KR101612397B1 - Cyyr1을 포함하는 돼지열병 예방용 백신 조성물 및 이를 이용한 분석방법 - Google Patents
Cyyr1을 포함하는 돼지열병 예방용 백신 조성물 및 이를 이용한 분석방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 양성 감별 마커를 포함한 돼지열병 예방용 백신 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 돼지열병 예방용 백신에 있어 야외 감염과 백신에 의한 항체 형성을 감별할 수 있는 양성 감별 마커를 포함한 돼지열병 예방용 백신 조성물에 관한 것이다.
선별된 양성 마커에 대해서는 야외감염과 백신에 의한 항체 형성을 감별하기 위해 경쟁적 방법을 사용하여 분석방법을 확립하였고, 선별된 양성 마커의 면역원성을 동물실험을 통해 입증하여 양성 마커를 포함한 돼지열병 예방용 백신 조성물이 야외 감염과 백신에 의한 감별에 용이하게 사용될 수 있다. 나아가 상기 마커를 포함한 돼지열병 바이러스의 사용은 가축 전염병의 예방 및 치료에 효율적으로 기여할 수 있다.
선별된 양성 마커에 대해서는 야외감염과 백신에 의한 항체 형성을 감별하기 위해 경쟁적 방법을 사용하여 분석방법을 확립하였고, 선별된 양성 마커의 면역원성을 동물실험을 통해 입증하여 양성 마커를 포함한 돼지열병 예방용 백신 조성물이 야외 감염과 백신에 의한 감별에 용이하게 사용될 수 있다. 나아가 상기 마커를 포함한 돼지열병 바이러스의 사용은 가축 전염병의 예방 및 치료에 효율적으로 기여할 수 있다.
Description
본 발명은 DIVA(differentiating infected from vaccinated animal) 전략에 따라 야외 감염과 백신 접종 간의 구별을 가능하게 하는 감별 마커 포함하는 백신 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 막단백질의 하나인 CYYR1을 양성 마커로 포함하는 돼지열병 예방용 백신 조성물과 이를 이용한 분석방법에 관한 것이다.
본 발명은 양성 마커와 돼지열병 바이러스 항원을 재조합한 유전공학분야 및 이를 기초로 백신으로 제조하여 돼지열병 예방약으로 사용하는 수의학분야에 속한다.
돼지열병 바이러스(classical swine fever virus, CSFV)는 크기가 약 40~50nm 정도인 RNA 바이러스로, 플라비비리대(Flaviviridae)의 페스티바이러스(Pestivirus) 속에 속하며, 양성 센스 단일 가닥(positive sense single strand) RNA로 구성된 12.3kb 유전자와 약 3900 아미노산으로 합성된 단백질로 구성된다. 돼지열병 바이러스에 감염된 돼지는 돼지의 감수성, 연령 및 바이러스의 종류에 따라 증상은 다양하나, 일반적인 증상은 고열과 함께 식욕부진, 설사나 변비, 피부청색증 및 뒷다리를 잘 못 쓰거나 비틀거림 등이 있다. 또한, 돼지열병 바이러스는 전염성이 매우 강하여 감염된 돼지는 연령에 상관없이 거의 폐사되기 때문에 가축전염병예방법 및 세계동물보건기구에서도 돼지열병을 제1종 가축전염병으로 규정하고 있다.
돼지열병 바이러스는 감염돼지의 분변, 오줌, 눈물, 콧물에 배출되어 감염되나 사람의 신발, 의복 및 기구 같은 매개체로도 감염된다. 주로 소화기와 호흡기를 통해 침입한 이 바이러스는 편도, 림프절, 실질장기의 세포에서 증식하여 독혈증을 일으키고, 감염시 급성일 경우 고열, 피부발적, 식욕결핍, 변비, 설사, 백혈구 감소, 후구 마비, 폐사 등의 증상을 일으킨다. 또한 임신한 돼지에 감염될 경우 바이러스는 태반을 통과하여 태아에 감염하여 태아의 일령에 따라 재흡수, 유산, 사산 및 허약자돈 분만 등의 증상을 나타낼 수 있다. 또한 병든 돼지의 분변으로 많은 양의 바이러스가 배출되어 2차 감염이 발생하기도 한다.
잠복기는 주로 6~11일이나 20~30일의 잠복기를 거치기도 하므로, 임상증상이 나타나기 전 이동시 확산의 위험이 크므로, 조기에 진단하여 확산을 방지하는 것이 중요하다.
