CN113504367A - 禽流感和新城疫的血凝抑制试验检测方法 - Google Patents
禽流感和新城疫的血凝抑制试验检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113504367A CN113504367A CN202110616206.7A CN202110616206A CN113504367A CN 113504367 A CN113504367 A CN 113504367A CN 202110616206 A CN202110616206 A CN 202110616206A CN 113504367 A CN113504367 A CN 113504367A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- avian influenza
- newcastle disease
- titer
- hemagglutination
- antibody titer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 title claims abstract description 90
- 208000010359 Newcastle Disease Diseases 0.000 title claims abstract description 86
- 208000002979 Influenza in Birds Diseases 0.000 title claims abstract description 85
- 206010064097 avian influenza Diseases 0.000 title claims abstract description 83
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title claims abstract description 80
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 title claims abstract description 40
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 34
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 33
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 33
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 16
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 claims description 49
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 claims description 42
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims description 27
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 26
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 claims description 22
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 17
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 16
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 16
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 14
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 10
- 238000010211 hemagglutination inhibition (HI) assay Methods 0.000 claims description 10
- 238000007037 hydroformylation reaction Methods 0.000 claims description 10
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 10
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 9
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 9
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000008098 formaldehyde solution Substances 0.000 claims description 6
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 5
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000005303 weighing Methods 0.000 claims description 5
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 claims description 4
