CZ20656U1

CZ20656U1 - Kompozice živé ockovací látky a lécivová formulace pro profylaxi onemocnení zprostredkovaných BHV-1

Info

Publication number: CZ20656U1
Application number: CZ200921092U
Authority: CZ
Inventors: Kalthoff@Donata; Beer@Martin; Küster@Heike
Original assignee: Riemser Arzneimittel Ag
Priority date: 2008-04-10
Filing date: 2009-04-09
Publication date: 2010-03-22
Also published as: TR200902782A1; SE0950224L; DE202009002058U1; EP2108375A1

Description

Oblast techniky

Předkládané technické řešení se týká kompozice živé očkovací látky a léčivové formulace pro profylaxi onemocnění zprostředkovaných BHV-1.

Dosavadní stav techniky

Bovinní herpetický virus 1 (BHV-1) je rozšířeným původcem nemocí v populaci hovězího dobytka. Způsobuje respirační příznaky onemocnění, narušení dojivosti a výkrmnosti a poruchy míry reprodukce, které často probíhají také subklinicky. Je to kauzativní agens infekční bovinní dobytčí tracheitidy (IBR) a infekční pustulámí vulvovaginitidy/balanopostitidy (IPV/IBP).

Potírání infekcí BHV-1 spočívá nyní především v očkování markerovými očkovacími látkami s dehtovaným glykoproteinem E (gE dehtovanými látkami) a v důkazu gE protilátek, aby se umožnilo spolehlivé rozlišování infikovaných zvířat od očkovaných zvířat.

gE dehtované očkovací látky BHV-1 se nabízejí ve formě zeslabených živých očkovacích látek nebo inaktivovaných očkovacích látek, přičemž živé očkovací látky zpravidla dodávají lepší ochranu.

Nevýhoda živých očkovacích látek BHV-1 však spočívá v tom, že jsou kvůli kontaminaci cizími viry, jako například virem bovinního průjmu skotu (BVDV), méně bezpečné než inaktivované očkovací látky. BVDV může vyvolávat příznaky nemoci, které se podobají příznakům IBR. Proto existuje poptávka po živých očkovacích látkách, které v podstatě nevyvolávají žádné klinické příznaky nemoci a dají se spolehlivě identifikovat.

Kromě toho při použití živých očkovacích látek vzniká nebezpečí, že by mohly ve stavu latence zůstávat v hovězím dobytku a reaktivovat se. Aby se snížilo toto riziko, dehtoval se druhý markerový protein. M.J. Kaashoek, F.A.C. van Engelenburg, A. Moerman, A.L.J. Gielkens, F.A.M. Rijsewijk a J.T. van Oirschot popisují v práci Veterinary Microbiology 48, (1996), 143-153, mutantu BHV-1, která je dehtována v polohách genů kódujících glykoprotein E a thymidinkinázu (TK). Prostřednictvím této mutanty se mohla vyvolat ochranná imunita proti onemocnění. Dosažený ochranný účinek ale nepřevyšoval ochranný účinek, kterého se dosáhlo pomocí jednoduše gE dehtovaného očkovacího viru.

Naproti tomu úkol předloženého řešení spočívá v zlepšení profylaxe infekcí BHV-1 u zvířat, zejména hovězího dobytku.

Podstata technického řešení

Předmětem navrhovaného řešení je kompozice živé očkovací látky, která obsahuje gE a TK dehtovanou mutantu BHV-1 ve vhodném nosiči a neviricidní adjuvans.

Ve výhodném provedení je neviricidním adjuvans polymer, zejména kopolymer nebo blokový kopolymer, například Polygen™. Podíl neviricidního adjuvans v kompozici přednostně Činí 5 až 50, zvláště pak 10 až 15 % (objem/objem).

Předmětem řešení je dále také léčivová formulace pro profylaxi onemocnění zprostředkovaných BHV-1, která obsahuje kompozici živé očkovací látky definovanou výše.

gE- a TK-Deletovaná mutanta BHV-1, obsažená v kompozici živé očkovací látky podle navrhovaného řešení, je připravitelná postupem zahrnujícím stupně A) až G):

A) transfekce DNA z BHV-1 ÁgE a rekombinačního plazmidu s BAC kazetou do eukaryotických buněk;

-1CZ 20656 U1

B) inzerce BAC kazety do DNA z BHV-1 AgE pro vytvoření BHV-lAgE-BAC-DNA;

C) elektroporace plazmidů BHV-lAgE-BAC-DNA do elektrokompetentní E. coli;

D) mutagenizace klonu BHV-lAgE-BAC v E. coli homologní rekombinací pro vytvoření BHVlAgEATK-BAC-DNA;

E) selektování mutagenizované BHV-lAgEATK-BAC-DNA;

F) transfekce mutagenizované BHV-lAgEATK-BAC-DNA do eukaryotických buněk;

G) generování gE a TK deletovaného potomstva BHV-1.

Pod pojmem „adjuvans“ se v tomto textu rozumí sloučenina, která podporuje vyvolání imunitní odpovědi na antigen.

Pod pojmem „neviricidní“ se v tomto textu rozumí vlastnost adjuvans při přidání k buněčné kultuře naočkované virem v koncentraci podle údajů výrobce poskytovat v podstatě srovnatelně vysoké titry buněčné kultury jako samotná virem naočkovaná buněčná kultura.

