이형 DNA 는, 화학 합성에 의해 얻을 수 있거나, 혹은, 서열 번호 1, 2 및 3 으로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 DNA, 또는 그 단편을 프로브로 하여, 콜로니 하이브리다이제이션, 플라크 하이브리다이제이션, 서던 블롯 등의 공지된 하이브리다이제이션법에 의해, cDNA 라이브러리 및 게놈 라이브러리로부터 얻을 수 있다. 또한, 상기 하이브리다이제이션에 있어서 스트린젠트한 조건으로는, 예를 들어, 0.1 × SSC ∼ 10 × SSC, 0.1 ％ ∼ 1.0 ％ SDS 및 20 ℃ ∼ 80 ℃ 의 조건을 들 수 있고, 보다 상세하게는, 37 ℃ ∼ 56 ℃ 에서 30 분 이상 프리 하이브리다이제이션을 실시한 후, 0.1 × SSC, 0.1 ％ SDS 중, 실온에서 10 ∼ 20 분의 세정을 1 ∼ 3 회 실시하는 조건을 들 수 있다. 하이브리다이제이션법의 상세한 순서에 대해서는, 「Moleculer cloning 4th Edt. Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012)」 등을 참조할 수 있다.

본 발명의 재조합 백시니아 바이러스의 제작은, 특별히 한정은 되지 않지만, 예를 들어, DENV 의 비구조 단백질 영역 (NS1 이나 NS2-5 의 원하는 영역) 을 코드하는 염기 서열 DNA 를, 원하는 발현 벡터 (플라스미드) 에 삽입하고, 그 플라스미드 벡터를 숙주인 백시니아 바이러스에 도입함으로써 실시할 수 있다. 당해 발현 벡터로는, 특별히 한정은 되지 않지만, 예를 들어, pSMART (등록상표) 벡터 등을 사용할 수 있고, 본 발명의 재조합 백시니아 바이러스에 포함되는 발현 프로모터는, 종래부터 백시니아 바이러스 유전자 발현에 사용되고 있는 각종 발현 프로모터 (예를 들어 mH5 프로모터 등) 를 사용할 수 있다.

플라스미드 벡터의 숙주에의 도입은, 공지된 임의의 수법을 채용할 수 있고, 예를 들어, 약독 백시니아 바이러스 DIs 주를 감염시킨 동물 세포 중에, 상기의 플라스미드 벡터를 도입함으로써, 백시니아 바이러스의 게놈 내에서 상동 재조합을 일으켜, DENV 의 비구조 단백질의 원하는 영역을 발현하는 재조합 백시니아 바이러스를 제작할 수 있다.

또한, 상기의 약독 백시니아 바이러스 DIs 주는, 천연두의 백신이었던 대련주 (DIE) 로부터 1 일 난 계대법에 의해 수립된 숙주역 유전자 결손체에서 고도로 약독화한 것으로, Chick Embryo Fibroblast (CEF) cells 에서만 증식 가능하고, 일본 국립 예방 위생 연구 연구소 (현 국립 감염증 연구소) 의 타가야 이사무 박사에 의해 개발되었다 (Tagaya et al. Nature 1961). 대규모의 유전자 결실에 의해 마우스, 모르모트, 토끼, 인간 등 대부분의 포유 동물 세포에서 증식을 할 수 없다. 이 때문에 면역 부전·면역 억제 환자에게 만일 접종되어도, 안전성이 담보된다.

제작한 재조합 백시니아 바이러스는, 바이러스 게놈을 주형으로 하여 DENV 의 비구조 단백질 영역 유전자 특이적인 프라이머에 의해 PCR 을 실시하여, 원하는 비구조 단백질 영역의 유전자 도입을 확인할 수 있다.

또한, 원하는 비구조 단백질의 발현은, 제작한 재조합 백시니아 바이러스를 감염시킨 후의 동물 세포를 샘플로 하여, 웨스턴 블롯법에 의해 확인할 수 있다. 또한, 웨스턴 블롯법에 있어서의 항체는, 예를 들어, 원하는 비구조 단백질 영역을 특이적으로 인식하는 시판되는 항체나, DENV 폴리펩티드를 면역하여 제작한 항혈청으로부터 Protein G 에 의해 IgG 를 정제한 것을 사용할 수 있다.

3. 뎅기 바이러스 감염증의 예방 또는 치료용의 의약 조성물

본 발명은, 상기 재조합 백시니아 바이러스를 포함하는 의약 조성물, 보다 구체적으로는, 뎅기 바이러스 감염증의 예방약 및 치료약으로서의 의약 조성물을 제공한다. 뎅기 바이러스 감염증으로는, 예를 들어, 뎅기 열, 뎅기 출혈열 등을 들 수 있다.

본 발명의 의약 조성물은, 모든 공지된 방법, 예를 들어, 근육, 복강 내, 피내 또는 피하 등의 주사, 혹은 비강, 구강 또는 폐로부터의 흡입, 경구 투여에 의해 생체에 도입할 수 있다. 또한, 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 재조합 백시니아 바이러스와, 기존의 항바이러스약 (예를 들어 인터페론) 을 병용하는 것도 가능하다. 병용의 양태는 특별히 한정되는 것이 아니고, 본 발명의 재조합 백시니아 바이러스와 기존의 항바이러스약을 동시에 투여할 수도 있고, 일방을 투여 후, 일정 시간 경과 후에 타방을 투여하는 방법에 의해 생체에 도입할 수도 있다.

또한, 본 발명의 의약 조성물은, 부형제, 증량제, 결합제, 활택제 등 공지된 약학적으로 허용되는 담체, 완충제, 등장화제, 킬레이트제, 착색제, 보존제, 향료, 풍미제, 감미제 등과 혼합할 수 있다.