돼지열병 바이러스 감염에 의한 돼지열병은 한때 널리 발생하였지만 2009년 미국, 일본 등 선진 축산국의 경우 철저한 방역으로 돼지열병이 발생하지 않아 국제수역사무국으로부터 청정지역으로 선정되어 있다. 반면, 한국을 포함한 중국 등의 아시아 국가와 불가리아, 루마니아, 헝가리 등 일부 유럽에서는 돼지열병 바이러스 감염에 의한 돼지열병이 지금도 발생하고 있다.
현재 한국은 돼지열병 순화 생독 바이러스인 LOM 균주로 제작한 생독 백신으로 예방접종하고 있으나, 돼지열병 근절을 위해 Erns 단백질을 이용한 유전자 재조합 마커 백신을 상용화할 계획이다. 하지만 유전자 재조합 마커 백신 사용시, 백신과 야외 감염 항체를 감별할 수 있는 검사법이 수립되지 않아 예찰 검사에 어려움이 있다.
돼지열병을 제어하기 위해 사용되는 백신은 이전에는 약독화 생백신(live attenuated vaccine)인 LOM 균주가 제조되어 생독 백신으로 사용되었다. 그러나, 생독 바이러스의 경우 접종 돼지들에서 백신주의 변이로 바이러스가 활성화되는 부작용이 있어 현재는 마커 백신 또는 DIVA 백신이 사용되고 있다.
현재 사용되고 있는 백신의 경우 바이러스의 유전자 결손에 의한 변이된 플라스미드(plasmid)나, 재조합 형태나 감염에 대해 보호를 유도할 수 있는 단백질을 발현하는 키메릭 바이러스 형태 및 바이러스 펩티드(viral peptide)가 사용 되고 있으나, 생독 백신주에 비해 열병 바이러스의 감염으로부터 접종 돼지들을 보호하는 면역반응이 약한 단점이 있다. 이를 보완하기 위해 마커 백신을 사용하고 있으며, 이러한 마커 백신의 경우 바이러스 E2 단백질을 이용한 유전자재조합 마커 백신 및 E2에 대한 항체를 검출할 수 있는 ELISA 방법도 개발되어 있다. 하지만 이 역시, 마커 백신으로서의 검출 감도가 뛰어나지 못하고, 감염 2주전 마커 백신을 처리하지 않으면 효과가 없다는 단점 때문에 제한적으로 사용되고 있다. 따라서, 새로운 DIVA 백신 개발이 요구되는 실정이다.
이에 본 발명자들은 예방 백신에 적용 가능한 감별 마커를 선정하기 위해, 이용 가능한 단백질 검색을 통해 후보 물질을 선정하고 이에 적합한 감별 진단법을 확립하여 돼지열병에 대한 유전자 마커 및 양성 마커가 포함된 돼지열병 예방용 백신 조성물을 완성하였다. 또한, 이렇게 만든 백신 조성물이 동물모델에서 마커로서 작용하는 것을 확인하기 위해 재조합 아데노바이러스(adenovirus) 시스템을 사용하여 마커 백신을 제조하고 돼지에 접종하여 마커 백신의 면역원성 및 분석방법을 확인함으로써 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
상기 과제를 해결하기 위해 본 발명에서는 양성 마커 후보들에 대해 본 발명자들이 보유하고 있는 인간 막단백질 라이브러리 중에서 유전자의 크기가 작고, 소, 돼지 혈청에 후보 마커에 대한 항체가 없으면서 면역반응이 잘 일어나서 항체 형성이 잘되고, 후보 마커에 대한 부작용, 알레르기, 자가면역반응이 없으며, 소, 돼지와의 서열 상동성(sequence homology)이 낮은 후보 감별 마커를 선별하였다.
선별된 후보 감별 마커에 대해 돼지 공혈청을 사용하여 경쟁적 방법의 일종인, 경쟁적 효소결합 면역흡수 분석(competitive enzyme-linked immunosorbent assay, competitive ELISA)을 사용하여 분석방법을 확립하였고, 확립된 분석방법으로 돼지 개체별 혈청을 사용하여 시스템의 적합성을 확인하였다.
이를 바탕으로 후보 감별 마커를 포함하는 돼지열병 예방용 백신 조성물 을 제조하여 동물 접종 후 혈청을 이용하여 감별 마커에 대한 항체 형성을 확인함으로써 본 발명을 완성하였고, 이로써 야외 감염과 구별할 수 있는 새로운 마커 백신 개발이 가능하게 되었다.
이에 본 발명은 새로운 감별 마커 CYYR1 유전자 및 이의 서열 정보를 제공한다.