Pod označením ,pc deietovaná mutanta BHV-1“, respektive „BHV-ΙΔχ“ se v tomto textu rozumí mutanta BHV-1, jejíž poloha genu kódující protein x je alespoň částečně, přednostně úplně deletována s tím důsledkem, že mutanta není schopna exprimovat protein x.

Překvapivě se ukázalo, že přidáním neviricidního adjuvans ke kompozici živé očkovací látky, která obsahuje gE a TK deletovanou mutantu BHV-1 ve vhodném nosiči, se v očkovaném zvířeti stimuluje imunita T-buněk, takže se splňují také požadavky na virovou očkovací látku pro neonatální pacienty. Kromě toho se prostřednictvím kompozice živé očkovací látky podle tohoto řešení indukují vysoké titry protilátek, které vedou k obzvlášť výraznému ochrannému stavu imunity a tím k rozsáhlé ochraně před zatěžkávací infekcí virulentním BHV-1. gE a TK deletovaná mutanta BHV-1 podle tohoto řešení se kromě toho ukázala jako úplně avirulentní a nevedla při intramuskulámí imunizaci k žádné prokazatelné replikaci očkovacího viru v nazální sliznici. Tím také existuje pravděpodobnost, že očkovacím virem se latentně neinfikovaly žádné buňky,

Neviricidním adjuvans je přednostně kompozice živé očkovací látky podle tohoto řešení polymer, zejména kopolymer nebo blokový kopolymer. Jako obzvlášť vhodné se pro kompozici živé očkovací látky podle tohoto řešení ukázalo adjuvans Polygen™ od firmy MVP Laboratories, lne., Omaha, NE, USA.

Jako nosiče pro gE a TK deletovanou mutantu BHV-1 se v kompozici živé očkovací látky podle tohoto řešení hodí zejména permanentní buněčné linie, jako například buněčné linie MadinDarby-Bovine-Kidney (MDBK) ve vhodném médiu. Výběr nosiče je v mezích odborných dovedností.

Kompozice živé očkovací látky podle tohoto řešení obsahuje neviricidní adjuvans přednostně v podílu 5 až 50 % (objem/objem, respektive objemových procent), obzvlášť přednostně v podílu 10 až 15 % (objem/objem).

Kompozice živé očkovací látky podle tohoto řešení může kromě toho obsahovat další složky, zejména pomocné látky, které zlepšují trvanlivost kompozice živé očkovací látky, například sta-’ bilizátory pro lyofilizaci.

Typická očkovací dávkování pro gE a TK deletovanou mutantu BHV-1 v kompozici živé očkovací látky podle tohoto řešení jsou v rozmezí od 10⁵ do 10⁸ KID50 (50% infekční dávka pro kulturu).

Předložené řešení se týká také použití kompozice živé očkovací látky podle tohoto řešení pro výrobu formulace léčiva pro profylaxi infekcí BHV-1 a onemocnění zprostředkovaných BHV-1.

K dalšímu řešení úkolu se navrhuje způsob výroby gE a TK deletované mutanty BHV-1 s těmito stupni:

-2CZ 20656 Ul

A) transfekce DNA z BHV-lAgE a rekombinačm plazmid s BAC kazetou do eukaryotických buněk;

B) inzerce BAC kazety do DNA z BHV-lAgE pro vytvoření BHV-lAgE-BAC-DNA;

C) elektroporace plazmidů z BHV-lAgE-BAC-DNA do elektrokompetentní E. coli;

D) mutagenizace klonu BHV-1 AgE-BAC v E. coli homologní rekombinací pro vytvoření BHVlAgEATK-BAC-DNA;

E) selektováni mutagenizované BHV-lAgEATK-BAC-DNA;

F) transfekce mutagenizované BHV-lAgEATK-BAC-DNA do eukaryotických buněk;

G) generování gE a TK deletovaného potomstva BHV-1, a také mutanta BHV-1 připravitelná tímto způsobem.

Pomocí způsobu podle tohoto řešení se podařilo zkonstruovat gE a TK deletovanou mutantu BHV-1, která se in vitro chovala skoro jako jednotlivě gE deletovaný BHV-1. Tím se může v buněčné kultuře jednoduše docílit vysokých titrů a navzdory dvojnásobné atenuaci (gE a TK) se dosahuje dostatečných imunitních odpovědí.

Předložené řešení se v následujícím textu blíže objasňuje na základě příkladu, který rozsah řešení neomezuje, a se zřetelem na připojené obrázky 1 až 7.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1 znázorňuje konstrukci ΔΤΚ deleční mutanty prostřednictvím cílené BAC mutageneze: A) znázorňuje genomovou organizaci BHV-1 a mapu restrikčních fragmentů HindlD. B) znázorňuje polohu UL23 TK ORF a jeho sousedních Čtecích rámců. C) znázorňuje deleci v TK ORF a inzerci genu rezistence na kanamycin a D) úsek genomu po eliminaci genu rezistence.