본 발명의 의약 조성물은, 정제, 캡슐제, 산제, 과립제, 환제, 액제, 시럽제 등의 경구 투여제, 주사제, 외용제, 좌제, 점안제 등의 비경구 투여제 등의 형태에 따라, 경구 투여 또는 비경구 투여할 수 있다. 바람직하게는, 피내, 근육, 복강 등에 대한 국부 주사 등이 예시된다.

투여량은, 유효 성분의 종류, 투여 경로, 투여 대상, 환자의 연령, 체중, 성별, 증상 그 밖의 조건에 따라 적절히 선택되지만, 재조합 백시니아 바이러스의 1 일 투여량으로는, 경구의 경우에는 1000 ∼ 1000000000 PFU (plaque forming units) 정도, 바람직하게는 100000 ∼ 100000000 PFU 정도이며, 비경구의 경우에는 100 ∼ 1000000000 PFU (plaque forming units) 정도, 바람직하게는 1000 ∼ 100000000 PFU 정도이다. 바이러스는, 1 일 1 회 투여할 수도 있고, 수회로 나누어 투여할 수도 있다.

본 발명의 재조합 백시니아 바이러스는, 뎅기 바이러스 감염증의 예방용 또는 치료용 백신으로서 사용될 수 있는데, 미리 백신으로서의 항체가 또는 세포성 면역 활성을 측정해 두는 것이 바람직하다.

예를 들어, 본 발명의 재조합 백시니아 바이러스, 또는 친주인 DIs 주에 대한 항체가는, 이들 바이러스주를 마우스, 토끼 등에 접종 후, 시간 경과적으로 혈청을 회수하고, 혈청의 DENV 단백질에 대한 ELISA 가나 NanoLuc (등록상표) 가 등을 측정함으로써 얻을 수 있다. 이로써 접종 개체에서의 뎅기 바이러스의 유전자 발현 및 면역 응답의 유무를 확인할 수 있다. 본 발명의 재조합 백시니아 바이러스를 접종한 마우스 혈청은, 접종 1 주일 후부터 DENV 단백질에 대한 항체가의 상승이 확인되었다.

또한, 세포성 면역 활성은, 본 발명의 재조합 백시니아 바이러스, 또는 친주인 DIs 주를 마우스에 접종 후, 면역한 마우스로부터 비장 세포를 분리하여, DENV 의 비구조 단백질에 특이적인 CD4 양성 및 CD8 양성 세포가 유도·활성화되어 있는지 여부를, FACS 나 ELISPOT assay 에 의해 측정할 수 있다. 본 발명에 있어서는, 본 발명의 재조합 백시니아 바이러스에 의해 면역한 BALB/c 마우스 유래의 비장 세포를, 각 비구조 단백질을 발현하는 표적 세포와 공배양함으로써, 항원 특이적으로 활성화한 CD4 및 CD8 양성 T 세포가 검출되었다. 이것으로부터, 본 발명의 재조합 백시니아 바이러스에 의한 면역은, BALB/c 마우스에 있어서, DENV 의 비구조 단백질에 특이적인 세포성 면역을 유도하는 것을 알 수 있었다.

이상으로부터, 본 발명자들이 제작한 재조합 백시니아 바이러스는, DENV 에 대한 액성 면역 및 세포성 면역을 유도하는 것이 확인되었다.

또한, 본 발명에 관련된 재조합 백시니아 바이러스 (뎅기 바이러스 백신) 는, 당해 백시니아 바이러스가 본래 직접 대상으로 하는 혈청형의 뎅기 바이러스에 대해서는 물론, 그 혈청형과는 상이한 혈청형의 뎅기 바이러스에 대해서도 (즉, 바람직하게는, 4 종의 혈청 아형 중, 2 종 또는 3 종 혹은 모두 (4 종) 의 혈청형의 뎅기 바이러스에 대하여), 배제 효과 (면역 응답에 의한 발증 방어 효과) 를 갖는 (요컨대, 교차 반응성을 갖는) 것이거나, 또는 갖는 것이 기대되는 것이다. 본 발명에 관련된 재조합 백시니아 바이러스는, 뎅기 바이러스 감염에서 특히 문제가 되고 있는 antibody-dependent enhancement (ADE) 의 현상에 의한 중증 질환 (뎅기 출혈열 등) 의 병태의 유발을 억제할 수 있는 백시니아 바이러스 (백신) 로서 유용한 것이다.

이하에, 실시예를 들어 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이것들로 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

1. 방법

(1) 뎅기 바이러스 비구조 단백질 유전자 재조합 백시니아 백신의 제작 및 평가

i) 유전자 재조합에 사용하는 뎅기 바이러스주의 선택

뎅기 바이러스에는 뎅기 1, 2, 3, 4 의 4 종류의 혈청형이 존재한다. 그 중에서 뎅기 2 는 추가로 아시아형과 코스모폴리탄형으로 나뉘고, 합계 종류의 주요한 형이 존재한다. 이 5 종류 뎅기 바이러스의 혈청형 계통수 해석의 결과, 대략 중앙에 위치하는 뎅기 2 형 코스모폴리탄주 (Dengue-2 : Cosmopolitan : o1Sa-054) 의 유전자를 백신 후보로서 선택하였다. 해석에 사용한 5 종류의 유전자 서열 정보를 이하에 나타낸다.

