CN107955804B - 一种猪流行性腹泻疫苗毒株及含有其的疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及动物疫苗，具体公开了一种猪流行性腹泻疫苗毒株及含有其的疫苗。本发明采用分离纯化致弱的猪流行性腹泻病毒作为毒种，以适宜的保护剂冻干，采用肌肉注射的方式接种猪只，可以产生较高的中和抗体水平，为哺乳仔猪提供被动保护，该疫苗具有制备工艺简单、性质稳定、免疫原性好的优势，可以有效预防猪流行性腹泻病毒感染。

Description

一种猪流行性腹泻疫苗毒株及含有其的疫苗

技术领域

本发明涉及动物疫苗，具体地说，涉及一种猪流行性腹泻的毒株及含有该毒株的疫苗。

背景技术

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起猪的一种急性胃肠道传染病，临床上以呕吐、腹泻、脱水为主要特征。2010年秋冬之际，中国多个省份爆发了PED，很快蔓延发展为全国大流行，期间哺乳仔猪及保育猪发病率为80％～100％，死亡率高达50％～90％。预防该病主要依赖疫苗接种。

市场销售的猪流行性腹泻疫苗主要为采用传统工艺制备的猪流行性腹泻与猪传染性胃肠炎二联活疫苗。由于疫苗病毒株稳定性差、培养困难、免疫原性不足，动物接种后中和抗体水平难以达到要求，造成免疫猪场依然时常爆发猪流行性腹泻。为此有必要开发性质稳定、免疫原性更好的疫苗。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种猪流行性腹泻疫苗毒株及含有其的疫苗。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供了一种猪流行性腹泻疫苗的毒种，经鉴定为猪流行性腹泻病毒，编号为ZM-PE56，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏日期为2017年09月13日，保藏编号为CGMCC No.14711。

本发明所提供的上述毒株，具有传代稳定、细胞适应性好的特点，相比现有技术中制备猪流行性腹泻疫苗所用的毒株，具有培养简单、毒价高、稳定性高、免疫原性好的优势。

所述培养简单体现在：所述毒株不依赖血清和胰酶即可稳定传代，传代过程中毒价稳定在10^7.0TCID₅₀/ml以上，生产中可直接选择不含血清的DMEM进行培养，生产成本低、培养工艺简单。实际应用时，可使用无血清DMEM培养基、或含15ug/ml胰酶的无血清DMEM培养基、或含15ug/ml胰酶的1％血清DMEM培养基进行培养。

所述毒价高体现在：所述毒株的毒价可达10^7.2以上。

所述稳定性高体现在：传代培养8代后，毒价未出现明显的降低，且使用无血清DMEM培养基和含15ug/ml胰酶的1％血清DMEM培养基进行传代培养后，毒价还有所提高。

第二方面，本发明提供了一种含有上述毒株和冻干保护剂的猪流行性腹泻疫苗。

所述冻干保护剂可以是明胶蔗糖保护剂、蔗糖脱脂乳保护剂等。

作为优选，所述冻干保护剂为：以纯水为溶剂，按照质量体积比g/mL含有以下成分：3～8％的水解明胶，1％的水解酪蛋白，6～12％的蔗糖，0.25～3％的精氨酸盐酸盐，0.05～3％的谷氨酸钠。该冻干保护剂可有效提高疫苗的稳定性，并延长疫苗的保存时间。

在本发明的一个具体实施方式中，所述冻干保护剂为：以纯水为溶剂，按照质量体积比g/mL含有以下成分：3％的水解明胶，1％的水解酪蛋白，10％的蔗糖，1％的精氨酸盐酸盐，0.2％的谷氨酸钠，

进一步地，所述疫苗的制备方法为：

利用权利要求1所述的毒株生产病毒含量≥10^6.0TCID₅₀/mL的种子液，按照培养体积的0.1％～1％的接种形成单层的Vero细胞，添加DMEM维持液进行培养，待细胞出现75％病变时，收获病毒液，离心或过滤后收集上清获得抗原；将所获得的抗原与所述冻干保护剂，将所获得的抗原与灭菌后的所述冻干保护剂，按照1:1的体积比混合，并进行冻干，即得。

其中，所述灭菌可采用115℃高压灭菌20min，也可采用本领域其他常用的灭菌方式。

在上述相对用量下，可有效的激发接种动物产生较高水平的中和抗体，同时可以为哺乳仔猪提供较好的被动保护。

本发明的有益效果在于：

本发明提供了一种猪流行性腹泻的毒株及含有该毒株的疫苗。本发明所提供的毒株，具有传代稳定、细胞适应性好的特点，相比现有技术中制备猪流行性腹泻疫苗所用的毒株，具有培养简单、毒价高、稳定性高、免疫原性好的优势。本发明提供的含有该毒株的疫苗，可有效的激发接种动物产生较高水平的中和抗体，同时可以为哺乳仔猪提供较好的被动保护，是一种可以有效预防猪流行性腹泻感染的疫苗。

具体实施方式

下面结合具体实施例子来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例子仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1猪流行性腹泻疫苗毒株的制备

