CN108103078B - 塞尼卡谷病毒疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种分离的塞尼卡谷病毒核酸、一种塞尼卡谷病毒株、一种包含所述塞尼卡谷病毒株的塞尼卡谷病毒疫苗及其制备方法，以及所述塞尼卡谷病毒疫苗在制备用于预防和/或控制动物塞尼卡谷病毒引起的相关疾病的药物中的用途。

Description

塞尼卡谷病毒疫苗及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种病毒株，尤其涉及一种塞尼卡谷病毒株、包含所述塞尼卡谷病毒株的塞尼卡谷病毒疫苗及其制备方法和应用，属于生物技术和生物制品领域。

背景技术

塞尼卡谷病毒(Seneca valley virus,SVV)，也称为塞尼卡病毒A(SVA)，是小RNA病毒科塞尼卡病毒属的唯一成员，为单股正链RNA。SVV感染猪能够引发猪的原发性水泡病，引起猪的鼻吻、蹄部冠状带的水泡病变，同时伴有跛行、厌食和嗜睡等临床表现。与口蹄疫、猪水泡病和水泡性口炎等引起的临床症状难以区分。SVV感染后能引起断奶仔猪、保育、育肥和繁殖的各年龄段的猪发生水泡性病变，同时伴随急性跛行、发热等症状。另外，还有报道SVV感染能够引起新生仔猪的突发性死亡。

2002年，SVV首例毒株(SVV-001株)由美国科研人员从细胞培养基污染物中分离。随后，从具有临床症状的猪上分离出来的RNA病毒的测序显示，20世纪80年代后期以来，美国猪群中便存在SVV。2002年确定病原以来，SVV主要在美国和加拿大零星散发，但自2015年以来，SVV先后在多个国家开始大范围流行，病原确定的地区越来越多，先后在美国(2015、2016、2017年)、加拿大(2007、2011、2015、2016年)、巴西(2014、2015年)、哥伦比亚(2016年)、中国(2015、2016、2017年)和泰国(2016年)的猪群中发生疫情。

本团队监测表明，2015年传入中国以来，SVV先后在福建、广东、广西、河南、河北、山东、辽宁等省迅速扩散开来，引起大量猪场发病，且存在SVV和口蹄疫病毒(FMDV)混合感染病例(Transbound Emerg Dis,2017,64:1024～1029)。然而，迄今为止，全球仍然没有商品化的SVV疫苗可用，该病仍处于失控状态，防控形式严峻。因此，本研究利用分离的SVV流行毒株，经过攻毒模型的建立、攻毒株的鉴定，疫苗种毒筛选和驯化，然后制备成疫苗，制备了以抗原产能高、抗体应答强、免疫保护力高等为特征的疫苗，为控制该病提供了有力保障。

发明内容

本发明涉及一种分离的塞尼卡谷病毒核酸、一种塞尼卡谷病毒株、一种包含所述塞尼卡谷病毒株的塞尼卡谷病毒疫苗及其制备方法，以及所述塞尼卡谷病毒疫苗在制备用于预防和/或控制动物塞尼卡谷病毒引起的相关疾病的药物中的用途。

一方面，本发明涉及一种分离的塞尼卡谷病毒核酸。

在本申请中，“分离的”是指一种物质(例如，多肽或者核酸)与它在自然界中正常存在的环境相分离或存在于与它在自然界中正常存在的环境不同的环境中。

在某些实施方式中，所述分离的塞尼卡谷病毒核酸的序列如SEQ ID NO:1所示。

在某些实施方式中，所述分离的塞尼卡谷病毒核酸包含SVV/FJ/001株的L基因序列、如SEQ ID NO:1所示的核酸序列、SVV/FJ/001株的P2基因序列和SVV/FJ/001株的P3基因序列。

在某些实施方式中，所述分离的塞尼卡谷病毒核酸包含SVV/FJ/001株的5’UTR序列、SVV/FJ/001株的L基因序列、如SEQ ID NO:1所示的核酸序列、SVV/FJ/001株的P2基因序列、SVV/FJ/001株的P3基因序列和SVV/FJ/001株的3’UTR序列。

另一方面，本发明涉及一种塞尼卡谷病毒株。

在某些实施方式中，所述塞尼卡谷病毒株包含如SEQ ID NO:1所示的核酸序列。在某些实施方式中，所述塞尼卡谷病毒株包含如SEQ ID NO:1所示的核酸序列编码的氨基酸序列。在某些实施方式中，如SEQ ID NO:1所示的核酸序列编码的蛋白为塞尼卡谷病毒株的结构蛋白P1蛋白。在某些实施方式中，所述塞尼卡谷病毒株包含SVV/FJ/001株的L基因序列、如SEQ ID NO:1所示的核酸序列、SVV/FJ/001株的P2基因序列和SVV/FJ/001株的P3基因序列。在某些实施方式中，所述塞尼卡谷病毒株包含SVV/FJ/001株的5’UTR序列、SVV/FJ/001株的L基因序列、如SEQ ID NO:1所示的核酸序列、SVV/FJ/001株的P2基因序列、SVV/FJ/001株的P3基因序列和SVV/FJ/001株的3’UTR序列。