Dengue-1 : genotype-I, M-72, Myanmar 2013 clinical isolate (NCBI GenBank Accession number : KR051912) (서열 번호 10)

Dengue-2 : Asian I, M-82, Myanmar 2013 clinical isolate (NCBI GenBank Accession number : KR051902) (서열 번호 11)

Dengue-2 : Cosmopolitan, o1Sa-054 (비구조 단백질 NS1 영역의 유전자 서열 정보 : 서열 번호 1 ; 비구조 단백질 NS2-5 영역의 유전자 서열 정보 : 서열 번호 2)

Dengue-3 : isolate DEL-72 (NCBI GenBank Accession number : GQ466079.1) (서열 번호 12)

Dengue-4 : strain GZ/9809/2012 (NCBI GenBank Accession number : KC333651.1) (서열 번호 13)

ii) 뎅기 2 코스모폴리탄주의 비구조 단백질 영역의 유전자를 클로닝하여, NS-1 영역 및 NS2-5 영역의 유전자를, 하기의 「NS-1 영역 프라이머」 및 「NS2-5 영역 프라이머」 를 사용하여, PCR 을 실시하였다. 당해 PCR 산물을 Sbf-I 효소 및 AsiSI 효소로 소화 후, DIs 주 유전자 재조합 플라스미드인 transfer vector pUC/DIs (Koji Ishii et. al, Virology 2001,302, 433-444) 개변 벡터에 삽입하였다. 그 후, DIs 재조합 백신 제작용의 재조합 벡터에 삽입하였다 (도 3). NS2-5 영역 GND 변이를 도입하는 데에 있어서는, 하기의 「NS2-5 영역 변이 도입 프라이머」 를 사용하여 퀵 체인지법 (QuikChange ; Stratagene) 에 의해 실시하였다. 이 재조합 벡터를 사용하여 재조합 바이러스의 수립을 진행시켰다 (도 4). 재조합 DIs 에 삽입된 유전자 서열을 확인한 후, 뎅기 바이러스 단백질이 발현하고 있는 것을 웨스턴 블롯법으로 확인하였다 (도 5, 6).

＜NS-1 영역 프라이머＞

SbfI-mH5p-NS1-2420-F :

5'_GGGCGGCCCTGCAGGAAAAATTGAAAATAAATACAAAGGTTCTTGAGGGTTGTGTTAAATTGAAAGCGAGAAATAATCATAAATAGCCTTGGCGatgAGCACCTCTCTGTCTGTGTCACTAG_3' (서열 번호 4)

NS1-SgfI (AsiSI)-3430-R :

5'_GGGCGGCGCGATCGCTCACTATTAGGCTGTGACCAAAGAGTTGACCAA_3' (서열 번호 5)

＜NS2-5 영역 프라이머＞

SbfI-mH5p-NS2-3474-F :

GGGCGGCCCTGCAGGAAAAATTGAAAATAAATACAAAGGTTCTTGAGGGTTGTGTTAAATTGAAAGCGAGAAATAATCATAAATAGCCTTGGCGatgGGACATGGGCAGATTGACAAC (서열 번호 6)

SgfI (AsiSI)-NS5-10224-R :

GGGCGGCGCGATCGCTCACATTTACCACAGGACTCCTGCCTCTTCC (서열 번호 7)

＜NS2-5 영역 변이 도입 프라이머＞

DEN2C NS5 GND-F :

5'_CAAGAATGGCTATCAGTGGAaATGATTGTGTTGTGAAACC_3' (서열 번호 8)

DEN2C NS5 GND-R :

5'_GGTTTCACAACACAATCATtTCCACTGATAGCCATTCTTG_3' (서열 번호 9)

또한, 상기의 NS-1 영역 프라이머 (서열 번호 4, 5) 를 사용한 PCR 은, 이하의 반응액 조성 및 반응 조건으로 실시하였다.

＜반응액 조성＞

주형 cDNA (DENV 2C cDNA) : 1.0 ㎕

5 × Q5 DNA polymerase 버퍼 : 5 ㎕

2.5 mM dNTP : 2.5 ㎕

Q5 DNA polymerase (2.0 U/㎕) : 0.5 ㎕

F 프라이머 (10 μM) : 1.25 ㎕

R 프라이머 (10 μM) : 1.25 ㎕

멸균수 : 13.5 ㎕

합계 : 25 ㎕

＜반응 조건＞

「열 변성·해리 : 98 ℃ (10 sec) → 어닐링 : 71 ℃ (15 sec) → 합성·신장 : 72 ℃ (40 sec)」 를 1 사이클로 하여 합계 35 사이클.

또한, 상기의 NS2-5 영역 프라이머 (서열 번호 6, 7) 를 사용한 PCR 은, 이하의 반응액 조성 및 반응 조건으로 실시하였다.

＜반응액 조성＞

주형 cDNA (DENV 2C cDNA) : 1.0 ㎕

5 × Q5 DNA polymerase 버퍼 : 5 ㎕

2.5 mM dNTP : 2.5 ㎕

Q5 DNA polymerase (2.0 U/㎕) : 0.5 ㎕

F 프라이머 (10 μM) : 1.25 ㎕

R 프라이머 (10 μM) : 1.25 ㎕

멸균수 : 13.5 ㎕

합계 : 25 ㎕

＜반응 조건＞

「열 변성·해리 : 98 ℃ (10 sec) → 어닐링 : 72 ℃ (15 sec) → 합성·신장 : 72 ℃ (40 sec)」 를 1 사이클로 하여 합계 35 사이클.

또한, 상기의 NS2-5 영역 변이 도입 프라이머 (서열 번호 8, 9) 를 사용한 퀵 체인지법에 대해서는, 이하의 키트, 반응액 조성 및 반응 조건으로 실시하였다.

