CN116904362A - 一种益生菌外泌体的提取分离方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于外泌体提取技术领域，具体涉及益生菌外泌体提取分离方法，首先将菌种接种至培养基平板中培养至长出单菌落，将单菌落接种至液体培养基中震荡过夜，得到种子液；将种子液与培养基按照1：15～1：20的体积比接种至透析瓶内，将透析瓶放入培养瓶内，并向培养瓶内注入培养基；将培养瓶置于恒温摇床上37℃培养，收集透析瓶内液体，离心，收取上清液；向离心后的沉淀中加入与上清液等体积的培养液重悬，再加入到透析瓶内；将培养瓶内培养基全部倾出，更换等量新的培养基，将透析瓶放入培养瓶内，继续培养过夜；收集透析瓶内液体离心，收取上清液；合并两次上清液；进行外泌体的分离纯化。本发明方法简单，提取外泌体得率更高，纯度更好。

Description

一种益生菌外泌体的提取分离方法

技术领域

本发明属于外泌体提取技术领域，具体涉及一种益生菌外泌体的提取分离方法。

背景技术

益生菌通常被认为是“一类当以足够剂量给予宿主时，通过促进肠道微生态平衡对宿主产生有利影响的活的微生物制剂”，人们对益生菌的安全性和健康促进作用已达成共识；益生菌具有多方面功能，如缓解抗生素引起的腹泻、提高免疫力、防治过敏、缓解炎性肠道疾病、抗感染、提高蛋白质利用率和防治乳糖不耐症等。乳酸菌(Lactic acidbacteria，LAB)是一类能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸的无芽胞、革兰氏阳性菌的总称。乳酸菌绝大部分是人和动物体内必不可少的益生菌群，是安全的(GRAS)食品级微生物。近年来大量研究表明，乳酸菌作为肠道必不可少的有益菌群可发挥多种生理功能：如维持肠道菌群平衡、减缓乳糖不耐症、增强机体免疫功能、调节血糖血压及血清胆固醇水平等。乳酸菌外泌体，即乳酸菌胞外囊泡，是由乳酸菌分泌的一种直径在20～400nm之间，具有磷脂膜双层结构的纳米级囊泡，其携带了乳酸菌的多种生物活性成分，可代替乳酸菌发挥益生作用。

目前主要存在以下几种典型的外泌体分离方法：超速离心法、基于大小分离法、免疫亲和性捕捉法、沉淀法。而无论基于何种方法进行外泌体分离，都需要在前期获得外泌体含量较高的混合培养物，否则在后期进行分离时则需要耗时耗力处理大量样本。

对源性细胞进行预培养，改变其培养方式和培养环境，是外泌体预处理的一项基本措施。

现有方案使用的是传统的发酵法，它是将菌种直接接种于培养液中，细菌在培养液中生长繁衍，培养时细菌、细菌的代谢物、细菌外泌体和培养液均混合在一起，细菌在含养料、排泄物的混合环境中生长，而在发酵过程中，营养物质的消耗和代谢产物的积累是导致细菌活力下降的主要原因，细菌活力下降则会影响到外泌体的分泌量。此外，如果需要进行单纯的细菌外泌体提取，需处理整个发酵罐中的所有混合培养物，这样就需要处理大量混合培养物来进行外泌体提取。

公开号为：CN110885770A，专利申请名称：一种原核生物外泌体及其提取分离方法与应用，其记载的常规外泌体培养方式(预处理)产量低、需处理较多样本才能得到较高浓度的提纯外泌体。

发明内容

为了解决上述现有技术存在的问题，本发明提供了一种益生菌外泌体的提取分离方法，该外泌体提取分离方法巧妙的将透析培养和外泌体提取进行有效的结合，优化了源性细菌的培养方法和外泌体收集，建设性的解决了常规培养法所得外泌体产量低、纯度低的技术问题。

本发明提供的技术方案，具体包括：

一种益生菌外泌体的提取分离方法，包括益生菌的透析培养及外泌体的收集、益生菌外泌体的分离纯化两大工序，具体的提取分离方法是：

S1：益生菌的透析培养及外泌体的收集

益生菌的透析培养是在培养瓶内的透析卡/透析瓶中进行，培养瓶为密封式灭菌玻璃瓶，透析卡/透析瓶为赛默飞世尔科技公司的Slide-A-Lyzer型号，透析卡/透析瓶是由刚性塑料框架、大表面积的再生纤维素膜和样品盖组成的盒装物；透析卡/透析瓶内的空间称为培养室，因此将一个透析卡/透析瓶称为一个培养室；透析卡/透析瓶所在的培养瓶称为培养基室。