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- 239000000376 reactant Substances 0.000 claims description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 3
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 claims description 3
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 claims description 3
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 3
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 claims description 3
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 claims description 3
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 3
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 claims description 2
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 claims description 2
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 claims 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 claims 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 claims 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 claims 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 claims 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 abstract description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 13
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 10
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 10
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 6
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 4
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 3
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 3
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 3
- 238000010079 rubber tapping Methods 0.000 description 3
- 241000711404 Avian avulavirus 1 Species 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 238000012631 diagnostic technique Methods 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
- G01N2333/08—RNA viruses
- G01N2333/11—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
- G01N2333/08—RNA viruses
- G01N2333/115—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
- G01N2333/125—Newcastle disease virus
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
- G01N2469/20—Detection of antibodies in sample from host which are directed against antigens from microorganisms
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Virology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
本发明涉及禽类疫病检测技术领域，尤其是一种禽流感和新城疫的血凝抑制试验检测方法。该种禽流感和新城疫的血凝抑制试验检测方法，经过大量试验证明修正后得到禽流感、新城疫血凝抑制试验抗体效价公式，设定11log2为禽流感的参照血凝效价，设定12log2为新城疫固定的参照血凝效价，直接进行血凝抑制试验并运用禽流感、新城疫血凝抑制试验抗体效价公式，求得HI抗体效价，其结果与正确抗体效价完全一致，具有实用性、准确性、普遍性，新检测方法既能节省试验时间，又能节省病毒抗原的使用量，大大提高了工作效率。