QuickChange Lightning Site-Directed Mutagenesis kit (Stratagene #210518)

＜반응액 조성＞

주형 DNA (DENV 2C NS25 plasmid) : 1.0 ㎕

10 × 반응 버퍼 : 2.0 ㎕

2.5 mM dNTP : 0.4 ㎕

F 프라이머 (50 ng/ul) : 1.0 ㎕

R 프라이머 (50 ng/ul) : 1.0 ㎕

QuickSolution reagent : 0.6 ㎕

QuickChange Lightning Enzyme : 0.4 ㎕

멸균수 : 13.6 ㎕

합계 : 20 ㎕

＜반응 조건＞

「열 변성·해리 : 95 ℃ (20 sec) → 어닐링 : 60 ℃ (10 sec) → 합성·신장 : 68 ℃ (6 min)」 를 1 사이클로 하여 합계 18 사이클.

iii) 동물에 접종하여 항체의 산생 및 세포성 면역의 유도 효과를 검증하기 위해서 필요한 뎅기 바이러스 유전자 재조합 DIs 백신 후보주를, 대량으로 배양하여 준비를 진행시켰다.

이 경과 중에, NS2-5 영역 유전자-DIs 재조합 바이러스 (rDIs-DENV2C-NS25) 의 역가가 낮아, 대량 증식이 곤란한 것이 분명해졌다. 그래서, 뎅기 바이러스 NS5 의 효소 활성을 결실시킨 변이주 (rDIs-DENV2C-NS25-GND) 를 제작하였다 (도 7).

(2) 뎅기 바이러스 비구조 단백질 유전자 재조합 백시니아 백신의 동물에서의 평가

제작한 NS-1 영역 혹은 NS2-5 영역 유전자를 포함하는 DIs 재조합 백신을, BALB/c 및 C57BL/6 마우스에 접종하여 면역 응답 평가를 실시하였다.

i) NS-1 영역 유전자-DIs 재조합 백신 (rDIs-DENV2C-NS1) 은 BALB/c 및 C57BL/6 마우스에 대하여 높은 항체 산생과 세포성 면역의 유도가 확인되었다.

ii) NS2-5 영역 유전자-DIs 재조합 백신 (rDIs-DENV2C-NS25) 은 NS2 영역에 대한 항체의 산생과, NS3 영역에 대한 세포성 면역의 유도가 확인되었다. 또한 백신 접종량, 백신 횟수, 기간 등 상세한 검토를 진행시키고 있다.

(3) 뎅기 바이러스 감염 모델 동물의 선택 및 백신 효과의 평가

야생형의 마우스는 뎅기 바이러스 감염이 약하고, 또한, 뎅기 바이러스 감염에 의해 출혈열 등 유발하는 동물 모델은 발견되지 않았다. 백신 효과를 검증하기 위해서는 뎅기 바이러스 감염 모델 동물이 필수가 된다. 그래서, 마모셋, 투파이아 및 유전자 개변 마우스를 사용하여 감염 감수성 및 병태 발증의 평가를 진행시키고 있다.

i) 유전자 개변 마우스

야생형의 마우스는 뎅기 바이러스 감염이 약하고, 뎅기 열이 발증도 하지 않는 것이 알려져 있다. 그래서, 항바이러스에 작용하는 인터페론의 수용체 결실 마우스를 사용하여 감염 발증 동물 모델로서의 가능성을 검토하였다. I 형 및 II 형 인터페론의 수용체 결실 마우스 (AG129 마우스) 에 뎅기 바이러스를 공격 감염시킨 결과, 발증·사망하는 것을 알아냈다. 이 AG129 마우스에 뎅기 바이러스 비구조 단백질 유전자 재조합 백시니아 백신을 접종하고, 또한 뎅기 바이러스 (혈청형 2 형) 로 공격 감염을 실시하였다. 백신 접종군은 비접종군과 비교하여, 양호한 감염 발증 방어 효과를 나타냈다.

ii) 마모셋

마모셋에 뎅기 바이러스 (혈청형 1 형, 혈청형 2 형) 를 접종하여 14 일간에 걸쳐 혈중 바이러스량, 항체 유도의 유무 등의 임상 경과를 관찰하였다.

iii) 투파이아

투파이아에 뎅기 바이러스 (혈청형 1 형, 혈청형 2 형) 를 접종하여 14 일간에 걸쳐 혈중 바이러스량, 항체 유도의 유무 등의 임상 경과를 관찰하였다.

2. 결과

(1) 뎅기 바이러스 NS5 의 효소 활성을 결실시킨 변이주 (rDIs-DENV2C-NS25-GND) 를 제작하였다. rDIs-DENV2C-NS25-GND 재조합 바이러스로 함으로써 4 배 이상의 고수율이 얻어지게 되었다 (도 8).

(2) 제작한 NS-1 영역 혹은 NS2-5 영역 유전자를 포함하는 DIs 재조합 백신 (rDIs-DENV2C-NS1, rDIs-DENV2C-NS25) 을, BALB/c 및 C57BL/6 마우스에 접종하여 면역 응답 평가를 실시하였다.

i) NS-1 영역 유전자-DIs 재조합 백신 (rDIs-DENV2C-NS1) 은 BALB/c 및 C57BL/6 마우스에 대하여 높은 항체 산생과 세포성 면역의 유도가 확인되었다 (도 9, 10).

ii) NS2-5 영역 유전자-DIs 재조합 백신 (rDIs-DENV2C-NS25) 은 NS2 영역에 대한 항체의 산생과, NS3 영역에 대한 세포성 면역의 유도가 확인되었다. 또한 백신 접종량, 백신 횟수, 기간 등 상세한 검토를 진행시키고 있다 (도 11, 12).

(3) NS2-5 영역 유전자-DIs 재조합 백신 (rDIs-DENV2C-NS25-GND) 을 AG129 마우스에 접종하여 2 주일 후에 뎅기 바이러스 (혈청형 2 형) 의 공격 감염을 실시하여, 면역 응답에 의한 발증 방어 효과의 평가를 실시하였다 (도 13). 이와 같이, 백신 접종 동물에 뎅기 바이러스를 공격 감염시킨 결과, 혈청 중 바이러스량의 감소가 확인되고 (도 14), 또한 체중 감소의 저해, 생존률의 상승 등의 현저한 발증 방어 효과가 확인되었다 (도 15, 16).