Obrázek 2 znázorňuje výsledky western blot analýzy BHV-1 AgEATK. Testování proteinové exprese gE a TK se provádělo pomoci SDS-(10%)-polyakrylamidové elektroforézy a následné immunoblotirtg metody. Vpravo vedle vyobrazení je vždy znázorněno označení velikosti. (A) Důkaz specifického pásu po použití monoklonální protilátky proti gE o velikostí přibližně 94 kDa (špička Šipky) se prováděl pouze u viru divokého typu (zleva doprava: neinfikované kontrolní buňky, BHV-1 AgEATK, BHV-lAgE a BHV-1 (hmotnost)). (B) Pro prozkoumání buněčných lyzátů se použila polyklonální protilátka TK1. Pouze u viru divokého typu a u BHV1 lAgE se podařila detekce specifického pásu o přibližné velikosti 37 kDa (Špička šipky). Mohla se tak verifikovat chybějící exprese proteinů detekovaných protilátkami u mutanty s dvojnásobnou deleci.

Obrázek 3 znázorňuje průběh tělesné teploty hovězího dobytku v pokusu na zvířatech. Znázorňují se průměrné hodnoty skupin zvířat Vacl, Vac2 a kontrolní skupiny Ko. Pruhy nad naměřenými hodnotami označují standardní odchylku. Krátká šipka označuje den zatěžkávací infekce, zatímco dlouhé šipky označují dny imunizace. Vacl označuje skupinu zvířat, která obdržela kompozici živé očkovací látky s BHV-1 AgEATK a adjuvans Polygen™. Vac2 znamená průměrné hodnoty zvířat, kterým byl pro imunizaci aplikován pouze očkovací virus BHV-1 AgEATK. Zkratkou Ko se označuje skupina kontrolních zvířat.

Obrázek 4 znázorňuje výsledky skupin zvířat testovaných v pokusu na zvířatech v gB-IDEXXELISA: Aritmetický střed procentuálního blokování pomocí testovacích sér v jednotlivých skupinách zvířat se zde nanáší v závislosti na časovém okamžiku po první imunizaci. Horizontální čára představuje hodnotu cut-off (přerušení) testu. Čáry nad naměřenými hodnotami znázorňují vždy standardní odchylky. Krátká šipka označuje den zatěžkávací infekce, zatímco dlouhé šipky označují dny imunizace. Vacl označuje skupinu zvířat, která obdržela kompozici živé očkovací látky s BHV-1 AgEATK a adjuvans Polygen™. Vac2 znamená průměrné hodnoty zvířat, kterým

-3CZ 20656 U1 byl pro imunizaci aplikován pouze očkovací virus BHV-1 AgEATK. Zkratkou Ko se označuje skupina kontrolních zvířat.

Obrázek 5 znázorňuje výsledky skupin zvířat testovaných v pokusu na zvířatech v markerovém testu gE-IDEXX ELISA: Znázorňují se aritmetické průměrné hodnoty každé skupiny zvířat po 5 první imunizaci. Prostřednictvím horizontální čáry se udává hodnota cut-off (přerušení) pro tento test. Standardní odchylka průměrných hodnot se znázorňuje prostřednictvím čár nad naměřenými hodnotami. Dlouhé šipky označují imunizaci v den 0 a přeočkování v den 21. Krátká šipka označuje den zatěžkávací infekce. Zkratky mají stejný význam jako na obr. 4.

Obrázek 6 znázorňuje výsledky skupin zvířat testovaných v pokusu na zvířatech v sérovém neutio ralizačním testu (SNT). Znázorňují se aritmetické průměrné hodnoty SNT titru skupin zvířat.

Čáry nad naměřenými hodnotami symbolizují standardní odchylku. Den, kdy se prováděla zatěžkávací infekce, je označen krátkou Šipkou. Dlouhé šipky označují dny, kdy byla zvířata imunizována. Zkratky mají stejný význam jako na obr. 4.

Obrázek 7 znázorňuje výsledky stanovení vylučování viru po zatěžkávací infekci. Znázorňují se 15 litry viru získané titrací na pennisivních MDBK buňkách ze vzorků z nosních tampónů odebíraných denně až do dne 63 po imunizaci. Den zatěžkávací infekce je označen šipkou. Standardní odchylky průměrných hodnot se vizualizují prostřednictvím čár nad naměřenými hodnotami. Zkratky mají stejný význam jako na obr. 4.

Příklady provedení

1. Příprava gE/TK deletovaných mutant BHV-1 gE/TK deletovaný BHV-1 se generoval prostřednictvím mutagenezového systému BAC (Bacterial Artificial Chromosome) vycházeje z kmene BHV-1 „Schónboken“. Při tom se genom viru po inzerci sekvence BAC zavedl do bakterií. Tím se mohou provádět všechny další manipulace virového genomu pomocí zavedených technik mutageneze, které jsou známy u bakterií. Přídavně 25 odpadá selekce virových subpopulací v buněčné kultuře, která často vedla k dalším nedefinovaným změnám ve virovém genomu.

Pomocí mutageneze BAC na bázi systému EL250 se generoval virus, který je částečně deletován v gE poloze genu a také v poloze genu UL23, která kóduje enzym thymídinkinázu viru BHV-1. K tomu se genom BHV-1 pBHV-lAgE (Trapp S, Osterrieder N, Keil GM, Beer M; J. Gen. Virol. 30 2003;84 (Pt 2):301-06) elektroporoval do elektrokompetentní E. coli typu EL 250 (Lee EC, Yu

D, Martinez de Velasco J, Tessarollo L, Swing DA, Court DL, Jenkins NA Copeland NG; Genomics. 2001 ;73( 1):56-65). Při tom se v důsledku defektního profágu zprostředkovávají funkce, které přispívají k protekci a rekombinaci transformované DNA. Pomocí PCR se generovala lineární DNA, která se jako rekombinační partner elektroporovala do buněk nesoucích 35 EL250 BAC. Tento lineární fragment DNA má homologní sekvence BHV-1, na základě kterých se uskutečňuje homologní rekombinace do genomu pBHV-lAgE. Gen plazmidu pKD13 rezistence na kanamycin se použil jako selekční markér v FRT místech.