(1)、猪流行性腹泻疫苗毒株ZM-PE56的克隆筛选

猪流行性腹泻疫苗毒株ZM-PE56是通过5次噬斑克隆后传代6次获得的。其克隆方法如下：

形成单层Vero细胞铺6孔板。

取PEDV病毒液100μL，用稀释液按10倍系列稀释，将10^-6、10^-5、10^-4、10^-3、10^-2稀释病毒液接种于长满Vero细胞单层的6孔板中，每孔接0.5ml，同时设一未添加该病毒的阴性对照孔。

接毒前弃去细胞培养板中的细胞培养液，用洗板液润洗六孔板两遍，然后弃去。

37℃吸附1.5h(每隔30分钟摇动一次)后吸去病毒液，等比例加入57℃预温的2％琼脂糖和37℃预温的2×MEM(无酚红)培养液2.0ml，并加入胰蛋白酶至终浓度6μg/mL。

待琼脂糖层凝固后，将培养板在37℃的5％CO₂培养箱中倒置培养4d，尔后添加含有0.01％中性红染液(添加100μL 1％中性红溶液于4.9mL的营养琼脂中)的同上所述营养琼脂；每孔接1.0ml,第二层琼脂加入后5～10h观察蚀斑的大小、形态和出现时间。

等蚀斑形成后，先在板子背面画好圈，标记好斑的大小，用一次性胶头吸管对着画好的斑，先扎再吸，胶就起来了。然后再用一个一次性胶头吸管，再板上再吸一下，将挑取的蚀斑放入500μL DMEM的离心管中，-80℃保存。

进行第二次克隆，先将蚀斑毒在3cm细胞板上进行扩繁(病毒进行扩繁，吸附1.5h，用1％DMEM(胰酶终浓度为6ug/ml))再按上述方法进行蚀斑形成试验，直至所有蚀斑的大小和形态完全相同，即形成生物学特性相同的克隆株。

(2)病毒培养方法及传代稳定性研究

为了比较本发明所述毒株与非克隆毒株的性质差异，将本发明所述毒株(ZM-PE56)和非克隆毒株(对照毒株)，分别以不含血清的DMEM、DMEM(含15ug/ml胰酶)、1％牛血清DMEM(含15ug/ml胰酶)进行传代培养。

接种方式为将病毒液按照培养瓶培养体积的体积比0.1％～1％接种形成单层的Vero细胞，37℃感作1h，分别添加不同的维持液进行培养，待细胞出现75％病变时(约72h)，冻融2次收获病毒液，离心或过滤后收集上清即获得病毒液。按此方法连续传代8代，进行毒价测定，评价病毒的适应性和稳定性，结果见表1。

表1：不同培养条件传代毒价对比

由表1可知，本发明所述毒株不依赖血清和胰酶即可稳定传代，传代过程中毒价稳定在10^7.0TCID₅₀/ml以上，生产中可直接选择不含血清的DMEM进行培养，生产成本低、培养工艺简单；而对照病毒培养过程中更依赖胰酶和血清，培养成本高，培养工艺复杂，且毒价最高仅为10^5.8TCID₅₀/ml。

(3)免疫原性试验

30日龄PEDV抗体阴性仔猪9头，按照表2分为3组，每组3头，接种28d采集血液，测定中和抗体效价，比较相同接种剂量不同病毒接种猪的中和抗体水平，中和抗体检测方法参考猪流行性腹泻微量血清中和试验操作规程(SN T 1699.1-2006)。结果，相同病毒含量下，ZM-PE56产生更高水平的中和抗体，说明其免疫原性好于对照病毒(见表2)。

表2毒株免疫原性比较

组别	接种物	接种剂量	接种28d动物中和抗体效价(各3头)
				1	ZM-PE56	10<sup>6.0</sup>TCID<sub>50</sub>	1：32、1:32、1:32
2	对照病毒	10<sup>6.0</sup>TCID<sub>50</sub>	1：16、1：16、1：8
				3	-		<1：4、<1：4、<1：4

实施例2猪流行性腹泻疫苗的制备

(1)抗原的制备

将PEDV生产种子(病毒含量≥10^6.0TCID₅₀/ml)，按照培养体积的0.1％～1％的接种形成单层的Vero细胞，添加DMEM维持液进行培养，待细胞出现75％病变时(约72h)，冻融2次收获病毒液，离心或过滤后收集上清即为抗原。收获的抗原10倍系列稀释接种96孔板Vero细胞单层，每个稀释度接种8孔，观察4d，按照Reed-Muench法公式，计算病毒含量。经测定，培养的1批抗原病毒含量为10^7.5TCID₅₀/ml。

(2)疫苗成品的制备以纯水为溶剂，按照质量体积份数，制备含有3％的水解明胶，1％的水解酪蛋白，10％的蔗糖，1％的精氨酸盐酸盐，0.2％的谷氨酸钠，115℃高压灭菌20min，恢复室温后与抗原按照1:1体积比进行混合，并进行冻干，获得冻干疫苗1批，疫苗批号为14001，含量为5头份/瓶。