在某些实施方式中，所述塞尼卡谷病毒株为塞尼卡谷病毒FJ/001株，即，SVV/FJ/001株，其微生物保藏号为：CCTCC NO:V201802。

SVV/FJ/001株是从福建发病猪场采集的发病猪水泡皮、水泡液等发病组织中分离，并通过细胞传代适应和驯化，挑选第001号蚀斑筛选得到的一种塞尼卡谷病毒株。

另一方面，本发明涉及一种包含所述塞尼卡谷病毒株的塞尼卡谷病毒疫苗。

在某些实施方式中，所述塞尼卡谷病毒疫苗能够激发动物对塞尼卡谷病毒的免疫活性。

在本申请中，“能够激发动物对塞尼卡谷病毒的免疫活性”是指能够使动物对塞尼卡谷病毒产生免疫应答。通常情况下，“免疫应答”是指宿主对抗原的体液免疫应答、细胞免疫应答或体液和细胞免疫应答，包括例如产生或者激活抗体、B细胞、辅助T细胞、抑制性T细胞和/或细胞毒性T细胞等。免疫应答通常可以使用本领域中已知的方法来测定，例如，标准免疫分析和中和分析。优选地，对塞尼卡谷病毒产生免疫应答的动物对新的感染的抵抗力增加，或者塞尼卡谷病毒引起的相关疾病的临床症状有所减轻，或者与感染的动物相比恢复时间更快，病毒滴度更低。

在某些实施方式中，所述塞尼卡谷病毒疫苗对至少1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种或更多种塞尼卡谷病毒分离株的半数免疫保护剂量(PD₅₀)的值均大于6.0。优选地，所述塞尼卡谷病毒疫苗对至少三种塞尼卡谷病毒分离株的PD₅₀值均大于6.0。更优选地，所述塞尼卡谷病毒疫苗对至少五种塞尼卡谷病毒分离株的PD₅₀值均大于6.0。所述塞尼卡谷病毒疫苗对至少七种塞尼卡谷病毒分离株的PD₅₀值均大于6.0。

目前国内外已公开多种塞尼卡谷病毒分离株。在某些实施方式中，所述塞尼卡谷病毒分离株独立地选自下组：SVV CH-FJ株、SVV CH-HN株、SVV CH-HNSL株、SVV CH-GD株、SVV CH-01-2015株、SVV CH-04-2015株、SVV CH-DB-11-2015株、SVV CH-DL-01-2016株、SVVCH-ZW-01-2016株、SVV HB-CH-2016株、SVV KS15-01株、SVV-001株和SVV Colombia/2016株。

在某些实施方式中，所述SVV CH-FJ株的Genbank登录号为KY747510，所述SVV CH-HN株的Genbank登录号为KY747511，所述SVV CH-HNSL株的Genbank登录号为KY747512，所述SVV CH-GD株的Genbank登录号为MF189000或MF189001，所述SVV CH-01-2015株的Genbank登录号为KT321458，所述SVV CH-04-2015株的Genbank登录号为KX173340，所述SVV CH-DB-11-2015株的Genbank登录号为KX751943，所述SVV CH-DL-01-2016株的Genbank登录号为KX751944，所述SVV CH-ZW-01-2016株的Genbank登录号为KX751946，所述SVV HB-CH-2016株的Genbank登录号为KX377924，所述SVV KS15-01株的Genbank登录号为KX019804，所述SVV-001株的Genbank登录号为DQ641257，所述SVV Colombia/2016株的Genbank登录号为KX857728。

在某些实施方式中，本申请所述的塞尼卡谷病毒疫苗包含减毒的塞尼卡谷病毒或者灭活的塞尼卡谷病毒。优选地，本申请所述的塞尼卡谷病毒疫苗包含灭活的塞尼卡谷病毒。

在本申请中，“减毒的塞尼卡谷病毒”是指虽然能感染动物但是不能引起塞尼卡谷病毒引起的相关疾病、或者使动物具有较少和/或较轻症状的塞尼卡谷病毒。“塞尼卡谷病毒引起的相关疾病”是指感染了塞尼卡谷病毒之后出现的一系列生理性或病理性症状，包括但不限于，水泡性病变、急性跛行、发热、厌食、嗜睡等。

在本申请中，“灭活的塞尼卡谷病毒”是指不具备感染性、但是仍然保持其免疫原性，可以引起动物免疫反应的塞尼卡谷病毒。灭活的塞尼卡谷病毒可以通过本领域熟知的方法制备，例如，可以通过使用福尔马林、β-丙内酯、二乙烯亚胺来灭活塞尼卡谷病毒。

在某些实施方式中，本申请所述的塞尼卡谷病毒疫苗还包含药学上可接受的佐剂。在某些实施方式中，本申请所述的塞尼卡谷病毒疫苗为油包水剂型、水包油包水剂型、水包油剂型或冷冻干燥形式。