Tabulka 1: Primer použitý pro TK deleci

Základem údajů o polohách jsou online dostupné údaje o sekvencích BHV-1 (NCBI Sequence 40 NCJJ0I847). Podtržená písmena označují pKD13 specifické sekvence, které kódují gen rezistence na kanamycin. Sekvence BHV-1 jsou označeny tučně a kurzívou tištěnými písmeny.

-4CZ 20656 U1

Poloha Řetězec

Sekvence (5' -► 3*)

63682 pozitivní

CTCTGCTACCCCTTCGCCCGCTACTGCCTC cgcgagatcaacgcggaagatagcgattg

TGTAGGCTGGAGC

63975 negativní gccattttgcattcatcacaactggggtct (XXSHKGCWXICNmW

AGTTCGAAGTTC

Aktivací rekombinázy flpe indukovatelné arabinózou se inzerovaný gen rezistence na kanamycin nakonec s výjimkou takzvaného místa FRT o 35 bp znovu odstranil z genomu. Na obr. 1 jsou schematicky znázorněny stupně mutagenizace pBHV-IDgE v E. coli. Genomická struktura viru 5 divokého typu a jeho mapa restrikčních fragmentů se objasňuje na obr. 1A. Genové okolí thymidinkinázy, která se má deletovat, je zvětšeno na obr. 1B. Obr. 1C představuje inzerci genu rezistence na kanamycin, zatímco na obr. ID je znázorněna struktura genomu po eliminaci genu rezistence proti antibiotiku.

ORF thymidinkinázy (63260. .64339) se nemohl úplně odstranit z genomu, protože důležitý io promotor pro sousední, podstatné geny je uložen uvnitř tohoto ORF. Z tohoto důvodu se deletuje

293 párů bází (bp) z 63683 až 63975. Aby se co možná nejméně cizích sekvencí přinášelo v genomu viru, odstranila se sekvence BAC v místě gE. K tomu se provedla kotransfekce s DNA dvojnásobně deletovaného BHV-1 a plazmidové DNA pTZ18RflanksgE. Plazmidová DNA pTZ18RflanksgE při tom obsahuje dvě 1,4 kbp velké BHV-1 homologní sekvence, které předsta15 vují gE-ORF s výjimkou oblasti 281 bp (bp 121694 až bpl21975). Po kotransfekci do buněk typu

MDBK se vyvinuly dvě virové populace: jedna odpovídala transfekované DNA, obsahovala tedy ještě sekvenci BAC a dala se identifikovat prostřednictvím exprese EGFP (enhanced green fluorescent protein). Druhá virová populace naproti tomu neexprimovala žádný EGFP, tedy ztratila sekvenci BAC v důsledku homologní rekombinace se sekvencemi plazmidové DNA 20 pTZl 8RflanksgE. Tato virová populace se dále čistila pomocí subpasáží pod polotuhým médiem.

2. Charakterizace genomu gE/TK deletované mutanty BHV-1

2.1 Sekvencování

Aby se virus charakterizoval na genomické úrovni, změněné genové úseky se sekvencovaly. Třikrát se navzájem nezávisle získala virová DNA, která se přivedla k sekvencování. Přizpůsobení 25 získaných sekvencí se provádělo pomocí programů a datových bank poskytovaných od NCBI.

Pro polohu genu pro TK vyplynuly následující rozdíly v sekvencích ve srovnání se zveřejněnými sekvencemi divokého typu:

V poloze 63712 u divokého typuje C, zatímco BHV-1 AgEATK má A. Aminokyselinová sekvence zůstává zachována, protože takto získaný kodon kóduje stejnou aminokyselinu.

AŽ do 63730 se nevyskytuje žádná další změna a od 63773 rovněž neexistují žádné změny. Mezi 63730 a 63773 se nachází 73 bází, které nepocházejí z genomu viru. Ze srovnání se sekvencí plazmidu pKD13 (viz výše) vyplynulo, že ve virovém genomu zůstaly na jedné straně „na tura 1 FRT-site“ a překrývající se sekvence „distal 35 nt of natural FRT-site“. Jedná se jen o nepod

-5CZ 20656 U1 statně více než vypočítané FRT site (místo FRT), tyto sekvence nemají v genomu žádnou funkci. Účinně deletováno je tedy 43 bází čtecího rámce TK.

Čtecí rámec gE měl následující změny ve srovnání se sekvencemi divokého typu:

V poloze 121653 se nachází G namísto Tav poloze 121654 A namísto C. V poloze 121657 chybí nukleotid G, který se vyskytuje v genomu divokého typu. Tyto změny sekvence bází jsou v oblasti genomu BHV-1, pro kterou dodnes není známa žádná funkce. Předpokládá se, že se jedná o nekódující oblast. V poloze 121695 následuje restrikční místo restrikční endonukleázy PacI, které slouží jako rozlišovací znak mezi genomem viru divokého typu a BHV-1 AgEATK (štěpení vyčištěné virové DNA restrikčním enzymem a analýza v gelu). Po tomto restrikčním místě následují sekvence jako u viru divokého typu od polohy 121976. V důsledku toho má BHV1 AgEATK deleci čtecího rámce gE od 121694 do 121975.