또한 본 발명은 감별 마커 CYYR1을 포함하는 돼지열병 예방용 백신 조성물의 유전자 및 이의 서열 정보를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 CYYR1 돼지열병 예방용 백신 조성물로서 재조합 아데노바이러스를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 CYYR1 감별 마커를 포함하는 백신 조성물과 야외 감염을 감별하는 방법을 제공한다.
본 발명은 서열번호 1의 CYYR1을 새로운 양성 마커로서 돼지열병 예방용 백신 조성물에 사용되어 야외 감염과 감별할 수 있는 마커 백신 개발에 사용할 수 있다는 점에서 우수하다.
보다 상세하게 첫째, 본 발명자들은 인간 막단백질 라이브러리에서 선정된 CYYR1에 대한 항체분석방법을 확립하였다.
둘째, CYYR1을 포함하는 백신 조성물로서 돼지열병 바이러스 E1, E2 항원을 탑재한 재조합 아데노바이러스를 제조하였다.
셋째, CYYR1 감별 마커를 포함하는 백신 조성물을 동물 접종한 후 CYYR1의 면역원성을 확인하고, 항체 분석방법을 검증함으로써 야생 바이러스 감염과 백신 접종에 의한 항체 형성을 감별할 수 있는 백신으로서 안전관리 및 예방에 유리한 효과가 있다.
도 1a는 감별 마커 항체 분석방법의 시스템 적합성을 통한 CYYR1의 음성대조군과 돼지 공혈청 간의 저해율(percent inhibition, PI)을 나타낸다. 도 1b는 음성대조군, 비히클, 테스트 혈청에 대한 모식도이다.
도 2a는 항체분석방법을 통한 CYYR1에 대한 494개체 돼지 공혈청 스크리닝 결과를 나타낸다. 도 2b는 돼지 공혈청 494개체에 대한 특이도(specificity)를 나타낸 결과이다.
도 3은 서열번호 2인 돼지열병 바이러스 E1, E2 항원과 감별 마커 CYYR1을 포함하는 재조합 E1-CYYR1-E2 단백질의 모식도와 이를 발현하는 재조합 벡터의 개략도이다.
도 4는 CSFV E1-CYYR1-E2을 포함하는 재조합 아데노바이러스의 도입유전자 확인을 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 방법으로 수행한 결과이다.
도 5a는 CYYR1 동물 접종을 위한 다중항원 펩티드(multiple antigen peptide, MAP)의 구조이다. 도 5b는 MAP CYYR1을 마우스에 일주일 단위로 투여한 뒤 각각 채혈한 혈청에서의 항체 형성을 확인한 결과이다. 도 5c는 MAP CYYR1으로 유도된 마우스 혈청과 재조합 아데노바이러스 접종으로 유도된 마우스 혈청에서의 항체형성 정도를 적정(titration)한 결과이다.
도 6a는 CYYR1 감별 마커를 포함하는 재조합 아데노바이러스 백신 조성물을 접종한 마우스 혈청을 이용하여 항체형성을 경쟁적 방법으로 확인한 결과이다. 도 6b는 CYYR1 감별 마커를 포함하는 재조합 아데노바이러스 백신 조성물을 접종한 돼지 혈청을 이용하여 항체 형성을 경쟁적 방법으로 확인한 결과이다.
도 2a는 항체분석방법을 통한 CYYR1에 대한 494개체 돼지 공혈청 스크리닝 결과를 나타낸다. 도 2b는 돼지 공혈청 494개체에 대한 특이도(specificity)를 나타낸 결과이다.
도 3은 서열번호 2인 돼지열병 바이러스 E1, E2 항원과 감별 마커 CYYR1을 포함하는 재조합 E1-CYYR1-E2 단백질의 모식도와 이를 발현하는 재조합 벡터의 개략도이다.
도 4는 CSFV E1-CYYR1-E2을 포함하는 재조합 아데노바이러스의 도입유전자 확인을 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 방법으로 수행한 결과이다.
도 5a는 CYYR1 동물 접종을 위한 다중항원 펩티드(multiple antigen peptide, MAP)의 구조이다. 도 5b는 MAP CYYR1을 마우스에 일주일 단위로 투여한 뒤 각각 채혈한 혈청에서의 항체 형성을 확인한 결과이다. 도 5c는 MAP CYYR1으로 유도된 마우스 혈청과 재조합 아데노바이러스 접종으로 유도된 마우스 혈청에서의 항체형성 정도를 적정(titration)한 결과이다.