在某些实施方式中，药学上可接受的佐剂包括(1)矿物油佐剂：ISA 206；(2)核酸佐剂：免疫刺激序列(ISS)，例如具有一个或更多非-甲基化的CpG单元的寡脱氧核糖核苷酸序列；(3)水包油乳剂，例如SPT乳剂、MF59乳剂等；(4)含有季铵盐的阳离子脂质，例如DDA；(5)细胞因子；(6)铝佐剂：氢氧化铝或磷酸铝；(7)植物性佐剂：皂苷或(8)其任何组合或混合物。

在某些实施方式中，本申请所述的塞尼卡谷病毒疫苗进一步包含一种或多种非塞尼卡谷病毒株或非塞尼卡谷病毒株的抗原性物质。在某些实施方式中，所述非塞尼卡谷病毒株选自下组：口蹄疫病毒、猪圆环病毒、伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒。

在本申请中，“非塞尼卡谷病毒株的抗原性物质”是指非塞尼卡谷病毒株中能够刺激动物机体产生抗体或致敏淋巴细胞，并能与这些产物在体内或体外发生特异性反应的物质。本领域技术人员可以通过本领域熟知的方法获得一种病毒株的抗原性物质，例如，可以通过稀释、浓缩或提取等方法获得该病毒株的抗原性物质。

在某些实施方式中，本申请所述的塞尼卡谷病毒疫苗中包含的塞尼卡谷病毒株和其他非塞尼卡谷病毒株或非塞尼卡谷病毒株的抗原性物质之间无免疫抑制。在本申请中，“无免疫抑制”是指所述塞尼卡谷病毒株和非塞尼卡谷病毒株或非塞尼卡谷病毒株的抗原性物质在免疫动物以后不会显著削弱对方的免疫效果。

另一方面，本发明涉及一种制备所述塞尼卡谷病毒疫苗的方法。

在某些实施方式中，所述方法包括如下步骤：

1)、将本申请所述的塞尼卡谷病毒株接种至易感细胞进行培养，得到塞尼卡谷病毒液；

2)、收获步骤1)中获得的塞尼卡谷病毒；

3)、对步骤2)中收获的塞尼卡谷病毒进行灭活；

4)、对步骤3)中灭活的塞尼卡谷病毒进行乳化。

在某些实施方式中，步骤1)中的塞尼卡谷病毒株为SVV/FJ/001株。在某些实施方式中，步骤1)中的易感细胞为BHK-21细胞、PK-15细胞、ST细胞、SK-RST细胞、IBRS-2细胞、H1299细胞或293T细胞。在某些实施方式中，本申请所述的塞尼卡谷病毒株在所述易感细胞中进行增殖时滴度高(病毒滴度不低于10^6.5TCID₅₀/mL)，能够很好地适应细胞增殖，抗原产能高。在某些实施方式中，步骤1)中的病毒培养液的pH值为7.2～7.8，例如，7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8。优选地，步骤1)中的病毒培养液的pH值为7.5～7.8。在上述pH值范围内，病毒病变时间短，且毒价稳定。

在某些实施方式中，步骤3)中的灭活用二乙烯亚胺(BEI)进行。用BEI进行灭活具有灭活彻底且毒副作用小的特点。在某些实施方式中，灭活所使用的BEI的终浓度为1.5～3mmol/L，例如1.5mmol/L、1.6mmol/L、1.7mmol/L、1.8mmol/L、1.9mmol/L、2.0mmol/L、2.5mmol/L、3.0mmol/L。优选地，灭活所使用的BEI的终浓度为1.5mmol/L。在某些实施方式中，灭活温度为30℃，灭活时间为30～36小时，例如31小时、32小时、33小时、34小时、35小时、36小时。优选地，灭活时间为36小时。

在某些实施方式中，步骤4)中的乳化是将所述的塞尼卡谷病毒与ISA 206佐剂以体积比1:1进行。

另一方面，本发明涉及由本申请所述的方法制备得到的塞尼卡谷病毒疫苗。

另一方面，本发明涉及本申请所述的塞尼卡谷病毒疫苗在制备用于预防和/或控制动物塞尼卡谷病毒引起的相关疾病的药物中的用途。

另一方面，本发明涉及一种预防和/或控制动物塞尼卡谷病毒引起的相关疾病的方法，其包含使用本申请所述的塞尼卡谷病毒疫苗。

另一方面，本发明涉及一种用于预防和/或控制动物塞尼卡谷病毒引起的相关疾病的塞尼卡谷病毒疫苗。

在某些实施方式中，本申请所述的动物为偶蹄类动物。在某些实施方式中，本申请所述的动物为猪、牛或羊。

本发明具有如下积极效果：

本发明依据塞尼卡谷病毒分子流行病学，借助已经积累的该病毒的流行毒株等资源，通过基因分析，并比较病变时间、病毒滴度、生物学特性等多种因素，筛选疫苗毒株，并对疫苗制备工艺等相关参数进行了优化和筛选，获得了病变时间短、病毒滴度高、病毒产量高的疫苗株，及抗体应答好、免疫保护效力高的疫苗，为控制该病在我国的流行提供了有力保障。

