CN113504367A - 禽流感和新城疫的血凝抑制试验检测方法 - Google Patents

禽流感和新城疫的血凝抑制试验检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113504367A
CN113504367A CN202110616206.7A CN202110616206A CN113504367A CN 113504367 A CN113504367 A CN 113504367A CN 202110616206 A CN202110616206 A CN 202110616206A CN 113504367 A CN113504367 A CN 113504367A
Authority
CN
China
Prior art keywords
avian influenza
newcastle disease
titer
hemagglutination
antibody titer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202110616206.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113504367B (zh
Inventor
李宇刚
洪炀
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Weihai Huancui District Animal Disease Prevention And Control Center Weihai Huancui District Animal Health And Quarantine Center
Original Assignee
Weihai Huancui District Animal Disease Prevention And Control Center Weihai Huancui District Animal Health And Quarantine Center
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Weihai Huancui District Animal Disease Prevention And Control Center Weihai Huancui District Animal Health And Quarantine Center filed Critical Weihai Huancui District Animal Disease Prevention And Control Center Weihai Huancui District Animal Health And Quarantine Center
Priority to CN202110616206.7A priority Critical patent/CN113504367B/zh
Publication of CN113504367A publication Critical patent/CN113504367A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113504367B publication Critical patent/CN113504367B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/11—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/115—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
    • G01N2333/125—Newcastle disease virus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/20—Detection of antibodies in sample from host which are directed against antigens from microorganisms
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明涉及禽类疫病检测技术领域，尤其是一种禽流感和新城疫的血凝抑制试验检测方法。该种禽流感和新城疫的血凝抑制试验检测方法，经过大量试验证明修正后得到禽流感、新城疫血凝抑制试验抗体效价公式，设定11log2为禽流感的参照血凝效价，设定12log2为新城疫固定的参照血凝效价，直接进行血凝抑制试验并运用禽流感、新城疫血凝抑制试验抗体效价公式，求得HI抗体效价，其结果与正确抗体效价完全一致，具有实用性、准确性、普遍性，新检测方法既能节省试验时间，又能节省病毒抗原的使用量，大大提高了工作效率。