Sekvenční analýzy ukazují, že všechny delece jsou úplné a že je možno pozorovat pouze minimální, v normálním rozsahu kolísání se vyskytující změny sekvencí.

2.2 Western blot analýza

Zkoumání proteinové exprese se provádělo pomocí analýz immunoblot elektroforeticky oddělených buněčných lyzátů zkoumaných virů. Porovnáváním se zkoumaly virus divokého typu BHV1 Schonboken, jedenkrát gE deletovaný virus a dvakrát deletovaný virus BHV-1 AgEÁTK. K tomu se MDBK buňky infikovaly příslušnými viry a po lóhodinové inkubaci se pomocí stupně lýzy s detergentem Triton X-100 získaly buněčné lyzáty. Pomocí BHV-1-specifických protilátek se testovala exprese jednak gE a jednak TK. Podle očekávání detekovalo polyklonální králičí sérum pAK-TKl proteinový pás o 37 kDa pouze v proteinovém modelu viru divokého typu BHV-1 Schonboken a v jedenkrát gE deletovaném viru (viz obr. 2A). Monoklonální protilátka mAk 2-1 reagovala specificky s 94kDa velkým proteinovým pásem v lyzátech rodičovského viru, zatímco u deletovaného viru se taková reakce neuskutečnila (obr. 2B). Tím reagoval dvakrát deletovaný virus na proteinové úrovni, jak by se korektní delece daly očekávat. Imunodetekce gE a TK se prováděla na stejných vzorcích na stejné membráně. To se umožnilo pomocí stupně známého jako stripování, který předcházel zpracování protilátkou, jejíž antigen se detekoval jako druhý.

Celkově se mohla pomocí western blot analýzy také potvrdit delece proteinů gE a TK.

2.3 Southem blot analýza

Pro prozkoumání delece čtecího rámce glykoproteinu E a částečné delece čtecího rámce thymidinkinázy se pořídil Southem blot. Při tom se genotyp mutovaného viru BHV-1 AgEÁTK srovnával s kmenem Schonboken výchozího viru BHV-1. DNA příslušných virů se izolovala a štěpila restrikčním enzymem Hind 111. Fragmenty se dělily v 0,7% agarózovém gelu.

Na rozdíl od výchozího viru neměla deleční mutanta BHV-1 AgEÁTK žádný fragment DNA o

7,2 kbp. Inzercí sekvence BAC se tento fragment zvětšil na 15,8 kbp. Následkem částečné delece TK-ORF se velikost fragmentu A zmenšila o 293 bp.

2.4 Konfokální laserová snímací mikroskopie - analýza subcelulámí lokalizace gE a TK

MDBK buňky se infikovaly virem divokého typu Schonboken a mutantou s dvojnásobnou deleci BHV-1 AgEATK. Povrch nefixovaných buněk se obarvil proti gE. Jako sekundární protilátka se použila anti-myší Alexa®Fluor®647, jejíž fluorescence se znázorňuje modře. Plazmatická membrána se obarvila pomocí Vybrant™Cell-Labeling Solutions Dii. Tato velmi lipofílní substance se dá aktivovat světlem vlnové délky 549 nm a fluorescence tohoto membránového markem je červená. Po fixaci buněk 80% acetonem se rovněž intracelulámí antigeny staly detekovatelné příslušnými protilátkami. V důsledku toho se pro detekci TK použila polyklonální protilátka. Pomocí anti-králičí Alexa®Fluor®488 se protilátka TK označila jako zeleně fluoreskující. Pomocí těchto 3 barevných spekter se dají zviditelnit subcelulámí lokalizace příslušných struktur, res

-6CZ 20656 U1 pektive proteinů. Při buňkách infikovaných divokým typem se podaří povrchové barvení proti gE. Toto barvení ozřejmí kolokalizaci s plazmatickou membránou buňky. Naproti tomu značení TK poskytuje tečkovitý distribuční vzor, který se kromě toho přednostně vyskytuje intracytoplazmaticky. Buněčné kultury, které byly infikovány dvojnásobně deletovaným virem BHV1 AgEATK, reagovaly stejně jako neinfíkované kontrolní buňky pouze se značkovací substancí pro biologické membrány. Tím se ještě jednou potvrdila nepřítomnost proteinů gE a TK.

3. In vitro charakterizace gE/TK deletované mutanty BHV-1

3.1 Jednostupňová růstová kinetika

Pro prozkoumání replikačních vlastností generovaného BHV-1 AgEATK se prováděly jednostupňové růstové kinetiky. K tomu se MDBK buňky z jedné jamky 24jamkové misky pro buněčnou kulturu infikovaly prostřednictvím BHV-1 Schónbóken (divokého typu), BHV-1 AgE a BHVlAgEATK s MOI (Multiplicity of Infection) rovnající se 1 (přibližně 300 000 PFU) a inkubovaly jednu hodinu za standardních podmínek. Následně se prováděly dva stupně promývání infikovaného povrchového růstu pufrem PBS (Phosphate Buffered Salině (fosfátem tlumený fyziologický roztok), pH 7,4; 137 mM NaCl; 2,7 mM KC1; 10 mM Na₂HPO₄; 2 mM KH₂PO₄). Následně se povrchový růst po dobu 2 min pokryl ledově studeným pufrem CBS (Citráte Buffered Salině citrátem tlumený fyziologický roztok): 40 mM kyseliny citrónové, 10 mM KC1; 135 mM NaCl nastaveného pomocí NaOH na pH 3,0), aby se inaktivovaly povrchově adsorbující virové částice. i