1)、基因测定和比较发现，SVV/FJ/001株的抗原基因P1基因与我国报道的已分离的SVV流行株的同源性大于98.6％，说明SVV/FJ/001株可以实现疫苗毒株抗原匹配性和免疫应答性，保证了疫苗株与流行毒株的针对性。

2)、SVV/FJ/001株病变时间短，病毒滴度高，稳定传代后病变时间约12-18h左右，毒价为10^6.5TCID₅₀/mL-10^9.5TCID₅₀/mL。

3)、实现疫苗种毒抗原谱广的特点，以分子流行病学为基础，筛选的SVV/FJ/001株具有抗原广谱性。攻毒试验结果表明，该疫苗种毒制备的灭活疫苗能够有效保护多种SVV分离毒株，例如福建、河南、广东等地分离的流行毒株，PD₅₀分别为11.21、9.0、11.84，实现了该疫苗株的抗原广谱性。

4)、本发明建立了动物感染模型，为开展疫苗效力评价等提供依据并奠定基础。

5)、本发明技术优化了病毒培养条件，疫苗生产工艺相关参数，为SVV的防控提供有效的疫苗支撑。

附图说明

图1为实施例1中SVV/FJ/001株分离培养，其中A表示正常BHK-21细胞；B表示出现细胞病变效应(CPE)的BHK-21细胞。

图2为实施例1中SVV/FJ/001株分离培养，其中A表示正常PK-15细胞；B表示出现CPE的PK-15细胞。

图3为实施例1中SVV/FJ/001株分离培养，其中A表示正常SK-RST细胞；B表示出现CPE的SK-RST细胞。

图4为实施例1中不同pH值培养基培养SVV/FJ/001株的病毒毒价检测结果。

图5为实施例2中接种了SVV/FJ/001株的间接免疫荧光结果，其中A表示正常细胞对照，B表示接种SVV/FJ/001株后的检测结果。

图6为SEQ ID NO:1的核酸序列。

图7为SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的核酸序列。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步地描述，但具体实施例并不对本发明做任何限定。

下列实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规条件，如《精编分子生物学实验指南》(F.M.奥斯伯，R.E.金斯顿，J.G.赛德曼等主编，马学军，舒跃龙译，北京：科学出版社，2004)中所述的方法进行。

实施例1：SVV/FJ/001株的分离、培养和筛选

1.1病毒分离

采集SVV发病猪的水泡皮、水泡液等发病组织，加入PBS研磨，经反复冻融3次后，4℃，5000rpm离心10min，收集上清，经0.22μm滤器过滤，提取RNA，用RT-PCR及QRT-PCR等方法鉴定病料中除SVV外，不含如口蹄疫病毒等能引起猪水泡病变的其他病原。

将上述已鉴定病料按病毒培养液的10％含量接入刚形成单层的BHK-21细胞中，37℃孵育1h，加DMEM培养液，于37℃培养5d，收获病毒液，经3次反复冻融后，接种第二代，培养4d，收获含毒培养液，经3次冻融后，继续连续传代培养，观察细胞病变(CPE)。结果显示：细胞出现变圆，脱落，并逐渐形成空斑的病变现象。最终获得能够在BHK-21细胞上传代的塞尼卡谷病毒株。

将获得的塞尼卡谷病毒株进行蚀斑纯化，制备单层的BHK-21细胞，加入梯度稀释的塞尼卡谷病毒，置37℃吸附1小时后，弃去病毒液，漂洗后，在细胞表面覆盖固体培养基，将培养板倒置于37℃培养至蚀斑出现，观察蚀斑形成情况，分别吸取单个蚀斑并编号，然后筛选出复制和生长特性最好的第001号蚀斑的毒株，命名为塞尼卡谷病毒FJ/001株，缩写为SVV/FJ/001株。

申请人已根据《布达佩斯条约》的规定，将SVV/FJ/001株提交至中国典型培养物保藏中心进行保藏。SVV/FJ/001株的具体保藏信息如下：微生物保藏号：CCTCC NO:V201802；分类命名：塞尼卡谷病毒FJ/001株(SVV/FJ/001株)；保藏地址：中国武汉武汉大学；保藏时间：2017年12月27日；保藏单位：中国典型培养物保藏中心。

1.2病毒培养

1.2.1不同细胞的培养特性

SVV/FJ/001株能够在BHK-21细胞、PK-15细胞、ST细胞、SK-RST细胞、IBRS-2细胞、H1299细胞或293T细胞等细胞中增殖，并引起细胞病变。正常对照细胞和SVV/FJ/001株感染各细胞后出现的CPE请见图1-3，其中，图1A显示了正常对照BHK-21细胞，图1B显示了SVV/FJ/001株感染BHK-21细胞出现的CPE；图2A显示了正常对照PK-15细胞，图2B显示了SVV/FJ/001株感染PK-15细胞出现的CPE；图3A显示了正常对照SK-RST细胞，图3B显示了SVV/FJ/001株感染SK-RST细胞出现的CPE。