Description

禽流感和新城疫的血凝抑制试验检测方法
技术领域
本发明涉及禽类疫病检测技术领域，尤其是一种禽流感和新城疫的血凝抑制试验检测方法。
背景技术
禽流感(Avian influenza，AI)是由A型流感病毒引起的危及禽类、小型哺乳动物和人类的病毒性传染病，它是以呼吸道症状为主，至全身性败血症的疾病综合症，被国际兽医局(OIE)定为A类传染病。新城疫(Newcastle Disease)俗称“亚洲鸡瘟”，新城疫病毒(NewcastleDisease Virus，NDV)是引起鸡瘟病的重要病原体。新城疫与禽流感相似，是严重危害禽类的传染病，其发病率，感染率和死亡率都很高，也被OIE列为A类疫病。
目前对新城疫进行检测多采用GBT16550-2020新城疫诊断技术，对禽流感进行检测多采用GB-T18936-2020高致病性禽流感诊断技术。按照高致病性禽流感诊断技术(GB/T18936-2020)和新城疫诊断技术(GB/T 16550-2020)进行血凝抑制试验，检测出HI抗体效价的效率较慢，病毒抗原的使用量较大，诊断效率低。
发明内容
本发明的目的在于提供一种禽流感和新城疫的血凝抑制试验检测方法，克服前述现有技术的不足，具有实用性、准确性、普遍性，既能节省试验时间，又能节省病毒抗原的使用量，大大提高了工作效率。
本发明解决其技术问题所采取的技术方案是：
一种禽流感和新城疫的血凝抑制试验检测方法，包括如下步骤：
(1)设定禽流感血凝抑制试验固定的参照血凝效价为11log2，设定新城疫血凝抑制试验固定的参照血凝效价为12log2；
(2)按照《禽流感、新城疫4HAU抗原配制表》配制禽流感参照血凝效价11log2或新城疫参照血凝效价12log2的4HAU抗原；
(3)取2个96孔V型微量反应板横向相邻放置，第2个96孔V型微量反应板作为第1个板的加长，用移液器在第1孔-第15孔各加入0.025mL PBS，第16孔加入0.05mL PBS；
(4)在第1孔加入0.025mL禽流感或新城疫标准阳性血清，充分混匀后移出0.025mL至第2孔，依次类推，倍比稀释至第14孔，第14孔弃去0.025mL，第15孔为阳性对照，第16孔为PBS对照；
(5)在第1孔—15孔各加入0.025mL 4HAU抗原，轻叩反应板，使反应物混合均匀，20℃-25℃室温下静置不少于30min，或在4℃环境下静置不少于60min；
(6)每孔加入0.025mL体积分数为1％的鸡红细胞悬液或0.75％鸡醛化红细胞悬液，轻晃混匀反应板后，20℃-25℃室温下静置35-45min，或在35-40℃恒温静置12-18min，当PBS对照孔红细胞呈明显纽扣状沉到孔底时判定结果；
(7)结果判定，在PBS对照孔出现正确结果的情况下，将反应板倾斜，从背侧观察，1-3s内看红细胞是否呈泪珠状流下，只有当阴性血清与标准抗原对照的HI滴度不大于2log2，阳性血清与标准抗原对照的HI滴度与已知滴度相差1个稀释度范围内，并且所用阴、阳性血清都不发生自凝的情况下，HI试验结果判定有效，记录试验抗体效价数值；
(8)禽流感抗体效价公式：参照血凝效价11log2比正确血凝效价数值多Y个滴度，禽流感抗体效价＝(试验抗体效价数值-Y)log2，Y＝0、1、2、3、4；
(9)新城疫抗体效价公式：参照血凝效价12log2比正确血凝效价数值多Y个滴度，新城疫抗体效价＝(试验抗体效价数值-Y)log2，Y＝0、1、2、3、4。
优选的，所述步骤(8)或步骤(9)中，若计算出的禽流感抗体效价或新城疫抗体效价大于10，则禽流感抗体效价或新城疫抗体效价记为10log2；若禽流感抗体效价或新城疫抗体效价小于或等于3log2，则判定抗体试验为阴性；若禽流感抗体效价或新城疫抗体效价等于4log2，则判定抗体试验为可疑，需重复试验；若禽流感抗体效价或新城疫抗体效价大于或等于5log2，则判定抗体试验为阳性。
优选的，所述步骤(6)中，1％鸡红细胞悬液在使用前，在移液槽内加满1％鸡红细胞悬液，每次吸取槽底的1％鸡红细胞悬液加入。
优选的，所述步骤(3)中PBS为pH7.2磷酸盐缓冲液，其配置方法包括如下步骤：称取氯化钠8.0g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钠0.24g，加蒸馏水至1000mL，将上述成分依次溶解，用盐酸调pH至7.2，分装，121℃，15min灭菌。
优选的，所述步骤(6)中1％鸡红细胞悬液的制备方法包括如下步骤：用阿氏液作为抗凝剂，采集至少三只SPF公鸡或无禽流感和新城疫抗体的非免疫鸡的抗凝血液，放入离心管中，加入3-4倍体积的PBS混匀，以2000r/min离心5min-10min，去掉血浆和白细胞层，重复以上过程，反复洗涤3-4次，洗净血浆和白细胞，2000r/min离心10min，最后吸取压积红细胞用PBS配成体积分数为1％鸡红细胞悬液，于4℃保存备用。