도 6a는 CYYR1 감별 마커를 포함하는 재조합 아데노바이러스 백신 조성물을 접종한 마우스 혈청을 이용하여 항체형성을 경쟁적 방법으로 확인한 결과이다. 도 6b는 CYYR1 감별 마커를 포함하는 재조합 아데노바이러스 백신 조성물을 접종한 돼지 혈청을 이용하여 항체 형성을 경쟁적 방법으로 확인한 결과이다.
본 발명은 양성 감별 마커를 포함하는 돼지열병 예방용 백신 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 돼지열병 예방용 백신에 있어 야외 감염과 백신 접종에 의한 항체 형성을 감별할 수 있는 막단백질의 하나인 CYYR1을 양성 감별 마커로 포함하는 돼지열병 예방용 백신 조성물에 관한 것이다.
이하, 본 발명의 내용을 실시예 및 시험예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 이들 실시예는 본 발명의 내용을 이해하기 위해 제시되는 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시예로 한정되는 것은 아니고, 당업계에서 통상적으로 주지된 변형, 치환 및 삽입 등을 수행할 수 있으며, 이에 대한 것도 본 발명의 범위에 포함된다.
[실시예 1] 감별 마커에 대한 시스템 적합성 확인
본 발명은 감별 마커 백신이 적용 가능한 단백질 후보 물질을 선정하기 위해 돼지 혈청에서 후보 마커에 대한 항체가 없으면서 면역반응이 잘 일어나서 항체 형성이 잘되고, 후보 마커에 대한 부작용, 알레르기, 자가면역반응이 없는 1Kb 미만 크기의 항원을 선별 기준으로 정하고, 다양한 인간 막단백질 후보 물질 인 AREG, TM6SF1, TM7SF3, KIAA0152, EMP1, ALCAM, C14orf1, TRO, PILRB, IGFBP7, PON2, CYYR1 등을 대상으로 스크리닝을 진행하여, 서열번호 1의 CYYR1을 마커 백신의 양성 마커로 최종 선정하였다.
선정된 양성 마커에 대해서는 항원과 1차 항체가 먼저 결합하면 동일한 항원과 결합할 수 있는 또 다른 검출 항체와의 결합을 방해하는 원리를 이용한 경쟁적 방법(competitive method)으로 양성 마커에 대한 분석방법을 확인하였다. CYYR1 펩티드(Santa Cruz, Cat NO. sc-83237P) 200ug/mL을 코팅버퍼(0.1M 인산나트륨)로 200배 희석하여 1ug/mL이 되도록 조제한 후 상온(25℃)에서 2시간 방치하여 플레이트에 코팅하였다. 플레이트 세척 후 1% BSA/PBS 버퍼로 코팅 플레이트의 백그라운드(background) 감소를 위해 상온(25℃)에서 1시간 방치하여 블로킹(blocking)을 진행하였다. 블로킹 세척 후 공동 돼지 공혈청(pooled porcine serum)을 PBS로 10배 희석하여 10% 공동돼지 공혈청을 준비하였다. 혈청에 대한 간섭 조건을 최소화 하기 위해 10배 희석을 진행하였다. CYYR1 펩티드 코팅플레이트에 준비한 10% 공동 돼지 공혈청과 PBS를 분주한 뒤 그 위에 토끼 항-CYYR1 항체(Santa Cruz, Cat NO. sc-83237) 100ug/mL을 1% BSA/PBS로 100배 희석하여 1ug/mL으로 조제된 항체를 추가로 분주하였다. 플레이트에 두 용액이 충분히 섞이도록 37℃에서 1시간 방치하였다. 플레이트 세척 후 결합된 토끼 CYYR1 항체의 검출을 위해 항토끼 IgG-HRP를 20000배 희석하여 37℃에서 30분간 방치하였다. 플레이트 세척 후 결과 확인을 위해 TMB(tetrameyhylbenzidine) 기질을 반응 플레이트에 분주하여 OD값을 확인하였다.
공동 돼지 공혈청과 PBS 간의 측정된 OD값은 도 1과 같으며 이를 바탕으로 하기 수학식 1을 통해 PI를 산출하였다. 이때 PI는 32%로 산출되었다.
[수학식 1]
저해율(percent inhibition, PI) = 100 X [1 - OD 테스트 혈청/OD 대조군]
(여기서, OD 대조군은 항체만 있는 것을 의미함)
[실시예 2] 돼지 공혈청에 대한 개체별 스크리닝
실시예 1을 통해 얻어진 방법을 통해 돼지 공혈청 494개체에 대해 후보 마커의 적합성을 확인하고 공혈청에서의 컷오프(cut off) 레벨을 산출하여 이 시험법의 특이도를 측정하고자 하였다.