(4) 마모셋에 뎅기 바이러스 (혈청형 1 형, 혈청형 2 형) 를 접종하여 14 일간에 걸쳐 혈중 바이러스량, 항체 유도의 유무 등의 임상 경과를 관찰하였다. 14 일간에 걸쳐 혈중 바이러스가 검출되고, 또한 바이러스 입자에 대한 항체 및 NS-1 영역의 항체가 산생되어 있어 감염 감수성이 있는 것을 알아냈다. 또한, 마모셋에 뎅기 1, 2, 3, 4 형을 접종하여 임상 경과를 관찰한 결과, 항뎅기 바이러스 항체가 산생되어 있어 감염 감수성이 있는 것을 알아냈다. 또한, 뎅기 1, 2, 3, 4 형 모두 잠혈 반응 양성을 나타내고, 신장에 이상 소견이 확인되었다. 이상의 지견으로부터, 마모셋에 의한 백신의 감염 발증 방어 효과를 평가하는 것이 가능해졌다.

(5) 투파이아에 뎅기 바이러스 (혈청형 1 형, 혈청형 2 형) 를 접종하여 14 일간에 걸쳐 혈중 바이러스량, 항체 유도의 유무 등의 임상 경과를 관찰하였다. 14 일간에 걸쳐 혈중 바이러스가 검출되고, 또한 바이러스 입자에 대한 항체 및 NS-1 영역의 항체가 산생되어 있어 감염 감수성이 있는 것을 알아냈다. 투파이아에 뎅기 1, 2, 3, 4 형을 접종하여 임상 경과를 관찰하였다. 모든 개체에서 NS-1 영역의 항체가 산생되어 있어 감염 감수성이 있는 것을 알아냈다. 이상의 지견으로부터, 투파이아에 의한 백신의 감염 발증 방어 효과를 평가하는 것이 가능해졌다. 현재, 뎅기 바이러스-DIs 재조합 백신을 접종하고, 백신의 감염 발증 방어 효과의 평가를 진행시키고 있다.

3. 고찰

뎅기 바이러스에 감염 후, 상이한 혈청형에 속하는 뎅기 바이러스가 2 번째로 감염되었을 경우에, 최초의 바이러스에 대한 항체가, 2 번째의 바이러스의 감염을 돕는, antibody-dependent enhancement (ADE) 라는 현상을 통하여 과잉의 바이러스 산생이 일어나, 뎅기 출혈열 등의 중증 질환의 발증으로 연결된다. 뎅기 바이러스 비구조 단백질에 대한 백신은 바이러스 입자에 결합하는 항체를 산생하지 않기 때문에 ADE 를 일으킬 위험성은 없어, 유효한 예방 백신이 될 수 있다. NS-1 영역 유전자-DIs 재조합 백신 및 NS2-5 영역 유전자-DIs 재조합 백신은 마우스 실험에 있어서 항체의 산생 및 세포성 면역의 유도가 확인되었다. 또한 백신 면역 마우스에 뎅기 바이러스를 공격 감염시킨 결과 현저한 바이러스 배제 및 발증 방어 효과를 나타냈다. 이것들로부터, NS-1 영역 유전자-DIs 재조합 백신 (rDIs-DENV2C-NS1) 및 NS2-5 영역 유전자-DIs 재조합 백신 (rDIs-DENV2C-NS25) 은, ADE 유발의 위험성을 회피할 수 있는, 유효한 신규 백신인 것이 나타났다.

[실시예 2]

실시예 1 에서 제작한, NS2-5 영역 유전자-DIs 재조합 바이러스 (rDIs-DENV2C-NS25) 의 변이주 (rDIs-DENV2C-NS25-GND) 를, I 형 및 II 형 인터페론의 수용체 결실 마우스 (AG129 마우스) 의 피부에, 1 × 10⁸ PFU 로 접종 (단회 접종) 하고, 2 주일 후에, 당해 마우스에 뎅기 바이러스 1 주 (혈청형 1 형 ; NIID-02-17 주) 의 공격 감염 (피하로의 감염) 을 실시하여, 면역 응답에 의한 발증 방어 효과의 평가를 실시하였다 (도 17A).

상기 감염으로부터 13 ∼ 16 일 후의 당해 마우스의 간장 중 및 비장 중의 바이러스량을 정량적 RT-PCR 로 측정한 결과, rDIs-DENV2C-N25-GND 접종군 (백신 접종군) 에서, 유의하게 바이러스량이 낮은 값을 나타냈다 (도 17B).

따라서, rDIs-DENV2C-N25-GND 의 접종은, 상이한 혈청형의 뎅기 바이러스 (혈청형 1 형) 가 감염되었을 경우에도, 신속하게 배제할 수 있는 효과를 갖는 것이 실증되었다. 이와 같이, 본원 발명에 관련된 재조합 백시니아 바이러스 (뎅기 바이러스 백신) 는, 상이한 혈청형의 뎅기 바이러스 (바람직하게는, 모든 혈청형 (4 개의 혈청 아형) 의 뎅기 바이러스) 에 대해서도, 배제 효과 (면역 응답에 의한 발증 방어 효과) 를 갖는 것이다. 그 때문에, 뎅기 바이러스 감염에서 특히 문제가 되고 있는 antibody-dependent enhancement (ADE) 의 현상에 의한 중증 질환 (뎅기 출혈열 등) 의 병태를 유발시키지 않는 재조합 백시니아 바이러스로서, 본 발명은 유용한 것이다.