按照常规方法消化上述易感细胞，如BHK-21细胞、PK-15细胞等细胞，加入含10％胎牛血清的DMEM完全培养基，将细胞铺于12孔板中，于37℃含有5％CO₂的培养箱中培养，待细胞单层长到80％-90％时备用。用DMEM以10倍倍比稀释病毒液，将各稀释度(10^-5.0～10^-10.0)的病毒液分别加入细胞板中，每个稀释度4孔，放入37℃含有5％CO₂的培养箱中进行培养，观察4天，用Reed-Muench氏法测定病毒对BHK-21细胞等不同细胞的半数感染量(TCID₅₀)。按照该法测定SVV/FJ/001株在BHK-21等不同细胞上的病毒滴度，计算SVV/FJ/001株的TCID₅₀为10^-6.5/mL～10^-9.5/mL。

Reed-Muench计算方法是本领域的已有技术，现有文献“Reed,L.J.and Muench,H.(1938)."A Simple Method of Estimating Fifty Percent Endpoints".The AmericanJournal of Hygiene 27:493–497”中对此已经进行了详细地描述，该文献在此通过引用方式并入本申请用作参考。

1.2.2培养液pH值对病毒毒价的影响

SVV/FJ/001株接种易感细胞时，分别用pH值为6.9、7.2、7.5、7.8、8.1、8.4的培养基，观察细胞病变情况，待病变达80％以上时收获病毒，反复冻融后，分别测定病毒毒价，结果(图4)显示，pH值为7.2～7.8时，SVV/FJ/001株毒价较高(可达10^8.5/50μL以上)，且病变时间稳定，当pH值低于7.2或高于8.1时，细胞完全病变时间延长，毒价降低。根据实验结果，在培养SVV/FJ/001株时，将病毒培养液pH值调节为7.2～7.8。

1.3基因分析

根据已公布的SVV参考序列，设计合成扩增抗原基因的引物，P1F(5’-TACGAACTACAGGGTAATGTCCAG-3’)(SEQ ID NO:2)，P1R(5’-GACGTCGCCTGATTGCATCAGCAT-3’)(SEQ ID NO:3)，提取SVV/FJ/001株的总RNA，用引物oligNot I(5’-ttttctagagcggccgct₃₈-3’)反转录合成第一链cDNA，以此为模板，用引物P1F和P1R扩增获得P1基因片段。扩增用适合长片段扩增、性能优良的LA(TaKaRa公司)DNA聚合酶，按照产品说明书配制50μL反应体系，扩增条件为：94℃3min，94℃30s，57℃30s，72℃2min30s，35个循环后，72℃10min，纯化回收PCR扩增产物并送测序，测序结果显示，SVV/FJ/001株的抗原序列为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

将SVV/FJ/001株P1基因对应的氨基酸序列与已报道的国内外SVV分离株的相应序列进行同源性比较分析，结果(表1)显示，分离的SVV/FJ/001株与我国已报道的SVV分离株的P1基因同源性达98.6％以上，且与其他国家的流行毒株也具有很高的同源性。P1基因是SVV的抗原基因，能够诱导机体产生中和抗体，说明SVV/FJ/001株可以作为良好的疫苗候选株用于我国及其他国家SVV的防控。

表1.SVV/FJ/001株抗原基因对应的氨基酸序列分析

实施例2：塞尼卡谷病毒的鉴定

2.1RT-PCR鉴定病毒

将稳定传代的SVV/FJ/001株感染BHK-21细胞、PK-15细胞、ST细胞、SK-RST细胞、IBRS-2细胞、H1299细胞或293T细胞等细胞的上清用RNAeasy Mini Kit(Qiagen)提取总RNA，反转录后，扩增P1基因，纯化回收后送测序，结果显示均能够扩增获得P1基因。

2.2间接免疫荧光鉴定病毒抗原

将SVV/FJ/001株感染BHK-21细胞的培养物反复冻融后，接种至底部放置了载玻片的生长有BHK-21细胞的六孔板里(单层细胞生长至60％～70％)，置于含5％CO₂的37℃培养箱中，24h后按常规方法做间接免疫荧光，一抗为SVV猪阳血清，二抗为FITC标记兔抗猪IgG(Sigma公司)，同时设正常细胞对照。接种SVV/FJ/001株培养物的细胞中可见绿色特异性荧光，而正常细胞对照无可见荧光产生(图5)。