494개체 돼지 공혈청을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 진행되었다. 공동 돼지 공혈청을 PBS로 10% 공동 돼지 공혈청이 되도록 10배 희석한 것과 같이, 494개체 돼지 공혈청에 대해 각각 10배씩 동일한 희석버퍼로 최종 10% 개체별 돼지 공혈청이 되도록 희석하였다. 494개체 돼지 공혈청과 PBS 간의 측정된 OD값은 도 2와 같으며, 이를 바탕으로 하기 수학식 2를 통해 컷오프 레벨을 산출하였다.
[수학식 2]
컷오프 레벨 = 평균 PI + 3 표준편차(SD)
이때 산출된 컷오프 레벨은 27%였다. 컷오프 레벨을 기준으로 27% 이상 측정된 개체가 5개체 존재하므로(구체적으로, 양성 5/494, 음성 489/494), 494개체에 대한 특이도는 99%임을 확인하였다.
[실시예 3] CSFV E1-CYYR1-CSFV E2 카세트의 구성
서열번호 2의 핵산서열을 가지는 돼지열병 바이러스 E1, E1과 감별 마커 CYYR1의 유전자를 융합유전자 형태로 화학적으로 합성하였다. 벡터에 삽입을 용이하게 하기 위해 5’말단에 Kpn I, 3’말단에 Xba I 제한효소 사이트를 첨가하였다. 합성된 DNA를 아데노바이러스 전달 벡터인 pShuttle.tet10 벡터(modified pShuttle CMV vector, Agilent Technologies, Cat NO. 240006)에 삽입시켜 pShuttle.tet10/tPA-CSFV E1-CYYR1-CSFV E2 벡터를 구축하였다.
[실시예 4] CYYR1 카세트를 발현하는 재조합 아데노바이러스의 생성
pShuttle.tet10/tPA-CSFV E1-CYYR1-CSFV E2 벡터를 Pme I 제한효소로 절단한 후, 복제 불가능한 pAd Easy 벡터(Agilent Technologies, cat.no.240005)와 상동 재조합(homologous recombination) 보정 기작이 없는 대장균 종인 BJ5183 대장균 세포(Agilent Technologies, Cat NO. 200154)에서 상동 재조합 반응을 수행하였다. 이 후 카나마이신(kanamycin) 항생제를 이용하여 CYYR1 카세트가 내제된 pAd/CSFV E1-CYYR1-CSFV E2(이후 pAd/E1-CYYR1-E2로 명명)를 콜로니(colony)를 선별하였다. 그리고, pAd/CSFV E1-CYYR1-CSFV E2를 생산 세포주 293R에 형질 전환시켜 CYYR1 카세트를 발현하는 재조합 아데노바이러스 rAd/E1-CYYR1-E2를 얻었다.
[실시예 5] 재조합 아데노바이러스의 도입유전자 확인(PCR법)
각 유전자 확인이 가능한 프라이머(primer)를 합성하여 VSS에서 키트(High Pure Viral Nucleic Acid Kit, Roche)로 바이러스 DNA(viral DNA)를 추출하여 전달 벡터와 삽입 유전자의 일부를 PCR 방법으로 증폭한 산물을 1% 아가로스 겔에 전기영동 하였다. 그 후 밴드 크기를 확인하여 유전자가 도입되었음을 확인하였다(도 4 참조).
[실시예 6] 재조합 아데노바이러스의 도입유전자 확인(ELISA법)
생성된 재조합 아데노바이러스를 A549 세포(ATCC, Cat NO. CCL185)에 세포 당 1000 VP(virus particle) 함량으로 감염 배지에서 3일 간 감염한 세포를 회수하여 VDPro CSFV AG ELISA Kit(MEDIAN Diagnostics)를 사용하여 도입유전자 E2의 발현을 확인하였다.
