CN112941016A - 一种超滤器及分离外泌体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种超滤器及分离外泌体的方法，涉及分离提纯技术领域。其包括储液容器，储液容器开设有进气口和进液口，进气口连接有空气过滤器，储液容器的出液端依次设置有除菌滤膜和超滤膜，且除菌滤膜与储液容器的底部互相配合密封连接，超滤膜的底部连通滤液出口。采用本发明中的超滤器对外泌体上清过滤后，可以保证外泌体膜和囊泡内的生物活性，获得完整性较高的外泌体。该方法避免了提纯浓缩过程中对于留在浓缩液中外泌体的破坏，保证了生物大分子的活性，有效避免了细菌污染问题的发生。该分离方法简单易行、成本低廉，具有良好的应用前景。

Description

一种超滤器及分离外泌体的方法

技术领域

本发明涉及分离提纯技术领域，具体而言，涉及一种超滤器及分离外泌体的方法。

背景技术

外泌体(exosomes)是动物组织细胞形成并释放到外周血液和体液中的大小为40～150nm的扁盘状细胞外囊泡。外泌体包裹了大量的核酸、蛋白质、脂肪等信息物质,而这些信息物质在细胞间的信息传递中发挥了重要作用并调控动物一些重要的生理活动，因此，对外泌体的研究一直备受关注。2013年,James Rothman、Randy Schekman和Thomas Südof3位科学家因发现了细胞内囊泡运输的调控机制获得了诺贝尔生理学或医学奖,而后国内外每年发表外泌体相关文章多达1500篇。

目前的研究多集中于外泌体的形成与功能以及外泌体在免疫调节中的作用，以期为利用外泌体开发肿瘤早期诊断、免疫治疗和动物疾病控制的新途径、新方法。新的研究发现外泌体具有发挥组织损伤修复和再生功能，可以起到抗衰老和保健作用，具有良好的美容作用。其中，脐带间充质干细胞的外泌体在实际应用中具有如下优势：来源易得，来源于新生儿脐带；脐带间充质干细胞分离培养技术很成熟，并有市售的专用于脐带间充质干细胞的商品培养基；在抗衰老、美容的应用效果较好。

目前，外泌体分离纯化方法有：超速离心法、蔗糖密度梯度离心法、商品化试剂盒沉淀法、聚合物沉淀法、超滤法、免疫磁珠法和微流控芯片法。

各类外泌体分离方法优缺点比较

综合目前的分离方法，尚无一种分离方法能够满足大批量样本分离需求，分离方法存在其他物质污染影响下游分析，且分离方法存在破坏外泌体结构或功能的缺陷，存在分离成本高的问题。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种超滤器及分离外泌体的方法以解决上述技术问题。

本发明是这样实现的：

本发明提供了一种超滤器，其包括储液容器，储液容器开设有进气口和进液口，进气口连接有空气过滤器，储液容器的出液端依次设置有除菌滤膜和超滤膜，且除菌滤膜与储液容器的底部互相配合密封连接，超滤膜的底部连通滤液出口。

外泌体和生物大分子的活性成分受到光、热、高压都容易降低其生物活性，所以保持时一般要求避光、低温(2-25℃)、密封，而外泌体上清是细胞培养的上清液，里面成分复杂，大的杂质有细胞、细胞碎片以及培养过程中的各种大分子交缠一起絮状物，小的杂质有：培养基里的各种盐、氨基酸、核酸、维生素、微量元素等成分，浓缩纯化的目的是尽可能留下外泌体和生物大分子，去掉没有功能甚至有害的大小杂质。

发明人发现影响外泌体分离方法处理量小，外泌体易受外界环境污染的原因在于，超滤膜无法高压湿热消毒灭菌，而现有的分离设备使用超滤膜进行过滤外泌体上清液时，容易造成外泌体上清液细菌污染的问题。另外，现有的过滤设备在对外泌体上清液进行过滤时，由于过滤时间较长(24h以上)，过滤设备内用于盛放待分离外泌体的外泌体上清液极易长菌，外泌体上清存放时间极为有限，分离效率低下。