Buňky se znovu dvakrát promyly pufrem PBS a následně se opatřily 1 ml média (DMEM (Dulbecco's Modified Eagles's Medium (Dulbeccovo modifikované Eaglovo médium)) + 10% FKS (fetální telecí sérum)), které se předehřálo na 37 °C. Pro stanovení infekciozity v supematantu* buněčné kultury se získávalo médium po 0 h, 4 h, 8 h, 12 h, 16 h, 24 h, 48 h a 72 h a převádělo4 do 1,5ml reakční nádoby. Pro stanovení infekciozity spojené s buňkami se povrchový růst, jak se*,| popisuje výše, pokryl pufrem CBS (pH 3,0) a promyl pufrem PBS. Následně se buňky seškrabalyI špičkou pipety z misky s kulturou, umístily do 1 ml média (viz výše) a převedly do l,5ml reakční nádoby.

Oba vzorky každé časové hodnoty se až do stanovení titru viru uskladňovaly při -70 °C.

Nemohly se určit žádné výrazné rozdíly v růstu mezi divokým typem a deletovanými virovými mutantami. Tedy delece glykoproteinu E v kombinaci s delecí thymidinkinázy nemá žádný měřitelný vliv na zde kvantifikovanou replikaci BHV-1.

3.2 Stanovení velikosti plaků

Kultivační misky s konfluentními MDBK buňkami se infikovaly 100 PFU (Plaque Forming Units / plak vytvářející jednotky) na jamku ójamkové misky pro buněčnou kulturu, po jedné hodině překryly polotuhým médiem Methcel, 48 hodin inkubovaly za standardních podmínek a po barvení krystalovou violetí vyhodnotily. Vyměřování plaků se provádělo pomocí programu zpracování obrazu analySIS® (od firmy Softimaging Systém GmbH, Můnster). Při tom se naměřilo 150 plaků na virus.

Průměrná hodnota velikosti plaků viru divokého typu se jako srovnávací hodnota stanovila na 100%. Jedenkrát gE deletovaný virus dosahoval 47% srovnávací velikosti, zatímco velikost plaků gE/TK dvojnásobně deletovaného viru činila přibližně 37 % velikosti plaků virů divokého typu.

Celkově neukazovala in vitro charakterizace BHV-1 AgEATK pro růstové kinetiky žádné relevantní rozdíly vzhledem k jedenkrát gE deletovanému viru. Ani srovnáni velikosti plaků neukazovalo rozdíly mezi dvojnásobně deletovaným BHV-1 AgEATK a jedenkrát deletovaným BHVlAgE. Virus BHV-1 AgEATK se celkově in vitro choval téměř jako jedenkrát gE deletovaný BHV-1 a je tedy úplně replikačně kompetentní. V buněčné kultuře se tedy může jednoduše dosáhnout vysokých titrů viru a navzdory dvojnásobné atenuaci (gE a TK) je možno očekávat dostatečné imunitní odpovědi.

-7CZ 20656 U1

4. Testování adjuvans na virovou toxicitu

Dvě adjuvans se testovala v Časově a koncentračně závislém testu v buněčné kultuře na svůj toxický účinek na virovou mutantu BHV-l AgEATK. K tomu se buněčné kultury naočkovaly mutantou viru a k naočkované buněčné kultuře se přidala adjuvans v koncentraci podle údajů vý5 robce. Testování na účinek adjuvans inhibující virus se provádělo na základě výpočtu virových plaků v buněčné kultuře. Při prvním testovaném adjuvans Quil A, částečně vyčištěném saponinovém extraktu z Quillaja saponaria, se zjistila výrazná inhibice viru. Druhým testovaným adjuvans Polygen™ je kopolymer s nízkou molekulovou hmotností. Polygen™ nepoškozoval virus, protože se mohly získat srovnatelně vysoké titry buněčných kultur jako u viru divokého typu.

ίο Následně se Polygen™ testoval v pokusu na zvířatech na svůj účinek u zvířat. Ukázalo se, že Polygen™ v místě injekce (intramuskulámě) nezanechával žádné reakce a nevyvolával žádné zvýšení tělesné teploty u zvířete. Kromě toho Polygen¹“¹ ve srovnáni s Freundovým adjuvans vyvolával u zvířete po aplikaci s imunizačním agens vyšší titry protilátek.

Celkově se tedy Polygen™ ukázal jako vhodný pro kombinovanou aplikaci živého viru s adju15 vans.