优选的，所述阿氏液的配制方法包括如下步骤：称取葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸0.055g、氯化钠0.42g，加蒸馏水至100mL，散热溶解后调pH值至6.1，69kPa15min高压灭菌，4℃保存备用。
优选的，所述步骤(6)中0.75％鸡醛化红细胞悬液的制备方法包括如下步骤：将新鲜红细胞用0.1mol/L PBS液充分洗涤5次，每次以3000r/min离心4min，最后1次用红细胞压缩体积的10倍PBS液洗涤，且3000r/min离心10min，去上清；按沉积红细胞的8倍量加入冷至4℃的36％甲醛溶液混合均匀，放置4℃作用24h，其间不断轻摇振荡；取出后再按沉积红细胞1份加2份冷至4℃的30％甲醛溶液混匀，4℃作用24h，然后用PBS液洗涤5次，配制0.75％醛化红细胞液，加入终浓度0.1％叠氮钠4℃备用。
本发明的有益效果是：与现有技术相比，本发明的一种禽流感和新城疫的血凝抑制试验检测方法具有以下优点：经过大量试验证明修正后得到禽流感、新城疫血凝抑制试验抗体效价公式，设定11log2为禽流感的参照血凝效价，设定12log2为新城疫固定的参照血凝效价，直接进行血凝抑制试验并运用禽流感、新城疫血凝抑制试验抗体效价公式，求得HI抗体效价，其结果与正确抗体效价完全一致，具有实用性、准确性、普遍性，新检测方法既能节省试验时间，又能节省病毒抗原的使用量，大大提高了工作效率。
具体实施方式
实施例1试剂制备
1％鸡红细胞悬液的制备：包括如下步骤：用阿氏液作为抗凝剂，采集至少三只SPF公鸡或无禽流感和新城疫抗体的非免疫鸡的抗凝血液，放入离心管中，加入3-4倍体积的PBS混匀，以2000r/min离心5min-10min，去掉血浆和白细胞层，重复以上过程，反复洗涤三次，洗净血浆和白细胞，2000r/min离心10min，最后吸取压积红细胞用PBS配成体积分数为1％鸡红细胞悬液，于4℃保存备用。
阿氏液的配制方法：包括如下步骤：称取葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸0.055g、氯化钠0.42g，加蒸馏水至100mL，散热溶解后调pH值至6.1，69kPa15min高压灭菌，4℃保存备用。
0.75％鸡醛化红细胞悬液的制备：包括如下步骤：将新鲜红细胞用0.1mol/L PBS液充分洗涤5次，每次以3000r/min离心4min，最后1次用红细胞压缩体积的10倍PBS液洗涤，且3000r/min离心10min，去上清；按沉积红细胞的8倍量加入冷至4℃的36％甲醛溶液混合均匀，放置4℃作用24h，其间不断轻摇振荡；取出后再按沉积红细胞1份加2份冷至4℃的30％甲醛溶液混匀，4℃作用24h，然后用PBS液洗涤5次，配制0.75％醛化红细胞液，加入终浓度0.1％叠氮钠4℃备用。
《禽流感、新城疫4HAU抗原配制表》如表1所示：
Figure BDA0003097685640000051
实施例2一种禽流感和新城疫的血凝抑制试验检测方法
受检样品为山东望联种禽集团有限公司的肉种鸡血清，原始编号为1-30，于2020.9.15免疫高致病性禽流感三价灭活苗(H5N1RE-11株+RE-12株，H7N9(H7-RE2株))，青岛易邦生物工程有限公司，生产批号201384900；于2020.9.25免疫新城疫冻干活疫苗，青岛易邦生物工程有限公司，生产批号200333110。
试剂使用哈尔滨国生生物科技股份有限公司生产的禽流感病毒H7N9(RE-2株)血凝抑制试验抗原，生产批号20190415，血凝效价8log2，和青岛立见诊断技术发展中心生产的新城疫血凝抑制试验抗原，生产批号010131801；血凝效价为10log2。
检测方法：
(1)设定禽流感血凝抑制试验固定的参照血凝效价为11log2，设定新城疫血凝抑制试验固定的参照血凝效价为12log2；
(2)按照《禽流感、新城疫4HAU抗原配制表》配制禽流感参照血凝效价11log2或新城疫参照血凝效价12log2的4HAU抗原；
(3)取2个96孔V型微量反应板横向相邻放置，第2个96孔V型微量反应板作为第1个板的加长，用移液器在第1孔-第15孔各加入0.025mL PBS，第16孔加入0.05mL PBS；
(4)在第1孔加入0.025mL禽流感或新城疫标准阳性血清，充分混匀后移出0.025mL至第2孔，依次类推，倍比稀释至第14孔，第14孔弃去0.025mL，第15孔为阳性对照，第16孔为PBS对照；
(5)在第1孔—15孔各加入0.025mL 4HAU抗原，轻叩反应板，使反应物混合均匀，20℃-25℃室温下静置不少于30min，或在4℃环境下静置不少于60min；
(6)每孔加入0.025mL体积分数为1％的鸡红细胞悬液或0.75％鸡醛化红细胞悬液，轻晃混匀反应板后，20℃-25℃室温下静置35-45min，或在35-40℃恒温静置12-18min，当PBS对照孔红细胞呈明显纽扣状沉到孔底时判定结果；
(7)结果判定，在PBS对照孔出现正确结果的情况下，将反应板倾斜，从背侧观察，1-3s内看红细胞是否呈泪珠状流下，只有当阴性血清与标准抗原对照的HI滴度不大于2log2，阳性血清与标准抗原对照的HI滴度与已知滴度相差1个稀释度范围内，并且所用阴、阳性血清都不发生自凝的情况下，HI试验结果判定有效，记录试验抗体效价数值；