鉴于此，发明人通过设置除菌滤膜将无法灭菌处理的超滤膜与盛放待分离的外泌体上清液的储液容器分隔，从而避免了超滤膜污染到储液容器中的外泌体上清液。而为了避免长时间超滤带来的滤膜长菌问题，发明人设置空气过滤器，加压空气进入储液容器前进行空气过滤。设置空气过滤器可以有效滤除空气中的微生物。

发明人通过自制了操作简单易行的超滤器，极大程度上降低了批量分离外泌体时的分离成本。

除菌滤膜与储液容器的底部互相配合密封连接，一方面可以防止储液容器内部与外界环境连通致使染菌，另一方面，除菌滤膜与储液容器的底部互相配合以形成一个较大的截面对所有通过截面的过滤介质进行除菌，有利于彻底性的除菌。

在一种实施方式中，可采用密封圈进行密封。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述超滤膜为分子量为5-15kD分子量的超滤膜，优选地，超滤膜为5-15kD分子量的PLC再生纤维复合膜或5-15kD分子量的聚醚砜膜。

设置5-15kD以便将滤液中的大部分水分以及来源于培养基的小于5-15kD的各种营养成分(如氨基酸、核糖核酸、各种盐、缓冲液小分子及各种维生素)被超滤分离而出，超滤保存液为高浓缩的外泌体、小量水分和大于10kD的生物大分子，最终浓缩10-50倍(按需要浓度进行浓度，达到外泌体需要的浓度即终止浓缩)。通过超滤膜将小分子物质分离出去从而保存大分子物质，这样可以去除没有功能的小分子物质，保留外泌体及一些具有生物功能大分子从而保持外泌体生物活性。在具体的实施方式中，可以根据分离外泌体的需要，选择合适分子量的超滤膜。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述除菌滤膜为圆片滤膜，圆片滤膜的直径为10-50cm。

大直径的滤膜有利于批量处理外泌体上清液，在其他实施方式中，滤膜的直径也可根据需要进行自适应调整，例如可以为15cm、20cm、30cm、40cm或50cm。

滤膜设置为圆片以满足外泌体上清液的在一个横截面上均匀过滤。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述除菌滤膜为单层除菌滤膜、双层除菌滤膜或三层除菌滤膜。

若除菌滤膜的层数过高，则会明显延长过滤除菌的时间，不利于快速分离外泌体，发明人发现除菌滤膜为1-3层时效果较优。而双层除菌滤膜效果更优。

优选地，除菌滤膜为0.22μm的除菌滤膜，可选自市售的0.22μm的除菌滤膜，材料可以是聚偏二氟乙烯(PVDF)材料。在其他实施方式中，除菌滤膜也可以根据需要设置其他孔径的除菌滤膜，并不限于上述规格的滤膜，只要能满足除菌均在本发明的保护范围之内。

外泌体上清液使用0.22μm孔径除菌滤膜过滤，该步骤是具有两方面作用，一可以过滤除菌，二可以将直径大于220nm的残留上清杂质去掉，而外泌体可以通过滤膜。而且过滤时使用大面积过滤滤膜以便较易过滤，在一种实施方式中，过滤时采用正压(低压力)以防压力过大在通过滤膜时外泌体受到破坏。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述空气过滤器还外接有加压气体输入管，且进气口和进液口设置于储液容器的顶端。

加压气体输入管外接载气储存装置，使用时，只需将外界的载气储存装置的出气管与加压气体输入管相接即可。通过进气口和加压气体输入管以对辅助过滤介质以一定的正压下快速通过滤膜，提升过滤效率。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述储液容器的材料为耐腐蚀材料；优选地，储液容器的材料为不锈钢。在一种实施方式中，设置储液容器为全不锈钢，设置不透光的材料隔绝了外界光源对于外泌体活性产生不利影响。

本发明还提供过来一种分离外泌体的方法，其包括：将待处理液由进液口进入超滤器，从滤液出口脱除滤出物。

待处理液通入所述超滤器前还包括：

将待处理液以1000-4000rpm的转速进行离心，取上清液以孔径为200-220nm孔径的滤膜进行过滤，收集滤出液用于超滤器除菌过滤。

将外泌体上清低速离心(1000-4000rpm)可以把外泌体上清可能含有的细胞及死亡细胞及一些细胞团或其他培养过程残留在上清中质重蛋白质缠绕团等物质沉淀去除，这些成分往往对人体有害，很容易引起身体过敏反应。

发明人发现离心速度过高，会导致被沉淀的物质较多，致使外泌体留存量较少，而低的离心速度有利于保存较大完整比例的外泌体。上述离心速度可以是1000rpm、1200rpm、2000rpm、2500rpm或3000rpm。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述离心步骤中离心的时间为10-30min。例如可以是10min、15min、20min、25min或30min。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述方法还包括向空气过滤器的加压气体输入管中通入加压气体，加压气体可以选用空气、氮气、或二氧化碳，气体压力加至能滤出滤液即可。过滤前后通过透射电子显微镜观察外泌体的完整性以便选择合适的压力过滤。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述方法还包括在分离外泌体前将超滤器进行灭菌处理，灭菌处理时，将超滤膜单独拆下不做灭菌，待灭菌后将超滤膜安装于除菌滤膜下。

使用超滤器超滤之前，先将储液容器、空气过滤器及双层除菌滤膜整体进行高温高压湿热灭菌。而在超滤时，先将已高温高压湿热灭菌的超滤器放置于无菌室超净工作台中，将不能高温高压的超滤膜放置在已经高温高压灭菌的除菌滤膜的下面封装成超滤器，这样安装使得未灭菌的超滤膜被除菌滤膜阻隔，而不会污染超滤器里的外泌体上清。

本发明提供的分离方法能够保持囊泡完整性以及生物大分子活性，特别适用于脐带间充质干细胞的外泌体分离。脐带间充质干细胞外泌体是大约40～150nm的细胞外囊泡，具有磷脂双分子膜，外泌体膜上和囊泡内包含一些具有生物活性的蛋白质、细胞因子及RNA等能够起到一定生物功效的物质。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种能够用于大批量、无污染、低成本的外泌体超滤器，采用本发明中的超滤器对外泌体上清过滤后，可以保证外泌体膜和囊泡内的生物活性，获得完整性较高的外泌体。该方法避免了提纯浓缩过程中对于留在浓缩液中外泌体的破坏，保证了生物大分子的活性，有效避免了细菌污染问题的发生。该分离方法简单易行、成本低廉，具有良好的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明提供的超滤器的结构示意图。

附图标记：100-超滤器；10-储液容器；11-进液口；12-进气口；13-空气过滤器；14-加压进气管；15-滤液出口；20-密封硅胶圈；30-除菌滤膜；40-超滤膜。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本发明提供了一种超滤器100，参照图1所示。其包括储液容器10，储液容器10顶部开设有进气口12和进液口11，进气口12连接有空气过滤器13，储液容器10的出液端(图1中的箭头指向的方向出液)依次设置有除菌滤膜30和超滤膜40，且除菌滤膜30与储液容器10密封连接，超滤膜40的底部连通滤液出口15。通过除菌滤膜30实现上清液中的杂质去除，通过超滤膜40以滤除大部分水分以及来源于培养基的小于5-15kD的各种营养成分。

超滤膜40为分子量为5-15kD分子量的超滤膜40，本实施例中设置分子量为10kD分子量的超滤膜40。

本实施例中的除菌滤膜30为圆片滤膜，圆片滤膜的直径为25cm。除菌滤膜30为双层除菌滤膜30。市售的两层0.22μm规格的除菌滤膜30。

空气过滤器13还外接有加压进气管14(即为加压气体输入管)，加压进气管14外接载气储存装置，使用时，只需将外界的载气储存装置的出气管与加压进气管14相接即可。通过进气口和加压进气管14以对辅助过滤介质以一定的正压下快速通过滤膜，提升过滤效率。

储液容器10的材料为耐腐蚀材料；优选地，储液容器10的材料为不锈钢。本实施例中的储液容器10为容量5L的全不锈钢储液容器10。在一种实施方式中，设置储液容器10为全不锈钢，设置不透光的材料隔绝了外界光源对于外泌体活性产生不利影响。

为保证密封性，除菌滤膜30的顶部与储液容器10的底部还设置有密封硅胶圈20。

本实施例还提供了一种分离外泌体的方法，其包括：在分离外泌体前将超滤器100进行灭菌处理，灭菌处理时，先将储液容器10、空气过滤器13及双层除菌滤膜30整体进行高温高压湿热灭菌。而在超滤时，先将已高温高压湿热灭菌的超滤器100放置于无菌室超净工作台中，将不能高温高压的超滤膜40放置在已经高温高压灭菌的除菌滤膜30的下面封装成超滤器100。

将外泌体上清液以1200rpm的转速进行离心，离心步骤中离心的时间为20min。取上清液以孔径为220nm(即为0.22μm)孔径的滤膜进行过滤，滤出液由进液口11进入超滤器100，从滤液出口15脱除滤出物。

实施例2

与实施例1相比，区别仅在于分离方法不同。将外泌体上清液以1200rpm的转速进行离心，离心步骤中离心的时间为10min。取上清液以孔径为220nm(即为0.22μm)孔径的滤膜进行过滤，滤出液由进液口11进入超滤器100，从滤液出口15脱除滤出物。

实施例3

与实施例1相比，区别仅在于分离方法不同。将外泌体上清液以4000rpm的转速进行离心，离心步骤中离心的时间为10min。取上清液以孔径为220nm(即为0.22μm)孔径的滤膜进行过滤，滤出液由进液口11进入超滤器100，从滤液出口15脱除滤出物。

实施例4

与实施例1相比，区别仅在于分离方法不同。将外泌体上清液以4000rpm的转速进行离心，离心步骤中离心的时间为20min。取上清液以孔径为220nm(即为0.22μm)孔径的滤膜进行过滤，滤出液由进液口11进入超滤器100，从滤液出口15脱除滤出物。

对比例1

与实施例1相比，区别仅在于分离方法不同。将外泌体上清液以12000rpm的转速进行离心，离心步骤中离心的时间为10min。取上清液以孔径为220nm(即为0.22μm)孔径的滤膜进行过滤，滤出液由进液口11进入超滤器100，从滤液出口15脱除滤出物。

对比例2

与实施例1相比，区别仅在于分离方法不同。将外泌体上清液以12000rpm的转速进行离心，离心步骤中离心的时间为20min。取上清液以孔径为220nm(即为0.22μm)孔径的滤膜进行过滤，滤出液由进液口11进入超滤器100，从滤液出口15脱除滤出物。

对比例3

与实施例1相比，区别仅在于分离方法不同。将外泌体上清液以1200rpm的转速进行离心，离心步骤中离心的时间为20min。取上清液以孔径为150nm(即为0.15μm)孔径的滤膜进行过滤，滤出液由进液口11进入超滤器100，从滤液出口15脱除滤出物。

实验例1

本实验例进行高速离心和低速离心对比实验。

实验目的：验证高低速离心后外泌体变化。

实验方法：取40ml外泌体(为自主培养脐带间充质干细胞获得)上清，设置三个离心速度：1200rpm、4000rpm、12000rpm，2种离心时间：10分钟、20分钟。其他的分离步骤与实施例1相同，离心后倒置显微镜观察沉淀物的成分，并称重，荧光倒置显微镜查看离心上清中的外泌体形态。

实验结果参照表1所示。

表1高低速离心后外泌体形态变化。

表1结果表明：离心速度越高，被沉淀的物质越多，外泌体留存量越少，也即离心速度越低越能保存外泌体。

实验例2

本实验例进行除菌滤膜30的过滤实验。

实验目的：双层除菌滤膜30过滤目的是将大于滤膜孔径的物质清除出去，清除杂质起到纯化作用。验证150nm、220nm、450nm三种滤膜过滤后查看上清外泌体完整比例。

实验方法：取同一批外泌体上清(来源与实施例1相同)，取三种滤膜分别过滤200ml，统计过滤持续时间(过滤持续时间对应难易程度)，然后在荧光倒置显微镜下查看离心上清里外泌体的形态。

结果参照表2所示。

表2不同孔径的滤膜过滤后的外泌体形态变化。

表2结果表明：滤膜孔径越小越难过滤，150nm的除菌滤膜30过滤时很容易堵塞，导致过滤无法正常进行，只能更换新的针头滤器，需要更换8个针头滤器，操作难度大。而使用220nm除菌滤膜30过滤也需要更换3个滤器，而450nm滤膜一个针头滤器即可完成过滤。

发明人选择先将外泌体上清液进行离心，然后用除菌滤膜30进行过滤。先把外泌体上清1200rpm离心，再用150nm、220nm滤膜过滤。

表3经过对外泌体上清离心处理后，不同孔径的滤膜过滤后的外泌体形态变化。

滤膜孔径	150nm	220nm
			过滤时间	15分钟	3分钟
离心上清外泌体完整比例	89％	98％

参照表3的结果可知：150nm滤膜过滤还需要3个针头滤器过滤，220nm的滤膜使用一个针头过滤器完成过滤。这是由于低速离心将外泌体上清中细胞和大碎片全部沉淀出去，所以没有这些杂质堵住滤膜的孔径。

因此，在实际上超滤器100过滤前，先以1200rpm低速离心，然后220nm滤膜过滤易于操作，且外泌体保存比例高，而450nm滤膜不能除菌，过滤操作过程容易污染。

实验例3

本实验例进行超滤实验。

实验目的在于制定可靠的大容量外泌体上清超滤提纯浓缩工艺。

实验方法包括如下步骤：使用外购(上海摩速科学器材有限公司)超滤器100进行超滤浓缩，然后采用实施例1制备的超滤器100进行超滤浓缩，然后做无菌检查和外泌体完整性检测。

试验过程包括：外购300ml容量的超滤器100，超滤膜40的直径为8cm。市售的超滤器100不能整体消毒灭菌，超滤200ml的外泌体上清需要12小时，浓缩10倍，但浓缩后外泌体上清已经长满细菌，即超滤器100已染菌。

采用实施例1提供的超滤器100(一次可装5L的外泌体上清液)，超滤4L外泌体上清液，浓缩50倍，用时48小时。无菌检查：阴性；外泌体检查，囊泡完整性达98％。

本发明提供的超滤器100可以拆除超滤膜40后，高温高压灭菌，且能避光。超滤膜40的面积较大，有利于极大程度上缩短超滤时间。此外该超滤器100的操作简便，价格便宜。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种超滤器，其特征在于，其包括储液容器，所述储液容器开设有进气口和进液口，所述进气口连接有空气过滤器，所述储液容器的出液端依次设置有除菌滤膜和超滤膜，且所述除菌滤膜与所述储液容器的底部互相配合密封连接，所述超滤膜的底部连通滤液出口。

2.根据权利要求1所述的超滤器，其特征在于，所述超滤膜为分子量为5-15kD分子量的超滤膜，优选地，所述超滤膜为5-15kD分子量的PLC再生纤维复合膜或5-15kD分子量的聚醚砜膜。

3.根据权利要求1所述的超滤器，其特征在于，所述除菌滤膜为圆片滤膜。

4.根据权利要求3所述的超滤器，其特征在于，所述除菌滤膜为单层除菌滤膜、双层除菌滤膜或三层除菌滤膜；

优选地，所述除菌滤膜为0.22μm的除菌滤膜。

5.根据权利要求1所述的超滤器，其特征在于，所述空气过滤器还外接有加压气体输入管，且所述进气口和所述进液口设置于所述储液容器的顶端。

6.根据权利要求5所述的超滤器，其特征在于，所述储液容器的材料为耐腐蚀材料；优选地，所述储液容器的材料为不锈钢。

7.一种分离外泌体的方法，其特征在于，其包括：将待处理液由所述进液口进入权利要求1-6任一项所述的超滤器，从所述滤液出口脱除滤出物。

8.根据权利要求7所述的分离外泌体的方法，其特征在于，所述待处理液通入所述超滤器前还包括：

将待处理液以1000-4000rpm的转速进行离心，取上清液以孔径为200-220nm孔径的滤膜进行过滤，收集滤出液用于超滤器除菌过滤；

所述离心步骤中离心的时间为10-30min。

9.根据权利要求7所述的分离外泌体的方法，其特征在于，所述方法还包括向所述空气过滤器的加压气体输入管中通入加压气体，加压气体选自空气、氮气或二氧化碳。

10.根据权利要求7所述的分离外泌体的方法，其特征在于，所述方法还包括在分离外泌体前将超滤器进行灭菌处理，所述灭菌处理时，将所述超滤膜单独拆下不做灭菌，待灭菌后将所述超滤膜安装于所述除菌滤膜下。

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