5, Testování způsobilosti gE/TK deletované mutanty BHV-l s adjuvans a bez adjuvans jako živé očkovací látky v pokusu na zvířatech

V pokusu na zvířatech se pro testování způsobilosti gE/TK deletované mutanty BHV-l jako živé očkovací látky použilo dvanáct kusů strakatého druhu skotu ve stáří devíti měsíců. V sérologic20 kém testování zvířat před začátkem pokusu se nemohly dokázat žádné protilátky BHV-l. Čtyři ze zvířat se jako kontrolní zvířata (Ko) vystavila pouze zatěžkávací infekci. Čtyři ze zvířat (vakcinovaná skupina Vacl) se dvakrát v intervalu 21 dní intramuskulámě imunizovala živým virem BHV-l AgEATK v kombinaci s adjuvans Polygen™ (12% objem/objem). Další čtyři zvířata (vakcinovaná skupina Vac2) se imunizovala stejnou virovou dávkou bez adjuvans. 21 dní po 25 druhé imunizaci se uskutečnila intranazálně zatěžkávací infekce virulentním kmenem 2204

BHV-l divokého typu, následně se zvířatům každý den odebíraly nosní tampóny a každý týden krev.

Vakcinační dávka činila l*10⁷ KID5o na zvíře. Vakcína se naočkovala do krčního svalstva. Dávka zatěžkávací infekce činila l*10⁷ KID50 na nosní dírku každého zvířete. Skupiny zvířat se 30 udržovaly v izolované stáji za stejných podmínek.

5.1 Teplota

Po celou dobu pokusu se zvířatům rektálně měřila teplota. Průměrné hodnoty skupin zvířat jsou uvedeny na obr. 3. Výkyvy mezi skupinami zvířat jsou před zatěžkávací infekcí nepatrné. Po zatěžkávací infekci se u kontrolních zvířat vyvíjela horečka po dobu pěti dnů, zatímco vakcino35 váné skupiny zvířat Vacl a Vac2 neprojevovaly žádnou horečku.

5.2 Testování sérových vzorků na gB a gE protilátky

Sérové vzorky získané z pokusu na zvířatech se testovaly prostřednictvím techniky ELISA na gE a gB protilátky.

Objasnění situace vzhledem k BHV-l se provádělo podle tabulky 2:

Tabulka 2

gB ELISA	gE ELISA	Hodnocení
pozitivní	pozitivní	Infekce polním virem BHV-l nebo očkování látkou bez markem
pozitivní	negativní	Zvíře očkované gE deletovanou markerovou očkovací látkou
negativní	negativní	Zvíře bez BHV-l
negativní	pozitivní	Výsledek gE ELISA je falešně pozitivní

-8CZ 20656 U1 gB ELISA

Při sérologickém testování na gB protilátky se použil komerční testovací kit od firmy IDEXX. Testování se provádělo podle údajů výrobce. Jedná se při tom o kompetitivní testovací systém, tj. jestliže jsou v neznámém vzorku gB protilátky, blokuje se antigen předem stanovený testem a už se nemůže detekovat testovacím systémem. Vzorek je tedy považován za pozitivní, když blokování prostřednictvím vzorku v % Činí > 55 %. Jestliže hodnota blokování jev rozmezí od 45 % do 55 %, považuje se vzorek za sporný. Jako negativní se hodnotí vzorky, jejichž hodnota blokování je <45 %.

V gB ELISA se v sérových vzorcích zvířat vakcinovaných skupin Vacl a Vac2 již jeden týden po imunizaci zjistily naměřené hodnoty, které vedly k pozitivnímu hodnocení testu (obr. 4). Kontrolní zvířata se 14 dní po zatěžkávací infekci hodnotily testovacím systémem pozitivně, gE ELISA

Pro stanovení stavu gE protilátek sérového vzorku se použil test gE ELISA od firmy IDEXX, Uskutečněni testů se provádělo podle údajů výrobce. Princip testování tímto testem ELISA odpovídá principu gB ELISA. Vyhodnocení testu se provádělo pomocí spektrální fotometrie při vlnové délce 650 nm. Hodnocení se uskutečňuje podle údajů výrobce přímo na základě naměřených hodnot absorpce, které byly přepočítány na % blokování.

V markerové diagnostice použitý systém gE ELISA reagoval s konstantně negativními naměřenými hodnotami při testování sérových vzorků všech vakcinovaných zvířat před zatěžkávací infekcí. Dva týdny po infekci virem divokého typu se zjistily nejvyšší naměřené hodnoty pro kontrolní zvířata v gE ELISA. Hodnoty z gE ELISA pro skupinu zvířat Vacl, která byla imunizována kompozicí živé očkovací látky obsahující adjuvans, překračovaly mezní hodnotu testu až k pozitivnímu hodnocení naproti tomu až tři týdny po zatěžkávací infekci (obr. 5).

5.3 Sérový neutralizační test (SNT)

Pomocí sérového neutralizačního testu se stanovil titr protilátek neutralizujících virus v sérových vzorcích. Pro úpravu sér se tato 30 min inaktivovala při 56 °C ve vodní lázni. Následně se sérové vzorky stejně tak jako referenční séra (pozitivní, negativní sérum) v log2 zřeďovacích stupních po třech vzorcích na zřeďovací stupeň (50 μΐ/jamka) nanesly na 96jamkovou plotnu. Testovaný virus se používal v koncentraci 10² KIDSO/50 μΐ. 50 μΐ tohoto testovaného viru se přidalo k sérovým zředěním a potom se inkubovalo 24 hodin při 37 °C a 5 % CO2. Pro další validaci testovacího systému se prováděla zpětná titrace použitého testovaného viru. V návaznosti na inkubaci se přidalo 100 μΐ MDBK buněčné suspenze (30 000 buněk/100 μΐ) do všech jamek. Hodnocení testu se uskutečnilo po čtyřdenní inkubaci při 37 ^ŮC a 5 % CO2. Při tom se neutralizační titr vypočítal na základě vzorce (4og2) = a/b + c, přičemž a odpovídá počtu jamek bez rozmnožování viru, b vyjadřuje počet jamek na zřeďovací stupeň a c odpovídá -log2 eventuálního předběžného zředění použitých testovacích sér.