Description
技术领域
本发明涉及禽类疫病检测技术领域，尤其是一种禽流感和新城疫的血凝抑制试验检测方法。
背景技术
禽流感(Avian influenza，AI)是由A型流感病毒引起的危及禽类、小型哺乳动物和人类的病毒性传染病，它是以呼吸道症状为主，至全身性败血症的疾病综合症，被国际兽医局(OIE)定为A类传染病。新城疫(Newcastle Disease)俗称“亚洲鸡瘟”，新城疫病毒(NewcastleDisease Virus，NDV)是引起鸡瘟病的重要病原体。新城疫与禽流感相似，是严重危害禽类的传染病，其发病率，感染率和死亡率都很高，也被OIE列为A类疫病。
目前对新城疫进行检测多采用GBT16550-2020新城疫诊断技术，对禽流感进行检测多采用GB-T18936-2020高致病性禽流感诊断技术。按照高致病性禽流感诊断技术(GB/T18936-2020)和新城疫诊断技术(GB/T 16550-2020)进行血凝抑制试验，检测出HI抗体效价的效率较慢，病毒抗原的使用量较大，诊断效率低。
发明内容
本发明的目的在于提供一种禽流感和新城疫的血凝抑制试验检测方法，克服前述现有技术的不足，具有实用性、准确性、普遍性，既能节省试验时间，又能节省病毒抗原的使用量，大大提高了工作效率。
本发明解决其技术问题所采取的技术方案是：
一种禽流感和新城疫的血凝抑制试验检测方法，包括如下步骤：
(1)设定禽流感血凝抑制试验固定的参照血凝效价为11log2，设定新城疫血凝抑制试验固定的参照血凝效价为12log2；
(2)按照《禽流感、新城疫4HAU抗原配制表》配制禽流感参照血凝效价11log2或新城疫参照血凝效价12log2的4HAU抗原；
(3)取2个96孔V型微量反应板横向相邻放置，第2个96孔V型微量反应板作为第1个板的加长，用移液器在第1孔-第15孔各加入0.025mL PBS，第16孔加入0.05mL PBS；
(4)在第1孔加入0.025mL禽流感或新城疫标准阳性血清，充分混匀后移出0.025mL至第2孔，依次类推，倍比稀释至第14孔，第14孔弃去0.025mL，第15孔为阳性对照，第16孔为PBS对照；
(5)在第1孔—15孔各加入0.025mL 4HAU抗原，轻叩反应板，使反应物混合均匀，20℃-25℃室温下静置不少于30min，或在4℃环境下静置不少于60min；
(6)每孔加入0.025mL体积分数为1％的鸡红细胞悬液或0.75％鸡醛化红细胞悬液，轻晃混匀反应板后，20℃-25℃室温下静置35-45min，或在35-40℃恒温静置12-18min，当PBS对照孔红细胞呈明显纽扣状沉到孔底时判定结果；
(7)结果判定，在PBS对照孔出现正确结果的情况下，将反应板倾斜，从背侧观察，1-3s内看红细胞是否呈泪珠状流下，只有当阴性血清与标准抗原对照的HI滴度不大于2log2，阳性血清与标准抗原对照的HI滴度与已知滴度相差1个稀释度范围内，并且所用阴、阳性血清都不发生自凝的情况下，HI试验结果判定有效，记录试验抗体效价数值；
(8)禽流感抗体效价公式：参照血凝效价11log2比正确血凝效价数值多Y个滴度，禽流感抗体效价＝(试验抗体效价数值-Y)log2，Y＝0、1、2、3、4；
(9)新城疫抗体效价公式：参照血凝效价12log2比正确血凝效价数值多Y个滴度，新城疫抗体效价＝(试验抗体效价数值-Y)log2，Y＝0、1、2、3、4。
优选的，所述步骤(8)或步骤(9)中，若计算出的禽流感抗体效价或新城疫抗体效价大于10，则禽流感抗体效价或新城疫抗体效价记为10log2；若禽流感抗体效价或新城疫抗体效价小于或等于3log2，则判定抗体试验为阴性；若禽流感抗体效价或新城疫抗体效价等于4log2，则判定抗体试验为可疑，需重复试验；若禽流感抗体效价或新城疫抗体效价大于或等于5log2，则判定抗体试验为阳性。
优选的，所述步骤(6)中，1％鸡红细胞悬液在使用前，在移液槽内加满1％鸡红细胞悬液，每次吸取槽底的1％鸡红细胞悬液加入。
优选的，所述步骤(3)中PBS为pH7.2磷酸盐缓冲液，其配置方法包括如下步骤：称取氯化钠8.0g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钠0.24g，加蒸馏水至1000mL，将上述成分依次溶解，用盐酸调pH至7.2，分装，121℃，15min灭菌。
优选的，所述步骤(6)中1％鸡红细胞悬液的制备方法包括如下步骤：用阿氏液作为抗凝剂，采集至少三只SPF公鸡或无禽流感和新城疫抗体的非免疫鸡的抗凝血液，放入离心管中，加入3-4倍体积的PBS混匀，以2000r/min离心5min-10min，去掉血浆和白细胞层，重复以上过程，反复洗涤3-4次，洗净血浆和白细胞，2000r/min离心10min，最后吸取压积红细胞用PBS配成体积分数为1％鸡红细胞悬液，于4℃保存备用。
优选的，所述阿氏液的配制方法包括如下步骤：称取葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸0.055g、氯化钠0.42g，加蒸馏水至100mL，散热溶解后调pH值至6.1，69kPa15min高压灭菌，4℃保存备用。
优选的，所述步骤(6)中0.75％鸡醛化红细胞悬液的制备方法包括如下步骤：将新鲜红细胞用0.1mol/L PBS液充分洗涤5次，每次以3000r/min离心4min，最后1次用红细胞压缩体积的10倍PBS液洗涤，且3000r/min离心10min，去上清；按沉积红细胞的8倍量加入冷至4℃的36％甲醛溶液混合均匀，放置4℃作用24h，其间不断轻摇振荡；取出后再按沉积红细胞1份加2份冷至4℃的30％甲醛溶液混匀，4℃作用24h，然后用PBS液洗涤5次，配制0.75％醛化红细胞液，加入终浓度0.1％叠氮钠4℃备用。