CSFV 항체 흡착 플레이트를 상온에서 10분간 방치 후, 각 웰에 희석액을 50uL씩 분주한 후 시료를 50uL씩 분주하였다. 감염한 세포를 회수한 후, 1x 샘플처리 버퍼로 시료를 준비하여 강 양성대조, 약 양성대조, 음성대조를 각 2개 웰에 50uL씩 분주하였다. 37℃ 항온기에서 90분간 반응시킨 후, 반응액을 제거하고 세척액을 웰 당 300uL씩 분주하여 제거하는 과정을 4회 반복하였다. 웰에서 세척액을 완전히 제거하고 HRPO Anti-CSFV Conjugate(CSFV AG)를 각 웰에 100uL씩 분주하였고 37℃ 항온기에서 1시간 동안 반응시킨 후, 반응액을 제거하고 세척액을 웰 당 300uL씩 분주하여 제거하는 과정을 4회 반복하였다. 웰에서 세척액을 완전히 제거하고 발색제를 각 웰에 100uL씩 분주하고 상온에서 15분간 반응시킨 후, 정지액을 각 웰에 50uL씩 첨가하여 반응을 중지시킨 후, ELISA 리더로 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
시험 적합은 강 양성대조의 평균 흡광 값은 0.80 이상, 약 양성대조의 평균 흡광 값은 0.35 이상, 음성대조의 평균 흡광 값은 0.30 이하여야 하고, 수정된 양성대조군(corrected positive control, CPC=강 양성대조 평균 OD-약 양성대조 평균 OD)의 값은 0.60 이상이어야 한다. 하기 표 1은 CSFV E1-CYYR1-E2을 포함하는 재조합 아데노바이러스의 도입유전자 확인을 ELISA 법으로 수행한 결과를 나타낸다.
| 검체이름 | OD 450nm 흡광값 | |||
| 1 | 2 | 평균 | 기준 | |
| 강 양성대조 (SPC) | 1.312 | 1.177 | 1.245 | ≥ 0.80 |
| 약 양성대조 (WPC) | 0.601 | 0.509 | 0.555 | ≥ 0.35 |
| 수정된 양성대조 (CPC) | 0.69 | ≥ 0.60 | ||
| 음성대조 (NC) | 0.051 | 0.050 | 0.051 | ≤ 0.30 |
| CSFV E1-CYYR1-E2 | 0.682 | 0.706 | 0.699 | - |
상기 표 1을 살펴보면, 측정 결과, 세포 파쇄액에서 발현을 확인하였으며, 시험이 적합함을 알 수 있다.
[실시예 7] 마커에 대한 면역원성 확인
CYYR1에 대한 동물에서 면역원성을 우선적으로 확인하기 위해 다중항원 펩티드(MAP) 시스템을 이용한 CYYR1을 마우스에 접종하여 면역원성을 확인하고자 하였다. MAP 시스템은 리신(lysine)을 이용하여 펩티드를 반복적으로 붙여 만든 구조체로 MAP을 이용하여 원하는 펩티드의 항체 반응을 유도하고 T 세포 반응을 유도하여 다양한 암이나 질병을 억제할 수 있음이 여러 논문에서 입증이 되어 있다.
또한 MAP 구조체의 c-말단 부분에 리포펩티드(lipopetide), 터프트신(tuftsin), 플라젤린(flagellin) 등을 융합하여 항체반응이나 T 세포 반응을 더욱 향상시킬 수 있음도 증명되었기에 먼저 MAP 구조체를 통해 CYYR1에 대한 항체 반응이 유도되는지를 확인하였다. Balb/C 5주령 마우스(코아텍)를 구입하여 MAP-CYYR1을 1ug씩 1주 간격으로 주사하였고 2주째부터 1주 간격으로 채혈하여 면역원성을 확인하였다. 면역반응이 확인된 마우스에 돼지열병 바이러스 E1, E2 항원과 CYYR1을 발현하는 재조합 아데노바이러스를 상기에서 확립된 공정을 바탕으로 생산, 정제하여 마우스당 107 PFU씩 주사한 후 MAP-CYYR1으로 유도된 면역반응에 부스팅하여 면역원성을 확인하였다(도 5 참조).
코팅 플레이트 준비는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 진행되었다. 마우스 공혈청 1ug/mL과 1차, 2차, 3차 채혈한 마우스 혈청을 각각 1% BSA/PBS로 10배 희석하였다. 코팅 플레이트에 준비된 10% 혈청을 분주하고 상온(25℃)에서 1시간 방치한다. 세척 후 항마우스 IgG-HRP를 1000배 희석하여 플레이트에 분주하고 상온(25℃)에서 30분 방치하였다. 면역반응이 유도된 마우스에서의 CYYR1 항체를 확인하기 위해 세척 후 TMB 기질을 분주하여 OD값을 측정하였다. 마우스 공혈청과 면역반응이 유도된 마우스 혈청 간의 측정된 OD값은 도 5에 나타내었다.
[실시예 8] 마커의 분석방법 확인
실시예 7에서 CYYR1이 감별 마커로서의 가능성을 확인하고자 앞서 적합성을 가진 것으로 판단된 시스템에서 면역원성이 확인된 마우스 혈청을 이용하여 PI값을 감소시키는지 확인하고자 하였다.