(8)禽流感抗体效价公式：参照血凝效价11log2比正确血凝效价数值多Y个滴度，禽流感抗体效价＝(试验抗体效价数值-Y)log2，Y＝0、1、2、3、4；
(9)新城疫抗体效价公式：参照血凝效价12log2比正确血凝效价数值多Y个滴度，新城疫抗体效价＝(试验抗体效价数值-Y)log2，Y＝0、1、2、3、4。
按照本实施例的检测方法，分别配制参照血凝效价11log2、12log2的4HAU抗原直接进行血凝抑制试验检测，考虑到种禽血清样品抗体效价很高，根据试剂的参照血凝效价、正确血凝效价和抗体效价公式进行预判，稀释样品到第13孔，即在反应板右侧平行放置的反应板的第1孔，其第2孔和第3孔分别作为阳性对照和红细胞对照。
2种试剂检测出试验HI效价(log2)情况如下：
检测出禽流感病毒H7N9(RE-2株)试验HI效价(log2)按照原始编号(1-30)结果分别为12、11、11、12、12、13、11、11、12、12、11、12、12、12、11、13、12、11、12、11、13、13、12、11、12、11、12、12、13、11；根据禽流感抗体效价公式，11log2比正确血凝效价8log2多3个滴度(Y＝3)，抗体效价(log2)＝试验抗体效价-3，求得禽流感病毒H7N9(RE-2株)HI效价(log2)按照原始编号(1-30)结果分别为9、8、8、9、9、10、8、8、9、9、8、9、9、9、8、10、9、8、9、8、10、10、9、8、9、8、9、9、10、8；
检测出新城疫血凝抑制试验抗原的试验HI效价(log2)按照原始编号(1-30)结果分别为12、12、12、12、12、12、12、12、12、12、12、12、12、12、12、12、12、12、12、12、12、11、12、12、12、12、12、11、12、12；根据新城疫抗体效价公式，12log2比正确血凝效价10log2多2个滴度(Y＝2)，抗体效价(log2)＝试验抗体效价-2，求得新城疫HI效价(log2)按照原始编号(1-30)结果分别为10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、9、10、10、10、10、10、9、10、10。
实施例3禽流感和新城疫的血凝试验传统检测方法
受检样品为山东望联种禽集团有限公司的肉种鸡血清，原始编号为1-30，于2020.9.15免疫高致病性禽流感三价灭活苗(H5N1RE-11株+RE-12株，H7N9(H7-RE2株))，青岛易邦生物工程有限公司，生产批号201384900；于2020.9.25免疫新城疫冻干活疫苗，青岛易邦生物工程有限公司，生产批号200333110。
试剂使用哈尔滨国生生物科技股份有限公司生产的禽流感病毒H7N9(RE-2株)血凝抑制试验抗原，生产批号20190415，血凝效价8log2，和青岛立见诊断技术发展中心生产的新城疫血凝抑制试验抗原，生产批号010131801；血凝效价为10log2。
根据高致病性禽流感诊断技术(GB/T 18936-2020)和新城疫诊断技术(GB/T16550-2020)分别进行血凝抑制试验。
检测出禽流感病毒H7N9(RE-2株)HI效价(log2)按照原始编号(1-30)结果分别为9、8、8、9、9、10、8、8、9、9、8、9、9、9、8、10、9、8、9、8、10、10、9、8、9、8、9、9、10、8；
检测出新城疫HI效价(log2)按照原始编号(1-30)结果分别为10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、9、10、10、10、10、10、9、10、10。
实施例3为实施例2的对比试验，由实施例2和实施例3对比可以看出，本实施例2所得到的试验抗体效价经过公式修正后的禽流感、新城疫血凝抑制试验抗体效价结果与实施例3中正确抗体效价完全一致。
实施例4一种禽流感和新城疫的血凝抑制试验检测方法
受检样品为环翠区广源养殖场的肉鸡血清，原始编号为1-30，未免疫高致病性禽流感三价灭活苗(H5N1RE-11株+RE-12株，H7N9(H7-RE2株))，于2020.7.25免疫新城疫灭活油苗，青岛易邦生物工程有限公司，生产批号19454700。
首先，用哈尔滨国生生物科技股份有限公司生产的禽流感病毒H5N1(RE-12株)血凝抑制试验抗原，生产批号20190819，血凝效价10log2，和青岛立见诊断技术发展中心生产的新城疫血凝抑制试验抗原，生产批号010131901；血凝效价为11log2。
检测方法：
(1)设定禽流感血凝抑制试验固定的参照血凝效价为11log2，设定新城疫血凝抑制试验固定的参照血凝效价为12log2；
(2)按照《禽流感、新城疫4HAU抗原配制表》配制禽流感参照血凝效价11log2或新城疫参照血凝效价12log2的4HAU抗原；