本发明的有益效果是：与现有技术相比，本发明的一种禽流感和新城疫的血凝抑制试验检测方法具有以下优点：经过大量试验证明修正后得到禽流感、新城疫血凝抑制试验抗体效价公式，设定11log2为禽流感的参照血凝效价，设定12log2为新城疫固定的参照血凝效价，直接进行血凝抑制试验并运用禽流感、新城疫血凝抑制试验抗体效价公式，求得HI抗体效价，其结果与正确抗体效价完全一致，具有实用性、准确性、普遍性，新检测方法既能节省试验时间，又能节省病毒抗原的使用量，大大提高了工作效率。
具体实施方式
实施例1试剂制备
1％鸡红细胞悬液的制备：包括如下步骤：用阿氏液作为抗凝剂，采集至少三只SPF公鸡或无禽流感和新城疫抗体的非免疫鸡的抗凝血液，放入离心管中，加入3-4倍体积的PBS混匀，以2000r/min离心5min-10min，去掉血浆和白细胞层，重复以上过程，反复洗涤三次，洗净血浆和白细胞，2000r/min离心10min，最后吸取压积红细胞用PBS配成体积分数为1％鸡红细胞悬液，于4℃保存备用。
阿氏液的配制方法：包括如下步骤：称取葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸0.055g、氯化钠0.42g，加蒸馏水至100mL，散热溶解后调pH值至6.1，69kPa15min高压灭菌，4℃保存备用。
0.75％鸡醛化红细胞悬液的制备：包括如下步骤：将新鲜红细胞用0.1mol/L PBS液充分洗涤5次，每次以3000r/min离心4min，最后1次用红细胞压缩体积的10倍PBS液洗涤，且3000r/min离心10min，去上清；按沉积红细胞的8倍量加入冷至4℃的36％甲醛溶液混合均匀，放置4℃作用24h，其间不断轻摇振荡；取出后再按沉积红细胞1份加2份冷至4℃的30％甲醛溶液混匀，4℃作用24h，然后用PBS液洗涤5次，配制0.75％醛化红细胞液，加入终浓度0.1％叠氮钠4℃备用。
《禽流感、新城疫4HAU抗原配制表》如表1所示：
实施例2一种禽流感和新城疫的血凝抑制试验检测方法
受检样品为山东望联种禽集团有限公司的肉种鸡血清，原始编号为1-30，于2020.9.15免疫高致病性禽流感三价灭活苗(H5N1RE-11株+RE-12株，H7N9(H7-RE2株))，青岛易邦生物工程有限公司，生产批号201384900；于2020.9.25免疫新城疫冻干活疫苗，青岛易邦生物工程有限公司，生产批号200333110。
试剂使用哈尔滨国生生物科技股份有限公司生产的禽流感病毒H7N9(RE-2株)血凝抑制试验抗原，生产批号20190415，血凝效价8log2，和青岛立见诊断技术发展中心生产的新城疫血凝抑制试验抗原，生产批号010131801；血凝效价为10log2。
检测方法：
(1)设定禽流感血凝抑制试验固定的参照血凝效价为11log2，设定新城疫血凝抑制试验固定的参照血凝效价为12log2；
(2)按照《禽流感、新城疫4HAU抗原配制表》配制禽流感参照血凝效价11log2或新城疫参照血凝效价12log2的4HAU抗原；
(3)取2个96孔V型微量反应板横向相邻放置，第2个96孔V型微量反应板作为第1个板的加长，用移液器在第1孔-第15孔各加入0.025mL PBS，第16孔加入0.05mL PBS；
(4)在第1孔加入0.025mL禽流感或新城疫标准阳性血清，充分混匀后移出0.025mL至第2孔，依次类推，倍比稀释至第14孔，第14孔弃去0.025mL，第15孔为阳性对照，第16孔为PBS对照；
(5)在第1孔—15孔各加入0.025mL 4HAU抗原，轻叩反应板，使反应物混合均匀，20℃-25℃室温下静置不少于30min，或在4℃环境下静置不少于60min；
(6)每孔加入0.025mL体积分数为1％的鸡红细胞悬液或0.75％鸡醛化红细胞悬液，轻晃混匀反应板后，20℃-25℃室温下静置35-45min，或在35-40℃恒温静置12-18min，当PBS对照孔红细胞呈明显纽扣状沉到孔底时判定结果；
(7)结果判定，在PBS对照孔出现正确结果的情况下，将反应板倾斜，从背侧观察，1-3s内看红细胞是否呈泪珠状流下，只有当阴性血清与标准抗原对照的HI滴度不大于2log2，阳性血清与标准抗原对照的HI滴度与已知滴度相差1个稀释度范围内，并且所用阴、阳性血清都不发生自凝的情况下，HI试验结果判定有效，记录试验抗体效价数值；
(8)禽流感抗体效价公式：参照血凝效价11log2比正确血凝效价数值多Y个滴度，禽流感抗体效价＝(试验抗体效价数值-Y)log2，Y＝0、1、2、3、4；
(9)新城疫抗体效价公式：参照血凝效价12log2比正确血凝效价数值多Y个滴度，新城疫抗体效价＝(试验抗体效价数值-Y)log2，Y＝0、1、2、3、4。
按照本实施例的检测方法，分别配制参照血凝效价11log2、12log2的4HAU抗原直接进行血凝抑制试验检测，考虑到种禽血清样品抗体效价很高，根据试剂的参照血凝效价、正确血凝效价和抗体效价公式进行预判，稀释样品到第13孔，即在反应板右侧平行放置的反应板的第1孔，其第2孔和第3孔分别作为阳性对照和红细胞对照。
2种试剂检测出试验HI效价(log2)情况如下：
检测出禽流感病毒H7N9(RE-2株)试验HI效价(log2)按照原始编号(1-30)结果分别为12、11、11、12、12、13、11、11、12、12、11、12、12、12、11、13、12、11、12、11、13、13、12、11、12、11、12、12、13、11；根据禽流感抗体效价公式，11log2比正确血凝效价8log2多3个滴度(Y＝3)，抗体效价(log2)＝试验抗体效价-3，求得禽流感病毒H7N9(RE-2株)HI效价(log2)按照原始编号(1-30)结果分别为9、8、8、9、9、10、8、8、9、9、8、9、9、9、8、10、9、8、9、8、10、10、9、8、9、8、9、9、10、8；
检测出新城疫血凝抑制试验抗原的试验HI效价(log2)按照原始编号(1-30)结果分别为12、12、12、12、12、12、12、12、12、12、12、12、12、12、12、12、12、12、12、12、12、11、12、12、12、12、12、11、12、12；根据新城疫抗体效价公式，12log2比正确血凝效价10log2多2个滴度(Y＝2)，抗体效价(log2)＝试验抗体效价-2，求得新城疫HI效价(log2)按照原始编号(1-30)结果分别为10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、9、10、10、10、10、10、9、10、10。
实施例3禽流感和新城疫的血凝试验传统检测方法
受检样品为山东望联种禽集团有限公司的肉种鸡血清，原始编号为1-30，于2020.9.15免疫高致病性禽流感三价灭活苗(H5N1RE-11株+RE-12株，H7N9(H7-RE2株))，青岛易邦生物工程有限公司，生产批号201384900；于2020.9.25免疫新城疫冻干活疫苗，青岛易邦生物工程有限公司，生产批号200333110。
试剂使用哈尔滨国生生物科技股份有限公司生产的禽流感病毒H7N9(RE-2株)血凝抑制试验抗原，生产批号20190415，血凝效价8log2，和青岛立见诊断技术发展中心生产的新城疫血凝抑制试验抗原，生产批号010131801；血凝效价为10log2。
根据高致病性禽流感诊断技术(GB/T 18936-2020)和新城疫诊断技术(GB/T16550-2020)分别进行血凝抑制试验。
检测出禽流感病毒H7N9(RE-2株)HI效价(log2)按照原始编号(1-30)结果分别为9、8、8、9、9、10、8、8、9、9、8、9、9、9、8、10、9、8、9、8、10、10、9、8、9、8、9、9、10、8；
检测出新城疫HI效价(log2)按照原始编号(1-30)结果分别为10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、9、10、10、10、10、10、9、10、10。
实施例3为实施例2的对比试验，由实施例2和实施例3对比可以看出，本实施例2所得到的试验抗体效价经过公式修正后的禽流感、新城疫血凝抑制试验抗体效价结果与实施例3中正确抗体效价完全一致。
实施例4一种禽流感和新城疫的血凝抑制试验检测方法
受检样品为环翠区广源养殖场的肉鸡血清，原始编号为1-30，未免疫高致病性禽流感三价灭活苗(H5N1RE-11株+RE-12株，H7N9(H7-RE2株))，于2020.7.25免疫新城疫灭活油苗，青岛易邦生物工程有限公司，生产批号19454700。
首先，用哈尔滨国生生物科技股份有限公司生产的禽流感病毒H5N1(RE-12株)血凝抑制试验抗原，生产批号20190819，血凝效价10log2，和青岛立见诊断技术发展中心生产的新城疫血凝抑制试验抗原，生产批号010131901；血凝效价为11log2。
检测方法：
(1)设定禽流感血凝抑制试验固定的参照血凝效价为11log2，设定新城疫血凝抑制试验固定的参照血凝效价为12log2；
(2)按照《禽流感、新城疫4HAU抗原配制表》配制禽流感参照血凝效价11log2或新城疫参照血凝效价12log2的4HAU抗原；
(3)取2个96孔V型微量反应板横向相邻放置，第2个96孔V型微量反应板作为第1个板的加长，用移液器在第1孔-第15孔各加入0.025mL PBS，第16孔加入0.05mL PBS；
(4)在第1孔加入0.025mL禽流感或新城疫标准阳性血清，充分混匀后移出0.025mL至第2孔，依次类推，倍比稀释至第14孔，第14孔弃去0.025mL，第15孔为阳性对照，第16孔为PBS对照；
(5)在第1孔—15孔各加入0.025mL 4HAU抗原，轻叩反应板，使反应物混合均匀，20℃-25℃室温下静置不少于30min，或在4℃环境下静置不少于60min；
(6)每孔加入0.025mL体积分数为1％的鸡红细胞悬液或0.75％鸡醛化红细胞悬液，轻晃混匀反应板后，20℃-25℃室温下静置35-45min，或在35-40℃恒温静置12-18min，当PBS对照孔红细胞呈明显纽扣状沉到孔底时判定结果；
(7)结果判定，在PBS对照孔出现正确结果的情况下，将反应板倾斜，从背侧观察，1-3s内看红细胞是否呈泪珠状流下，只有当阴性血清与标准抗原对照的HI滴度不大于2log2，阳性血清与标准抗原对照的HI滴度与已知滴度相差1个稀释度范围内，并且所用阴、阳性血清都不发生自凝的情况下，HI试验结果判定有效，记录试验抗体效价数值；
(8)禽流感抗体效价公式：参照血凝效价11log2比正确血凝效价数值多Y个滴度，禽流感抗体效价＝(试验抗体效价数值-Y)log2，Y＝0、1、2、3、4；
(9)新城疫抗体效价公式：参照血凝效价12log2比正确血凝效价数值多Y个滴度，新城疫抗体效价＝(试验抗体效价数值-Y)log2，Y＝0、1、2、3、4。
2种试剂检测出试验HI效价(log2)情况如下：
步骤(7)检测出禽流感病毒H5N1(RE-12株)HI效价(log2)按照原始编号(1-30)结果分别为：1、1、1、1、1、1、1、2、1、1、1、2、1、1、1、1、1、2、1、1、1、1、3、1、1、1、1、1、1、1；根据禽流感抗体效价公式，11log2比正确血凝效价10log2多1个滴度(Y＝1)，抗体效价(log2)＝试验抗体效价-1，求得禽流感病毒H5N1(RE-12株)HI效价(log2)按照原始编号(1-30)结果分别为：0、0、0、0、0、0、0、1、0、0、0、1、0、0、0、0、0、1、0、0、0、0、2、0、0、0、0、0、0、0；
步骤(7)检测出新城疫HI效价(log2)按照原始编号(1-30)结果分别为，7、9、7、7、8、7、9、8、9、9、8、8、8、7、7、9、8、8、6、9、7、9、9、7、8、9、9、9、9、6；根据新城疫抗体效价公式，12log2比正确血凝效价11log2多1个滴度(Y＝1)，抗体效价(log2)＝试验抗体效价-1，求得新城疫HI效价(log2)按照原始编号(1-30)结果分别为6、8、6、6、7、6、8、7、8、8、7、7、7、6、6、8、6、7、5、8、6、8、8、6、7、8、8、8、8、5。
实施例5禽流感和新城疫的血凝试验传统检测方法