코팅 플레이트 준비는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 진행되었다. CYYR1 감별 마커를 포함하는 돼지열병 예방용 백신 조성물로 접종으로 유도된 마우스 혈청과 돼지 혈청을 PBS로 10배 희석하였다. 코팅 플레이트에 준비된 10% 혈청과 음성대조군으로 PBS를 분주하고 그 위에 토끼 CYYR1 항체를 1% BSA/PBS로 100배 희석하여 1g/mL으로 조제된 용액을 추가로 분주하였다. 모든 웰에 준비한 1ug/mL CYYR1 항체를 분주하고 37℃에서 1시간 방치하였다. 세척 후 항토끼 IgG HRP를 1% BSA/PBS로 20000배 희석하여 모든 웰에 분주하고 37℃에서 30분 방치하였다. 면역반응이 유도된 마우스 혈청과 돼지 혈청(양성대조항체)에서의 OD 저해 정도를 보기 위해 세척 후 TMB 기질을 분주하여 OD값을 측정하였다.
면역반응이 유도된 마우스 혈청과 돼지 혈청(양성대조항체), 음성대조군의 OD값은 도 6의 결과와 같으며, 음성대조군 대비 MAP CYYR1으로 면역 유도된 마우스 혈청의 PI는 22%, CYYR1 아데노바이러스(pShuttle.tet10/tPA-CSFV E1-CYYR1-CSFV E2)로 면역 유도된 마우스 혈청의 PI는 26%로 확인되었고, 접종된 돼지 1차 혈청의 PI는 18%, 2차 혈청의 PI는 21%, 3차 혈청의 PI는 25%임을 확인하였다.
이는 항체가 생성될수록 OD값이 감소하여 결과적으로 PI값은 증가하는 경쟁적 분석(competitive assay) 원리로, 면역 유도된 마우스 혈청 및 돼지 혈청은 접종 횟수에 비례하여 PI값이 증가함을 알 수 있었다. 따라서, 접종 횟수가 많을수록 항체의 양이 증가하였다고 판단되며, 이로써 CYYR1가 감별 마커로서 활용될 수 있음이 확인되었다.
<110> Korea
<120> Vaccine composition comprising CYYR1 for preventing classical
swine fever, and detecting method using thereof
<130> YPD201405-0040
<160> 4
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 99
<212> DNA
<213> Human
<400> 1
cagtgcggaa aggattgcaa aagctactgc tgcgacggca ccacacctta ctgctgcagc 60
tactatgctt acatcggaaa cattctgagc ggcacagcc 99
<210> 2
<211> 1674
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Recombinant sequence
<400> 2
atgggcggcc acctatcaga atttctgctg ctctctctgg ttgttctgtc tgacttcgcc 60
cctgaaacag ccagcgcgtt atacctcatt ttgcactacg tgattcctca atcccaagaa 120
gaacctgaag gctgtgacac aaaccagctg aatctaacag tggaactcag gactgaagac 180
gtaataccgt catcagtctg gaatgttggc aaatatgtgt gtgttagacc agactggtgg 240
ccatatgaaa ccaaggtggc tctgttattt gaagaggcag gacaggtcgt aaagttagcc 300
ttacgggcgc tgagggattt aatcagggtc tggaatagcg catcaaccac ggcattcctc 360
atctgcttga taaaagtatt aaggggacag atcgtgcaag gtgtgatatg gctgctacta 420
gtaactgggg cacaaggcgc ggccgcccag tgcggaaagg attgcaaaag ctactgctgc 480
gacggcacca caccttactg ctgcagctac tatgcttaca tcggaaacat tctgagcggc 540
acagccctcg agcggctagc ctgcaaggaa gattacaggt acgcactatc atcaaccaat 600
gagatagggc tactcggggc cggaggtctc accaccacct gggaagaata caaccacgat 660
ttgcaactga atgacgggac cgttaaggcc atttgcgtgg caggttcctt taaaatcacg 720
gcacttaatg tggtcagtag gaggtatttg gcatcattgc ataaggaggc tttacccact 780
tctgtgacat tcgagctcct gttcgacggg accaacccat caactgagga aatgggagat 840
gacttcgggt tcgggctgtg cccgtttgat acgagtcctg ttgtcaaggg aaagtacaat 900
acaaccttgt tgaacggtag tgctttctat cttgtctgtc caatagggtg gacgggtgtt 960
atagagtgca catcatttaa tatggacact ctgagaacag aagtggtaaa gaccttcagg 1020
agggacaagc cctttccgca cagaatggat tgtgtgacca caacagtgga aaatgaagat 1080
ttattctact gtaattgggg gggcaactgg acatgtgtga aaggtgaacc agtggtctac 1140
gcgggggggc tagtaaaaca atgcagatgg tgtggctttg acttcaatga gcctgacgga 1200
ctcccacact accccatagg taagtgcatt ttggcaaatg agacaggtta cagaatagtg 1260
gattcaacag actgtaacag agatggtgtt gtaatcagca cagaggggag tcatgagtgc 1320
ttgatcggta acacaaccgt caaggtgcat gcatcagatg aaagactggg ccccatgcca 1380
tgcagaccta aagagaccgt ctctagtgaa ggacctgtaa ggaaaacttc ctgtacattc 1440
aactacgcaa aaactttgaa gaacaagtac tatgagccca gggacagcta tttccagcaa 1500
tatatgctta agggcgagta tcagtactgg tttgacctgg acgtgactga ccgccactca 1560
gattacttcg cagaatttgt tgtcttggtg gtggtagcac tgttaggagg aagatatgtc 1620
ctgtggttaa tagtgaccta catagtttta acagaacaac ccgccgctgg ttaa 1674
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer
<400> 3
gtgtgttaga ccagactg 18
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer
<400> 4
ggtcacacaa tccattctgt 20
Claims (12)
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- 하기 단계를 포함하여, 돼지열병 바이러스의 야외 감염과 백신 접종에 의한 항체 형성을 감별하는 분석방법;
1) 야외 감염에 의한 감염체로부터 얻는 혈청 샘플의 OD 값을 측정하여 저해율(percent inhibition, PI)을 산출하는 단계;
(이 때, PI = 100 X [1 - 측정된 OD 값 / 대조군 OD 값]이며, 대조군은 항체만 있는 것이다)
2) CYYR1 외부 도메인과 돼지열병 바이러스 유래 E1 및 E2 단백질을 재조합하여 만든 재조합 항원 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자 또는 이 유전자가 도입된 발현 벡터를 포함한, 백신 조성물로 접종된 감염체로부터 얻은 혈청 샘플의 OD 값을 측정하여 PI를 산출하는 단계; 및
(이 때, PI = 100 X [1 - 측정된 OD 값 / 대조군 OD 값]이며, 대조군은 항체만 있는 것이다)
3) 상기 1) 단계의 PI 값과 비교하여, 상기 2) 단계의 PI 값의 감소여부를 확인하는 단계. - 제9항에 있어서, 상기 단계 1)의 감염체 및 상기 단계 2)의 감염체는 돼지인 것을 특징으로 하는 분석 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 단계 2)의 CYYR1 외부 도메인은 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드 서열을 갖는 유전자로부터 발현된 것을 특징으로 하는 분석 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 단계 2)의 CYYR1 외부 도메인은 인간 막단백질 유래인 것을 특징으로 하는 분석 방법.
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| KR1020140091163A KR101612397B1 (ko) | 2014-07-18 | 2014-07-18 | Cyyr1을 포함하는 돼지열병 예방용 백신 조성물 및 이를 이용한 분석방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| KR1020140091163A KR101612397B1 (ko) | 2014-07-18 | 2014-07-18 | Cyyr1을 포함하는 돼지열병 예방용 백신 조성물 및 이를 이용한 분석방법 |
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| KR1020140091163A KR101612397B1 (ko) | 2014-07-18 | 2014-07-18 | Cyyr1을 포함하는 돼지열병 예방용 백신 조성물 및 이를 이용한 분석방법 |
Country Status (1)
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| KR (1) | KR101612397B1 (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20190103792A (ko) | 2018-02-28 | 2019-09-05 | 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장) | Il-7을 포함하는 돼지열병바이러스의 치료 및 예방용 조성물 |
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| KR0174449B1 (ko) | 1995-12-26 | 1999-04-15 | 배순훈 | 테이프 레코더의 음성 콘트롤 헤드 조립체 |
-
2014
- 2014-07-18 KR KR1020140091163A patent/KR101612397B1/ko active IP Right Grant
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| Title |
|---|
| GenBank: EU915211.1 |
| 진현탁, NDSL 농림축산검역검사기술개발 연구보고서 초록 (2013.11.)* |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20190103792A (ko) | 2018-02-28 | 2019-09-05 | 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장) | Il-7을 포함하는 돼지열병바이러스의 치료 및 예방용 조성물 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20160010818A (ko) | 2016-01-28 |
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