(3)取2个96孔V型微量反应板横向相邻放置，第2个96孔V型微量反应板作为第1个板的加长，用移液器在第1孔-第15孔各加入0.025mL PBS，第16孔加入0.05mL PBS；
(4)在第1孔加入0.025mL禽流感或新城疫标准阳性血清，充分混匀后移出0.025mL至第2孔，依次类推，倍比稀释至第14孔，第14孔弃去0.025mL，第15孔为阳性对照，第16孔为PBS对照；
(5)在第1孔—15孔各加入0.025mL 4HAU抗原，轻叩反应板，使反应物混合均匀，20℃-25℃室温下静置不少于30min，或在4℃环境下静置不少于60min；
(6)每孔加入0.025mL体积分数为1％的鸡红细胞悬液或0.75％鸡醛化红细胞悬液，轻晃混匀反应板后，20℃-25℃室温下静置35-45min，或在35-40℃恒温静置12-18min，当PBS对照孔红细胞呈明显纽扣状沉到孔底时判定结果；
(7)结果判定，在PBS对照孔出现正确结果的情况下，将反应板倾斜，从背侧观察，1-3s内看红细胞是否呈泪珠状流下，只有当阴性血清与标准抗原对照的HI滴度不大于2log2，阳性血清与标准抗原对照的HI滴度与已知滴度相差1个稀释度范围内，并且所用阴、阳性血清都不发生自凝的情况下，HI试验结果判定有效，记录试验抗体效价数值；
(8)禽流感抗体效价公式：参照血凝效价11log2比正确血凝效价数值多Y个滴度，禽流感抗体效价＝(试验抗体效价数值-Y)log2，Y＝0、1、2、3、4；
(9)新城疫抗体效价公式：参照血凝效价12log2比正确血凝效价数值多Y个滴度，新城疫抗体效价＝(试验抗体效价数值-Y)log2，Y＝0、1、2、3、4。
2种试剂检测出试验HI效价(log2)情况如下：
步骤(7)检测出禽流感病毒H5N1(RE-12株)HI效价(log2)按照原始编号(1-30)结果分别为：1、1、1、1、1、1、1、2、1、1、1、2、1、1、1、1、1、2、1、1、1、1、3、1、1、1、1、1、1、1；根据禽流感抗体效价公式，11log2比正确血凝效价10log2多1个滴度(Y＝1)，抗体效价(log2)＝试验抗体效价-1，求得禽流感病毒H5N1(RE-12株)HI效价(log2)按照原始编号(1-30)结果分别为：0、0、0、0、0、0、0、1、0、0、0、1、0、0、0、0、0、1、0、0、0、0、2、0、0、0、0、0、0、0；
步骤(7)检测出新城疫HI效价(log2)按照原始编号(1-30)结果分别为，7、9、7、7、8、7、9、8、9、9、8、8、8、7、7、9、8、8、6、9、7、9、9、7、8、9、9、9、9、6；根据新城疫抗体效价公式，12log2比正确血凝效价11log2多1个滴度(Y＝1)，抗体效价(log2)＝试验抗体效价-1，求得新城疫HI效价(log2)按照原始编号(1-30)结果分别为6、8、6、6、7、6、8、7、8、8、7、7、7、6、6、8、6、7、5、8、6、8、8、6、7、8、8、8、8、5。
实施例5禽流感和新城疫的血凝试验传统检测方法
受检样品为环翠区广源养殖场的肉鸡血清，原始编号为1-30，未免疫高致病性禽流感三价灭活苗(H5N1RE-11株+RE-12株，H7N9(H7-RE2株))，于2020.7.25免疫新城疫灭活油苗，青岛易邦生物工程有限公司，生产批号19454700。
首先，用哈尔滨国生生物科技股份有限公司生产的禽流感病毒H5N1(RE-12株)血凝抑制试验抗原，生产批号20190819，血凝效价10log2，和青岛立见诊断技术发展中心生产的新城疫血凝抑制试验抗原，生产批号010131901；血凝效价为11log2。
根据高致病性禽流感诊断技术(GB/T 18936-2020)和新城疫诊断技术(GB/T16550-2020)分别进行血凝抑制试验。
检测出禽流感病毒H5N1(RE-12株)HI效价(log2)按照原始编号(1-30)结果分别为0、0、0、0、0、0、0、1、0、0、0、1、0、0、0、0、0、1、0、0、0、0、2、0、0、0、0、0、0、0；
检测出新城疫HI效价(log2)按照原始编号(1-30)结果分别为6、8、6、6、7、6、8、7、8、8、7、7、7、6、6、8、6、7、5、8、6、8、8、6、7、8、8、8、8、5。
实施例5为实施例4的对比试验，由实施例4和实施例5对比可以看出，本实施例4所得到的试验抗体效价经过公式修正后的禽流感、新城疫血凝抑制试验抗体效价结果与实施例5中正确抗体效价完全一致。
除实施例2-5之外后，发明人又检测辖区内其他多家禽养殖场肉鸡和蛋鸡血清样品，同样进行比对试验，先按照高致病性禽流感诊断技术(GB/T 18936-2020)和新城疫诊断技术(GB/T 16550-2020)进行血凝抑制试验，检测出HI抗体效价，再在试剂不变的情况下应按照新检测方法设定11log2、12log2为禽流感、新城疫固定的参照血凝效价，直接进行血凝抑制试验并运用禽流感、新城疫血凝抑制试验抗体效价公式，求得HI抗体效价，其结果与正确抗体效价完全一致。