4. 관련 정보·논문

산업상 이용가능성

본 발명의 재조합 백시니아 바이러스, 및 그것을 사용한 의약 조성물 등은, 뎅기 바이러스 백신으로서, 당해 바이러스 비감염자에게 접종했을 경우에도, 그 후, 뎅기 열이나 뎅기 출혈열 (특히 중증도가 높은 뎅기 출혈열) 의 발증 리스크를 억제할 수 있는 (예를 들어, antibody-dependent enhancement (ADE) 의 현상에 의한 중증 질환 (뎅기 출혈열 등) 의 병태의 유발을 억제할 수 있는) 것인 점에서 매우 유용하다.

서열표 프리 텍스트

서열 번호 3 : 개변 DNA

서열 번호 4 : 합성 DNA

서열 번호 5 : 합성 DNA

서열 번호 6 : 합성 DNA

서열 번호 7 : 합성 DNA

서열 번호 8 : 합성 DNA

서열 번호 9 : 합성 DNA

SEQUENCE LISTING <110> Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science Kagoshima University National University Corporation, Nagasaki University <120> A dengue virus vaccine <130> G2265WO <150> JP 2019-047582 <151> 2019-03-14 <160> 13 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1140 <212> DNA <213> Dengue virus 2 <400> 1 gccttggcga tgagcacctc tctgtctgtg tcactagtat tagtggggat cgtgacattg 60 tatttgggag tcatggtgca ggccgatagt ggttgcgttg tgagttggaa aaacaaagaa 120 ctgaaatgtg gtagtgggat ttttatcaca gacaacgtgc acacatggac agaacaatac 180 aaattccaac cagaatcccc ttcaaagctg gcttcagcta tccagaaggc tcatgaagag 240 ggcatttgtg gaatccgctc agtaacaaga ttggagaatc tgatgtggaa acaaataaca 300 ccagaactga atcacattct atcagaaaat gaggtaaaat tgactatcat gacaggagac 360 attaaaggaa tcatgcaggc aggaaaacga tccctgcggc ctcaacccac tgagctgaaa 420 tactcttgga aagcatgggg caaagcgaaa atgctctcca cagagcttca taaccacacc 480 tttctcattg atggccccga aacagcagaa tgtcccaaca caaacagagc ttggaactca 540 ctagaagttg aagactatgg ctttggagta ttcaccacca acatatggct gaaactgaaa 600 gaaaggcagg atgtattttg tgactcaaaa ctcatgtcag cagccataaa agacaacagg 660 gccgtccacg ccgatatggg ttattggata gaaagcgcac ttaatgacac atggaagatt 720 gagaaagcct cctttattga agttaaaagc tgccactggc caaagtcaca cactctctgg 780 agtaatggag tgctagaaag tgagatgata attccaaaga attttgcagg accagtgtca 840 cagcacaact acagaccggg ctatcataca caaacggcag gaccctggca tctaggtaaa 900 cttgagatgg actttgattt ctgcgaagga accacagtgg tagtgactga ggactgtgga 960 aatagaggac cctctttaag aacaactact gcttctggaa aactcataac agaatggtgc 1020 tgccgatctt gcacattacc accgctaagg tacagaggtg aggatggatg ctggtatgga 1080 atggaaatca ggccattgaa agagaaagaa gagaacttgg tcaactcttt ggtcacagcc 1140 <210> 2 <211> 6804 <212> DNA <213> Dengue virus 2 <400> 2 gccttggcga tgggacatgg gcagattgac aacttctcac taggagtctt gggaatggca 60 ttgttcctgg aagaaatgct caggacccgc gtaggaacga aacatgcaat attgctagtt 120 gcagtttctt tcgtgacatt gatcacaggg aacatgtctt ttcgagattt ggggagagtg 180 atggttatgg tgggcgctac tatgacggat gacataggca tgggcgtgac ttatcttgcc 240 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gtgacagcca caataactcc taggtcacca tcggttgaag ttaaattgcc 1440 ggactatgga gaactaacac tcgattgcga gcccaggtcc ggaattgatt ttaatgagat 1500 gatcctgatg aagatgaaaa agaaaacgtg gcttgtgcat aagcaatggt ttttagacct 1560 acctctacca tggacggcag gagcagatac atcagaagtt cattggaatc ataaagagag 1620 aatggtgaca ttcaaggttc ctcatgccaa gagacaggat gtgacagtgc taggatctca 1680 ggagggagct atgcattctg ccctcgccgg agccacagaa gtggattctg gtgatggaaa 1740 tcacatgttt gcaggacatc tcaagtgcaa agtccgcatg gagaaattga gaattaaagg 1800 aatgtcatac acgatgtgtt caggaaagtt ctcaattgac aaagagatgg cagaaacaca 1860 gcatggaacc acagtggtga aagtcaagta tgaaggcgct ggagctccgt gtaaagttcc 1920 catagagata agagatgtga acaaggaaaa agtggtcgga cgtatcatct catctacccc 1980 ttttgctgag aataccaaca gcgtaaccaa catagaatta gaaccccctt ttggggacag 2040 ctacatagtg ataggtgttg gagagagtgc attaacactc cattggttca gaaaagggag 2100 ctccattggc aagatgtttg agtccacata cagaggtgca aaacgaatgg ccattctagg 2160 tgaaacagct tgggattttg gctctgttgg tggactgttc acatcattgg gaaaggccgt 2220 acaccaggtt tttggaagtg tgtatacaac tatgtttgga ggggtctcat ggatggttag 2280 aatcctaatt gggttcttag tattgtggat tggcacaaat tcaagaaaca cttcaatggc 2340 aatgacgtgc atagctgttg gaggaatcac tctgtttctg ggtttcacag ttcaagcaga 2400 catgggttgt gtggtgtcat ggaatgggaa ggaattaaaa tgtggaagcg gaatttttgt 2460 ggttgacaac gtacacactt ggacagaaca gtacaaattt caaccagagt ccccagcaag 2520 actagcgtct gcaatattga atgcccacaa agatggggtc tgtggaatta gatcaaccac 2580 gaggctggaa aatgttatgt ggaagcaaat aaccaatgag ctaaactatg ttctctggga 2640 aggaggacat gacctcactg tagtggctgg ggatgtgaag ggggtgttga ccaaaggcaa 2700 gagagcactc acacctccag tgaatgatct gaaatattca tggaagacat gggggaaagc 2760 aaaaatcttt accccagaag caagaaacag tacgttttta atagacggac cagacacctc 2820 cgaatgcccc aatgagcgaa gagcatggaa cttttttgag gtagaagact atggatttgg 2880 catgttcacg accaacatat ggatgaaatt ccgagaagga agttcagaag tgtgtgacca 2940 tagactaatg tcggcggcaa tcaaagatca gaaagctgtg catgctgaca tgggttattg 3000 gatagagagc tcaaaaaacc agacctggca gatagagaaa gcatccctta ttgaagtgaa 3060 aacatgtctg tggcccaaaa cccacacgct gtggagcaat ggagtgctgg aaagtcagat 3120 gctcattcca agatcatatg caggcccctt ttcacagcac aattaccgtc agggctatgc 3180 cacgcaaacc gtgggcccat ggcacctagg caaattggag atagactttg gagaatgccc 3240 cgggacaaca gtcgcaattc gggaggattg tgaccacaga ggcccatctt tgagaaccac 3300 cactgcatct ggaaaactgg tcacgcaatg gtgctgccgc