其培养步骤包括：

a.菌株活化：将冻存菌种接种至培养基平板，37℃厌氧培养，至长出单菌落；

b.配制液体培养基：根据培养基说明书加入超纯水配制液体培养基，高压蒸汽灭菌后冷却至室温，备用；

c.制备种子液：将单菌落接种至5～20mL液体培养基中震荡培养过夜，得到种子液；

d.透析培养：将种子液与培养基按照1：15～1：20的体积比接种至透析卡/透析瓶(培养室)内，将透析卡/透析瓶拧紧瓶盖后垂直放入培养瓶内，并向培养瓶内注入培养基，将培养瓶置于恒温摇床上37℃培养；

e.样品收集：培养至7～9小时时，收集透析卡/透析瓶内液体，离心，收取上清液；

f.菌体重悬：向离心后的沉淀中加入与上清液等体积的培养液重悬，再加入到透析卡/透析瓶内；

g.二次透析培养：将培养瓶(培养基室)内培养基全部倾出，更换等量新的培养基，将透析卡/透析瓶拧紧瓶盖后垂直放入培养瓶内，于恒温摇床上37℃继续培养过夜；

h.样品收集：收集透析卡/透析瓶内液体，离心，收取上清液。

i.合并两次收取的上清液，上清液中含有外泌体；

S2：益生菌外泌体的分离纯化

a.使用0.22μm过滤器对上清液进行过滤，收集滤液；

b.使用沉淀法、超离法或等超滤等方法对上清液进行外泌体提取。

优选的，所述培养室的数量为一个或多个。

进一步的，培养室体积与培养基室体积的比例在1：3～6。

优选的，培养基室内的培养基需完全淹没所有培养室。

优选的，恒温摇床转速为100～150rpm。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1.本发明通过将含一定浓度乳酸菌的培养液密封在透析卡/透析瓶里，将透析卡/透析瓶浸泡于大瓶培养液里，利用合适孔径的透析卡/透析瓶(半透膜)截留细菌和外泌体，而不影响营养物质的交换，小分子物质如乳酸等代谢产物可以通过透析膜出去，通过调整透析卡/透析瓶外的培养液PH或更换外侧培养液可降低乳酸的含量，进一步解除乳酸对乳酸菌的生长抑制，在与发酵法培养等体积的情况下，只需处理透析卡/透析瓶内的混合培养物就可进行外泌体提取；

2.本发明通过透析培养的方式获得了较高浓度的外泌体溶液(未提纯)，通过后续分离纯化可得到更高浓度的提纯外泌体；

3.方法简单，不需操作大型设备，成本低；

4.透析培养法结合外泌体提取，得到高浓度外泌体；

5、透析培养法通常是用于细菌毒素的富集，而本发明利用其在培养过程中可控性强(可根据需要调节透析膜外侧环境)，可连续培养和收集等特点，将其应用于外泌体提取领域，优化了源性细菌的培养方法和外泌体收集，建设性的解决了常规培养法所得外泌体产量低、纯度低的技术问题；

6、本发明克服了常规外泌体培养分离方法中，需要处理大量的样本量，才能收集到足量的提纯外泌体的缺点，在处理等量菌液的前提下，本发明能显著提高外泌体的得率，且纯度更高。

附图说明

下面结合附图和具体实施例方法对本发明进一步说明。

图1是益生菌的透析培养及外泌体的收集流程示意图；

图2是益生菌外泌体的形态学验证照片或图片，A-D为乳酸菌外泌体的透射电镜照片，其中，A为常规培养下通过沉淀法结合超滤法分离纯化得到的外泌体；B为透析培养下通过沉淀法结合超滤法分离纯化得到的外泌体；C为常规培养下通过超离法结合超滤法分离纯化得到的外泌体；D为透析培养下通过超离法结合超滤法分离纯化得到的外泌体，可见均能观察到完整的囊泡结构；E-H为纳米粒度追踪测得的乳酸菌外泌体粒径分布，其中，E为常规培养下通过沉淀法结合超滤法分离纯化得到的外泌体；F为透析培养下通过沉淀法结合超滤法分离纯化得到的外泌体；G为常规培养下通过超离法结合超滤法分离纯化得到的外泌体；H为透析培养下通过超离法结合超滤法分离纯化得到的外泌体，可见粒径分布规律基本一致；

图3是常规培养与透析培养下通过沉淀法结合超滤法以及超离法结合超滤法分离纯化得的外泌体的蛋白浓度柱状图；

图4是常规培养与透析培养下通过沉淀法结合超滤法以及超离法结合超滤法分离纯化得的外泌体颗粒浓度柱状图；

图5是常规培养与透析培养下通过沉淀法结合超滤法以及超离法结合超滤法分离纯化得的外泌体的纯净度柱状图。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