以上试验证明本发明的禽流感、新城疫血凝抑制试验抗体效价公式具有实用性、准确性、普遍性，本发明的检测方法既能节省试验时间，又能节省病毒抗原的使用量，大大提高了工作效率。
上述具体实施方式仅是本发明的具体个案，本发明的专利保护范围包括但不限于上述具体实施方式的产品形态和式样，任何符合本发明权利要求书且任何所属技术领域的普通技术人员对其所做的适当变化或修饰，皆应落入本发明的专利保护范围。

Claims (7)

1.一种禽流感和新城疫的血凝抑制试验检测方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)设定禽流感血凝抑制试验固定的参照血凝效价为11log2，设定新城疫血凝抑制试验固定的参照血凝效价为12log2；
(2)按照《禽流感、新城疫4HAU抗原配制表》配制禽流感参照血凝效价11log2或新城疫参照血凝效价12log2的4HAU抗原；
(3)取2个96孔V型微量反应板横向相邻放置，第2个96孔V型微量反应板作为第1个板的加长，用移液器在第1孔-第15孔各加入0.025mL PBS，第16孔加入0.05mL PBS；
(4)在第1孔加入0.025mL禽流感或新城疫标准阳性血清，充分混匀后移出0.025mL至第2孔，依次类推，倍比稀释至第14孔，第14孔弃去0.025mL，第15孔为阳性对照，第16孔为PBS对照；
(5)在第1孔—15孔各加入0.025mL 4HAU抗原，叩动反应板，使反应物混合均匀，20℃-25℃室温下静置不少于30min，或在4℃环境下静置不少于60min；
(6)每孔加入0.025mL体积分数为1％的鸡红细胞悬液或0.75％鸡醛化红细胞悬液，晃动混匀反应板后，20℃-25℃室温下静置35-45min，或在35-40℃恒温静置12-18min，当PBS对照孔红细胞呈明显纽扣状沉到孔底时判定结果；
(7)结果判定，在PBS对照孔出现正确结果的情况下，将反应板倾斜，从背侧观察，1-3s内看红细胞是否呈泪珠状流下，只有当阴性血清与标准抗原对照的HI滴度不大于2log2，阳性血清与标准抗原对照的HI滴度与已知滴度相差1个稀释度范围内，并且所用阴、阳性血清都不发生自凝的情况下，HI试验结果判定有效，记录试验抗体效价数值；
(8)禽流感抗体效价公式：参照血凝效价11log2比正确血凝效价数值多Y个滴度，禽流感抗体效价＝(试验抗体效价数值-Y)log2，Y＝0、1、2、3、4；
(9)新城疫抗体效价公式：参照血凝效价12log2比正确血凝效价数值多Y个滴度，新城疫抗体效价＝(试验抗体效价数值-Y)log2，Y＝0、1、2、3、4。
2.根据权利要求1所述的一种禽流感和新城疫的血凝抑制试验检测方法，其特征在于：所述步骤(8)或步骤(9)中，若计算出的禽流感抗体效价或新城疫抗体效价大于10，则禽流感抗体效价或新城疫抗体效价记为10log2；若禽流感抗体效价或新城疫抗体效价小于或等于3log2，则判定抗体试验为阴性；若禽流感抗体效价或新城疫抗体效价等于4log2，则判定抗体试验为可疑，需重复试验；若禽流感抗体效价或新城疫抗体效价大于或等于5log2，则判定抗体试验为阳性。
3.根据权利要求1或2所述的一种禽流感和新城疫的血凝抑制试验检测方法，其特征在于：所述步骤(6)中，红细胞悬液在使用前，在移液槽内加满红细胞悬液，每次吸取槽底的红细胞悬液加入。
4.根据权利要求1或2所述的一种禽流感和新城疫的血凝抑制试验检测方法，其特征在于：所述步骤(3)中PBS为pH7.2磷酸盐缓冲液，其配置方法包括如下步骤：称取氯化钠8.0g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钠0.24g，加蒸馏水至1000mL，将上述成分依次溶解，用盐酸调pH至7.2，分装，121℃，15min灭菌。
5.根据权利要求1或2所述的一种禽流感和新城疫的血凝抑制试验检测方法，其特征在于：所述步骤(6)中1％鸡红细胞悬液的制备方法包括如下步骤：用阿氏液作为抗凝剂，采集至少三只SPF公鸡或无禽流感和新城疫抗体的非免疫鸡的抗凝血液，放入离心管中，加入3-4倍体积的PBS混匀，以2000r/min离心5min-10min，去掉血浆和白细胞层，重复以上过程，反复洗涤3-4次，洗净血浆和白细胞，2000r/min离心10min，最后吸取压积红细胞用PBS配成体积分数为1％的悬液，于4℃保存备用。
6.根据权利要求5所述的一种禽流感和新城疫的血凝抑制试验检测方法，其特征在于：所述阿氏液的配制方法包括如下步骤：称取葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸0.055g、氯化钠0.42g，加蒸馏水至100mL，散热溶解后调pH值至6.1，69kPa15min高压灭菌，4℃保存备用。