Průměrné hodnoty neutralizačních protilátek měřených v SNT pro obě vakcinované skupiny Vacl a Vac2 se odlišovaly do té míry, že skupina zvířat Vacl, která obdržela kompozici živé očkovací látky s adjuvans Polygen™, měla téměř nepřetržitě před zatěžkávací infekcí vyšší titry BHV-1 protilátek (obr. 6). Po zatěžkávací infekci se titry zvířat obou skupin vyrovnaly. Kontrolní zvířata produkovala až do tohoto časového okamžiku neutralizační protilátky. Křivky naměřených hodnot, které se zjistily pro vakcinovaná zvířata, mimo to zřetelně ukazovaly stimulaci odpovědi protilátek v důsledku přídavné imunizace a také zatěžkávací infekce.

5.4 Kvantifikace nazální exkrece viru

Vzorky nosních tampónů se odebíraly po první imunizaci denně po dobu 10 dní a po zatěžkávací infekci denně. Pomocí titrace viru na permisivní MDBK buňky se kvantifikovala exkrece infekčního BHV-1. MDBK buňky se použily pro provádění titrací viru v 96jamkových mikrotitračních

-9CZ 20656 U1 plotnách (Mayr, A., Bachmann, P.A., Bibrack, B., Wittmann, G. (1974) Virologische Arbeitsmethoden Band I, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart). K tomu se infekční virové alikvoty naředily vloglO zřeďovacích stupních a nanesly na buňky a potom inkubovaly tři dny za standardních podmínek. Následně se buňky mikroskopicky zkoumaly ohledně tvorby zpE (cytopatogenního 5 účinku). Obsah infekčních virových částic se vypočítal jako KIDso/ml (50% infekční dávka kultury na ml) podle metody Spaermana a Kaerbera (Mayr et al., 1974).

Po první imunizaci se v žádném ze vzorků z nosních tampónů nedokázal infekční virus.

Nazální vylučování virů dosáhlo u kontrolních zvířat nejvyššího průměrného titru 10^7,375

KIDso/ml třetí den po zatěžkávací infekci a mohlo se u této skupiny zvířat pozorovat v průměru ίο po dobu jedenácti dnů. Skupina zvířat Vac2, která pro imunizaci obdržela pouze očkovací virus, vylučovala virus nazálně po dobu devíti dnů, přičemž titry viru byly sníženy minimálně o jeden, maximálně o čtyři log stupně. Průměrné naměřené hodnoty skupiny zvířat Vacl, která byla imunizována živým virem a adjuvans Polygen™, ukazovala minimální snížení titrů o dva log 10 stupně a maximální o pět loglO stupňů. Vylučování viru se zkrátilo a mohlo se dokazovat v prů15 měru po dobu osmi dnů (obr. 7).

Použitý živý virus se ukázal jako úplně avirulentní u obou skupin zvířat. Intramuskulámí imunizace mimo to nevedla k žádné dokazatelné replikaci očkovacího viru v nazální sliznici. Protože po imunizaci nebyla nijakým způsobem dokazatelná exkrece viru, je pravděpodobné, že očkovacím virem nebyly latentně infikovány žádné buňky.

Po intranazální zatěžkávací infekci ukazovaly obě vakcinované skupiny zvířat výrazně snížené titry viru ve vzorcích nosních tampónů a trvání vylučování viru nosem bylo značně zkráceno ve srovnání s nevakcinovanými kontrolními zvířaty. Skupina zvířat Vacl ukazovala imunologicky příznivější vývoj vzhledem k titru protilátek a nazální exkreci viru, který lze vyvozovat z přídavného použití adjuvans.

Zvířata ze skupiny zvířat Vacl vyvíjela tak ochranný imunitní stav, že zatěžkávací infekce se mohla pomocí markerového testu (ELISA gE-protilátky) detekovat nejdříve tři týdny po testované infekci.

To odpovídá obzvlášť vyhraněné ochraně před zatěžkávací infekcí virulentním BHV-1.

NÁROKY NA OCHRANU

Claims

30 1. Kompozice živé očkovací látky, vyznačující se tím, Že obsahuje gE a TK deletovanou mutantu BHV-1 ve vhodném nosiči a neviricidní adjuvans.
2. Kompozice živé očkovací látky podle nároku 1, vyznačující se tím, že neviricidním adjuvans je polymer, zejména kopolymer nebo blokový kopolymer.
3. Kompozice živé očkovací látky podle nároku 2, vyznačující se tím, že neviri35 cidním adjuvans j e Polygen™.
4. Kompozice živé očkovací látky podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že podíl neviricidního adjuvans v kompozici činí 5 až 50 % (objem/objem).
5. Kompozice živé očkovací látky podle nároku 4, vyznačující se tím, že podíl neviricidního adjuvans v kompozici činí 10 až 15 %.

40
6. Léčivová formulace pro profylaxi onemocnění zprostředkovaných BHV-1, vyznačující se tím, že obsahuje kompozici živé očkovací látky podle některého z nároků 1 až 5.
7 výkresů