本发明的发明构思是基于常规外泌体培养方法产量低、浓度低、纯度低等技术问题，我们就想，如果只是在原有常规培养方法上进行突破或改进是难以得到浓度和纯度较高的外泌体的；基于这样的问题导向，后来，经过多方面的查资料和思考观察，发现，在蛋白质截流除杂中，会用到透析卡/透析瓶来进行杂质的去除，我们就想，可不可以使用这种透析方式来对我们的外泌体进行除杂的同时对外泌体的高效培养，在等量菌种的条件下，得到纯度、浓度更高的外泌体，鉴于此，我们做了透析卡和透析瓶等方面的选择和多项实验，从而得到我们本发明的创造成果。

本发明使用的透析卡和透析瓶为赛默飞世尔科技公司Slide-A-Lyzer型号，所述透析卡和所述透析瓶是由刚性塑料框架、大表面积的再生纤维素膜和样品盖组成的盒装物；截留分子量是10K，容量为25-70ml，具体参数为Slide-A_Lyzer G3透析卡，70ml/10K(经过电子束辐照)，A52984。Slide-A-Lyzer G3透析卡和透析瓶适用于低分子量杂质的去除、脱盐、缓冲液置换及样本浓缩等多种应用。

实施例1：

益生菌的透析培养方法及外泌体的收集如图1所示，具体如下：

a.将冻存的乳酸菌菌种融化后，使用接种环小心蘸取少量液体接种至培养基平板，37℃厌氧培养18小时，得到有乳酸菌单菌落的平板。

b.根据MRS肉汤培养基说明书加入超纯水配制液体培养基，高压蒸汽灭菌后冷却至室温，备用。

c.从平板上挑取直径2mm左右的单菌落接种到20mL MRS液体培养基中，37℃厌氧培养18小时，得到种子液(菌液)。

d.取3个规格为70mL的透析卡，向每个透析卡(培养室)内加入4mL种子液与66mLMRS液体培养基。

e.将3个透析卡垂直放入培养瓶中，并向培养瓶(培养基室)中注入990mL培养基后密封，将培养瓶置于恒温摇床上37℃，120rpm培养，

f.培养至8小时时，收集透析卡/透析瓶内液体，4℃，10000×g条件下离心20min，收取上清液4℃保存，同时将沉淀用与上清液等体积的培养液重悬后再加入到透析卡/透析瓶内。

g.将培养瓶(培养基室)内培养基全部倾出，更换等体积新的培养基，将透析卡/透析瓶拧紧瓶盖后垂直放入培养瓶内，于恒温摇床上37℃继续培养过夜，收集透析卡/透析瓶内液体，4℃，10000×g条件下离心20min，收取上清液。

h.合并两次收取的上清液，上清液中含有外泌体。

实施例2：

益生菌外泌体的分离纯化——沉淀法结合超滤法，具体如下：

a.取200mL收集到的上清液，使用0.22μm过滤器对上清液进行过滤，收集滤液。

b.向滤液中加入2mL的10mg/mL的聚赖氨酸溶液，充分混匀。

c.室温孵育1-3小时。

d.4℃，12000×g离心15min，弃上清。

e.加入PBS重悬，4℃，12000×g离心10min，弃上清，并重复一次，收集沉淀。

f.向沉淀中加入50mM，PH＝8.5的Tris-HCl溶液，室温溶解5min,并短暂离心除去不溶物，收集上清液。

g.将上清液加入到100KD的超滤管中进行超滤，超滤时补加PBS缓冲液，超滤至滤出液(超滤管外管中溶液)PH＝7.0-7.4，且滤出液颜色无色透明为止，此时超滤管内管中即为提纯后的外泌体溶液。

实施例3：

益生菌外泌体的分离纯化——超离法结合超滤法，具体如下：

a.取200mL收集到的上清液，使用0.22μm过滤器对上清液进行过滤，收集滤液。

b.将滤液转移至超离管中，配平后，4℃，100000×g超速离心2h。

c.超速离心结束后，弃去离心管中上清液，加入1mL PBS缓冲液重悬沉淀。

d.将重悬后的液体转移到100KD的超滤管中进行超滤，超滤时补加PBS缓冲液，超滤至滤出液(超滤管外管中溶液)PH＝7.0-7.4，且滤出液颜色无色透明为止，此时超滤管内管中即为提纯后的外泌体溶液。

对比实验：

①分为两组进行培养和外泌体收集，第一组按实施例1中各步骤进行透析培养及外泌体收集；第二组进行常规培养及外泌体收集，具体为先按实施例1中a-c的步骤进行种子液制备，然后将种子液与MRS液体培养基按照1:99的比例接种于培养瓶中，该比例与透析培养中总的种子液体积与培养液体积保持一致。同样将培养瓶置于恒温摇床上37℃，120rpm培养8小时后离心收取上清液，沉淀加入与上清液等体积的新鲜培养液，于恒温摇床上37℃，120rpm继续培养过夜，离心收取上清液，上清液中含有外泌体。

②将透析培养和常规培养所得上清液各取200mL按照实施例2中方法进行分离纯化；将透析培养和常规培养所得上清液各取200mL按照实施例3中方法进行分离纯化，提纯得到的外泌体溶液均稀释(或重悬)到1mL，以便进行对比。

③对分离纯化得到的外泌体通过透射电镜鉴定形态，NTA鉴定粒径分布(图2)，并进行蛋白浓度(图3)、颗粒浓度(图4)、纯净度对比(图5)，具体数据见表1。

表1透析培养及常规培养提取分离、纯化后外泌体对比

可以看出，通过实施例1中方法培养和收集，实施例2或3进行分离纯化，与常规培养法相比：平均粒径未发生囊泡数量级变化。

在实施例2所述分离纯化方法下，与常规培养法相比：蛋白浓度提高13.7％；颗粒数及纯净度约是常规培养的5倍。

在实施例3所述分离纯化方法下，与常规培养法相比：蛋白浓度提高约19.1％；颗粒数是常规培养的1.5倍，纯净度是常规培养的2倍。

综上所述，通过本发明得到外泌体浓度与纯度更高。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种益生菌外泌体的提取分离方法，其特征在于，包括益生菌的透析培养及外泌体的收集、益生菌外泌体的分离纯化两步工序；

其中，

S1益生菌的透析培养及外泌体的收集

所述益生菌的透析培养是在培养瓶内的透析卡或/和透析瓶中进行，透析卡和透析瓶内的空间称为培养室，一个透析卡或透析瓶称为一个培养室，透析卡或/和透析瓶所在的培养瓶称为培养基室；

具体步骤包括：

a.菌株活化：将冻存菌种接种至培养基平板，37℃厌氧培养，至长出单菌落；

b.配制液体培养基：根据培养基说明书加入超纯水配制液体培养基，高压蒸汽灭菌后冷却至室温，备用；

c.制备种子液：将单菌落接种至5～20mL液体培养基中震荡培养过夜，得到种子液；

d.透析培养：将种子液与培养基按照1：15～1：20的体积比接种至透析卡/透析瓶(培养室)内，将透析卡/透析瓶拧紧瓶盖后垂直放入培养瓶内，并向培养瓶内注入培养基，将培养瓶置于恒温摇床上37℃培养；

e.样品收集：培养至7～9小时时，收集透析卡/透析瓶内液体，离心，收取上清液；

f.菌体重悬：向离心后的沉淀中加入与上清液等体积的培养液重悬，再加入到透析卡/透析瓶内；

g.二次透析培养：将培养瓶(培养基室)内培养基全部倾出，更换等量新的培养基，将透析卡/透析瓶拧紧瓶盖后垂直放入培养瓶内，于恒温摇床上37℃继续培养过夜；

h.样品收集：收集透析卡/透析瓶内液体，离心，收取上清液；

i.合并两次收取的上清液，上清液中含有外泌体；

S2益生菌外泌体的分离纯化

a.使用0.22μm过滤器对上清液进行过滤，收集滤液；

b.使用沉淀法、超离法或等超滤等方法对上清液进行外泌体提取。

2.根据权利要求1所述的一种益生菌外泌体的提取分离方法，其特征在于，所述培养瓶为密封式灭菌玻璃瓶，所述透析卡和透析瓶为赛默飞世尔科技公司Slide-A-Lyzer型号，所述透析卡和所述透析瓶是由刚性塑料框架、大表面积的再生纤维素膜和样品盖组成的盒装物。

3.根据权利要求1所述的一种益生菌外泌体的提取分离方法，其特征在于，所述培养室的数量为一个或多个。

4.根据权利要求3所述的一种益生菌外泌体的提取分离方法，其特征在于，所述培养室体积与所述培养基室体积的比例在1：3～6。

5.根据权利要求1所述的一种益生菌外泌体的提取分离方法，其特征在于，所述培养基室内的培养基需完全淹没所有所述培养室。

6.根据权利要求1所述的一种益生菌外泌体的提取分离方法，其特征在于，所述步骤d中，恒温摇床的转速为100～150rpm。