tcctgcacga tgcctccctt 3360 aaggttcttg ggagaagatg gatgttggta tgggatggag atcaggcctc tgagtgaaaa 3420 agaagagaac atggtcaaat cacaggtaac ggccggacag ggcacatcag aaactttttc 3480 tatggggctg ttatgcctga ccttgtttgt ggaagaatgc ttgaggagaa gagttactag 3540 gaaacacatg atattggttg tggtaatcac cttttgcgct atcatcctag gaggtctcac 3600 atggatggac ttactacgag cccttatcat gttaggggat actatgtctg gtagaatagg 3660 aggacagatc cacctagcca tcatggcagt gtttaagatg tcaccaggat acgtgctggg 3720 tgtgttttta aggaaactta cttcaagaga gacagcgctg atggtaatag gaatggccat 3780 gacaacggtg ttttcaatcc cacatgacct catggaactc attgatggaa tatcattggg 3840 gttgatatta ctaaaaatag taacacattt tgacaacact caagtgggaa ccctagccct 3900 ttccttgact tttttaagat caacaatacc attagtcatg gcttggagga ccattatggc 3960 tgtgttcttt gtggtcacac tcattccttt gtgcaggaca agctgtcttc aaaaacattc 4020 ccactgggta gaaataacag cactcatcct aggagcccag gctttgccag tgtacctaat 4080 gactctcatg aagggagcct caaggagatc ttggcctctc aatgagggca taatggctgt 4140 aggtttggtg agcctcttag gaagcgccct cttgaagaat gatgttcctt tggctggccc 4200 aatggtggca ggaggcttgc ttctagcggc ttacgtaatg agtggtagct cagcagacct 4260 gttactagag aaagctgcca acgtgcagtg ggatgaaatg gcggacataa ctggctcaag 4320 cccaatcata gaagtgaagc aggatgaaga tggctctttt tccatacggg acgtcgagga 4380 aaccaatatg atgactctct tggtgaaact ggcactgata acagtatcag gtctttaccc 4440 cttggcaatt ccagtcacaa tggcattatg gtatatttgg caagtgaaga cacaaagatc 4500 aggagctctg tgggacgtcc cctcacccgc tgccacccag aaagccacac tgtctgaagg 4560 agtgtatagg attatgcaaa gagggctgtt tgggaaaact caagttggag taggaataca 4620 catggaaggc gtatttcaca caatgtggca tgtaacaagg ggatcagtga tctgccatga 4680 gacagggaga ttagagccat cttgggctga cgtcagaaac gacatgatat catacggtgg 4740 gggatggagg ctcggagaca aatgggacaa agaagaagat gttcaggttt tagccataga 4800 accagggaaa aatcccaaac atgtccaaac gaaacctggc cttttcaaga ccctaactgg 4860 agaaattgga gcagtaactc tggatttcaa acccggaacg tctggctctc ccattattaa 4920 caagaaaggg aaagttattg gactctatgg aaatggagtg gttaccaaat caggtgatta 4980 tgtcagtgcc ataacgcaag ccgagagaat tggtgagcca gattatgaag tagatgagga 5040 catttttcga aagaaaagat taaccataat ggatttacac cctggagctg gaaagacaaa 5100 aagaatcctc ccatcaatag tcagagaggc cttaaaaagg aggctgcgaa ccctgatttt 5160 agctcccacg agagtggtgg cggccgagat ggaagaggcc ctacgtggat tgccaatccg 5220 ttatcagact ccagctgtga aatcagagca cacaggaaga gagattgtag acctcatgtg 5280 tcatgcaacc tttacaacaa gacttttgtc atcaaccagg gttcctaatt ataacctcat 5340 agtgatggat gaagcacatt tcactgaccc ttgcagtgtc gcggctagag ggtacatttc 5400 aaccagggtg gaaatgggag aggcagcagc tatcttcatg actgcaaccc ctcctggagc 5460 gacagatccc ttcccccaga gcaacagccc aatagaagac atcgagaggg aaattccaga 5520 aaggtcatgg aacacagggt tcgactggat aacagactac caagggaaaa ctgtgtggtt 5580 tgttcccagc 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tatgacccaa aatttgaaaa gcaattaggg caagtcatgc tactagtcct 7320 gtgtgctgga caattacttt tgatgagaac aacatgggct ctctgcgaag tcttgacttt 7380 ggccacagga ccagccatga ccttgtggga gggcaaccca ggaaggtttt ggaacacgac 7440 catagctgta tccacagcca acattttcag aggaagctat ttggcaggag ctggactagc 7500 tttttcgctc ataaagaatg cacaaacccc taggagggga actgggacca caggagagac 7560 actgggagag aagtggaaga gacagttaaa ctcattagac agaaaagagt ttgaagagta 7620 caaaagaagt ggaatactag aagtggatag gactgaagcc aagtctgccc taaaagatgg 7680 atctaaaatc aagcatgcgg tgtccagagg gtctagtaag atcagatgga ttgttgaaag 7740 agggatggtt aagccgaaag ggaaggtcgt ggatcttggt tgcgggaggg gaggatggtc 7800 ctattacatg gcgacactca agaacgtgac tgaagtgaaa ggatatacaa aaggaggtcc 7860 aggacatgag gaaccaatcc ccatggctac ttatggctgg aacttggtca aactccattc 7920 aggggttgat gtgttttaca aacccactga gcaggtggac accttgctct gtgacattgg 7980 ggagtcgtcc tctaatccga caatagagga aggaaggaca ttgagagtct tgaagatggt 8040 agagccatgg ctctcttcaa aacctgagtt ctgcatcaaa gtcctcaacc cctacatgcc 8100 aacagttata gaagagctgg agaaactcca gagaagatat ggcggaagcc tcgtcagatg 8160 ccctttatcc aggaattcca cccatgagat gtattgggtg tcaggtgcgt cgggaaacat 8220 cgtgagttct gtgaacacaa tatcaaagat gctgttgaac aggttcacaa caaggcatag 8280 gaaacccact tatgagaagg acgtggatct tggggcagga acgagaagtg tctccactga 8340 aacagaaaaa ccagacatga cagttattgg gagaaggctt cagagattgc aagaagagca 8400 caaagaaacc tggcactatg accaggaaaa cccatacaga acctgggcgt atcatggaag 8460 ctatgaagct ccttcgacag gctcagcatc ctccatggtg aacggggtag taaaactgct 8520 gacaaaaccc tgggatgtga ttccaatggt gacccagttg gccatgacag acacaacccc 8580 ttttgggcaa caaagagtgt tcaaggagaa ggtggatacc agaacaccac aaccaaaacc 8640 cggcacacga atgattatga ccacgacagc caattggctg tgggctctcc tcgggaagaa 8700 gaaaagtccc agattgtgta caagggaaga gttcatctca aaagttaggt caaatgcagc 8760 cataggcgca gtctttcagg aagaacaagg atggacatca gccagtgaag ctgtgaatga 8820 cagccggttc tgggaactgg ttgacaaaga aagggctctg caccaggaag gaaaatgtga 8880 atcgtgtgtc tataacatga tgggaaagcg tgagaaaaaa ttaggagagt ttggtagggc 8940 caagggaagc 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Claims (10)