7.根据权利要求1或2所述的一种禽流感和新城疫的血凝抑制试验检测方法，其特征在于：所述步骤(6)中0.75％鸡醛化红细胞悬液的制备方法包括如下步骤：将新鲜红细胞用0.1mol/L PBS液充分洗涤5次，每次以3000r/min离心4min，最后1次用红细胞压缩体积的10倍PBS液洗涤，且3000r/min离心10min，去上清；按沉积红细胞的8倍量加入冷至4℃的36％甲醛溶液混合均匀，放置4℃作用24h，其间不断轻摇振荡；取出后再按沉积红细胞1份加2份冷至4℃的30％甲醛溶液混匀，4℃作用24h，然后用PBS液洗涤5次，配制0.75％醛化红细胞液，加入终浓度0.1％叠氮钠4℃备用。
CN202110616206.7A 2021-06-02 2021-06-02 禽流感和新城疫的血凝抑制试验检测方法 Active CN113504367B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110616206.7A CN113504367B (zh) 2021-06-02 2021-06-02 禽流感和新城疫的血凝抑制试验检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110616206.7A CN113504367B (zh) 2021-06-02 2021-06-02 禽流感和新城疫的血凝抑制试验检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113504367A true CN113504367A (zh) 2021-10-15
CN113504367B CN113504367B (zh) 2023-08-08

Family

ID=78008898

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110616206.7A Active CN113504367B (zh) 2021-06-02 2021-06-02 禽流感和新城疫的血凝抑制试验检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113504367B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117757892A (zh) * 2024-02-22 2024-03-26 潍坊华卓生物科技有限公司 预防鸡新城疫病毒的功能性益生菌反向筛选方法及应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4298346A (en) * 1978-02-06 1981-11-03 Takeda Chemical Industries, Ltd. Virus hemagglutination-inhibition reaction
US20090325148A1 (en) * 2008-06-30 2009-12-31 Vaxdesign Inc. Bead Array Reader Based-Hemagglutination and Hemagglutination Inhibition Assay
CN102012430A (zh) * 2010-11-05 2011-04-13 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 禽流感病毒H5N1亚型Re-5株血凝抑制抗原标准物质及制备方法
CN106749639A (zh) * 2016-11-23 2017-05-31 临沂大学 一种新的h5亚型禽流感卵黄抗体代替血清抗体监测的方法
CN110511283A (zh) * 2019-08-26 2019-11-29 中国农业科学院上海兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心上海分中心) 一种具有绿色荧光活性的检测蛋白的检测试剂盒
CN111323581A (zh) * 2020-03-03 2020-06-23 广州鸿泉生物科技有限公司 一种流感血凝抑制试验检测方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4298346A (en) * 1978-02-06 1981-11-03 Takeda Chemical Industries, Ltd. Virus hemagglutination-inhibition reaction
US20090325148A1 (en) * 2008-06-30 2009-12-31 Vaxdesign Inc. Bead Array Reader Based-Hemagglutination and Hemagglutination Inhibition Assay
CN102012430A (zh) * 2010-11-05 2011-04-13 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 禽流感病毒H5N1亚型Re-5株血凝抑制抗原标准物质及制备方法
CN106749639A (zh) * 2016-11-23 2017-05-31 临沂大学 一种新的h5亚型禽流感卵黄抗体代替血清抗体监测的方法
CN110511283A (zh) * 2019-08-26 2019-11-29 中国农业科学院上海兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心上海分中心) 一种具有绿色荧光活性的检测蛋白的检测试剂盒
CN111323581A (zh) * 2020-03-03 2020-06-23 广州鸿泉生物科技有限公司 一种流感血凝抑制试验检测方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117757892A (zh) * 2024-02-22 2024-03-26 潍坊华卓生物科技有限公司 预防鸡新城疫病毒的功能性益生菌反向筛选方法及应用
CN117757892B (zh) * 2024-02-22 2024-06-11 潍坊华卓生物科技有限公司 预防鸡新城疫病毒的功能性益生菌反向筛选方法及应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN113504367B (zh) 2023-08-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106596933B (zh) 新城疫病毒抗体检测阻断elisa试剂盒
CN109239342B (zh) Qx型ibv血凝抑制试验抗原及其制备方法与应用
CN113504367B (zh) 禽流感和新城疫的血凝抑制试验检测方法
CN102093982B (zh) 一种禽流感h9n2亚型病毒毒株及其应用
CN102012430B (zh) 禽流感病毒H5N1亚型Re-5株血凝抑制抗原标准物质及制备方法
CN109580942B (zh) Qx型ibv的细胞适应株mj在制备全病毒抗原elisa检测试剂盒中的应用及试剂盒
CN104258386A (zh) 一种水貂病毒性肠炎灭活疫苗-犬瘟热活疫苗组合
CN109633170A (zh) 一种EB病毒壳抗原IgA抗体检测试剂盒
CN102004151B (zh) 禽流感病毒h9亚型血凝抑制抗原标准物质及制备方法
CN113533718A (zh) 禽流感和新城疫的血凝试验检测方法
CN113376387B (zh) 一种鸽新城疫Ⅵb亚型阳性血清标准品及其制备方法
CN1557838A (zh) Sars冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体、产生该抗体的杂交瘤和含此抗体的检测试剂及其用途
CN102286638A (zh) 一种鸡传染性支气管炎病毒的鉴定方法
Nagy et al. Seroprevelance of avian Metapneumovirus in Egyptian chicken and duck flocks with a reference on economic impact
CN106771173A (zh) 抗h9亚型禽流感病毒的单克隆抗体、杂交瘤细胞株及其应用
AU2021100216A4 (en) An xMAP Assay for Detection of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Antibodies
CN104667270B (zh) 一种鸡传染性支气管炎病毒抗原及其制备方法
CN114675024A (zh) 一种猪a型塞内卡病毒中和性抗体、竞争elisa检测试剂盒及检测方法
CN107991481A (zh) 一种检测猪伪狂犬病毒和口蹄疫病毒的二联阻断elisa抗体检测试剂盒及其应用
CN111707822A (zh) 一种鸡毒支原体抗体检测试剂及制备方法和应用
RU2738900C1 (ru) Диагностический набор для выявления антител к вирусу гриппа птиц подтипа Н9 в реакции торможения гемагглютинации
KR101099076B1 (ko) Ｈｅｐａｒｉｎ 처리된 ＰＲＲＳＶ 항원을 사용한 간접면역효소반응 키트 및 이의 제조 방법
CN106033038A (zh) 鸡传染性支气管炎血凝抑制试验用血清处理方法
RU2815532C1 (ru) Диагностический набор для выявления антител к вирусу гриппа птиц и идентификации подтипа гемагглютинирующего вирусного агента в реакции торможения гемагглютинации
CN110438093A (zh) 一种鸡传染性支气管炎hi抗原及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant