JPS62234031A - 百日咳抗原の精製 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はボルデテラ百日咳伝染病に対するワクチン生成
に使われる抗原物質製造法に関する。

従来百日咳防疫に殺した全細胞ボルデテラ百日咳ワクチ
ンが広く使われている。全細胞ワクチンに対する逆反応
およびそれによるこのワクチンの公式利用の減少により
分離された百日咳抗原を含むよ、り安全な非細胞ワクチ
ン生成のための多くの試験研究が行なわれている。

非細胞ワクチンの有用成分として３つの抗原部分、即ち
゛（ｉ）リンパ球増加症促進因子（ｚ、ＰＦ）、（２１
フィラメント状ヘマグルチニン（Ｈａｇｓａｇｇｌｓｔ
ｉｎｆ）　（ＰＥＡ　）および（３）　　線毛性凝集原
（フィンブリエ）があげられる。

第３部分、即ち線毛性凝集原によってあられされる種類
の抗原には°凝集原２と３”といわれる凝集原がある。

（凝集原２と３は°Ａｔ　２＋３°ともいわれる。凝集
原２と３は少なくとも凝集原２と３抗原をもっている有
機体から分離されるフィンブリエより成ると思われる。

（＃集原３はある著者によって°凝集原６”ともいわれ
凝集［３と６は同じかもしれない、） これらの各部分を小規模分離する方法は知られているが
３部分全部をボルデテラ百日咳培養液から個別に能率よ
く生成する方法はこれまで使われていない。故に例えば
ＥＰ−Ａ−０００３９１６号はボルデテラ百日咳の細胞
からえた液体試料を固定相として用いて親和力クロマト
グラフ法にかけることによりリンパ球増加症促進因子（
ＬＰＩＰ）をえる方法を記載している。しかし使用した
液体試料は均質化した細胞ペーストからえたもので、記
載の方法はＬＰ！ＰＦに有効であるが、特許はフィラメ
ント状ヘマグルチニン（ＦＨＡ）と凝集原２と３　（Ａ
ｔ　２＋３　）の個別分離に向けられていない。

ボルデテラ百日咳の培養上澄液からリンパ球増加症促進
因子（ｒ、ｐｙ）とフィラメント状ヘマグルチニン（Ｆ
ｙＡ）をえる方法も提案されている。例えばサトーら（
Ｉ％ｆｇ６ｔｔｍ８ｓｄ　ｌｍ５ｓｓｊｔｙ、　４１巻
、３１３−３２０．１９８３年７月）は培養上澄液から
ヒドロキシルアパタイト管上の分別吸着によるＬＰＦと
ＦＨＡの精製を述べている。

しかしこれらの従来法はリンパ球増加症促進因子（ＬＰ
り、フィラメント状ヘマグルチニン（ＦＨＡ）ｇよび線
毛性凝集原全３８！の同時生成法と関係ない。

これらの抗原部分すべてを含むワクチン組成物製造法に
おいて各部分が最終ワクチンに２いてほぼ同一割合であ
ると便利なので望む３部分を匹敵する収率でえることが
望ましい。

本発明によって １ａ）　　培養物を細胞部分と上澄液に分離し、（ｃ）
　　上澄液を濃縮し、 （ｃ）　　濃縮上澄液をリンパ球増加症促進因子（ｘ、
ｐｉ）とフィラメント状ヘマグルチニン（ｙｘＡ）含有
部分に分別分離し、 （ｄ）　　細胞部分から少なくとも１の線毛性凝集原を
分離する工程より成るリンパ球増加症促進因子ＣＬＰ１
！’）、フィラメント状ヘマグルチニン（ｙｇＡ）およ
び少くとも１の線毛性凝集原の製造法が提供されるので
ある。

工程（ｄｌにおいて少なくとも凝集原２と３　（Ａｐ２
＋３）より成る線毛性凝集原は細胞部分から分離される
。分離された凝集原はなお任意に凝集原４．５および６
の１又は２以上を含む。

本発明はまた上記工程（ａ）から（４までにより生成さ
れた（ｉ）ＺＦＪ’、ｔｌ）ＦＨＡおよび（Ｉｌｉ＋　
　少なくとも１の線毛性凝集原を解毒した後混合する又
は混合した後解毒することより成るリンパ球増加症促進
因子（ＬＰり、フィラメント状ヘマグルチニン（ｙｇＡ
）および少なくとも１の線毛性凝集原より成るワクチン
組成物の製法も提供する。線毛性凝集原は少なくとも凝
集原２と３　（Ａｆ２＋−３）を含むとよい。

線毛性凝集原はまた凝集原４．５および６の少々くとも
１を含んでもよい。

本発明によってＬＰＦ、Ｐ”ＨＡおよび少なくとも１の
線毛性凝集原を分離することにより単一培養液からこれ
ら成分をワクチン組成物に治療有効量で再混合できる収
量でえることができる。

上記のとおり本発明の方法を行なうに分別工程（ｃ）の
前に上澄液を濃縮する、そして驚いたことに細胞部分か
ら上澄液を分離後行なった濃縮工程（ｃ）とこの工程を
連続性なうことによってＦＨＡの甚しい損失を避けうる
ことがわかったのである。

培養物の細胞部分と上澄液への分離は培養物ｐＨが７．
０以上、好ましくは８．０又はそれ以上である場合遠心
分離法によって行なわれる。培養物ｐＨは７．５乃至９
．０の範囲が最もよい。

遠心分離後上澄液は元の容量の５０％以下、好ましくは
２５％以下の濃縮減量するとよい。普通の脱水法、例え
ばペリコン濃縮法によって便利に濃縮できる。濃縮工程
後でＬＰＦとＦＨＡ含有部分に上澄液を分ける前残留有
機体除去のため濾過するとよい０次いで分別工程（ａ）
は上澄液を例えば管中のヒドロキシルアパタイトと接触
させて便利にできる。ここでＦＨＡ含有部分は保留され
ＬＰＦ含有部分を含む溶離液は回収できる。

ＬＰ！含有部分は普通の蛋白質分別方式、例えば硫酸ア
ンモニウムを用いて塩濃度増加により蛋白質物質を沈澱
させた後適当な緩衝液を用いて沈澱を抽出する方法によ
って精製できる。抽出液は透析できかくてえｆＦ−ＬＰ
ＩＰ含有液は例えばＥＰ−Ａ−０００３９１６号に記載
の方法により他の蛋白質と脂肪多糖類を除去して精製で
きる。

故に例えば透析したＬＰ！含有液はフェトウィンセファ
ローズ管に応用し保持されたＬＰＩＰを塩化マグネシウ
ム緩衝液で溶離できる。

こうして精製したＬＰＥｉ含有部分は次に再び透析し一
過した後解毒することができる。

ＦＨＡ含有部分の精製は増加するイオン強度をもつ緩衝
液を用いて部分をヒドロキシルアパタイト吸着剤から溶
離した後例えば塩高濃度における沈澱生成とクロマトグ
ラフ法を含む普通の蛋白質精製法によって行なうことが
できる。

最後に精製されｆｅ、ＦＨＡ含有部分は膜濾過と解毒工
程をうける。

細胞部分から線毛性凝集原、例えば凝集原２と３ＣＡｔ
２＋３）を分離するには細胞を洗い適当な緩衝剤中に均
質化するとよい。遠心分離後線毛性凝集原含有部分を分
離するため上澄液は普通の蛋白質精製法をうける。した
がって例えば線毛性凝集原含有部分は液のイオン強度を
増して沈澱させた後緩衝液で１又は２回以上抽出し再沈
澱し透析できる。結局精製線毛性凝集原含有部分は膜濾
過され解毒される。

必要ならば線毛性凝集製部分の脂肪多糖類含量は例えば
ポリミキシン−セファローズ４Ｂ管上親和カクロマトグ
ラフ法によって減少できる。

解毒工程はＬＰＦ、ＦＨＡおよび線毛性凝集原含有部分
を個々に又は例えばホルムアルデヒドの様な普通の解毒
剤と混合して地理して行なわれる。

ＬＰＦ、ＦＨＡおよび線毛性凝集製部分からワクチン組
成物を生成するためにこれらの部分は治療的有効割合に
混合し単位服用量当り各成分少なくとも１乃至５μ入好
ましくは少なくとも２μｔｆ含む服用単位に調合される
。

本発明に出発物質として使われるボルデテラ百日咳培養
液生成には普通の成長媒質が使用できる。しかしＦＨＡ
を商業的に価値ある収率で製造するためには特に振とう
培養又は攪拌発酵器中のジメチル−β−シクロデキスト
リンＣＭａＣＤ）２−６岬／ｄＱ含むステイナーとショ
ルテの媒質を用いるとよいことがわかっている。多量の
培養物成長は媒質３００ｄ入り１ｔ）ンプソンびん中又
は１のを発酵器中で便利に行なうことができる。ボルデ
テラ百日咳の適当法は１．２．３セロタイプ（ｉ−デｏ
ｔｙｐｅ）のウェルカム２８株である。抗原の適当収率
を生成する１、２．３セロタイプの他の株も使用できる
。

本発明にょろりツバ球増加症促進因子ＣＬＰＦ）、フィ
ラメント状ヘマグルチニン（ＦＨＡ）および凝集［２と
３（Ａｔ２＋３）の製造法は次の実施例に記載する。

実施例 ボルデテラ百日咳培養液を次のとｊ？りつくった二Ｂ、
ペルタシス株ウェルカム２８の冷凍乾燥アンプルｔＵけ
内容物ｔ−殺菌水に分散させ繊維素除去した馬の血液１
の％を含む木炭寒天板上にピペットでとった。３５℃４
８時間培養後有機体を多数の木炭寒天板上に２次培養し
て３５℃に４８時間保った。

次いで有機体をけずりとってカサミノｒＲ１％とＭａＣ
Ｉ）１ダ／−を含むストレイナーとショルダーの媒質１
の０ｇの入りている２５０ゴコニカルフラスコ多数に入
れた。フラスコを３５℃で毎分１８０回２４時間振とう
し、液の５−１の１を媒質３０ＯＮｔを入れた６０トム
プソンびんの各々に移した。びんを振とう機上で３５℃
でしづかに４８時間振とうした後びん内容物を併せた。

えたボルデテラ百日咳培養液をソルヴアルＲＣ３Ｂ遠心
分離機中で５０００デｐｍで１時間分離した。上澄液を
傾瀉し細胞を凝集原２と３　（Ａｔ２，４−５）調合用
に４℃で貯えた。

１の．０００分子量カットオフフィルター付きミリボア
ベリコン装置を用いて上澄液を濃縮した。１８ｔの上澄
液を約４ｔの容量に濃縮した。濃厚液を次にゲルマン０
．２μｍポリスルホンミニカプセルフィルターをとおし
て無Ｍ濾過をした。

ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフ法、硫酸アンモ
ニワム沈澱法およびセファローズＣＬ−６Ｂクロマトク
ラフ法の連続工程によって培養上澄液からのフィラメン
ト状ヘマグルチニン（ｐＨＡ）の精製を行なった。

回転長円体ヒドロキシルアパタイト（ＢＤＨケミカルズ
社）４００．ｉ／を０．ＩＭ　ＮａＯＨ液５００１Ｌｔ
中に懸濁させた。

粉末を室温で２０分間沈降させ過剰液を傾瀉した。沈澱
をＮａＯＨ液で２回洗った後溶離液のｐＨが約８．０と
なるまで蒸留水で洗った。

洗った粉末を０．ＯＬＭりん酸塩緩衝液５００ａ中に懸
濁させ２０分後緩衝液を傾瀉した。更に３回りん酸塩緩
衝液で洗った。

洗ったヒドロキシルアパタイトを０．０ＩＡｆりん酸塩
緩衝液でｐＨ８，０に平衡させたクロマトグラフ管中に
つめた。

次いで管を濃縮上澄液容器に接続して嬬動ポンプを用い
て液を約５００ｍｊ／時の流速で管をとおして送つ九。

溶離液はＬＰＦ単離用にとりおいた（下記参照）。

管を＋１）０．ＯＩＭりん酸塩ｐＨ８緩衝液、（ｉ）　
　０．　Ｉ　Ｍりん酸塩ｐＨ８，０緩衝液および１ｌｉ
ｌ）　　０．ＩＪｆりん酸塩−０，５Ｍ塩化ナトリクム
ｐＨ６，５緩衝液で順次洗うことによってとりおいたＦ
ＨＡ部分を管から溶離した。最終洗浄において７８Ｍ部
分を捕集し各部分の２８０％倶に２ける光学密度を記録
した。ま九別の部分のへマグルチネーチング活性を新し
く洗ったがちょうの赤血球を用いて試験した。ヘマグル
チネーチ／グ滴定値（Ｌｏｇ　２）　７又は７以上をか
つ部分を併せた。溶離記録は図１に示している。

上記の併せた部分に硫酸アンモニウムを加えて３０％飽
和溶液とした後遠心分離してＦＨＡを沈澱させた。上澄
液を傾瀉しすてて沈澱をｐＨ７，２の０．０５Ｍりん酸
塩−０，５Ｍ塩化ナトリワム緩衝液にとかし同一緩衝液
に対して透析した透析懸濁液を遠心分離し上澄液は次の
精製のためとりおいた。

Ｃ，セファローズＣＬ−６Ｂクロマトグラフ法上記のと
２つ、ｆｆ？、２の０．０５Ｍりん酸塩−０，５Ｍ塩化
ナトリ９ム緩衝液と平衡させておいた上澄液をセファロ
ーズＣＬ−６Ｂゲル上でクロマトグラフ法を行なっ友。

次いで０．０５Ｍり４塩−０，５Ｍ塩化ナトリウムのｐ
Ｈ７，２緩衝液を用いてＦＨＡを管から溶離し８５ｍ部
分を捕集した。溶離部分を上記の方法で蛋白質とへマグ
ルチネーチング活性について検べてヘマグルチネーチン
グ滴定値７又は７以上をもつ部分を併せた。溶離液の記
録は図２に示している。

２、ＬＰＦの精製 ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフ法工程からの溶
離液をＬＰ！回収のため処理した。

初工程において硫酸アンモニウムを加えて７４％飽和溶
液として粗ＬＰＦを沈澱させた。えた懸濁液を遠心分離
して液はすてた。沈澱を、Ｈ？、２の０．０５Ｊ／りん
酸塩−〇、０５Ｍ塩化ナト塩化ニトリ９ム緩衝液させた
。次いで懸濁液を１５．０００７ｐｔｎで遠心分離して
上澄液をとり２いた。生成物を更に同じ緩衝液で４回抽
出しえた上澄液を併せた。

７法 併ぜ九上澄液をｐＨ７．２の０．０５Ｍりん酸塩−０，
０５Ｍ塩化ナトリウム緩衝液に対して透析した後予めｐ
Ｈ７，２０ｏ、ｏｓｙりん酸塩−０，０５Ｍ塩化す）　
ＩＪウム緩衝液と平衡させておいたフェトタイ／セファ
ローズゲル上でクロマトグラフ法を行なった。管を同じ
緩衝液で洗い溶離液はすてた。

管からｐＨ６，４の６．７惰Ｍトリスー０．０１３Ｍ塩
化ナトリウム／３Ｍ塩化マグネシウム緩衝液を用いて精
製ＬＰ！含有部分を溶離して５０滴部分３０個を捕集し
た。ヘマグルチネーチング滴定値７又は７以上をもつ部
分を集め０゜０５トリスＨＣ４１ＭＮａＣＬ　ｐＨ８，
０の緩衝液２ｔに対し透析した。ＬＰ！含有部分をｐＨ
７．２の０．０１Ｍりん酸塩−〇、５Ｍ塩化ナトリ９ム
緩衝液を用いて再び透析してえた精製ＬＰ！含有部分を
とりおいた。

遠心分離した細胞部分を発熱物質のない無菌蒸留水で洗
い遠心分離した後ｐＨ７．２の０．０１４Ｍりん酸塩−
０，１４Ｍ塩化ナトリウム緩衝液を用いて均質化し念。

均質化した細菌懸濁液を９０００ｒμで遠心分離して細
菌細胞を除きボルデテラ百日咳フィムブリエを含む上澄
液をとりおいた。

これに硫酸アンモニウムを加えて最終濃度３０％飽和液
とし４℃で懸濁液を一夜放置して線毛性蛋白質を沈澱さ
せた。

９０００デｐｔｎで遠心分離した後上澄液をすて冷りん
酸塩緩衝液で沈澱を抽出した。懸濁液を１５０００デｐ
％で遠心分離し上澄液をとりおいた。抽出を４回反復し
て液を併せ念。

併せた上澄液に硫酸アンモニウムを加えて最終濃度１５
％飽和液としえた上澄液を４℃で一夜おいて線毛性蛋白
質を沈澱させ九。

懸濁液を１５０００デｐｍで遠心分離して上澄液をすて
た。

固体をリム酸塩緩衝液で抽出し１５０００デｐｍで遠心
分離した。抽出を４回反復しえ北上澄液を併せた。この
液に硫酸ア／モニワムを加えて最終１５％飽和液としこ
れを４℃で一夜おいて線毛性蛋白質を沈澱させた。Ｉ＠
濁液を１５θＯＩＪ　ｒｐｍで遠心分離し上澄液をすて
た。（必要ならば更に硫酸アンモニウム沈澱法を用いて
もよい。）固体をりん酸塩緩衝液で抽出し１５０００　
ｒｐｍで遠心分離した。上澄液を集め、抽出を４回反復
しえた抽出液を併せた。

併せた液をりん酸塩緩衝液に対して透析し膜−過した。

４、解毒法 すべての抗原をミレツクスＧＶ０．２２μ鴨濾過器をと
おしＰ遇した。ＬＰＦｍ合液をｐＨ７．２の０．０５Ｍ
りん酸塩−０，５Ｍ塩化ナトリワム緩衝液を用いて最終
蛋白質濃度２００μｆ／ｌ＃ｃうすめた。これにホルム
アルデヒド４０％溶液を加えて最終ホルムアルデヒド濃
度０．５％とした。

ＬＰ！ＰＦ液を３７℃で１４日培養した。この間少なく
とも２日に１回内容物をさかさにして生じた沈澱を分散
させた。

えた解毒ＬＰ！部分をホルムアルデヒド０．０１％とチ
オメルサル０．Ｏ１％を含むＰＢＳ緩衝液に対して透析
し容器に移し沈澱物質を全部移し貯えた。

同じ解毒法をＦＨＡ部分と凝集原２と３（Ａｆ２＋３）
部分に応用した、但し培養は３７℃で７日間行なった。

ホルムアルデヒド０．０１％とチオメルサル０．０１％
を含むＰＨ３中の解毒した抗原を同じ割合で混合し無菌
水、ホルムアルデヒド０．０４％とチオメルサル０．０
４％およびアルヒドロゲルを含む４ｘｌｌａｐｎｓでう
すめ九等張ＰＢＳ中のえたワクチンは蛋白質１２０μｆ
／１１１１．２５％アルヒドロゲル、０．０１％ホルム
アルデヒドおよび０．０１％チオメルサルを含んでいる
。アルヒドロゲルに対する別の補薬としてりん酸アルミ
ニクム（壇化アルミニ９ムとして加えた）を使用できる
。ワクチンは更にＦＥＥ、ジプテリア（ｄｔ−ｐｔｋｇ
ｒ４゛ａ）と破傷風トキソイドおよびアルヒドロゲルで
稀釈して百日咳抗原６０　ｐｆ／Ｍｌ濃度とすることが
できる。

培養液１８ｔからＦＨＡ、ｒ、ＰＦおよび凝集原２と３
（ＡｙＨ３）を次の収率でえた： ＦＨＡ　　　　　　　　　　　　　　　　　　１９０ｒ
ｌＩｇｒ、　Ｐ　Ｆ　　　　　　　　　　　　　　　　
　　５０ｙｘ；）凝集原２と３　（Ａｔ、３）５０’１
９

【図面の簡単な説明】

図１は本発明のｐＨ６，５の０．１Ｍりん酸塩−０，５
ＭＮａＣ１緩衝液によるヒドロキシルアパタイトからの
ＦＨＡ溶離における２　８０　ｎｆｎＫ！ける光学密度
とへマグルチネーチング滴定値（Ｌｏｇ　２）の記録を
示している。 図２は本発明のセファローズＣＬ−６Ｂクロマトグラフ
法によるＦＨＡ精製における２　８０　ｔＬｍに３ける
光学密度とへマグルチネーチング滴定［（Ｌｏｇ２）の
記録を示している。 特許出願人　　パブリック　ヘルス　ラボラトリ−サー
ビス　ポード ・　・ト・）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（ａ）ボルデテラ百日咳培養液を細胞部分と上澄液
   部分に分離し、 （ｂ）上澄液部分を濃縮し、 （ｃ）濃縮上澄液部分をリンパ球増加症促進因子（ＬＰ
   Ｆ）含有部分とフィラメント状ヘマグルチニン（ＦＨＡ
   ）含有部分に分別分離し、かつ （ｄ）細胞部分から少なくとも１の線毛性凝集原を単離
   する 工程より成ることを特徴とするボルデテラ百日咳培養液
   からのリンパ球増加症促進因子、フィラメント状ヘマグ
   ルチニンおよび少なくとも１の線毛性凝集原の製造法。 ２、工程（ｄ）で分離した線毛性凝集原が凝集原２、３
   、４、５および６の少なくとも１を含む特許請求の範囲
   第１項に記載の方法。 ３、工程（ｄ）で分離した線毛性凝集原が凝集原２と３
   （Ａｇ＿２＿＋＿３）より成る特許請求の範囲第１項に
   記載の方法。 ４、分離した凝集原が更に凝集原４、５および６の１又
   は２以上を含む特許請求の範囲第３項に記載の方法。 ５、分離工程（ａ）をｐＨ７．０以上において行なう特
   許請求の範囲第１項から第４項までのいづれか１に記載
   の方法。 ６、分離工程（ａ）をｐＨ７．５乃至９．０において行
   なう特許請求の範囲第５項に記載の方法。 ７、工程（ｂ）において上澄液を元の容量の５０％以下
   、好ましくは２５％以下に濃縮する特許請求の範囲第１
   項から第６項までのいづれか１に記載の方法。 ８、工程（ｃ）においてＬＰＦ含有部分をフェトウイン
   セファローズ上に吸着させた後塩化マグネシウム緩衝液
   を用いて溶離して精製する特許請求の範囲第１項から第
   ７項までのいづれか１に記載の方法。 ９、（ｉ）リンパ球増加症促進因子（ＬＰＦ）、（ｉｉ
   ）フィラメント状ヘマグルチニン（ＦＨＡ）、および（
   ｉｉｉ）少なくとも１の線毛性凝集原を混合しかつ混合
   前又は後にＬＰＦ、ＦＨＡおよび少なくとも１の凝集原
   を解毒することより成る上記ＬＰＦ、ＦＨＡおよび少な
   くとも１の線毛性凝集原より成るワクチン組成物の製法
   。