受检样品为环翠区广源养殖场的肉鸡血清，原始编号为1-30，未免疫高致病性禽流感三价灭活苗(H5N1RE-11株+RE-12株，H7N9(H7-RE2株))，于2020.7.25免疫新城疫灭活油苗，青岛易邦生物工程有限公司，生产批号19454700。
首先，用哈尔滨国生生物科技股份有限公司生产的禽流感病毒H5N1(RE-12株)血凝抑制试验抗原，生产批号20190819，血凝效价10log2，和青岛立见诊断技术发展中心生产的新城疫血凝抑制试验抗原，生产批号010131901；血凝效价为11log2。
根据高致病性禽流感诊断技术(GB/T 18936-2020)和新城疫诊断技术(GB/T16550-2020)分别进行血凝抑制试验。
检测出禽流感病毒H5N1(RE-12株)HI效价(log2)按照原始编号(1-30)结果分别为0、0、0、0、0、0、0、1、0、0、0、1、0、0、0、0、0、1、0、0、0、0、2、0、0、0、0、0、0、0；
检测出新城疫HI效价(log2)按照原始编号(1-30)结果分别为6、8、6、6、7、6、8、7、8、8、7、7、7、6、6、8、6、7、5、8、6、8、8、6、7、8、8、8、8、5。
实施例5为实施例4的对比试验，由实施例4和实施例5对比可以看出，本实施例4所得到的试验抗体效价经过公式修正后的禽流感、新城疫血凝抑制试验抗体效价结果与实施例5中正确抗体效价完全一致。
除实施例2-5之外后，发明人又检测辖区内其他多家禽养殖场肉鸡和蛋鸡血清样品，同样进行比对试验，先按照高致病性禽流感诊断技术(GB/T 18936-2020)和新城疫诊断技术(GB/T 16550-2020)进行血凝抑制试验，检测出HI抗体效价，再在试剂不变的情况下应按照新检测方法设定11log2、12log2为禽流感、新城疫固定的参照血凝效价，直接进行血凝抑制试验并运用禽流感、新城疫血凝抑制试验抗体效价公式，求得HI抗体效价，其结果与正确抗体效价完全一致。
以上试验证明本发明的禽流感、新城疫血凝抑制试验抗体效价公式具有实用性、准确性、普遍性，本发明的检测方法既能节省试验时间，又能节省病毒抗原的使用量，大大提高了工作效率。
上述具体实施方式仅是本发明的具体个案，本发明的专利保护范围包括但不限于上述具体实施方式的产品形态和式样，任何符合本发明权利要求书且任何所属技术领域的普通技术人员对其所做的适当变化或修饰，皆应落入本发明的专利保护范围。
Claims (7)
1.一种禽流感和新城疫的血凝抑制试验检测方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)设定禽流感血凝抑制试验固定的参照血凝效价为11log2，设定新城疫血凝抑制试验固定的参照血凝效价为12log2；
(2)按照《禽流感、新城疫4HAU抗原配制表》配制禽流感参照血凝效价11log2或新城疫参照血凝效价12log2的4HAU抗原；
(3)取2个96孔V型微量反应板横向相邻放置，第2个96孔V型微量反应板作为第1个板的加长，用移液器在第1孔-第15孔各加入0.025mL PBS，第16孔加入0.05mL PBS；
(4)在第1孔加入0.025mL禽流感或新城疫标准阳性血清，充分混匀后移出0.025mL至第2孔，依次类推，倍比稀释至第14孔，第14孔弃去0.025mL，第15孔为阳性对照，第16孔为PBS对照；
(5)在第1孔—15孔各加入0.025mL 4HAU抗原，叩动反应板，使反应物混合均匀，20℃-25℃室温下静置不少于30min，或在4℃环境下静置不少于60min；
(6)每孔加入0.025mL体积分数为1％的鸡红细胞悬液或0.75％鸡醛化红细胞悬液，晃动混匀反应板后，20℃-25℃室温下静置35-45min，或在35-40℃恒温静置12-18min，当PBS对照孔红细胞呈明显纽扣状沉到孔底时判定结果；
(7)结果判定，在PBS对照孔出现正确结果的情况下，将反应板倾斜，从背侧观察，1-3s内看红细胞是否呈泪珠状流下，只有当阴性血清与标准抗原对照的HI滴度不大于2log2，阳性血清与标准抗原对照的HI滴度与已知滴度相差1个稀释度范围内，并且所用阴、阳性血清都不发生自凝的情况下，HI试验结果判定有效，记录试验抗体效价数值；
(8)禽流感抗体效价公式：参照血凝效价11log2比正确血凝效价数值多Y个滴度，禽流感抗体效价＝(试验抗体效价数值-Y)log2，Y＝0、1、2、3、4；
(9)新城疫抗体效价公式：参照血凝效价12log2比正确血凝效价数值多Y个滴度，新城疫抗体效价＝(试验抗体效价数值-Y)log2，Y＝0、1、2、3、4。
2.根据权利要求1所述的一种禽流感和新城疫的血凝抑制试验检测方法，其特征在于：所述步骤(8)或步骤(9)中，若计算出的禽流感抗体效价或新城疫抗体效价大于10，则禽流感抗体效价或新城疫抗体效价记为10log2；若禽流感抗体效价或新城疫抗体效价小于或等于3log2，则判定抗体试验为阴性；若禽流感抗体效价或新城疫抗体效价等于4log2，则判定抗体试验为可疑，需重复试验；若禽流感抗体效价或新城疫抗体效价大于或等于5log2，则判定抗体试验为阳性。
3.根据权利要求1或2所述的一种禽流感和新城疫的血凝抑制试验检测方法，其特征在于：所述步骤(6)中，红细胞悬液在使用前，在移液槽内加满红细胞悬液，每次吸取槽底的红细胞悬液加入。
4.根据权利要求1或2所述的一种禽流感和新城疫的血凝抑制试验检测方法，其特征在于：所述步骤(3)中PBS为pH7.2磷酸盐缓冲液，其配置方法包括如下步骤：称取氯化钠8.0g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钠0.24g，加蒸馏水至1000mL，将上述成分依次溶解，用盐酸调pH至7.2，分装，121℃，15min灭菌。