1. 뎅기 바이러스 유래의 비구조 단백질을 코드하는 cDNA 의 전부 또는 일부와, 발현 프로모터를 포함하는, 재조합 백시니아 바이러스.
2. 제 1 항에 있어서,
   백시니아 바이러스가 DIs 주인, 재조합 백시니아 바이러스.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
   상기 비구조 단백질을 코드하는 cDNA 가, 뎅기 바이러스 유래의 비구조 단백질 중의 NS1 영역을 코드하는 cDNA 인, 재조합 백시니아 바이러스.
4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
   상기 비구조 단백질을 코드하는 cDNA 가, 뎅기 바이러스 유래의 비구조 단백질 중의 NS1 영역 이외의 영역을 코드하는 cDNA 인, 재조합 백시니아 바이러스.
5. 제 4 항에 있어서,
   상기 비구조 단백질 중의 NS1 영역 이외의 영역이, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B 및 NS5 영역으로 이루어지는 영역인, 재조합 백시니아 바이러스.
6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 뎅기 바이러스가, 2 형의 혈청형의 것인, 재조합 백시니아 바이러스.
7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 비구조 단백질을 코드하는 cDNA 가, 이하의 (a) ∼ (d) 의 DNA 인, 재조합 백시니아 바이러스.
   (a) 서열 번호 1 에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 DNA
   (b) 서열 번호 1 에 나타내는 염기 서열과 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 80 ％ 이상의 동일성을 갖고, 또한, 뎅기 바이러스 유래의 비구조 단백질을 코드하는 DNA
   (c) 서열 번호 2 에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 DNA
   (d) 서열 번호 2 에 나타내는 염기 서열과 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 80 ％ 이상의 동일성을 갖고, 또한, 뎅기 바이러스 유래의 비구조 단백질을 코드하는 DNA
   (e) 서열 번호 3 에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 DNA
   (f) 서열 번호 3 에 나타내는 염기 서열과 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 80 ％ 이상의 동일성을 갖고, 또한, 뎅기 바이러스 유래의 비구조 단백질을 코드하는 DNA
8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 기재된 재조합 백시니아 바이러스를 포함하는, 의약 조성물.
9. 제 8 항에 있어서,
   뎅기 바이러스 감염증의 예방약인, 의약 조성물.
10. 제 8 항에 있어서,
    뎅기 바이러스 감염증의 치료약인, 의약 조성물.

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