另选择常规保护剂以相同的抗原制备疫苗，制备方法为：纯水配置的2％明胶、10％蔗糖，115℃高压灭菌20min，恢复室温后与抗原按照1:1体积比进行混合，并进行冻干，疫苗批号为14002-CG。

对疫苗成品进行病毒含量测定，并按照《中华人民共和国兽药典》方法进行无菌检验、支原体检验和外源病毒检验。结果14001批、14002-CG疫苗成品每头份病毒含量均为10^6.8TCID₅₀，无菌检验、支原体检验、外源病毒检验均符合规定。

实施例3稳定性试验

本实施例用于说明本发明所制备的疫苗的稳定性，具体操作如下：

将实施例2制备的两批疫苗14001、14002-CG，37℃放置7d，测定毒价变化，结果前者毒价下降10^0.7TCID₅₀，而后者下降10^1.5TCID₅₀，表明新保护剂额外添加的适宜浓度水解酪蛋白、精氨酸盐酸盐、谷氨酸钠等成份可显著提高疫苗的稳定性。

将实施例2制备的两批疫苗14001、14002-CG放置-15℃冰箱，分别与0个月、12个月、24个月、36个月测定毒价变化。结果，不同时间点，14001批疫苗每头份疫苗病毒含量分别为10^6.8、10^6.8、10^6.6、10^6.3TCID₅₀,即保存1年毒价保持不变，保存3年毒价仅下降0.5个滴度，疫苗稳定性较好。而14002-CG在-15℃保存0个月、12个月、24个月、36个月每头份疫苗病毒含量分别为10^6.8、10^6.8、10^6.0、10^5.8TCID₅₀，保存2年毒价即下降了0.8个滴度。表明新保护剂疫苗稳定性好与常规保护剂疫苗。

实施例4免疫原性试验

30日龄PEDV抗体阴性仔猪9头，按照表3分为3组每组3头，分别接种采用本发明疫苗14001，商品疫苗和生理盐水，耳后肌肉接种仔猪，免疫后28d测定中和抗体效价，比较不同疫苗免疫猪的中和抗体水平，中和抗体检测方法参考猪流行性腹泻微量血清中和试验操作规程(SN T 1699.1-2006)。结果，采用实施例2中制备的疫苗免疫效果好于商品化疫苗(见表3)。

表3PEDV疫苗免疫原性试验结果

实施例5对母猪所产仔猪的保护作用

妊娠60d母猪6头，随机分为三组，每组2头，A组肌肉注射14001疫苗1头份/头，B组肌肉注射1头份商品疫苗，A、B两组均间隔28d以同样的方法进行二次免疫，另两头猪作为对照不免疫，每头母猪所产仔猪在7日龄时随机挑选5头，采用PEDV组织强毒进行口服攻毒，观察仔猪的临床症状，确定攻毒保护力情况。结果疫苗免疫母猪所产仔猪可抵御强毒的攻击，保护率为100％，而商品苗保护率为70％，未免疫对照母猪所产仔猪攻毒后全部发病死亡。

表4 PEDV疫苗被动免疫实验结果

组别	接种物	母猪数量	分娩母猪抗体水平	仔猪攻毒保护情况
					A	14001	2头	1：128、1:256	10/10
B	商品苗	2头	1：64、：1：64	7/10
					C	-	2头	<1：4、<1：4	0/10

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (6)

1.一种猪流行性腹泻疫苗毒株，所述毒株命名为猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus)ZM-PE56，保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为：CGMCC NO.14711。

2.一种猪流行性腹泻疫苗，其特征在于，含有权利要求1中所述的毒株和冻干保护剂。

3.根据权利要求2所述的猪流行性腹泻疫苗，其特征在于，所述冻干保护剂为：

以纯水为溶剂，按照质量体积比g/mL含有以下成分：3～8％的水解明胶，1％的水解酪蛋白，6～12％的蔗糖，0.25～3％的精氨酸盐酸盐，0.05～3％的谷氨酸钠。

4.根据权利要求3所述的猪流行性腹泻疫苗，其特征在于，所述冻干保护剂为：

以纯水为溶剂，按照质量体积比g/mL含有以下成分：3％的水解明胶，1％的水解酪蛋白，10％的蔗糖，1％的精氨酸盐酸盐，0.2％的谷氨酸钠。

5.根据权利要求2～4任一项所述的猪流行性腹泻疫苗，其特征在于，所述疫苗的制备方法为：

利用权利要求1所述的毒株生产病毒含量≥10^6.0TCID₅₀/mL的种子液，按照培养体积的0.1％～1％接种形成单层的Vero细胞，添加DMEM维持液进行培养，待细胞出现75％病变时，收获病毒液，离心或过滤后收集上清获得抗原；

将所获得的抗原与灭菌后的所述冻干保护剂，按照1:1的体积比混合，并进行冻干，即得。

6.根据权利要求5所述的猪流行性腹泻疫苗，其特征在于，所述灭菌采用115℃高压灭菌20min。