5.根据权利要求1或2所述的一种禽流感和新城疫的血凝抑制试验检测方法，其特征在于：所述步骤(6)中1％鸡红细胞悬液的制备方法包括如下步骤：用阿氏液作为抗凝剂，采集至少三只SPF公鸡或无禽流感和新城疫抗体的非免疫鸡的抗凝血液，放入离心管中，加入3-4倍体积的PBS混匀，以2000r/min离心5min-10min，去掉血浆和白细胞层，重复以上过程，反复洗涤3-4次，洗净血浆和白细胞，2000r/min离心10min，最后吸取压积红细胞用PBS配成体积分数为1％的悬液，于4℃保存备用。
6.根据权利要求5所述的一种禽流感和新城疫的血凝抑制试验检测方法，其特征在于：所述阿氏液的配制方法包括如下步骤：称取葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸0.055g、氯化钠0.42g，加蒸馏水至100mL，散热溶解后调pH值至6.1，69kPa15min高压灭菌，4℃保存备用。
7.根据权利要求1或2所述的一种禽流感和新城疫的血凝抑制试验检测方法，其特征在于：所述步骤(6)中0.75％鸡醛化红细胞悬液的制备方法包括如下步骤：将新鲜红细胞用0.1mol/L PBS液充分洗涤5次，每次以3000r/min离心4min，最后1次用红细胞压缩体积的10倍PBS液洗涤，且3000r/min离心10min，去上清；按沉积红细胞的8倍量加入冷至4℃的36％甲醛溶液混合均匀，放置4℃作用24h，其间不断轻摇振荡；取出后再按沉积红细胞1份加2份冷至4℃的30％甲醛溶液混匀，4℃作用24h，然后用PBS液洗涤5次，配制0.75％醛化红细胞液，加入终浓度0.1％叠氮钠4℃备用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110616206.7A CN113504367B (zh) | 2021-06-02 | 2021-06-02 | 禽流感和新城疫的血凝抑制试验检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110616206.7A CN113504367B (zh) | 2021-06-02 | 2021-06-02 | 禽流感和新城疫的血凝抑制试验检测方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113504367A true CN113504367A (zh) | 2021-10-15 |
| CN113504367B CN113504367B (zh) | 2023-08-08 |
Family
ID=78008898
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110616206.7A Active CN113504367B (zh) | 2021-06-02 | 2021-06-02 | 禽流感和新城疫的血凝抑制试验检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113504367B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117757892A (zh) * | 2024-02-22 | 2024-03-26 | 潍坊华卓生物科技有限公司 | 预防鸡新城疫病毒的功能性益生菌反向筛选方法及应用 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4298346A (en) * | 1978-02-06 | 1981-11-03 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Virus hemagglutination-inhibition reaction |
| US20090325148A1 (en) * | 2008-06-30 | 2009-12-31 | Vaxdesign Inc. | Bead Array Reader Based-Hemagglutination and Hemagglutination Inhibition Assay |
| CN102012430A (zh) * | 2010-11-05 | 2011-04-13 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 | 禽流感病毒H5N1亚型Re-5株血凝抑制抗原标准物质及制备方法 |
| CN106749639A (zh) * | 2016-11-23 | 2017-05-31 | 临沂大学 | 一种新的h5亚型禽流感卵黄抗体代替血清抗体监测的方法 |
| CN110511283A (zh) * | 2019-08-26 | 2019-11-29 | 中国农业科学院上海兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心上海分中心) | 一种具有绿色荧光活性的检测蛋白的检测试剂盒 |
| CN111323581A (zh) * | 2020-03-03 | 2020-06-23 | 广州鸿泉生物科技有限公司 | 一种流感血凝抑制试验检测方法 |
-
2021
- 2021-06-02 CN CN202110616206.7A patent/CN113504367B/zh active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4298346A (en) * | 1978-02-06 | 1981-11-03 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Virus hemagglutination-inhibition reaction |
| US20090325148A1 (en) * | 2008-06-30 | 2009-12-31 | Vaxdesign Inc. | Bead Array Reader Based-Hemagglutination and Hemagglutination Inhibition Assay |