实施例3：SVV/FJ/001株对猪攻毒模型的建立

从非疫区筛选试验用猪6头，并经中和实验检测，SVV中和抗体效价＜1：4。将制备的SVV/FJ/001株采用注射途径进行攻毒，攻毒剂量为2×10⁹TCID₅₀，同时设立研磨组织病料毒为对照，攻毒剂量为2mL/头，连续观察15天，观察并记录记录发病情况，根据蹄部、鼻镜、口唇出现水泡等症状判定动物发病情况，并计分(5分制，判定标准参照口蹄疫判分标准制定，分数越高表明临床症状越严重)。攻毒结果显示，SVV/FJ/001株攻毒后从第二天开始出现典型临床症状，蹄部出现水泡，之后有的在鼻镜上出现水泡。组织毒攻毒后，从第三天开始出现临床症状，症状较细胞传代毒略轻。从发病猪采集水泡皮或水泡液，均能检测到塞尼卡谷病毒。结果见表2。

表2.塞尼卡谷病毒对猪攻毒模型建立的临床症状

实施例4：塞尼卡谷病毒疫苗的制备和免疫效果评价

4.1疫苗制备

4.1.1病毒液的制备：将分离的SVV/FJ/001株按照实施例1的方法培养，将病毒按培养液量的1％接入已形成单层的易感细胞中，当病变达到80％以上时，收获含毒细胞培养液，经反复冻融后，-70℃保存备用。同时，按照实施例1所述测定病毒含量，按照Reed-Muench法计算病毒的TCID₅₀，结果每毫升病毒液不低于10^6.5TCID₅₀。

4.1.2灭活：用终浓度为1.5mmol/L二乙烯亚胺(Binary ethylenimine,BEI)(Sigma公司)，于30℃灭活36h，加入阻断剂硫代硫酸钠溶液，4℃过夜，保存备用。同时，将灭活后的病毒液在SVV易感细胞上盲传三代做安检，设立病毒对照和正常细胞对照，结果灭活后的病毒液不能引起易感细胞发生病变。

4.1.2.1二乙烯亚胺使用剂量及浓度确定

分别用终浓度为0.5mmol/L、0.75mmol/L、1mmol/L、1.25mmol/L、1.5mmol/L、2.0mmol/L的BEI在30℃的条件下，灭活36h，灭活后将灭活病毒液感染易感细胞，并连续盲传3代，检测结果见表3，根据实验结果，采用终浓度为1.5mmol/L的BEI对病毒液进行灭活。

表3.不同终浓度的BEI灭活病毒后感染细胞病变情况

4.1.2.2二乙烯亚胺灭活时间的确定：

用终浓度为1.5mmol/L的BEI在30℃的条件下，分别做12h、24h、30h、36h、42h、48h等不同时间的灭活，灭活后将灭活病毒液感染易感细胞，并连续盲传3代，检测结果见表4，根据试验结果，最终确定灭活的条件为用终浓度为1.5mmol/L的二乙烯亚胺，于30℃，灭活30h～36h，是制备塞尼卡谷病毒灭活疫苗的最佳灭活条件。

表4.不同灭活时间的灭活病毒液感染细胞病变情况

4.1.3疫苗的配制：灭活抗原经安检后与ISA206佐剂(法国SEPPIC)以1：1比例乳化制备成油包水剂型疫苗，分装备用。

4.1.4安全性试验：从非疫区购买实验用猪，并经中和实验检测，SVV中和抗体效价＜1：4，用仔猪、保育猪、育肥猪、后备母猪、妊娠母猪等各2头，分别肌肉注射该灭活疫苗6mL，设立条件相同未免疫猪为对照，连续观察28d，观察期内免疫猪健康良好，没有出现因疫苗注射引起的任何局部或全身不良反应。

4.2疫苗免疫攻毒保护试验

将得到的安检合格的塞尼卡谷病毒灭活疫苗免疫10头猪，同时设2头非免疫对照，测定其免疫效力。实验用猪购自非疫区，并经中和实验检测，SVV中和抗体效价＜1：4。免疫动物后，分别在免疫后7天、14天、21天、28天采血、分离血清，进行中和抗体检测并统计检测结果，结果表明，该疫苗具有很好的免疫原性，能有效激发血清中和抗体(表5)。

表5.疫苗免疫后SVV中和抗体水平检测结果

免疫猪28天后，用2×10⁹TCID₅₀剂量的流行强毒SVV/FJ/001株进行攻毒实验，连续观察15天，结果表明，免疫的动物没有临床症状，100％保护，如表6所示。

表6.塞尼卡谷病毒灭活疫苗免疫猪攻毒后临床症状和保护情况

4.3疫苗免疫效力与交叉攻毒试验

本试验所用动物实验用猪购自非疫区，并经中和实验检测，SVV中和抗体效价＜1：4，且均严格在ABSL-3实验室圈养。按照2015年版《中国兽药典》记载的半数保护量(PD₅₀)测定方法来测定疫苗的半数保护量，具体方法如下。免疫组每组18头和/或15头，免疫剂量分1头份、1/3头份、1/9头份，分别免疫，28d后，分别用SVV/FJ/001株、塞尼卡谷病毒河南株(SVV-HN株)、塞尼卡谷病毒广东株(SVV-GD株)，这些不同省份分离的流行强毒进行攻毒，攻毒剂量为2×10⁹TCID₅₀剂量，每组设3头对照，攻毒方式为肌肉注射。攻毒后连续观察15日，根据鼻镜、口唇、蹄部出现水泡等症状判定病毒液致动物发病情况，动物发病即判为不保护。计算各组免疫动物的保护比例，最后再按照Reed-Muench法分别计算各组的PD₅₀。

免疫效力及交叉攻毒试验测定结果表明，疫苗种毒株对SVV/FJ/001株、SVV-HN株和SVV-GD株的PD₅₀分别为11.21、9.0、11.84(参见表7)，说明该疫苗对不同省份流行毒的PD₅₀值均大于6，是理想的抗塞尼卡谷病毒疫苗，可用于我国塞尼卡谷病毒的预防和控制。

表7塞尼卡谷病毒疫苗株免疫效力及交叉攻毒保护结果

以上所述的实施例仅表述了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可做出其它改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> 塞尼卡谷病毒疫苗及其制备方法和应用

<130> 1700401

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2574

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SVV/FJ/001株的抗原序列

<400> 1

ggtaatgtcc agacaacctc aaagaacgat tttgattccc gcggcaataa tggtaacatg 60

accttcaatt actacgcaaa cacttaccag aattcagtag acttctcgac ctcctcgtcg 120

gcgtcaggcg ccggacccgg gaactcccgg ggcggattag cgggtctcct cacaaatttc 180

agtggaatct tgaaccctct tggctacctc aaagatcaca ataccgaaga aatggaaaac 240

tctgctgatc gagtcataac gcaaacggcg ggcaacactg ccataaacac gcaatcatca 300

ctgggtgtgt tgtgtgccta cgttgaagac ccgaccaaat ctgaccctcc gtccagcagc 360

acagatcaac ccaccaccac ttttactgcc atcgacaggt ggtacactgg acggctcaat 420

tcttggacaa aagctgtaaa aaccttctct tttcaggccg tcccgctccc tggagccttc 480

ctgtctaggc agggaggcct caacggaggg gccttcacgg ctaccctaca tagacatttc 540

ttaatgaagt gcgggtggca agtgcaggtc caatgcaatt tgacacaatt ccaccaaggc 600

gctcttcttg ttgccatggt ccccgaaacc acccttgatg tcaaacctga cggcaaggca 660

aagagtttac aagagctgaa tgaagagcag tgggtggaga tgtctgacga ttaccggacc 720

gggaaaaaca tgccttttca gtctcttggc acttactatc ggccccctaa ctggacttgg 780

ggccccaatt tcatcaaccc ctatcaagta acagtcttcc cacaccaaat tctgaacgcg 840

agaacctcta cctcggtaga cataagtgtc ccatacatcg gggagactcc tacgcaatcc 900

tcagagacac agaactcctg gaccctcctc gttatggtgc ttgtccccct ggactacaag 960

gagggagcca caactgaccc agaaattaca ttttctgtaa ggcctacaag tccttacttc 1020

aacgggcttc gtaaccgttt cacgaccggg acggacgagg agcaggggcc cattcccaca 1080

gcacccagag aaaattcgct tatgtttctc tcaaccatcc ctgacgacac tgttcctgct 1140

tacgggaatg tgcgtacccc tcccgtcaat tacctccctg gtgaaataac cgacctctta 1200

caactggccc gtatacccac tctcatggcg tttgggcggg tgtctgaacc cgagcctgcc 1260

tcagacgcat atgtgcctta cgttgccgtt cctgcccagt tcgacgacaa gcctctcatc 1320

tccttcccga tcaccctctc agatcctgtc taccagaaca ccctggtggg cgccatcagt 1380

tcgaacttcg ccaactaccg ggggtgtatc caaatcactc tgacattttg tggacccatg 1440

atggcaagag ggaaattcct gctctcgtat tctcccccaa atggagcaca accacagacc 1500

ctttctaaag ctatgcagtg cacatactct atttgggata taggcttgaa ctctagttgg 1560

acctttgtca tcccctatat ctcgcccagt gattaccgtg aaactcgggc tattaccaac 1620

tcagtttatt ctgctgatgg ttggtttagc ttgcacaagc tgaccaaaat tactctacca 1680

cctgactgcc cacagagtcc ctgtattctc tttttcgcct ctgctggtga ggattacacc 1740

ctccgcctcc ctgttgattg taatccttcc tacgtgttcc actccaccga caacgccgag 1800

actggggtta ttgaggcagg taacactgac accgatttct ctggtgaact ggcggctcct 1860

ggctctaacc atactaatgt caaattcctg tttgaccgat ctcggctact gaatgtaatt 1920

aaggtactgg agaaggacgc cgtcttcccc cgtcctttcc ccacagcaac aggtgcacag 1980

caggacgatg gttacttttg tcttctaaca ccccgcccaa cagtcgcttc ccgacccgcc 2040

actcgtttcg gcctgtacgt caacccgtct gacaatggcg ttctcgctaa cacttcactg 2100

gatttcaatt tttacagttt ggcctgtttc acttacttta gatcagacct tgaagtcacg 2160

gtggtctcac tggagccaga tctggaattc gccgtggggt ggttcccctc tggcagtgag 2220

taccaggctt ctagctttgt ctacgaccaa ctgcatgtac cctaccactt tactgggcgc 2280

actccccgcg ctttcaccag caagggtgga aaggtatcct tcgtgctccc ttggaactct 2340

gtctcttccg tgcttcccgt gcgctggggg ggcgcctcca agctttcttc tgccacgcgg 2400

ggtctgccgg ctcatgctga ctgggggacc atttacgcct ttgtcccccg tcctaacgag 2460

aagaaaggca ccgctgtaaa gcacgtggcg gtgtacgttc ggtacaagaa cgcgcgtgcc 2520

tggtgcccca gcatgcttcc ctttcgcagc tacaagcaga agatgctgat gcaa 2574

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 扩增引物P1F

<400> 2

tacgaactac agggtaatgt ccag 24

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 扩增引物P1R

<400> 3

gacgtcgcct gattgcatca gcat 24

Claims (22)

1.一种分离的塞尼卡谷病毒核酸，其特征在于，所述核酸由如SEQ ID NO:1所示的序列组成。

2.一种塞尼卡谷病毒株，其特征在于，所述病毒株为塞尼卡谷病毒SVV/FJ/001株，其微生物保藏号是：CCTCC NO:V201802。

3.一种塞尼卡谷病毒株，其特征在于，其包含如SEQ ID NO:1所示的核酸序列。

4.根据权利要求3所述的塞尼卡谷病毒株，其特征在于，其包含SVV/FJ/001株的L基因序列、如SEQ ID NO:1所示的核酸序列、SVV/FJ/001株的P2基因序列和SVV/FJ/001株的P3基因序列。

5.一种包含如权利要求2-4中任一项所述的塞尼卡谷病毒株的塞尼卡谷病毒疫苗。

6.根据权利要求5所述的塞尼卡谷病毒疫苗，其特征在于，所述塞尼卡谷病毒疫苗能够激发动物对选自下组的塞尼卡谷病毒分离株的免疫活性：SVV/FJ/001株、SVV-HN株和SVV-GD株。

7.根据权利要求6所述的塞尼卡谷病毒疫苗，其特征在于，所述疫苗对选自下组的塞尼卡谷病毒分离株的半数免疫保护剂量(PD₅₀)的值均大于6.0：SVV/FJ/001株、SVV-HN株和SVV-GD株。

8.根据权利要求7所述的塞尼卡谷病毒疫苗，其特征在于，所述SVV-HN株的Genbank登录号为KY747511。

9.根据权利要求5所述的塞尼卡谷病毒疫苗，其特征在于，所述塞尼卡谷病毒疫苗包含灭活的塞尼卡谷病毒。

10.根据权利要求5所述的塞尼卡谷病毒疫苗，其特征在于，其还包含药学上可接受的佐剂。

11.根据权利要求5所述的塞尼卡谷病毒疫苗，其特征在于，其进一步包含一种或多种非塞尼卡谷病毒株或非塞尼卡谷病毒株的抗原性物质。

12.根据权利要求11所述的塞尼卡谷病毒疫苗，其特征在于，所述非塞尼卡谷病毒株选自下组：口蹄疫病毒、猪圆环病毒、伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒。

13.一种制备如权利要求5所述的塞尼卡谷病毒疫苗的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)、将如权利要求2-4中任一项所述的塞尼卡谷病毒株接种至易感细胞进行培养，得到塞尼卡谷病毒培养液；

2)、收获步骤1)中获得的塞尼卡谷病毒；

3)、对步骤2)中收获的塞尼卡谷病毒进行灭活；

4)、对步骤3)中灭活的塞尼卡谷病毒进行乳化。

14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，步骤3)中的所述灭活用二乙烯亚胺进行。

15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述二乙烯亚胺的终浓度为1.5mmol/L。

16.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述灭活温度为30℃；时间为30～36小时。

17.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述乳化是与ISA206佐剂以体积比1:1进行。

18.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述易感细胞为BHK-21细胞、PK-15细胞、ST细胞、SK-RST细胞、IBRS-2细胞、H1299细胞或293T细胞。

19.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，步骤1)中的病毒培养液的pH值为7.2～7.8。

20.由权利要求13所述的方法制备得到的塞尼卡谷病毒疫苗。

21.根据权利要求5所述的塞尼卡谷病毒疫苗在制备用于预防和/或控制猪或牛塞尼卡谷病毒SVV/FJ/001株、SVV-HN株和SVV-GD株引起的相关疾病的药物中的用途。

22.根据权利要求20所述的塞尼卡谷病毒疫苗在制备用于预防和/或控制猪或牛塞尼卡谷病毒SVV/FJ/001株、SVV-HN株和SVV-GD株引起的相关疾病的药物中的用途。