| CN102012430A (zh) * | 2010-11-05 | 2011-04-13 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 | 禽流感病毒H5N1亚型Re-5株血凝抑制抗原标准物质及制备方法 |
| CN106749639A (zh) * | 2016-11-23 | 2017-05-31 | 临沂大学 | 一种新的h5亚型禽流感卵黄抗体代替血清抗体监测的方法 |
| CN110511283A (zh) * | 2019-08-26 | 2019-11-29 | 中国农业科学院上海兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心上海分中心) | 一种具有绿色荧光活性的检测蛋白的检测试剂盒 |
| CN111323581A (zh) * | 2020-03-03 | 2020-06-23 | 广州鸿泉生物科技有限公司 | 一种流感血凝抑制试验检测方法 |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117757892A (zh) * | 2024-02-22 | 2024-03-26 | 潍坊华卓生物科技有限公司 | 预防鸡新城疫病毒的功能性益生菌反向筛选方法及应用 |
| CN117757892B (zh) * | 2024-02-22 | 2024-06-11 | 潍坊华卓生物科技有限公司 | 预防鸡新城疫病毒的功能性益生菌反向筛选方法及应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113504367B (zh) | 2023-08-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106290867A (zh) | 一种同时检测五种禽垂直传播疾病抗体的液相芯片及方法 | |
| CN111420044A (zh) | 一种四价流感病毒亚单位疫苗及其制备方法 | |
| CN113504367B (zh) | 禽流感和新城疫的血凝抑制试验检测方法 | |
| CN109239342B (zh) | Qx型ibv血凝抑制试验抗原及其制备方法与应用 | |
| CN113376387B (zh) | 一种鸽新城疫Ⅵb亚型阳性血清标准品及其制备方法 | |
| CN102012430B (zh) | 禽流感病毒H5N1亚型Re-5株血凝抑制抗原标准物质及制备方法 | |
| CN103063854B (zh) | 一种鸭坦布苏病毒抗体固相竞争elisa检测试剂盒 | |
| Cho et al. | Detection of antibodies to equine arteritis virus by a monoclonal antibody-based blocking ELISA | |
| Bhuiyan et al. | Seroprevalence of infectious bronchitis virus in different types of chicken in Bangladesh | |
| CN109633170A (zh) | 一种EB病毒壳抗原IgA抗体检测试剂盒 | |
| CN113533718B (zh) | 禽流感和新城疫的血凝试验检测方法 | |
| Nagy et al. | Seroprevelance of avian Metapneumovirus in Egyptian chicken and duck flocks with a reference on economic impact | |
| CN111537714A (zh) | 一种用于检测鸡滑液囊支原体的冻干血凝抑制试验抗原及抗原组合、制备方法 | |
| CN106771173A (zh) | 抗h9亚型禽流感病毒的单克隆抗体、杂交瘤细胞株及其应用 | |
| CN110438093A (zh) | 一种鸡传染性支气管炎hi抗原及其制备方法 | |
| CN102735853A (zh) | 一种猪流感灭活疫苗的效价测定方法 | |
| CN103789273B (zh) | 一种禽流感h9n2亚型病毒毒株及其应用 | |
| CN105929159B (zh) | 一种新的h9亚型禽流感卵黄抗体代替血清抗体监测的方法 | |
| CN105866427A (zh) | 一种组合物及其在鸡传染性支气管炎抗体测定中的应用 | |
| CN101025420B (zh) | 一种禽流感病毒乳胶凝集检测试剂盒及应用 | |
| KR101099076B1 (ko) | Ｈｅｐａｒｉｎ 처리된 ＰＲＲＳＶ 항원을 사용한 간접면역효소반응 키트 및 이의 제조 방법 | |
| CN112666349A (zh) | 一种用于检测prv抗体的液相芯片 | |
| Sultan et al. | Inactivated oil emulsion H9N2 vaccine in broiler chickens: Pathogenesis and Clinicopathological studies | |
| CN107991481A (zh) | 一种检测猪伪狂犬病毒和口蹄疫病毒的二联阻断elisa抗体检测试剂盒及其应用 | |
| Yu et al. | Development of a specific latex agglutination test based on a recombinant hemagglutinin protein to detect antibodies to H5 avian influenza viruses |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |